Chip a scatto per immunodosaggi panino multiplex Cross-reactivity e Spotter-free

Bioengineering

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Summary

Dimostriamo una tecnologia di chip di snap per l'esecuzione di test immunologici cross-reactivity-gratis multiplex panino semplicemente schioccando due diapositive. Un'apparecchiatura di snap è utilizzata per il trasferimento in modo affidabile i reagenti da microarray a DNA-microarray. Il chip di snap può essere utilizzato per eventuali reazioni biochimiche che richiedono colocalizzazione di reagenti diversi senza la contaminazione incrociata.

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Li, H., Bergeron, S., Larkin, H., Juncker, D. Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays. J. Vis. Exp. (129), e56230, doi:10.3791/56230 (2017).

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Abstract

Analisi multiplex della proteina ha mostrato sensibilità diagnostica superiore e precisione rispetto alle singole proteine. Microarrays dell'anticorpo consentono migliaia di test immunodiagnostici di micro-scala eseguite contemporaneamente su un singolo chip. Formato di dosaggio sandwich migliora la specificità dell'analisi rilevando ogni destinazione con due anticorpi, ma soffre di reattività crociata fra i reagenti, limitando così la loro capacità di multiplexing. Microarray di colocalizzazione dell'anticorpo (ACM) è stato sviluppato per la rilevazione di proteine "multiplex" cross-reactivity-gratis, ma richiede un costoso spotter in loco per la produzione di microarray durante le analisi. In questo lavoro, dimostriamo una tecnologia di chip di snap che trasferisce il reagente da microarray a DNA-microarray di schiocco semplicemente due chip insieme, che così nessun spotter è necessaria durante l'incubazione del campione e la successiva applicazione degli anticorpi di rilevamento (danti) su deposito di diapositive pre-macchiati, dissociando la preparazione del vetrino dall'esecuzione di test. Entrambi i metodi di trasferimento di singole e doppie sono presentati per ottenere l'allineamento tra i due microarray e la fabbricazione di diapositiva per entrambi i metodi sono descritti. I risultati indicano che < 40 μm allineamento è stato realizzato con doppio trasferimento, raggiungendo una densità di matrice di 625 punti/cm2. Un immunoassay 50-plexed è stato condotto per dimostrare l'utilizzabilità del chip lo snap in analisi multiplex della proteina. Limiti di rilevazione delle 35 proteine sono nella gamma di pg/mL.

Introduction

Un pannello di biomarcatori che comprende proteine multiple può fornire maggiore sensibilità e specificità rispetto al singolo biomarcatore nella diagnosi di malattie complesse come cancri1,2. L'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) è stata la tecnologia di gold standard utilizzata nei laboratori clinici, raggiungimento di un limite di rilevazione a basso pg/mL nel plasma, ma limiti a una sola destinazione per dosaggio3,4,5. Microarrays dell'anticorpo sono stati sviluppati per accogliere migliaia di saggi miniaturizzati condotto in parallelo su un microscopio singola diapositiva6,7,8. Tuttavia, la capacità di multiplexing di questo metodo è limitata dalla reattività crociata reagente-driven, derivanti dall'applicazione di una miscela di dAbs, e diventa più problematico con un numero crescente di target9,10 , 11. Pla et al. hanno dichiarato che la vulnerabilità risultante di un'analisi multiplex panino bilance come 4N(N-1) dove N è il numero dei bersagli12.

Per attenuare la reattività crociata in microarrays dell'anticorpo, anticorpo colocalizzazione microarray (ACM) è stato sviluppato nel nostro laboratorio per sandwich multiplex assay12. Gli anticorpi di cattura (cabine) sono macchiati su un substrato con uno spotter di microarray. Dopo blocchi campioni vengono applicati sulla superficie, e quindi i singoli tocchi sono macchiati sulle stesse macchie con il complesso antigene-cabina. Tutti gli scenari di reattività crociata tra antigeni e anticorpi possono essere mitigati con ACM e limiti di rilevazione a pg/mL sono stati raggiunti. Tuttavia, il protocollo del test richiede preparazione e spotting i danti durante gli esperimenti usando un microarray in loco spotter con alta precisione per scopo di allineamento, che è costoso e richiede tempo, limitare l'ampia applicazione di questa tecnologia in altri laboratori. Un palmare ACM, denominato snap chip è stato sviluppato per cross-reactivity-gratis e privo di spotter multiplex panino immunoassays13,14,15. i taxi e i tocchi sono pre-macchiati su una diapositiva di dosaggio e un trasferimento rispettivamente nel formato microarray e memorizzati. Durante il dosaggio, le diapositive vengono recuperate e un microarray di tocchi sono trasferite collettivamente il vetrino di saggio semplicemente schioccando i due chip insieme. Un'apparecchiatura di snap è utilizzata per il trasferimento affidabile reagente. Diapositive di nitrocellulosa rivestita con una capacità di legame dell'anticorpo relativamente grandi sono stati usati come gli scivoli di dosaggio per assorbire le goccioline di liquide e facilitando così il trasferimento di reagente, tuttavia, le diapositive sono più costose di microarray e diapositive di vetro regolare scanner compatibile con diapositive non trasparenti sono necessari per l'acquisizione del segnale.

