Techniek van minimaal invasieve dwarse aorta vernauwing in muizen voor inductie van links ventriculaire hypertrofie

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Het doel van dit protocol is te beschrijven stap voor stap de techniek van minimaal invasieve dwarse aorta vernauwing (TAC) in muizen. Door eliminatie van intubatie en ventilatie die verplicht is voor de gebruikte standaardprocedure zijn, minimaal invasieve TAC vereenvoudigt de operatieve procedure en vermindert de stam het dier op te zetten.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tavakoli, R., Nemska, S., Jamshidi, P., Gassmann, M., Frossard, N. Technique of Minimally Invasive Transverse Aortic Constriction in Mice for Induction of Left Ventricular Hypertrophy. J. Vis. Exp. (127), e56231, doi:10.3791/56231 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Transversale aorta vernauwing (TAC) in muizen is een van de meest gebruikte chirurgische technieken voor experimentele onderzoek van druk overbelasting-geïnduceerde ventriculaire hypertrofie (LVH) en de progressie van links naar hartfalen. Deze procedure is in het merendeel van de gerapporteerde onderzoeken uitgevoerd met intubatie en ventilatie van het dier dat maakt het veeleisende en tijdrovende en draagt bij aan de chirurgische lasten aan het dier. Het doel van dit protocol is voor het beschrijven van een vereenvoudigde methode van minimaal invasieve TAC zonder intubatie en ventilatie van muizen. Kritische stappen van de techniek worden benadrukt met het oog op lage sterfte en hoog rendement in inducerende LVH.

Mannelijke C57BL/6 muizen (10-week-oude, 25 à 30 g, n = 60) werden verdoofd met een enkele intraperitoneale injectie van een mengsel van ketamine en xylazine. In een spontaan ademhaling dier na een 3-4 mm bovenste gedeeltelijke sternotomy, een segment van 6/0 zijde hechtdraad schroefdraad door het oog van een afbinding steun werd aangenomen onder de aortaboog en gebonden over een afgestompte 27-gauge naald. Sham bediende dieren onderging de dezelfde chirurgische voorbereiding maar zonder vernauwing van de aorta. De doeltreffendheid van de procedure in het inducerende LVH wordt getuigd door een aanzienlijke toename van het hart/lichaam / gewichtsverhouding. Deze verhouding wordt verkregen dagen 3, 7, 14 en 28 na chirurgie (n = 6-10 in elke groep en elk tijdstip). Met behulp van onze techniek wordt LVH waargenomen in TAC t.o.v. sham dieren vanaf dag 7 tot dag 28. Operatieve en late (meer dan 28 dagen) sterfte zijn beide zeer laag op 1,7%.

Kortom, onze kosteneffectieve techniek van minimaal invasieve TAC in muizen draagt zeer lage operatieve en post-operatieve sterfte en is zeer efficiënt in het inducerende LVH. Het vereenvoudigt de operatieve procedure en vermindert de stam het dier op te zetten. Het kan gemakkelijk worden uitgevoerd door de kritische stappen in dit protocol.

Introduction

In het afgelopen jaar, de studie van hartfalen is uitgevoerd in levensvatbare diermodellen1. Vergeleken met grote dierlijke modellen van hartverlamming, hebben kleine dierlijke modellen talrijke potentiële voordelen. Naast lagere kosten van huisvesting en onderhoud zijn kleine dierlijke modellen toegankelijk voor meer onderzoekers als gevolg van de minder complex faciliteiten die nodig zijn2.

Hartfalen Muismodellen biedt veel van dezelfde voordelen als de rat-modellen. Bovendien tot verminderde huisvesting kost3, Muismodellen profiteren van de beschikbaarheid van relevante transgene en knockoutstadia (KO) stammen. De mogelijkheid van cel type-specifieke, afleidbare KO of transgene strategieën maken de muis een waardevol instrument te bestuderen van de pathogenese van hartfalen en te proberen vast te stellen nieuwe therapeutische regimes3.

