无交叉反应和无免疫多路复用夹芯芯片

Bioengineering

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Summary

我们展示了一个快照技术, 执行无交叉的多路复用三明治免疫简单地捕捉两个幻灯片。一种用于可靠地从 microarray-to-microarray 中转移试剂的 snap 装置。该 snap 芯片可用于任何生化反应需要定位不同的试剂没有交叉污染。

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Li, H., Bergeron, S., Larkin, H., Juncker, D. Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays. J. Vis. Exp. (129), e56230, doi:10.3791/56230 (2017).

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Abstract

多路复用蛋白分析显示, 与单一蛋白相比, 诊断灵敏度和准确度均较高。抗体微阵列允许在单个芯片上同时进行数以千计的微型免疫。三明治化验格式通过检测每个目标的两个抗体, 提高了检测的特异性, 但在试剂之间交叉, 从而限制了它们的复用能力。抗体定位微阵列 (ACM) 已发展为无交叉多路复用蛋白质检测, 但需要一个昂贵的观察员 on-site 芯片制造过程中的化验。在这项工作中, 我们展示了一个 snap 芯片技术, 通过简单地将两个芯片一起从 microarray-to-microarray 转移试剂, 因此在样品孵化和随后应用检测抗体 (轻) 时不需要任何的观测存储 pre-spotted 的幻灯片, 游离的幻灯片准备从化验执行。本文介绍了两种单片和双转印方法, 实现了双微阵列的精确对准, 并描述了这两个方法的滑动制作。结果表明, #60; 40 μ m 对准实现了双转移, 达到了625点/cm2的阵列密度。50-plexed 免疫分析已经进行了演示芯片的可用性, 在多路复用蛋白质分析仪。检测35种蛋白质的限度在 pg/毫升的范围内。

Introduction

一个由多种蛋白质组成的生物标志物的面板比单一的标志物在诊断复杂疾病如癌症1,2中提供更高的灵敏度和特异性。酶联免疫吸附试验 (ELISA) 是在临床实验室中使用的金标准技术, 在低 pg/毫升的等离子体中达到了检测的极限, 但每个化验值限制为一个目标3,4,5。抗体微阵列已开发, 以容纳数以千计的微型检测并行进行的单一显微镜幻灯片6,7,8。但是, 这种方法的复用能力受到试剂驱动交叉的限制, 这是由轻混合的应用引起的, 并且越来越多的目标9,10,11. 解放军et al。指出, 复合夹层分析结果的脆弱性是 4 n (n-1), 其中 n 是目标12的数目。

为了减少抗体微阵列中的交叉, 在我们的实验室中开发了抗体定位基因芯片 (ACM), 用于多重夹层试验12。捕获抗体 (cab) 被发现在基板上的微阵列的观察员。在表面上应用阻断样品后, 在与驾驶室抗原复合物相同的斑点上发现单个轻。所有交叉方案之间的抗体和抗原可以减轻与 ACM, 并限制检测在 pg/毫升已经实现。然而, 该检测协议要求在实验过程中使用一种高精度的 on-site 微阵列探测器来准备和识别轻, 这是昂贵和耗时的, 这限制了该技术的广泛应用其他实验室。一个手持式 ACM, 命名的 snap 芯片已开发为无交叉和无检举的复合夹层免疫13,14,15。驾驶室和轻是 pre-spotted 到一个化验幻灯片和转移幻灯片分别在微阵列格式和存储。在分析过程中, 通过简单地将两个芯片合在一起, 将检索到幻灯片, 并将轻的微阵列集体转移到化验幻灯片上。一种用于可靠的试剂转移的 snap 装置。具有相对较大的抗体结合能力的硝化纤维素切片被用作化验幻灯片, 以吸收液滴, 从而促进试剂的转移, 但是, 幻灯片比普通的玻片和微阵列更昂贵与非透明幻灯片兼容的扫描仪需要进行信号采集。