In questo lavoro, dimostriamo il protocollo di esecuzione di un immunodosaggio a sandwich multiplex con un chip di snap. Un apparato di romanzo snap è stato sviluppato per il trasferimento di reagente più conveniente e affidabile da microarray a DNA-microarray. Cosa importante, qui abbiamo stabilito il metodo di trasferimento di reagente su vetrini regolari con il chip di snap. 1024 punti correttamente trasferiti e allineati su una lastra di vetro, espandendo significativamente l'uso di questa tecnologia nella maggior parte dei laboratori.

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Protocol

1. fabbricazione e deposito di scatto chip

  1. metodo di trasferimento singolo ( Figura 1a)
    1. Spot cabina soluzioni contenenti 400 µ g/mL anticorpi e glicerolo 20% in tampone fosfato salino (PBS) su una nitrocellulosa (o un bicchiere funzionalizzato) diapositiva di dosaggio con un getto di inchiostro microarray spotter 13 a un'umidità relativa del 60% (1.2 nL per ogni spot) con spaziatura di centro--centro 800 µm. Accertarsi che il vetrino sia fissato sul ponte spotter secondo un angolo (qui, nell'angolo inferiore sinistro è stato utilizzato).
    2. Incubare il vetrino di saggio macchiato a temperatura ambiente per 1 h con un'umidità relativa del 60%.
    3. Morsetto una guarnizione di modulo diapositiva a 16 scomparti sul vetrino di saggio di dividerlo in 16 pozzetti. Sciacquare il vetrino tre volte con l'aggiunta di 80 µ l di PBS contenente 0.1% Tween-20 (PBST) in ogni bene e agitazione a 450 giri/min con un agitatore, 5 min ogni volta.
    4. Aggiungere 80 µ l di bloccare soluzioni per ogni bene e agitare per 1 h a 450 giri/min.
    5. Rimuovere la guarnizione e far asciugare il vetrino di saggio con un flusso di azoto.
    6. Fissare un trasferimento sul ponte spotter e spingere nell'angolo inferiore sinistro della diapositiva contro angolo inferiore sinistro del ponte spotter. A getto d'inchiostro spot matrice di segni di allineamento (una soluzione di microsfere di polistirolo) con lo stesso layout che per i taxi.
    7. Asciugare i segni di allineamento. Capovolgere la diapositiva di trasferimento e rimetterlo sul ponte spotter, fissaggio contro l'angolo inferiore sinistro.
    8. Preparare il dAb spotting soluzioni contenenti 20 µ g/mL anticorpi, 20% glicerolo e BSA 1%.
    9. Utilizzando lo spotter ' s fotocamera, prendere una foto di un marchio di allineamento. Implementare questa immagine nel programma spotting come un fiducial e ottenere il sistema di riconoscimento di immagine del cercatore a getto d'inchiostro per identificare il marchio di sinistro più in alto. Usare la sua coordinata come il primo spot della matrice dAb. Spot 8 nL per goccia con una spaziatura da centro a centro di 800 µm.
  2. Metodo di trasferimento doppia ( Figura 1b)
    1. disporre un vetrino di trasferimento 1 sul ponte spotter inkjet contro l'angolo inferiore sinistro. Individuare soluzioni di cabine contenenti 400 µ g/mL anticorpi, glicerolo 20% e 1% BSA in PBS sulla diapositiva con un spotter di microarray a getto d'inchiostro ad un'umidità relativa del 60% (0,4 nL per ogni spot e ~ 200 µm di diametro). La spaziatura da centro a centro è 400 µm.
    2. a scatto il trasferimento con una nitrocellulosa rivestito (o un bicchiere funzionalizzato) dosaggio diapositive utilizzando un apparato di snap ( Figura 2) per trasferire le goccioline di cabina il vetrino di saggio.
      1. Disabilita tutti i sei pulsanti sul lato apparato snap di 90 gradi per tirare e bloccare tutti i tuffatori in posizione aperta. Inserire la diapositiva di trasferimento il portavetrini in suo recipiente con l'angolo tagliato rivolto verso il perno fisso pogo. Girare la prima serie di tre pulsanti per rilasciare i tuffatori con il perno d'oro pogo e assicurarsi che le diapositive vengono spinti contro i perni di allineamento.
      2. Inserire una diapositiva rivestite con nitrocellulosa in snap apparato capovolto udienza i 4 perni di pogo. Girare la seconda serie di tre pulsanti per rilasciare pressori con il perno d'argento e assicurarsi che le diapositive vengono spinti contro i perni di allineamento.
      3. Chiudere l'apparecchio snap posizionando il guscio superiore sulla porta diapositive utilizzando i pilastri di allineamento e fori per un posizionamento preciso.
      4. Inserire l'apparecchio snap chiuso nella sua gabbia e spingere la linguetta di chiusura completamente verso il basso per portare i microarrays faccia a faccia, esercitando la pressione appropriata. Tenere chiuso per 1 min.
    3. Separare le diapositive. Incubare il vetrino di saggio a temperatura ambiente per 1 h con un'umidità relativa del 60%. Lavare, bloccare e far asciugare il vetrino di saggio come descritto nei passaggi 1.1.3 - 1.1.5.
    4. Mettere un altro trasferimento slide sul ponte spotter inkjet e spingere contro l'angolo inferiore sinistro. Soluzioni punto dAb contenente 50 o 100 µ g/mL di anticorpi (Vedi tabella 1), glicerolo 20% e 1% BSA in PBS. Garantire che ogni luogo è 0,8 nL e la spaziatura da centro a centro tra spot è 400 µm.
    5. Memorizzare il dosaggio e lo scivolo di trasferimento. Guarnizione sia saggio e trasferimento i vetrini in un sacchetto ermetico contenente essiccante e messo in un congelatore a-20 ° C.