Onder de muis modellen van hartfalen gebruikt momenteel4, dwarse aorta vernauwing (TAC) die voor het eerst door Rockman5 beschreven werd is het aangewezen model voor het genereren van druk overbelasting-geïnduceerde links ventriculaire hypertrofie (LVH)1 , 3. het grootste voordeel van dit model is de mogelijkheid tot stratificatie van LVH2, hoewel links ventriculaire remodelleren in reactie op TAC is variabel tussen verschillende muis stammen. In het bijzonder, ontwikkelen C57BL/6 muizen snelle LV dilatatie na TAC, die niet met andere stammen4,6,7kan optreden.

Het plotselinge begin van hypertensie bereikt met TAC oorzaken een ongeveer 50% toename in LV massa binnen 2 weken, waardoor snel onderzoeken de activiteit van farmacologische of moleculaire interventies die gericht zijn op de ontwikkeling van LVH4modulerende. De acute inductie van ernstige hypertensie door TAC niet precies het reproduceren van de progressieve links ventriculaire hypertrofie en remodelleren waargenomen in de klinische setting van aorta stenose of arteriële hypertensie. Dit model wordt echter gebruikt door veel onderzoekers te identificeren en aanpassen van nieuwe therapeutische doelen in hartfalen4.

Uitvoeren van TAC in muizen vereist meer chirurgische expertise die nodig is voor andere technieken die worden gebruikt voor het opwekken van LVH en latere hartfalen2. De meeste auteurs uitvoeren deze procedure door intubating en ventileren van de dierlijke2,8, waardoor deze procedure meer veeleisende en tijdrovende en wordt toegevoegd aan de chirurgische lasten voor het dier. Alleen enkele onderzoekers hebben minimaal invasieve TAC gebruikt in hun studie met korte verwijzing naar de chirurgische ingreep9,10,11.

Het doel van dit protocol is te beschrijven stap voor stap een vereenvoudigde en gebruikersvriendelijke techniek van minimaal invasieve dwarse vernauwing van de aorta in muizen, markeren de kritieke fasen van de procedure. Door de volgende belangrijke stappen, kunt een gemakkelijk deze techniek uitvoeren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

mannelijke C57BL/6J muizen (10 weken, 25 à 30g, n = 60) in dit protocol worden gebruikt. Dieren een humane behandeling met inachtneming van de richtsnoeren geformuleerd door het Franse Ministerie van landbouw en van hoger onderwijs en onderzoek, en alle procedures worden uitgevoerd overeenkomstig de Europese richtlijn van de Raad van de Gemeenschap van 24 November 1986 () 86/609/EEG) en de Franse wetten. Het protocol is goedgekeurd door de " regionale ethische commissie voor dier experimenten CREMEAS " (#2016092816207606).

1. voorbereiding op de operatie

  1. de muizen gedurende een week na aankomst in het dier faciliteit op een 12/12 uur licht/donker cyclus, in standaard kooien, met voedsel (voor details zie de tabel van materialen) en water beschikbaar ad libitum.
  2. Op de dag van de operatie, plaats de muizen in afzonderlijke kooien een paar minuten vóór de inductie van de anesthesie, teneinde eventuele extra stress bij het dier. Alle chirurgische instrumenten de dag voor de operatie steriliseren.
  3. Tijdens peritoneally injecteren van een enkelvoudige dosis van een mengsel van ketamine (51.4 mg/kg) en xylazine (3,3 mg/kg) verdund in een zoutoplossing (0,9% NaCl).
  4. Zorg ervoor dat van de diepte van de narcose door het ontbreken van de teen-retraite reflex.
  5. Scheren van de nek en borst van het dier met een commercieel beschikbare scheermes en desinfecteren van de geschoren zone met 70% alcohol.
  6. Het dier op een schone kurk werken pad liggende plaatsen en de poten vast met plakband.