在这项工作中, 我们演示了执行一个多路三明治免疫分析与快照芯片的协议。为更方便、可靠的试剂从 microarray-to-microarray 中转移, 研制了一种新型的抓拍装置。重要的是, 在这里, 我们已经建立了试剂传输方法到常规玻璃幻灯片与快照芯片。1024斑点成功地被转移了并且被排列了到玻璃幻灯片, 极大地扩展这技术的用途在多数实验室。

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Protocol

1. 快照芯片的制作和存储

  1. 单传输方法 ( 图 1a )
    1. 现场 cAb 解决方案, 包含400和 #181; 在磷酸盐缓冲盐水中的 g/毫升抗体和20% 甘油(PBS) 在硝化纤维 (或功能化玻璃) 上使用喷墨微阵列检测幻灯片, 在相对湿度为 60% (每点 1.2 nL) 的情况下使用800和 #181; m 中心间距。确保幻灯片是固定在观察甲板根据一个角落 (这里, 左下角使用).
    2. 在室温下孵育 1 h 的斑点化验幻灯片, 相对湿度为 60%.
    3. 在化验幻灯片上夹住16隔间的滑动模块垫圈, 将其分成16口井。通过添加80和 #181 的 PBS, 冲洗三次幻灯片; 在每个井中都有 0.1% Tween-20 (PBST), 每次在摇床上晃动 450 rpm, 每一次都有5分钟.
    4. 添加80和 #181; L 对每个井的堵塞解决方案, 并在 450 rpm 时抖动1小时.
    5. 取下垫片, 用氮气流干燥化验滑块.
    6. 在观察甲板上固定一张传送幻灯片, 并将幻灯片的左下角按下左下角的探测甲板。喷墨点一组对准标记 (聚苯乙烯微珠的解决方案) 与驾驶室的布局相同.
    7. 让校准标记为干燥。翻转转移幻灯片, 并把它放回观察员甲板上, 在左下角固定.
    8. 准备民建联的解决方案, 包括20和 #181; g/毫升抗体, 20% 甘油和 1% BSA.
    9. 使用监视器和 #39 的摄像头, 拍摄对齐标记的图片。把这张图片作为一个基准来实现, 并得到喷墨观测器的图像识别系统, 以确定最左上标记。使用它的坐标作为第一个点的民建联阵列。点 8 nL 每液滴与中心间距800和 #181; m.
  2. 双传输方法 ( 图 1b )
    1. 将传输幻灯片1放在底部左下角的喷墨检测甲板上。包含400和 #181 的现场 cab 解决方案; PBS 中的 g/毫升抗体, 20% 甘油和 1% BSA, 在相对湿度为60% 的喷墨微阵列检测 (每个点 0.4 nL, 直径为200和 #181) 的幻灯片上。中心间距为400和 #181; m.
    2. 使用一台 snap 设备 ( 图 2 ) 将转印的小水滴转到化验幻灯片上, 用一个硝化棉涂层 (或功能化的玻璃) 检测幻灯片来对传送幻灯片进行捕捉。
      1. 将 snap 设备一侧的所有六按钮按90度打开, 并将所有活塞在打开的位置上锁定。将传送滑块插入其插座中的滑动架上, 并将所修剪的拐角朝向固定的弹簧针。打开第一组三按钮, 以释放活塞与金色的弹簧针, 并确保幻灯片是推对齐针.
      2. 在4弹簧脚上倒置的装置上插入一个硝化纤维素涂层的滑动器。打开第二组三按钮, 释放活塞与银针, 并确保幻灯片是推对齐针脚.
      3. 通过将顶部壳体放置在滑动架上, 使用对齐柱和孔进行精确定位, 从而关闭 snap 装置.
      4. 将闭合的 snap 装置插入其保持架中, 并将关闭标签完全向下推送, 以便在应用适当压力时面对面地进行微阵列。保持关闭1分钟.
    3. 分离幻灯片。在室温下孵育 1 h 的化验幻灯片, 相对湿度为60%。如步骤 1.1.3-1.1.5 所述, 清洗、阻挡和干燥化验幻灯片.
    4. 在喷墨探测甲板上放置另一个传送幻灯片, 然后按下左下角。斑点民建联解决方案包含50或100和 #181; 抗体的 g/毫升 (见表 1), 20% 甘油, 和 1% BSA 在 PBS。确保每个点都是 0.8 nL, 点之间的中心间距是400和 #181; m.
    5. 存储检测和转移幻灯片。在含有干燥剂的密闭袋中密封化验和转移幻灯片, 并放入-20 和 #176; C 冷冻.