2. Multiplexed immunodosaggi con snap chips

  1. recuperare il vetrino di saggio dal freezer. Lasciare il sacchetto sigillato per 30 min fino a quando la diapositiva viene a temperatura ambiente.
  2. Preparare 7 punti serie campione soluzioni diluite di chiodare proteine in PBS contenente 0.05% Tween-20.
    Nota: Qui, viene utilizzato un fattore di diluizione 5 volte. Le concentrazioni di partenza per ogni proteina sono elencate nella tabella 1.
  3. Preparare soluzioni campione come appropriato. Ad esempio, diluire il siero umano 4 volte in tampone PBST.
  4. Morsetto una guarnizione 16-vano sulla diapositiva test.
  5. Riempire una colonna di 8 pozzetti con le soluzioni di diluizione 7 proteina e una soluzione di tampone PBST privo di proteine di pipettaggio. Pipettare soluzioni campione in altri 8 pozzetti nella stessa diapositiva.
    Nota: 80 soluzioni µ l possono essere in forma in ogni bene. Altre diapositive possono essere utilizzati per misurare campioni supplementari quando necessario.
  6. Incubare i campioni su un agitatore a 450 giri/min per 1 h a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. lavare il vetrino tre volte con PBST sull'agitatore a 450 giri/min, 5 min ogni volta. Rimuovere la guarnizione e far asciugare il vetrino sotto un getto di gas azoto.
  7. Recuperare la diapositiva di trasferimento con i tocchi dal freezer. Tenere il sacchetto sigillato per 30 min a temperatura ambiente. Quindi, incubare il vetrino in una camera chiusa (ad esempio casella vuota suggerimenti) contenente microsfere di stabilizzazione di umidità 60% per 20 min per reidratazione.
  8. a scatto la diapositiva di trasferimento con il vetrino di saggio utilizzando un apparato di snap ( Figura 2) per trasferire le goccioline di dAb. Vedere sezione 1.2.2 per il funzionamento dell'apparato snap.
  9. Separare le diapositive. Incubare il vetrino di saggio in una camera chiusa contenente microsfere di stabilizzazione di umidità 60% per 1 h. morsetto il vetrino di saggio con una guarnizione di 16-vano e sciacquare il vetrino 4 volte con PBST su un agitatore a 450 giri/min, 5 min ogni volta.
  10. Pipetta 80 µ l di soluzioni contenenti 2,5 µ g/mL streptavidina fluoroforo in PBS in ciascun pozzetto. Incubare per 20 minuti su un agitatore a 450 giri/min.
  11. Sciacquare il vetrino 3 volte con PBST e una volta con acqua distillata sull'agitatore a 450 giri/min. Rimuovere la guarnizione e far asciugare il vetrino utilizzando gas azoto.