2. Chirurgie

  1. steriele chirurgische techniek wordt gebruikt in de procedures. In een spontaan ademhaling dier, uitvoeren van een longitudinaal middellijn cervicale snede meer dan 10 mm met een 11-mes van supra-sternale inkeping naar de mid borst om bloot het borstbeen ( Figuur 1).
  2. Intrekken van de schildklier door het passeren van een 4/0 monofilamenten polypropyleen verblijf hechtdraad met een Crile-hout naald houder en tape aan de werkende pad.
  3. Scheiden botweg de vooraf tracheale spieren met een micro-chirurgische Tang te ontdekken van de luchtpijp.
  4. Dia voorzichtig de gladde-tipped micro-chirurgische pincet met de gesloten kaken gebogen over de luchtpijp en achter het borstbeen.
  5. Door zorgvuldig openen en sluiten van de kaken van de gladde-tipped gebogen microchirurgische verlostang verrichten een botte dissectie onder de vooraf tracheale spieren en achter het borstbeen tot het borstvlies opzijschuiven.
  6. Begrijpen de juiste supra-clavicular spieren met de gladde-tipped rechtstreeks micro-chirurgische Tang en trek voorzichtig de borst van het dier.
  7. Schuif de inferieure kaak van het bot nipper onder het borstbeen en het uitvoeren van een 3-4 mm bovenste gedeeltelijke sternotomy ( Figuur 2). Het onderste deel van de mini-sternotomy iets naar links direct.
  8. Passeren een 7/0 monofilamenten polypropyleen verblijf hechtdraad van binnen naar buiten de tweede intercostale ruimte aan elke kant van de mini-sternotomy met behulp van een micro-chirurgische naald houder. Blijf dicht bij costo-sternale hoek om te voorkomen dat schade aan intercostale en interne thoracale vaartuigen of borstvlies.
  9. Verspreid de sternale randen met behulp van 7/0 monofilamenten polypropyleen verblijf hechtingen aan elke kant en pas deze aan naar het pad van het werken met plakband.
  10. Voorzichtig opzij verplaatsen de vooraf tracheale spieren, mediastinale vet en zwezerik met behulp van gladde-tipped gebogen microchirurgische pincet om te visualiseren de aortaboog onder spaarstand vergroting (2-3 X) ( Figuur 3). Bepaalde zorg niet te raken of beschadigen van de pariëtale pleura om te voorkomen dat de ontwikkeling van de pneumothorax.
  11. Bloot van het zachte weefsel onder de aortaboog door koppelverkoop pincet ( Figuur 4 A) en spreid voorzichtig haar kaken. Bereiden van een tunnel in het zachte weefsel onder de aortaboog met een tweede gelijkmakende Tang door voorzichtig openen en sluiten van de kaken in de weke.
  12. Geven een segment van 6/0 zijde ligatuur schroefdraad door het oog van een afbinding hulp ( Figuur 4 B) gehouden in de linkerhand onder de aortaboog en het op te halen door koppelverkoop pincet gehouden in de rechterhand tussen de oorsprong van de juiste innominate en linker gemeenschappelijk halsslagaderen ( Figuur 5).
  13. Knippen van een 27-gauge naald tot een lengte van 5 mm en botte beide uiteinden door hen met een Crile naald houder. De afgestompte 27-gauge naald naast de aortaboog ( Figuur 6) met een gladde-tipped rechtstreeks micro-chirurgische Tang en binden van de hechtdraad gezellig rond de naald en de aorta tussen de juiste innominate en linker gemeenschappelijke halsslagader slagaders met behulp van de twee gelijkmakende verlostang ( Figuur 7). Uitvoeren om te binden zonder speling de hechtdraad, een eerste dubbele knoop gevolgd door vier extra knopen. Ervoor te zorgen dat alle knopen plat zijn.
  14. Na afbinding, Verwijder snel maar voorzichtig de naald te bereiken een 0,4 mm diameter vernauwing en een reproduceerbare dwarse 65-70% aorta vernauwing.
  15. Controleren voor hemostase van het zachte weefsel rond de aortaboog, de sternale randen en vooraf tracheale spieren. Resorbeerbare hemostatische gaas zetten waar lekt bloed wordt waargenomen. Verwijder de 7/0 monofilamenten polypropyleen blijven hechtingen gebruikt voor het verspreiden van de sternale randen.
  16. Geven een eenvoudige 6/0 monofilamenten polypropyleen hechtdraad met de houder van een micro-chirurgische naald van buiten aan binnenkant van de linker tweede intercostale ruimte en vervolgens van binnen naar buiten de juiste tweede intercostale ruimte. Blijf dicht bij costo-sternale hoek om te voorkomen dat schade aan intercostale en interne thoracale vaartuigen of borstvlies.
  17. Brengen samen de sternale randen door 6/0 polypropyleen monofilament hechtdraad koppelverkoop met een Crile-hout naald houder.
  18. Sluit de huid met een 5/0 monofilamenten polypropyleen hechtdraad uitgevoerd in één laag met een Crile-hout naald houder.
  19. Voeren de sham procedure identiek aan de operatie van de vernauwing, maar zonder een hechtdraad rond de aorta koppelverkoop.