2。多路免疫与 snap 芯片

  1. 从冰箱中检索化验幻灯片。把袋子密封30分钟, 直到幻灯片到室温.
  2. 在含有 0.05% Tween-20 的 PBS 中通过峰值蛋白质制备7点系列稀释样品溶液.
    注: 在这里, 使用5倍的稀释因子。表1列出了每个蛋白质的起始浓度.
  3. 根据需要准备示例解决方案。例如, 在 PBST 缓冲液中稀释人血清4倍.
  4. 在化验幻灯片上夹住一个16室垫片.
  5. 用7蛋白稀释溶液和无蛋白质的 PBST 缓冲液, 用移填充一列8口井。在同一张幻灯片的其他8口井中抽取样品溶液.
    注:80 和 #181; L 解决方案可以适合每一个井。必要时可以使用更多的幻灯片来测量其他示例.
  6. 在室温下以 450 rpm 将样品孵化为1小时, 或在4和 #176 过夜; c. 在振动筛上用 PBST 冲洗三次, 每次450分钟。取下垫片, 在氮气流下烘干滑块.
  7. 从冷冻库中取出带有轻的传输幻灯片。在室温下将袋子密封30分钟。然后, 在关闭的腔室中孵育幻灯片 ( 例如 空提示框), 其中包含60% 湿度稳定珠, 用于20分钟的补液.
  8. 使用 snap 设备 ( 图 2 ) 将传输幻灯片与分析幻灯片对齐, 以传输 "民建联" 液滴。有关 snap 设备的操作, 请参见1.2.2 节.
  9. 将幻灯片分开。在包含60% 湿度稳定珠的密闭腔中孵育 1 h. 用16室垫片夹住化验幻灯片, 用 PBST 在 450 rpm、5分钟的振动筛上冲洗4次幻灯片.
  10. 吸管80和 #181; 包含2.5 和 #181 的溶液的 L; 亲和荧光在 PBS 中的每一个井。在 450 rpm 的振动筛上孵育20分钟.
  11. 用 PBST 冲洗幻灯片3次, 在 450 rpm 的情况下用蒸馏水在振动筛上清洗一次。取下垫片, 用氮气将滑块擦干.

3。幻灯片扫描和数据分析

  1. 使用 635 nm 激光扫描带有荧光微阵列扫描的检测幻灯片.
  2. 使用分析软件 (如阵列 pro 分析器) 16 提取每个点的净强度.
  3. 使用统计软件计算每个蛋白质的检测限度 (LOD), 并确定样本中的蛋白质浓度.
    注意: LOD 被定义为标准 cu 的 Y 截距rve 增加了三倍的标准偏差三独立的化验.