3. Far scorrere la scansione e analisi dei dati

  1. scansione il vetrino di saggio con uno scanner di microarray di fluorescenza usando il laser-nm-635.
  2. Estrarre l'intensità netta di ogni spot utilizzando un'analisi software (ad es. matrice-pro analizzatore) 16.
  3. Calcolare il limite di rilevabilità (LOD) di ogni proteina usando un software di statistiche e determinare le concentrazioni di proteina nei campioni.
    Nota: Il LOD è definito come l'intercetta Y della norma cuRVE incrementato di tre volte la deviazione standard dei tre saggi indipendenti.

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Representative Results

La procedura di analisi per singolo e doppio metodi di trasferimento è mostrato nella Figura 1. Nel singolo trasferimento, le cabine sono macchiate direttamente nella diapositiva saggio e i tocchi vengono trasferiti nella diapositiva di analisi al momento dell'impiego in un modello di specchio delle carrozze (Figura 1a). Un solo trasferimento procedura è necessaria, ma questo metodo soffre di disallineamento tra i due microarray, principalmente a causa del disallineamento tra il vetrino e il cavalletto a getto d'inchiostro (Figura 2). Un approccio per affrontare questa sfida è quello di trasferire sia i taxi e i tocchi in sequenza il vetrino di saggio dopo spotting e le diapositive di fissaggio nell'apparato snap correttamente (Figura 1b). Utilizzando questo metodo, entrambi microarrays sono trasferiti per la stessa posizione. Nessun Marcatore immagine sistema o allineamento del riconoscimento è richiesto per il metodo di trasferimento doppia. Il disallineamento per il 98% dei punti è stato entro 41 µm, 6 volte miglioramento rispetto al trasferimento singolo metodo14.

L'apparato di snap è stato progettato per essere facile da usare senza alcun addestramento e ridurre al minimo il rischio di disallineamento di matrice. Le diapositive sono portate insieme con posizionamento accurato grazie ai perni di allineamento comuni alle diapositive sia saggio e trasferimento. Lo scivolo di trasferimento è leggermente più piccolo per adattarsi sotto il vetrino di saggio quando sospesa dai perni pogo, fino a quando l'apparato di snap è chiuso. Un distanziatore è incluso nella diapositiva di trasferimento mantenere un divario di dimensioni micrometriche che consente il trasferimento affidabile goccia sul vetrino. Infine, la gabbia e la relativa scheda di chiusura sono progettati per applicare la pressione necessaria per il trasferimento efficace a ogni scatto per trasferimento riproducibile, di alta qualità. Una foto dell'apparato di snap è illustrata nella Figura 3.

Immagini rappresentative che illustra i risultati del reagente trasferimento su una diapositiva di nitrocellulosa e un vetrino sono mostrati in Figura 4. 532 di Alexa etichettato IgG sono stati usati come primo reattivo, e Alexa 647 etichettato IgG sono stati usati come secondo reattivo. Dopo il trasferimento, la diapositiva è stata digitalizzata con 532 nm e 635 nm laser. Il risultato mostra che 3136 (per la diapositiva di nitrocellulosa) o 1024 (per il vetrino) microspots sono stati trasferiti con zero errore sui vetrini di saggio e nessuna contaminazione è stata osservata all'atto del trasferimento secondo reattivo. Quando si utilizza lastre di vetro, è possibile creare più idrofobo superficie dalla funzionalizzazione, riducendo la dimensione di ogni spot e diminuendo la distanza di spot a spot per il trasferimento di un numero maggiore di punti. Questo lavoro si espande l'applicazione della tecnologia chip snap ai substrati di vetro comunemente usato.