3. Post-operatieve herstel

  1. de dieren nauwlettend. overdracht van de muis naar een individuele kooi en breng dit in een liggend.
  2. Toestaan de muis te herstellen onder een opwarming van de aarde licht tot volledig wakker (minder dan 1 uur na de verdoving inducerende).
  3. Voor postoperatieve Analgesie, injecteren 0,1 mg/kg van buprenorfine intraperitoneally. Herhaal subcutane injecties van 0,1 mg/kg van buprenorfine elke 8 h voor de eerste drie dagen zoals aangegeven.
  4. Plaats van de bediende muizen in standaard kooien (maximaal 3 muizen per korf) en minimum 2 muizen per kooi.

4. Hart van oogst

  1. op de dag van analyse, euthanaseren de muis met een oplossing van ketamine 300 mg/kg en xylazine 20 mg/kg in een zoutoplossing door intraperitoneale injectie.
  2. Eerste oogst het bloed van de vena cava inferior en vervolgens via dezelfde lijn injecteren 5 mL van oplossing van 2.6 mM EDTA in een zoutoplossing.
  3. Oogst van het hart, het verwijderen van de atria en het gewicht van het hart (linker en rechter ventrikel zonder atria).
  4. Scheiden links van de juiste ventricle met het septum resterende naar het linkerventrikel deel. Wegen beide weefselsteekproeven en bevriezen ze in vloeibare stikstof.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Voortbestaan van de operatieve en laat
De operatieve overleven was zeer hoog, 98,3% (59 van 60) voor de hele reeks (TAC en sham bediende dieren). De alleen operatieve dood was te wijten aan een bloeding complicatie in een muis geschaafd voor sham werking. Post-operatieve overleven tijdens de observatieperiode van 28 dagen was ook uitstekend, door 98,3% (58 van 59). Alleen late overlijden postoperatieve in een TAC-muis op dag (D) 16, eventueel van cardiale oorsprong.

Validatie van de techniek
De gepresenteerde techniek is zeer betrouwbaar en reproduceerbaar. De juiste plaatsing van de hechtdraad tussen de juiste innominate en linker gemeenschappelijk halsslagaderen werd bevestigd tijdens weefsel oogst in alle dieren ondergaan TAC.