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Representative Results

单和双传输方法的检测过程如图 1所示。在单转移, 驾驶室被发现直接在化验幻灯片和轻被转移到化验幻灯片后使用的一个镜像模式的驾驶室 (图 1a)。只有一个转移过程是必需的, 但这种方法是由两个微阵列之间的失调, 主要是由于在幻灯片和喷墨龙门之间的角度失调 (图 2) 造成的。解决这一难题的一种方法是在检测后依次将 cab 和轻传输到分析幻灯片上, 并正确地在 snap 设备中固定幻灯片 (图 1b)。使用这种方法, 两个微阵列都转移到完全相同的位置。双传输方法不需要图像识别系统或对齐标记。98% 点的失调是在41µm, 6 倍的改善相比, 单一的传输方法14

该 snap 装置已被设计为易于使用, 无需任何培训, 并尽量减少阵列失调的风险。由于对齐引脚共同对分析和传输幻灯片, 使幻灯片与精确定位结合在一起。当被弹簧针悬挂时, 转印滑块稍微小一些, 以适应分析滑动, 直到折断装置关闭。在传输滑块上包括一个间隔, 保持微米间隙, 允许可靠的熔滴转移到玻片上。最后, 笼子和它的关闭标签被设计为在每一个单元中应用需要的有效传输的压力, 以实现可重现、高质量的传输。快照设备的照片如图 3所示。

图 4中显示了将试剂转移到硝化纤维幻灯片和玻片上的代表性图像。alexa 532 标记 IgGs 作为第一个试剂, 和 alexa 647 标记 IgGs 被用作第二个试剂。在传输后, 幻灯片被扫描 532 nm 和 635 nm 激光器。结果表明, 3136 (对于硝化纤维素滑动) 或 1024 (为玻片) microspots 转移与零故障上的化验幻灯片和没有交叉感染后, 转移第二个试剂。当使用玻片时, 可以通过功能化来创造更多疏水性的表面, 从而减小每个斑点的大小, 减少 spot-to-spot 的距离, 从而转移更多的斑点。这项工作扩展了芯片技术在常用玻璃基板上的应用。

50丛免疫分析靶向乳腺癌相关蛋白的标准曲线在图 5中说明, 对应于迄今没有交叉的最大的复合夹层抗体芯片。本试验采用双转移法, 对滑动进行了扫描, 并对荧光强度进行了量化, 生成了标准曲线。35出50蛋白达到检测在 pg/毫升 (见表 1), 并可通过优化的化验条件进一步改善。定位的试剂有助于在单张幻灯片上使用多个抗体对而不交叉, 并且允许对每对的优化, 而不受其他对12的干扰。这些结果表明, 快照芯片是一种可扩展的技术, 可用于多路复用蛋白质的量化。

Figure 1
图1。比较 (a) 单和 (b) 双重转移方法的化验程序示意图.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图2。示意图显示单 double-transfer 之间的差异.(a) 转移试剂的镜像放大了幻灯片和喷墨 XY 工作台之间的角度偏差。(b) double-transfer 方法克服了角偏差。根据权限从引用14改编。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图3。快照设备的照片.(a) 打开的设备。(b) 封闭式装置。(c) 设备的全景视图。简要地, (i) 转移幻灯片被安置入幻灯片持有人和推挤反对对准线别针使用 pogopin 安装在活塞。(ii) 化验幻灯片放在 pogopins 的顶部, 并使用第二组活塞对齐销进行推送。(iii) 顶部壳体位于滑动架顶部, 并插入笼中。使用 "关闭" 选项卡压缩 pogopin 并将幻灯片组合在一起时, 将施加压力。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图4。使用 snap 芯片来集体转移斑点.荧光扫描使用 532 nm 和 633 nm 激光, 以证明抗体转移到 (a) 硝化纤维素幻灯片 (适应从参考14与许可) 和 (b) 玻璃幻灯片。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图5。用双转移法测定50种蛋白质平行测定的荧光图像和标准曲线.(a) 用于生成标准曲线的化验幻灯片的荧光图像。(b) 阵列特写。缩放条 = 2 毫米 (c) 标准曲线为50蛋白质。误差线被计算为标准偏差从三独立实验。根据权限从引用14改编。请单击此处查看此图的较大版本.