Le curve standard di un cancro al seno targeting di 50-plex immunoassay relative proteine sono illustrate nella Figura 5, corrispondente per il più grande multisala panino dell'anticorpo microarray fino ad oggi senza reattività crociata. Metodo di trasferimento doppio è stato usato per questo test, la diapositiva è stata digitalizzata e l'intensità di fluorescenza è stato quantificato per generare le curve standard. 35 su 50 proteine raggiunto LODs a pg/mL (Vedi tabella 1) e può essere ulteriormente migliorata ottimizzando le condizioni di saggio. Colocalizzazione di reagenti facilita l'uso di coppie di anticorpo multiple su una singola diapositiva senza reattività crociata e consente l'ottimizzazione di ogni coppia indipendentemente con nessuna interferenza su altre coppie12. Questi risultati indicano che quel chip di snap è una tecnologia scalabile che può essere utilizzata per la quantificazione della proteina multiplex.

Figure 1
Figura 1. Schema della procedura di dosaggio singolo (a) e (b) il doppio trasferimento metodi a confronto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Schematica che mostra le differenze tra singolo e doppio-trasferimento. (a) il mirroring dei reagenti trasferimento amplifica il disallineamento angolare tra il vetrino e la fase XY a getto d'inchiostro. (b) doppio-trasferimento metodo sormonta il disallineamento angolare. Adattato da riferimento 14 con permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3. Foto dell'apparato snap. (a) dispositivo aperto. (b) dispositivo chiuso. (c) vista di prospettiva del dispositivo. Brevemente, (i) trasferire diapositive sono posizionati nel porta-diapositive e spinto contro i perni di allineamento utilizzando il pogopin montato su stantuffi. (ii) le diapositive di dosaggio sono poste sulla parte superiore del pogopins e spinto contro i perni di allineamento utilizzando un secondo set di pistoni. (iii) il guscio superiore è posizionato sulla parte superiore del supporto per diapositive e inserito nella gabbia. Viene applicata una pressione utilizzando la scheda di chiusura per comprimere la pogopin e riunire le diapositive. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4. Transfer collettivi dei punti utilizzando un chip di snap. Analisi di fluorescenza utilizzando 532 nm e 633 nm laser per dimostrare il trasferimento degli anticorpi in un (a) nitrocellulosa diapositiva (adattato da riferimento 14 con autorizzazione) e (b) far scorrere il vetro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5. Immagine di fluorescenza di una diapositiva di dosaggio e le curve standard di 50 proteine misurata in parallelo utilizzando il metodo di trasferimento doppia. (a) immagine di fluorescenza di un vetrino di saggio per la generazione di una curva standard. (b) Close-up di una matrice. Barra della scala = 2 mm. curve (c) Standard per 50 proteine. Barre di errore sono stati calcolati come deviazioni standard da tre esperimenti indipendenti. Adattato da riferimento 14 con permesso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nome della proteina A partire di concentrazione (ng/ml) LOD (pg/ml) Nome della proteina A partire di concentrazione (ng/ml) LOD (pg/ml)
ANG2 500 1,3 × 104 IL-6b 1 2,1 × 102
BDNF 500 1,0 × 102 IL-5 50 77 CA 15-3 * 1 4.9 × 103 IL-4 1000 1,5 × 104 CEA 1000 5,4 × 103 -2 50 76 CXCL10/IP-10 50 1,7 × 102 LEP 200 4.0 × 102 CRP 200 44 MIG 500 11 × 102 ENG 1000 6,2 × 102 CCL3/MIP-1 Α 50 3.3 FEG 50 1.8 × 102 CCL4/MIP-1 Β 50 12 EGFR 200 1,9 × 102 MMP-3 500 1,0 × 102 FAS-L 500 4,5 × 102 M-CSF 500 8.2 × 103 FGF 500 1,0 × 103 MMP-9 200 3.1 × 102 G-CSF 500 39 CCL2/MCP-1 50 55 GM-CSF 50 3.8 NCAM-1 500 1,7 × 103 GRO-Α 50 3.0 × 102 Β-NGF 200 1,4 × 103 HER2 500 3,5 × 103 NT-3 200 5,8 × 102 PDGF-BB 200 73 OPN 500 1,9 × 103 IL-1 Β 500 7.9 × 102 RBP4 200 1.2 × 102 IL-1ra 200 1,1 × 103 SPARC 1000 4,6 × 104 IL-15 50 8.2 × 102 TNF-Α 50 4.4 IL-12 1 30 TNF-RI 50 1,3 × 102 IL-11 500 1.2 × 103 TNF-RII 50 12 IL-10 500 6,1 × 102 FAS/TNFRSF6 200 2,8 × 102 IL-8 50 6.6 uPA 200 24 IL-7 2.5 26 uPAR(CD87) 200 76 IL-6un 1000 84 VEGF 200 6.7 × 102