De werkzaamheid van de techniek voor het opwekken van de linker ventriculaire hypertrofie werd gevalideerd door bepaling van hart gewicht/body gewicht ratio's (HW/BW, mg/g) 3, 7, 14 en 28 dagen na chirurgie. De HW is het gewicht van de ventrikels van het linker- en zonder atria. De verhouding tussen de HW/BW aanzienlijk verhoogd in het gestreepte in vergelijking met de sham-groepen van post-operatieve D7 (4.9±0.2 versus 4.1±0.05 mg/g, P < 0,01) op, en bleef aanzienlijk hoger tot D28 (5.8±0.3 versus 4.1±0.1 mg/g, P < 0.0001) na operatie (Figuur 8). De waargenomen stijging in HW/BW verhouding was uitsluitend een stijging van de linker hartkamer/lichaam / gewichtsverhouding (Figuur 9A) sinds de rechter ventrikel/lichaam-gewichtsverhouding bleef vergelijkbaar tussen TAC en sham bediende dieren tijdens de hele waarneming periode (Figuur 9B).

Verder, we gemeten in het linkerventrikel weefsel de mRNA uitdrukking van de biomarkers voor hypertrofie van het hart als eerder beschreven12. Bij D14, mRNA uitdrukking van hersenen natriuretic eiwit (BNP), atriale natriuretic eiwit (ANP), angiotensine converting enzym (ACE), collageen 1a1 (Col1a1) en transformeren groeifactor ß (TGFß) was significant hoger in de aorta-banded in vergelijking met Sham bediende dieren (Figuur 10). Vandaar, de waargenomen links ventriculaire hypertrofie valideert de efficiëntie van onze TAC-techniek.

Gemiddelde en standaardafwijking van het gemiddelde waarden werden vergeleken tussen TAC en sham groepen met one-way ANOVA gevolgd door Bonferroni van post-hoc test voor vergelijking van de gekoppelde gegevens.

Figure 1
Figuur 1 : Insnijding.
De huid is meer dan 10 mm van supra-sternale inkeping tot halverwege borstbeen ingesneden en de schildklier met een hechtdraad verblijf wordt teruggetrokken. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Bone nipper.
Dit instrument kan een kort en precies knippen in het bot voor een 3-4 mm bovenste gedeeltelijke superieure mini-sternotomy. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : Blootstelling.
Na intrekking van de sternale randen met 7/0 blijven hechtingen, de aortaboog, rechts innominate en linker gemeenschappelijk halsslagaderen samen met de luchtpijp worden blootgesteld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : A. Tying pincet. Deze pincet zijn nodig voor het uitvoeren van een zachte en botte dissectie achter het borstbeen en rond de aortaboog. B. steun van de afbinding. Dit is het belangrijkste instrument voor het realiseren van een delicate en atraumatische doorgang onder de aortaboog zowel in TAC en sham bediende muizen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5 : Passage onder de aorta arch.
Een segment van 6/0 zijde ligatuur is doorgegeven onder de aortaboog met behulp van de afbinding steun en tussen de juiste innominate en linker gemeenschappelijk halsslagaderen geplaatst. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6 : Voorbereiding van de afbinding.
Een korte segment 2-3 mm van een afgestompte 27-gauge-naald wordt geplaatst over de aortaboog. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7 : Transverse aorta vernauwing.
De zijde hechtdraad is gekoppeld via de naald en de aortaboog tussen de juiste innominate en linker gemeenschappelijk halsslagaderen gelijkmakende pincet gebruiken. De silk in plaats van polypropyleen hechtdraad is de voorkeur voor de aorta afbinding omdat de knoop zal beter houden. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8 : Validatie van transversale aorta vernauwing.
De inductie van hypertrofie van het hart door onze minimaal invasieve dwarse aorta vernauwing blijkt uit de aanzienlijke toename van hart gewicht/lichaam / gewichtsverhouding in gestreepte (zwarte balken) ten opzichte van sham bediend (witte balken) muizen. De hypertrofie van het hart is al aanwezig op D7 na de operatie en verhoogt geleidelijk na verloop van tijd tot D28 (n = 6-10 per fractie. ** P < 0,01, *** P < 0.001, *** P < 0.0001). Gegevens worden gepresenteerd zoals bedoel ± SEM (foutbalken). Pleidooise Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding.