蛋白质名称 起始浓度 (ng/毫升) LOD (pg/毫升) 蛋白质名称 起始浓度 (ng/毫升) LOD (pg/毫升)
ANG2 500 1.3 x 104 IL-6b 1 2.1 x 102
bdnf 500 1.0 x 102 IL-5 50 77 CA 15-3 * 1 4.9 x 103 IL-4 1000 1.5 x 104 cea 1000 5.4 x 103 IL-2 50 76 CXCL10/IP-10 50 1.7 x 102 lep 200 4.0 x 102 crp 200 44 mig 500 11 x 102 局 1000 6.2 x 102 CCL3/MIP-1α 50 3。3 egf 50 1.8 x 102 CCL4/MIP-1β 50 12 egfr 200 1.9 x 102 MMP-3 500 1.0 x 102 FAS-L 500 4.5 x 102 m-CSF 500 8.2 x 103 fgf 500 1.0 x 103 MMP-9 200 3.1 x 102 g-csf 500 39 CCL2/MCP-1 50 55 GM-CSF 50 3。8 NCAM-1 500 1.7 x 103 α 50 3.0 x 102 β-NGF 200 1.4 x 103 HER2 500 3.5 x 103 NT-3 200 5.8 x 102 BB 200 73 opn 500 1.9 x 103 IL-1β 500 7.9 x 102 RBP4 200 1.2 ×102 IL-1ra 200 1.1 x 103 sparc 1000 4.6 ×104 IL-15 50 8.2 x 102 TNF-α 50 4。4 IL-12 1 30 TNF-RI 50 1.3 x 102 IL-11 500 1.2 x 103 TNF-RII 50 12 IL-10 500 6.1 ×102 FAS/TNFRSF6 200 2.8 ×102 IL-8 50 6。6 upa 200 24 IL-7 2。5 26 uPAR (CD87) 200 76 IL-6a 1000 84 vegf 200 6.7 x 102

表 1.蛋白质浓度和检测在缓冲区从50丛分析。CA 15-3 的 LOD 位于 U/ml (*) 中。根据权限从引用14改编。

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Discussion

在这项工作中, 我们提出了一个 snap 芯片技术, 使交叉免费复免疫广泛适用于研究人员的基本实验设置。与现有的抗体微阵列不同, 不需要 end-users。单和双传输方法都证明, 双转移提供了优越的对准精度下降到〜40μ m 为98% 点, 与最大的失调63µm14。开发了一种新颖的 snap 装置, 可以方便地将两张幻灯片保持一致的压力, 使这项技术能够被研究人员使用。可靠的试剂传递不仅在硝化棉涂层的幻灯片上实现, 而且在普通的玻片上也有, 在不需要进行广泛的培训的情况下, 大大扩展了这项技术的应用。为了演示快照芯片的可用性, 使用 pre-spotted 和存储的幻灯片进行了50丛免疫分析, 70% 的蛋白质在 pg/mL14范围内实现了检测。与现有的复合免疫, 应用轻作为一个混合物, 一个重要的好处的 ACM 和 snap 芯片技术是, 在芯片上的化验是相互独立的, 从而允许添加或删除任何抗体对没有干扰任何其他对。数十到数百个蛋白质可以同时用一个短切芯片来测量, 从而缩短了测试时间, 与其他方法, 如连续孵化自动串行测量, 要求每抗体17的串行应用。只有 sub-nanoliter 的每个抗体的芯片制造, 使其更经济比传统的免疫。

抗体浓度的使用和抗原孵化步骤是至关重要的, 以达到高的检测灵敏度。在芯片的制作中, 抗体浓度可以根据抗体对的亲和性和化验滑块 (硝化纤维或 non-nitrocellulose) 的类型来进行优化。根据检测能力和对准精度, 可以对每个抗体点的体积进行调整, 并据此改变斑点之间的中心间距。在将驾驶室转移到化验幻灯片后, 我们在室温下孵育了1小时的化验幻灯片, 在4° c 的夜间孵化可能会给予更好的抗体结合能力。BSA 自由稳定剂解决方案 (见材料表) 被用来阻止化验幻灯片后, 孵化驾驶室。其他阻断试剂, 如动物血清或牛奶也可用于本应用。