Tabella 1. Concentrazioni di proteina e LODs nel buffer del dosaggio di 50-plex. Il LOD per CA 15-3 è in U/ml (*). Adattato da riferimento 14 con permesso.

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Discussion

In questo lavoro, abbiamo presentato una tecnologia di chip di snap che rende i test immunologici cross-reactivity-gratis multiplex ampiamente disponibili per i ricercatori con base messa a punto sperimentale. Diverso da microarrays dell'anticorpo esistente, nessun spotter microarray è necessaria per gli utenti finali. Sono dimostrati sia singola che doppia i metodi di trasferimento, e raddoppiare il transfer offre una precisione di allineamento superiore verso il basso per ~ 40 μm per macchie di 98%, con il più grande cattivo allineamento di 63 µm14. Un apparato di romanzo snap è stato sviluppato per scattare comodamente le due diapositive con una pressione costante, rendendo questa tecnologia accessibile ai ricercatori. Trasferimento affidabile reagente è realizzato non solo sulle diapositive rivestite con nitrocellulosa, ma anche sulle lastre di vetro normale, espandendo significativamente l'applicazione di questa tecnologia senza la necessità di una formazione completa. Per dimostrare l'utilizzabilità del chip snap, un immunoassay 50-plex è stata condotta utilizzando diapositive pre-macchiati e memorizzati, e 70% delle proteine ha raggiunto LODs nella gamma di pg/mL14. Rispetto ai test immunologici multiplex esistenti che applicano un tocchi come una miscela, un importante vantaggio di ACM e la tecnologia del chip di snap è che le analisi su un chip sono indipendenti tra loro, consentendo in tal modo aggiungendo o rimuovendo qualsiasi coppia di anticorpo senza interferire con eventuali altre coppie. Decine o centinaia di proteine possono essere misurati simultaneamente con un chip di snap, accorciando così il tempo di dosaggio rispetto ad altri metodi come la misurazione seriale automatizzata tramite incubazione sequenziale che richiede applicazione seriale di ogni anticorpo 17. Solo sub-nanolitro di ogni anticorpo è necessaria per la fabbricazione di chip di snap, che lo rende più economico convenzionale immunoassays.

Le concentrazioni di anticorpi utilizzate e le fasi di incubazione di antigene sono fondamentali per raggiungere alta sensibilità. Nella fabbricazione dei chip snap, concentrazione di anticorpi può essere ottimizzato in funzione dell'affinità delle coppie di anticorpo e i tipi delle diapositive assay (nitrocellulosa o non-nitrocellulosa). I volumi di ogni spot di anticorpo possono essere regolati sulla base della capacità di ricognizione e la precisione di allineamento e la spaziatura da centro a centro tra le macchie possa essere cambiata di conseguenza. Dopo aver trasferito i taxi il vetrino di saggio, abbiamo incubato il vetrino di saggio a temperatura ambiente per incubazione Overnight h. 1 a 4 ° C potrebbe dare la migliore capacità di legame dell'anticorpo. BSA stabilizzatore gratuito soluzioni (vedere la tabella dei materiali) sono stati utilizzati qui per bloccare il vetrino di saggio dopo incubazione cabine. Altri reagenti blocchi come latte o siero animale possono funzionare anche per questa applicazione.

Nei immunoassays multiplex, protocolli per le diapositive non nitrocellulosa con diversa composizione chimica superficiale possono essere sviluppati e ottimizzati. Un fattore di diluizione differente può essere utilizzato per fare curve standard a seconda delle proteine bersaglio. Fluorofori diversi possono essere utilizzato per etichettare i tocchi e la diapositiva possa essere analizzata utilizzando un laser alla lunghezza d'onda diversa per la raccolta di segnale.