Figure 9
Figuur 9 : Links (A) en (B) ventrikel rechts / lichaam / gewichtsverhouding.
Tijdens de observatieperiode verhoogt de linker ventrikel/lichaam / gewichtsverhouding terwijl de rechter ventrikel/body gewichtsverhouding qua TAC (zwarte balken blijft) in vergelijking met sham bediende (witte balken) dieren. Dit linker ventriculaire hypertrofie ongewijzigd in het rechterventrikel bevestigt en versterkt de validatie van onze techniek (n = 6-10 per fractie. ** P < 0,01, *** P < 0.001, *** P < 0.0001). Gegevens worden gepresenteerd zoals bedoel ± SEM (foutbalken). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 10
Figuur 10 : BNP-mRNA uitdrukking.
mRNA uitdrukking van hersenen natriuretic eiwit (BNP), atriale natriuretic eiwit (ANP), angiotensine converting enzym (ACE), collageen 1a1 (Col1a1) en transformeert groeifactor ß (TGFß), positieve controles voor hypertrofie van het hart in de aorta-banded (zwarte balk) VS sham dieren (witte balk) (n = 6 per groep) op D14. Expressie wordt berekend als de 2(-ΔCt) waar de kalibrator is het niveau van de mRNA van het gen Gapdh referentie. Gegevens worden gepresenteerd zoals bedoel ± SEM (foutbalken). * P < 0,05, ** P < 0,01, *P < 0.001 ten opzichte van sham groep (t-test). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het doel van dit protocol is te presenteren van een stap voor stap illustratie van de chirurgische techniek voor minimaal invasieve dwarse aorta vernauwing in muizen. Gedetailleerde technische beschrijving van transversale aorta vernauwing in muizen is gemeld door andere auteurs2,8. Echter, deze onderzoekers chirurgie uitvoeren na intubatie en ventilatie van dieren. Het gebruik van een extra stap van intubatie-ventilatie vergroot de complexiteit en de duur van de hele procedure en de wereldwijde stress het dier is blootgesteld aan. Om deze redenen heeft het concept van minimaal invasieve dwarse aorta vernauwing sommige aandacht gekregen. De minimaal invasieve dwarse aorta vernauwing in muizen wordt gebruikt voor het opwekken van de linker ventriculaire hypertrofie en de progressie naar hartfalen9,10,11. Deze studies richten op de trajecten die betrokken zijn bij het ontstaan van de linker ventriculaire hypertrofie en hartfalen, maar niet op de beschrijving van de operatietechniek9,10,11.

In dit protocol rapporteren we in details een vereenvoudigde en reproduceerbare techniek van minimaal invasieve TAC in muizen. Een bekwame chirurg kunt doen de operatie van de vernauwing in 20 minuten en de werking van de sham (zonder hechtdraad koppelverkoop) in 15 minuten. Tijdens onze eerste technische bewijs vonden we dat de invoering van een belangrijk instrument, de afbinding steun, een zeer lage operatieve sterfte van 1,7% toegestaan. Dit steekt gunstig tot operatieve sterfte van 4% gemeld door Rockman et. al. 5, van 3,7% door Liao et al. 13 en van 2,7% door Stansfield et al14. Naar aanleiding van, de observatieperiode van 28 dagen, ook toont een zeer lage late postoperatieve sterfte van 1,7%. Nogmaals, dit vergelijkt goed tot de late sterfte gemeld door Rockman et al (10%)5, Liao et al (19%)13 of Stansfield et al (2,6%),14.

De passage onder de aortaboog is de meest cruciale stap voor de hele procedure. De reproduceerbaarheid van deze stap werd niet beschreven door Hu en collega's die een zelfgemaakte draad met een strik aan haar einde gebruikt geschiedde onder de aorta tussen de oorsprong van de juiste innominate en linker gemeenschappelijk halsslagaderen9, noch door Tarnavski die geplaatst de gebogen pincet van de mediale kant onder de oplopende aorta te vangen van de zijde van 7/0 hechtdraad aan de overkant en verplaats het onder de aorta2. De steun van de afbinding gebruikt in onze techniek kan een gestandaardiseerde en reproduceerbare manoeuvre met laag risico van aorta scheur.