在多路复用免疫中, 可以开发和优化具有不同表面化学特性的 non-nitrocellulose 幻灯片的协议。不同的稀释因子可用于使标准曲线取决于目标蛋白质。不同的荧光可用于标记轻, 并且可以使用不同波长的激光扫描该幻灯片以进行信号采集。

目前, 通过双传输方法14实现了625点/cm2的密度。为了进一步提高快照芯片的复用能力, 我们提供了几种策略。首先, 较小的体积可以用来减少斑点的大小, 从而允许更短的中心距离之间的斑点和增加的阵列密度。其次, 可以选择一个更疏水表面的转移幻灯片, 以减少光斑大小。第三, 通过对喷墨观测机进行微调, 进一步优化了喷嘴与滑动面之间的距离, 从而实现了两种微阵列之间的更好的对准。

对于所有的抗体免疫, 芯片免疫检测的性能取决于抗体的可用性和质量。snap 芯片使用三明治化验格式, 这是最广泛使用的检测格式, 在 ELISA 由于高灵敏度和特异性提供的双, 顺序结合的一对抗体针对不同的表位, 但它取决于用于捕获和检测靶蛋白所需的一对相容抗体的可用性。

芯片技术的价值是建立在免疫, 它可以用于任何化学和生物化学的反应, 需要应用不同的试剂没有 cross-contaminations18,19,20,21,22. 事实上, snap 芯片提供了一个一般的解决方案, 提供各种 pre-spotted 试剂从 microarray-to-microarray, 从而解除芯片制造与化验程序, 从而帮助解决 "macro-to-micro "接口挑战23。作为一个例子, 该 snap 芯片已被用于4丛均匀酶抑制试验分析128条件, 准确的时间, 并可比较的结果大体积实验14。它也被用于多复用组织染色。此外, 它可以有助于药物筛选应用, 以测试在不同的细菌或细胞数以千计的化学品, 为单细胞分析21,24, 或测试不同的条件, 在单一或多步骤的化学反应.

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Disclosures

麦吉尔大学在这项工作的一些方面提出了专利申请, 杨惠妍和大卫. 容克作为发明者。

Acknowledgments

我们感谢 Dr. 抢 Sladek 的使用喷墨观察员。我们承认加拿大卫生研究所 (研究院)、加拿大自然科学和工程研究理事会 (NSERC)、加拿大癌症协会研究所和加拿大创新基金会 (CFI) 的最后支持。感谢来自加拿大研究主席的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline tablet Fisher Scientific 5246501EA
Streptavidin-conjugated Cy5 Rockland s000-06
Tween-20 Sigma-Aldrich p1379
Bovine serum albumin Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc 001-000-162
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer SurModics, Inc SG02
Nitrocellulose coated slides Grace Bio-Laboratories, Inc 305116
Aminosilane coated slides Schott North America 1064875
Snap Device Parallex BioAssays Inc. PBA-SD01
Inkjet microarray spotter GeSiM Nanoplotter 2.0
Slide module gasket Grace Bio-Laboratories, Inc 204862
Humidity Stabilization Beads Parallex BioAssays Inc. PBA-HU60
Array-Pro Analyzer software Media Cybernetics Version 4.5
Fluorescence microarray scanner Agilent SureScan Microarray Scanner
Biostatistics software GraphPad Software GraphPad Prism 6
Endoglin capture antibody R&D Systems MAB10972
Endoglin protein R&D Systems 1097-EN
Endoglin detection antibody R&D Systems BAF1097
IL-6a (see Table 1) R&D Systems
IL-6b (see Table 1) Invitrogen

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References

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