Attualmente, una densità di 625 punti/cm2 è stata realizzata con transfer a doppio metodo14. Per migliorare ulteriormente la capacità di multiplexing del chip snap, sono disponibili diverse strategie. In primo luogo, i volumi più piccoli possono essere utilizzati per ridurre le dimensioni delle macchie, consentendo in tal modo minore centro--centro distanza tra punti e matrice maggiore densità. In secondo luogo, si può scegliere una diapositiva di trasferimento con una superficie più idrofobica per ridurre la dimensione dello spot. In terzo luogo, si potrebbe ottenere migliore allineamento tra i due microarray eseguendo la regolazione fine del cercatore a getto d'inchiostro, e ulteriormente l'ottimizzazione dei parametri spotting come la distanza tra gli ugelli e la superficie di scorrimento.

Per quanto riguarda tutti i test immunologici basati su anticorpi, le prestazioni del dosaggio immunologico chip snap sono soggetta a disponibilità e qualità degli anticorpi. Il chip di snap opera utilizzando un formato di dosaggio del panino, che è il formato più ampiamente usati test in ELISA a causa dell'elevata sensibilità e specificità offerto dall'associazione dual, sequenza di un paio di anticorpi differenti epitopi di targeting, ma è dipenda la disponibilità di un paio di anticorpi compatibili necessari per l'acquisizione e la rilevazione della proteina bersaglio.

Il valore della tecnologia chip snap viene stabilito per test immunologici, e si prevede che può essere utilizzato per eventuali reazioni chimiche e biochimiche che richiedono l'applicazione dei reagenti differenti senza cross-contaminazioni18,19 , 20 , 21 , 22. in realtà, il chip snap fornisce una soluzione generale per la fornitura di vari reagenti pre-macchiati da microarray di microarray, dissociazione così la fabbricazione di chip con la procedura del dosaggio e di conseguenza consente di affrontare il " l'interfaccia macro al micro"sfida23. Ad esempio, il chip di snap è stato utilizzato per un'analisi di inibizione dell'enzima omogeneo di 4-plex per analizzare 128 condizioni con tempi precisi e risultati comparabili a esperimenti di grande volume14. È stato applicato anche per la colorazione del tessuto "multiplex". Inoltre, può contribuire a applicazioni per testare migliaia di sostanze chimiche su diversi tipi di batteri o cellule, per singola cella analisi21,24, o per diverse condizioni di prova in prodotto chimico singolo o multi-step di screening di stupefacenti reazioni.

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Disclosures

McGill University ha presentato una domanda di brevetto su alcuni aspetti di questo lavoro con Huiyan Li e David Juncker come inventori.

Acknowledgments

Ringraziamo il Dr. Rob Sladek per l'uso del cercatore a getto d'inchiostro. Riconosciamo il supporto finale da istituti canadesi per Health Research (CIHR), scienza naturale e ingegneria ricerca Consiglio del Canada (NSERC), l'Istituto di ricerca di società cancri canadese e la Fondazione canadese per l'innovazione (CFI). D.J. grazie sostegno da un Canada Research Chair.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline tablet Fisher Scientific 5246501EA
Streptavidin-conjugated Cy5 Rockland s000-06
Tween-20 Sigma-Aldrich p1379
Bovine serum albumin Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc 001-000-162
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Blocking solution: BSA-free StabilGuard Choice Microarray Stabilizer SurModics, Inc SG02
Nitrocellulose coated slides Grace Bio-Laboratories, Inc 305116
Aminosilane coated slides Schott North America 1064875
Snap Device Parallex BioAssays Inc. PBA-SD01
Inkjet microarray spotter GeSiM Nanoplotter 2.0
Slide module gasket Grace Bio-Laboratories, Inc 204862
Humidity Stabilization Beads Parallex BioAssays Inc. PBA-HU60
Array-Pro Analyzer software Media Cybernetics Version 4.5
Fluorescence microarray scanner Agilent SureScan Microarray Scanner
Biostatistics software GraphPad Software GraphPad Prism 6
Endoglin capture antibody R&D Systems MAB10972
Endoglin protein R&D Systems 1097-EN
Endoglin detection antibody R&D Systems BAF1097
IL-6a (see Table 1) R&D Systems
IL-6b (see Table 1) Invitrogen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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