Een andere doorslaggevende stap van de procedure is de spanning toegepast op de band over de 27-gauge naald om efficiënt en homogeen het lumen van de aortaboog. Ten eerste, we gebruiken gelijkmakende pincet, waarmee de toepassing van een uniform en reproduceerbare spanning op het hechtdraad rond de aortaboog. De juiste plaatsing van de hechtdraad wordt gecontroleerd tijdens de oogst van het hart en de aortaboog. Gecontroleerd de juiste plaatsing van de band door evaluatie van Doppler-signalen van de halsslagaderen zowel vóór als na de plaatsing van de aorta band11Andersen en collega's. In hun verslag, werd voldoende "banding" geaccepteerd wanneer de verhouding tussen de Doppler snelheid verdubbeld van rechts naar links halsslagaderen11. In onze techniek, kozen we voor het meten van de doelmatigheid van TAC door de mate van geïnduceerde links ventriculaire hypertrofie in gestreepte ten opzichte van sham dieren om te valideren van de procedure, aangezien het niet geïmplementeerde vergt verhoogde duur van de procedure of aanvullende verdoving van de dieren. In onze techniek, de mate van links ventriculaire hypertrofie en passende plaatsing van "banding" worden gecontroleerd aan het einde van het experiment. De mate van links ventriculaire hypertrofie door onze techniek vergeleken gunstig met de resultaten gerapporteerd door andere onderzoekers op 3 weken na TAC in muizen15. Daarnaast verklaart de lage variatie van de verhouding van hart te lichaamsgewicht waargenomen in onze gestreepte dieren de lage wisselingen in de spanning toegepast op de band.

Kortom, door vermijden van intubatie-ventilatie biedt zoals gepresenteerd in dit protocol, onze techniek van minimaal invasieve TAC in muizen een betrouwbare en reproduceerbare model. Dit model vermindert de globale spanning zetten van de dieren en tijd - en kostenbesparende vergeleken met de TAC met behulp van intubatie-ventilatie van dieren. De operatieve en late sterftecijfers van deze procedure zijn zeer laag en maak deze techniek een van de methoden van keuze voor inductie van links ventriculaire hypertrofie in muizen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben geen conflict van belang om te vermelden.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door een subsidie (N ° 32016) van de Zwitserse cardiovasculaire Stichting RT.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Surgical microscope Olympus SZX2-TR30
Razor Rowenta Nomad TN3650FO
Sutures:
Polypropylene 7/0 Ethicon BV-1X
Polypropylene 6/0 BBraun C0862061
Silk 6/0 ligature  FST 18020-60
Polypropylene 4/0 Ethicon 8683
Polypropylene 5/0 Ethicon Z303
Drugs:
Ketamin Merial Imalgène 1000, LBM154AD
Xylazine Bayer Rompun 2%, KP09PPC
Buprenorphine Ceva Vetergesic, 072013
Instruments: 
Bone nippers Fine Surgical Tools 16101-10
Ligation aid Fine Surgical Tools 18062-12
Tying forceps Fine Surgical Tools 18026-10
Needle holder Crile-Wood Fine Surgical Tools 12003-15
Microsurgery forceps  Fine Surgical Tools 11003-12
Microsurgery forceps  Fine Surgical Tools 11002-12
Tissue forceps Fine Surgical Tools 11021-12
Microsurgery needle holder Fine Surgical Tools 12076-12
Microsurgery scissors Fine Surgical Tools 91501-09
Mayo scissors Fine Surgical Tools 14511-15
11-blade knife Fine Surgical Tools 10011-00
RNA extraction and qPCR:
TriReagent Euromedex TR-118-200
Rneasy Mini kit Qiagen 74704
Qubit Fluorimetric RNA assay Fisher Scientific 10034622
RNA 6000 Nano kit Agilent 5067-1511
High Capacity cDNA kit Fisher Scientific 10400745
Taqman Master Mix Fisher Scientific 10157154
Taqman BNP primers Fisher Scientific Mm01255770_g1
Taqman ANP primers Fisher Scientific Mm01255747_g1 
Taqman ACE primers Fisher Scientific Mm00802048_m1
Taqman Col1a1 primers  Fisher Scientific Mm00801666_g1
Taqman TGFb primers Fisher Scientific Mm01178820_m1
Taqman Gapdh primers Fisher Scientific Mm99999915_g1
ABIPrism  Thermocycler Applied Biosystems 7000
Software:
GraphPad Prism GraphPad Prism 7
Animal food
Complete diet for adult rats/mice Safe UB220610R

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Molinari, F., Malara, N., Mollace, V., Rosano, G., Ferraro, E. Animal models of cardiac cachexia. Int. J. Cardiol. 219, (15), 105-110 (2016).
  2. Tarnavski, O. Mouse surgical models in cardiovascular research. Methods. Mol. Biol. 573, 115-137 (2009).
  3. Verma, S. K., Krishnamurthy, P., Kishore, R., et al. Transverse aortic constriction: a model to study heart failure in small animals. Manual of Research Techniques in Cardiovascular Medicine. Ardehali, H. Wiley, J., & Sons. 164-169 (2014).
  4. Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure. Development of novel therapies, past and present. Circ. Heart Fail. 2, (2), 138-144 (2009).
  5. Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, (18), Erratum in: Proc. Natl. Acad. Sci. USA Page 9907 8277-8281 (1991).
  6. Barrick, C. J., Rojas, M., Schoonhoven, R., Smyth, S. S., Threadgill, D. W. Cardiac response to pressure overload in 129S1/SvImJ and C57BL/6J mice: temporal- and background-dependent development of concentric left ventricular hypertrophy. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, (5), 2119-2130 (2007).
  7. Deschepper, C. F., Olson, J. L., Otis, M., Gallo-Payet, N. Characterization of blood pressure and morphological traits in cardiovascular-related organs in 13 different inbred mouse strains. J. Appl. Physiol. 97, (1), 369-376 (2004).
  8. Almeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. T. Transverse aortic constriction in mice. J. Vis. Exp. (38), April 21 (2010).
  9. Hu, P., Zhang, D., Swenson, L., Chakrabarti, G., Abel, E. D., Litwin, S. E. Minimally invasive aortic banding in mice: effects of altered cardiomyocyte insulin signaling during pressure overload. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285, (3), 1261-1269 (2003).
  10. Faerber, G., et al. Induction of heart failure by minimally invasive aortic constriction in mice: Reduced peroxisome proliferator-activated receptor ϒ coactivator levels and mitochondrial dysfunction. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 141, (2), 492-500 (2011).
  11. Andersen, N. M., Tang, R., Li, L., Javan, H., Zhang, X. Q., Selzman, C. H. IKK-β inhibition prevents adaptive left ventricular hypertrophy. J. Surg. Res. 178, (1), 105-109 (2012).
  12. Nemska, S., Monassier, L., Gassmann, M., Frossard, N., Tavakoli, R. Kinetic mRNA profiling in a rat model of left ventricular hypertrophy reveals early expression of chemokines and their receptors. PLoS ONE. 11, (8), 0161273 (2016).
  13. Liao, Y., et al. Echocardiographic assessment of LV hypertrophy and function in aortic-banded mice: necropsy validation. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 282, (5), 1703-1708 (2002).
  14. Stansfield, W. E., et al. Characterization of a model to independently study regression of ventricular hypertrophy. J. Surg. Res. 142, (2), 387-393 (2007).
  15. Beetz, N., et al. Ablation of biglycan attenuates cardiac hypertrophy and fibrosis after left ventricular pressure overload. J. Mol. Cell. Cardiol. 101, December 145-155 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics