Imaging Amyloid vev beiset med selvlysende konjugert Oligothiophenes av hyperspektral AC Confocal mikroskopi og fluorescens levetid bildebehandling

Biochemistry
 

Summary

Amyloid avsettelse er et kjennetegn på ulike sykdommer og rammer mange ulike organer. Dette dokumentet beskriver anvendelsen av selvlysende konjugert oligothiophene fluorescens flekker i kombinasjon med fluorescens mikroskopi teknikker. Denne flekker metoden representerer et kraftig verktøy for deteksjon og utforsking av protein mengdefunksjoner i både kliniske og vitenskapelige oppsett.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Nyström, S., Bäck, M., Nilsson, K. P. R., Hammarström, P. Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging. J. Vis. Exp. (128), e56279, doi:10.3791/56279 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Proteiner som depositum som amyloid i vev i kroppen kan være årsak eller konsekvens av en rekke sykdommer. Blant disse finner vi nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers og Parkinsons sykdom afflicting primært sentralnervesystemet, og systemiske amyloidose der serum amyloid A, transthyretin og IgG lys kjeder innskudd som amyloid i leveren, hakke tunnelen, milt, nyre, hjerte og andre perifere vev. Amyloid har blitt kjent og studert i mer enn et århundre, ofte ved hjelp av amyloid bestemt fargestoffer som Kongo rød og Thioflavin T (ThT) eller Thioflavin (ThS). I dette papiret presentere vi heptamer-formyl tiofen eddiksyre (hFTAA) som et eksempel på nylig utviklet supplementer til disse fargestoffer kalt selvlysende konjugert oligothiophenes (LCOs). hFTAA er enkel å bruke og er kompatibel med co farging i immunofluorescence eller andre cellulære markører. Omfattende forskning har vist at hFTAA oppdager et bredere spekter av sykdom forbundet protein aggregater enn konvensjonelle amyloid fargestoffer. I tillegg kan hFTAA også brukes for optisk tildeling av forskjellige aggregert morphotypes å tillate studier av amyloid fibril polymorfisme. Mens tenkelig metodikken brukt er valgfritt, vi her viser hyperspektral avbildning (hans), skanning AC confocal mikroskopi og fluorescens levetid imaging (FLIM). Disse eksemplene viser noen av Bildeteknikker hvor LCOs kan brukes som verktøy for å få mer detaljert kunnskap om dannelsen og strukturelle egenskapene for amyloids. En viktig begrensning med teknikken er som for alle vanlige optiske mikroskopi teknikker, behovet for mikroskopisk størrelse av aggregater tillate gjenkjenning. Videre, samlet bør omfatte en repeterende β arks struktur å tillate hFTAA binding. Overdreven fiksering og/eller epitope eksponering som endrer samlede strukturen eller konformasjon kan gjengi dårlig hFTAA bindende og dermed utgjør begrensninger nøyaktig bildebehandling.

Introduction

Avsettelse av amyloid i vev er en patologisk kjennetegn i et antall sykdommer som Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, systemisk amyloidose og prionsykdommer. Til tross for utbredelsen av amyloid-relaterte sykdommer, og det faktum at nær 40 ulike proteiner hittil er klassifisert som amyloid forløpere i menneskelig1, er lite kjent om forholdet mellom amyloid avsettelse og sykdom fenotypen. Histology med prøver fra menneskelige pasienter har vært brukes både diagnostiske og vitenskapelige formål. Et stort antall dyremodeller er etablert for å undersøke sammenhengen mellom amyloid byrden og atferd, levetid og en rekke andre fenotypiske lese outs sykdom progresjon2,3. Store arbeidet blir også gjort i stoffet funnet og design for å kjempe mot noen av våre mest fryktede utbredte sykdommer. Men er evalueringen av forbindelsen mellom genotype, fenotype, amyloid plakk belastning og Bedøve Administrasjon ikke rett frem. Verktøy for flekker og tenkelig av amyloid i vev er ofte sløv og gir lav oppløsning informasjon amyloid dannelse og struktur.

Kongo røde birefringence og ThT ThS fluorescens er eksempler på klassisk metoder for oppdager og analyserer amyloid byrden i vevsprøver pasienten biopsier, post mortem prøver og dyr modeller av sykdom4. Disse teknikkene har blitt brukt i flere tiår (Kongo red siden 1920-årene og ThT og derivater siden 1960), og selv om instrumentering har blitt forbedret og gir detaljert analyse, farging prosedyrer og analyse utføres fremdeles på samme måte som nesten et århundre siden.

I dette papir beskriver vi utnyttelsen av en svært følsom romanen amyloid fargestoff, hFTAA5, som tillater påvisning av små umodne protein innskudd med høy nøyaktighet, samt gjenkjenning av eldre amyloid. Sammenlignet med konvensjonelle fargestoffer, har hFTAA vist å oppdage en rekke sykdom forbundet protein aggregater5,6,7. I tillegg kan hFTAA også brukes for optisk tildeling av forskjellige aggregert morphotypes8. Her beskriver vi hFTAA flekker og analyse av etablerte dyremodeller prion sykdom og Amyloid-β forløper Protein (APP) transgene mus designet for å etterligne plakk utvikling i Alzheimers9,10 . Vi viser også analyse av diagnose og post mortem eksempler fra pasienter som lider av systemisk amyloidose. LCOs har iboende egenskaper som gjør dem til å rapportere på conformational forskjeller innenfor en plakett; og ved å kombinere to LCOs med ulike egenskaper om binding og fluorescens, forskjellen er enda mer uttalt11. En epifluorescence mikroskop utstyrt med lange pass filter og hyperspektral kameraet hode brukes til å aktivere objektive klassifisering av spektrale egenskapene og opptak av micrographs for spektral analyse. AC confocal fluorescens mikroskopi med en tunable laser excitation kilde brukes til å evaluere tredimensjonale egenskapene til en amyloid plakk i større detalj. Tunable laser kan samling av eksitasjon spektrum og litt mindre utvalg av utslipp bølgelengder på mikroskopet gjør co imaging LCO fluorescens og immunofluorescence å fastslå co lokalisering av målet protein og amyloid. FLIM tilbyr enestående følsomhet for conformational forskjeller pålagt LCOs og avdekker avvik som ikke blir oppdaget på fluorescens utslipp spectra.

Hovedmålene med metoden beskrevet flekker er å lette følsom påvisning av liten amyloid innskudd og å karakterisere conformational polymorfisme innen amyloid innskudd. Denne kunnskapen er viktig for den grunnleggende forståelsen av protein aggregering sykdommer.

Protocol

Merk: LCO syntese er utført i våre laboratorier i mer enn et tiår. Egentlig bruker protokollene for Elektrofil aromatisk substitusjon, palladium katalysert kryss-kopling, amid kopling og ester hydrolyse, tilpasse vi syntetisk sonder for ulike formål 5 , 12. etter syntese, karakterisering og rensing, LCO produktet er lyofiliserte og oppbevares ved romtemperatur. Noen av sonder (blant dem hFTAA) er nå kommersielt tilgjengelig (se Tabell av materialer).

1. LCO flekk løsning

Merk: Hvis hFTAA er kjøpt fra en kommersiell leverandør, følg leverandøren ' s instruksjoner i stedet for avsnitt 1.

  1. Resuspend den lyofilisert hFTAA i 2 mM NaOH å forberede en lagerløsning 1 mg/ml. Holde aksjer i et hetteglass på 4 ° C. Aksjen kan lagres i ett år.
  2. Ved farging, forberede en fungerende løsning ved å fortynne den lager 1:10,000 i fosfat-bufret saltvann (PBS).

2. Forberedelse av

Merk: mange typer vev kan avbildes bruker hFTAA som en amyloid markør. Se figur 1 for eksempel. hFTAA er følsom for samlet konformasjon. Den flekker bør derfor fortrinnsvis utføres på uforstyrret aggregater med ingen epitope eksponering. Optimal spectral kvalitet oppnås hvis vev fiksering holdes til et minimum. Dermed foretrekkes frisk frosne materiale, forsiktig rettet i etanol ved flekker. Det er imidlertid mulig å oppdage amyloid innskudd også i vev som er løst med f.eks formalin. hFTAA vanligvis trenger vevet godt. Velg prøven tykkelse som er kompatibel med tiltenkt tenkelig teknikk.

  1. Hvis formalin fast, parafinembedded inndelinger brukes, deparafinize i xylen over natten. Dypp delene i påfølgende bad 99% etanol, 70% etanol, dH 2 O og PBS, 10 min i hver. Tillate delene vev tørke under omgivelsesforhold.
    Forsiktig: Xylen håndteres alltid i kjemisk avtrekksvifte. Xylen og andre organiske løsemidler er skadelig.
    1. Tøvær cryosections i romtemperatur. Fikse delene vev i 10% formalin over natten og rehydrate av dyppe dem i påfølgende bad 99% etanol, 70% etanol, dH 2 O og PBS, 10 min i hver. Tillate delene vev tørke under omgivelsesforhold.
  2. Legge dråper av hFTAA arbeider løsningen (ca 200 µL) til delene vev å dekke. Slippverktøyet bør bo på plass av overflatespenningen. Inkuber i 30 min ved romtemperatur til farging.
  3. Skyll av flekker løsningen med 500 µL PBS bruker en pipette og deretter dyppe lysbildet i PBS badekaret for 10 min. Tillat delen tørke under rombetingelser *.
  4. Monteres med fluorescens montering medium. Tillater montering medium å avgjøre natten.
    Merk: hFTAA flekker kan utføres i kombinasjon med andre flekker metoder som immunofluorescence, celle- eller organelle spesifikke indikatorer, etc. For å utføre co flekker, kjøre din komplett fargeprotokoll valgfrihet og legge hFTAA flekker på slutten, fra trinn 2.2. Se figur 2 eksempler. Immunofluorescence, helst velge en sekundær antistoff som er spent på 640 nm eller høyere. I denne bølgelengdeområde, hFTAA absorberer ikke og dermed heller ikke være glade og vil ikke fluoresce. Dette sikrer at ingen gjennomslag er sett mellom hFTAA og antistoff.

3. Mikroskopi

Merk: bruke fluorescens mikroskop utstyrt med lang-pass-filtre. Alle innstillingene nedenfor ble brukt til å generere bilder i Figur 4. Justeringer må gjøres avhengig av amyloid type og vev prøven. Selv om hFTAA bundet til amyloid stabil mot bleking, er det lurt å deaktivere lyskilden når prøven ikke er undersøkt eller fotografert.

  1. Hans
    Merk: eksperimentet ble utført ved hjelp av en epifluorescence mikroskop med lange pass utslipp filtre og kameraet leder for hans (se Tabell for materiale).
    1. Bruk standard fluorescens mikroskop utstyrt med lange pass filter og et hyperspektral kamera. Kontroller at spectral kameraet er kalibrert.
    2. i programvaren navn prosjektet, Velg " spectral bilde " og starte oppkjøpet.
    3. Merke objektet av interesse gjennom okulær bruker 436-nm eksitasjon filteret og skifte lys banen til kameraet.
    4. i the Case Data Manager (CDM), Velg eksempel Spectral, etiketten utvalget, og trykk erverve. Vinduet Kjøp åpnes.
    5. i vinduet Kjøp " Spectral imaging ", åpne innstillingsmenyen, Velg oppkjøpet egenskaper og angi spectral til 460-700, hastighet kvaliteten med maksimal hastighet og målingen skriver på gass/laser/smale filtre. Lukk dialogboksen.
    6. På bilde-menyen, Velg live full. I baren ikoner deaktivere frynser. Velge eller endre størrelsen på et område å bilde med topp minne verdi under 800 MB. Angi eksponeringstid til en verdi som gir en total bildelysstyrke mellom 1000 og 3000. Trykk farget kameraet i baren ikoner. Oppkjøpet vil starte. Når bildeopptak er fullført, trykk på lagre i den " anskaffe spectral bilde " dialogboksen og " nye celle " i dialogboksen saksdata manager.
    7. Fra CDM, åpne samlet bildet med analyse startknappen. Vinduet data analyse åpnes.
    8. Spectral informasjon kan innhentes fra hver piksel i bildet ved å velge ROIs Spectral vise dialogboksen. Velg " angi " og velg ROIs de aktuelle områdene av bildet.
    9. Lagre spectral dataene som en tekstfil ved hjelp av knappen Lib. Lagrede txt-filen kan importeres til analyseprogramvare av valget. Filen .slb kan brukes til analyser innen data analyseprogramvare. Hyperspektral kubedataene fra hele bildet kan også eksporteres som en raw-fil, som " lagene som tif ", eller som " lagene i tekstformat " for data og bilder analyse programmer som bruker ekstern programvare.
  2. AC confocal mikroskopi
    Merk: AC confocal mikroskopet er utstyrt med en tunable laser excitation kilde. For alle fluorescens utslipp eksperimenter, angi laser intensitet 0,2% (tilsvarende en gjennomsnittlig strøm av 3 µW), pinhole 1 luftige enhet, rammestørrelsen til 1024 px x 1,024 px, skannehastighet 7 og gjennomsnitt over 16 skanner og bitdybden som 8-biters (se < s trong > tabell for materiale). Disse innstillingene må justeres for hver individuelle AC confocal system, laser kilde, og eksempler.
    1. For utslipp spekteret, samle dataene med lambda modus og magnetisering bruker argon laser satt til 488 nm. Samle utslipp mellom 503 og 687 nm bruke 22 kanaler på 32 kanal GISP detektoren. Angi forsterkningen til 755.
    2. å oppnå enkeltkanals bilder, bruke smart sette opp alternativ. For FITC (grønn filter), angi forsterkningen til 750 og for Alexa 535 (rød filter) angi forsterkningen til 845.
    3. å samle eksitasjon spekteret med tunable laser, bruke eksitasjon med 1 nm trinn mellom 490 og 545 nm mens samle utslipp mellom 551 og 586 nm. Angi laser intensiteten til 2% (tilsvarende en gjennomsnittlig strøm av 30 µW) og gevinsten til 774.
    4. å samle Z stabel i spektral modus, søke gjennom dybden av delen i trinn 0.96 µm. De samme excitation og utslipp innstillingene i trinn 3.2.1 kan brukes, men angi forsterkningen til 730.
  3. FLIM
    Merk: AC confocal mikroskopet er utstyrt med en FLIM enhet (se Tabell for materiale).
    1. Satt opp følgende parametere for AC confocal mikroskopet: Pinhole, 20, eksitasjon bølgelengde, 490 nm, laser intensitet, 0,5% (tilsvarende en gjennomsnittlig effekt på 7,5 µW). Bruke pulserende lasere på 40 MHz.
    2. I FLIM programvare, definere Foton telle over 550 nm. I vinduet Vis parametere følge Foton telle før Max antallet er rundt 4000 Foton teller.
    3. Lagre filen og eksportere det som SPC.
    4. Passer dataene til en 2-komponent eksponensiell decay i FLIM programvaren. En passform som gir en χ 2 < 2 er bra. Verdien på y-aksen er antall teller gitt levetiden.
    5. Velg en terskel for teller å inkludere, f.eks 100. Fargekode T1 og velg levetid. Forfall er avhengige av amyloid strukturen der hFTAA er bundet. Fluorescens levetid mellom 300 og 1000 ps er observert. Lagre filen.
    6. Eksportere rådata valg for eksport og lagre de ønskede dataene i en ny mappe.

Representative Results

Sensitive og selektiv farging av amyloid innskudd fra et stort antall proteiner i mange ulike vev typer fra både menneskelige pasienter og forsøksdyr er avgjørende for klinisk diagnostikk også i vitenskapelig forskning. Dette papiret, vi viser hvordan dette kan oppnås ved hjelp av LCOs, eksemplifisert ved hFTAA, for farging og flere bildebehandling av amyloid fra et utvalg av vev. Siden den første utgivelsen av tiofen-baserte amyloid ligander over ti år siden13amyloid innskudd består av en rekke proteiner i ulike vev har blitt avbildet med LCOs6,7,11, 14,15,16 (figur 1). I kombinasjon med antistoffer eller andre histologiske markører gir LCOs utmerket verktøy for både diagnostiske og vitenskapelige formål (figur 1a, figur 2). Med et riktig valg av fluorescerende markører, kan flere fluorophores avbildes på samme delen (figur 1a, hFTAA og DAPI, figur 2a hFTAA i immunofluorescence installasjonsprogrammet). Det er også mulig å bruke etterfølgende avsnittene til farging med brightfield og fluorescens (figur 2b, hFTAA og DAB antistoff flekker). HFTAA har nylig vist seg for å være et lovende supplement til Kongo røde flekker i klinisk diagnostikk7,15 (Figur 3).

Utviklingen av Bildeteknikker de siste tiårene har økt behovet av amyloid fargestoffer som kan skille mellom minutt, men på samme tid dyp forskjellene i amyloid innskudd i en kvantitativ måte. Konjugert systemet innen LCO gir det en unik evne til å rapportere på variasjon i modus for bindingen. Vridning av molekylet kan føre til forvrengning i bindingen vinkler i konjugert systemet og hindre transport av elektroner (figur 4a). Dette gjenspeiler i sin tur i LCO både i eksitasjon og utslipp bølgelengde og utslipp levetid fluorescerende egenskaper. Vi bruker hans i en oppreist fluorescens mikroskop utstyrt med lang-pass-filtre for utslipp. For eksitasjon og utslipp spectra AC confocal mikroskopi og FLIM bruker vi en LSM780 med pulsed laser. Du eksemplifiserer ulike teknikker, vi fotografert ett objekt (beta amyloid (Aβ) plakett i en APP transgene mus) (figur 4b--e). Hyperspektral fluorescens spectra (figur 4b) tillater for vurdering av spectral Skift og intensitet variasjoner i forskjellige regioner av plakk. Eksitasjon spektrum i AC confocal mikroskopi (Figur 4 c) kan brukes til å bestemme den optimale eksitasjon bølgelengden for nedstrøms eksperimenter, f.eks, kombinasjon farging med flere fluorophores. Denne metoden kan også være nyttig for påvisning av conformational forskjeller i bindingsmodus av LCO. Utslipp spektrum i AC confocal modus kan brukes til å bestemme egenskapene fluorescens utslipp fra hFTAA eller fra en kombinasjon av flere fluorophores å vurdere colocalization kombinasjon eksperimenter med flere LCOs eller LCO og immunofluorescence kombinasjoner. Fluorescens levetid hFTAA er sterkt påvirket av små variasjoner i bindingsmodus av hFTAA. Derfor er FLIM et kraftig verktøy i forskjellsbehandle forskjellene pålagt hFTAA av bindende målet (Figur 4 d). Dette kan brukes for eksempel til forskjellsbehandling mellom forskjellige prion stammer8. AC confocal imaging og behandling Z-stabler i tredimensjonale bilder er et nyttig verktøy for å utforske den generelle formen på en amyloid aggregasjon (figur 4e). Igjen, bruk av ekstra fluorophores kan hjelpe forstå sammensetningen av et depositum.

Figure 1
Figur 1: ulike vev typer og proteiner aggregatene viser h-FTAA farging av: (en) Mallory-Denk organer består av keratin mengdefunksjoner i en leveren (counterstained med DAPI), (b) p62-positive r Inneslutninger i sporadisk inkludering kroppen myositt (s-IBM) muskelvev, (c) Amyloid av Holme amyloid polypeptid i menneskelig bukspyttkjertelen, (d) Amyloid av immunglobulin lys kjeden i menneskelige tarmen, (e) sauer Skrapesyke (prioner) i mus hjernen, (f ) Kronisk sløse sykdom (prioner) i musen hjernen, (g) Aβ plaketter i APP23 musen hjernen, (h) Aβ patologi APP/PS1 musen hjernen og (jeg) fett biopsi smøres utover fra diagnostiske prøver av transthyretin amyloid i menneskelige pasienter Gradert 1-4 i henhold til standard Kongo rødt (CR) scoring. Gul områder viser hFTAA farget amyloid innskudd og blå er autofluorescence fra fettvev. Bar Skalalengde angis i hvert panel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: eksempler på co farging med antistoffer. (en) co flekker med anti-serum amyloid protein A (AA) immunofluorescence og hFTAA av menneskelig AA amyloid på samme delen. Øverst til venstre: AA antistoff utslipp 640 nm; øvre høyre hFTAA på 488 nm; nedre panelet overlegg bildet viser colocalization i gult. (b) antistoff flekker og hFTAA fluorescens på etterfølgende avsnittene. Topp panel: AA antistoff DAB flekk, nedre panelet: hFTAA fotografert med en longpass utslipp filter. Skala bar: 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Sammenligne fluorescens med kort-pass-filtre på transthyretin amyloid i menneskets hjerte med Mayer hematoxylin/Kongo rød (en-d) og Mayer hematoxylin/hFTAA (e). (en) Brightfield bilde, (b) Brightfield + fluorescens, (c) Brightfield + krysset polarisatorer, (d) Brightfield fluorescens + krysset polarisatorer, (e) hFTAA fluorescens i 405NM + 480 nm eksitasjon (etterfølgende avsnittene til en-d). Skala bar: 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: samme objekt farget med hFTAA og fotografert med flere teknikker er demonstrert ved hjelp av en Aβ plakk i en alderen APP23 mus. (en) fluorescensen egenskapene til hFTAA bestemmes av sin conformational tilstand. Strukturen til hFTAA plan og vridd vises. (b) hyperspektral avbildning for evaluering av kontinuerlig utslipp spektrum. Spectra i nedre panel er fargekodet etter eske regioner av interesse i bildet. (c) (i) Confocal bildebehandling for eksitasjon bildebehandling og (ii og iii) spektrum og utslipp imaging filter eller (iv) spectral modus. (d) fluorescens levetid bildebehandling for gjenkjenning av conformational forskjeller i amyloid, der kortere levetid finnes i utkanten av Aβ plakk og livet tidene er lengre i midten av plakk. Histogrammet i nedre panel viser fordelingen av livet ganger for hele plakk. Bildet er farget i henhold til skalaen under histogrammet. (e) AC Confocal Z stabel samlet i filteret for å vise tredimensjonale strukturen i objekter. Bar Skalalengde angis i hvert panel. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Deponering av aberrantly foldet proteiner i amyloid er en viktig begivenhet for mange sykdommer prosesser. Ekstracellulære amyloid plaques består av Aβ peptider og intracellulær neurofibrillary ledninger dannet av hyperphosphorylated tau finnes i hjernen av Alzheimers pasienter. En rekke ulike proteiner, f.eks, transthyretin (TTR), Serum Amyloid A komponent (SAA) og IgG lys kjeden misfold og manifestere som amyloid innskudd i vev utenfor CNS. Selv om amyloid innskudd har blitt kjent og studert i mer enn et århundre, vi fremdeles mangler detaljert kunnskap om hvordan amyloid er deponi igangsatt på molekylært nivå og hva kan gjøres for å unngå denne prosessen. For Alzheimers sykdom er det nødvendig å bekrefte hvordan prosessen med amyloidose er forbundet med neurodegeneration. En nøkkel quest på oppdraget å behandle amyloidose er å utvikle romanen finjustert verktøy for å overvåke amyloid innvielsen, progresjon og regresjon; Derfor er målrettet amyloid oppdagelsen nøkkelen. I det lange løp, fordelen klinisk diagnostikk av øke følsomhet og selektivitet av amyloid flekker metoder7,15. Dagens utfordringer i denne forbindelse er enorm og er et svært aktivt forskningsfelt. En Hovedproblemet for klinisk utvikling og forsøk er prognostiske diagnose. Disse sykdommene trolig begynne før symptomer, men med behandling der må være identifikasjon av sykdommen. Her, er følsomheten et viktig aspekt for romanen metoder. Videre, problemet er enda mer komplisert fordi noen protein aggregater er giftige, noen er beskyttende, og noen er nøytral. Derav er muligheten til å overvåke bestemte aggregert morphotypes viktig siden eksistensen av forskjellige aggregert arter har blitt foreslått for å forklare heterogene fenotypen rapportert for et mangfold av nevrodegenerative protein aggregering sykdommer. For eksempel er prion protein et klassisk eksempel på hvordan en identiske primære sekvens av aminosyrer kan misfold i forskjellige samlet morphotypes, som gir opphav til bestemte prion stammer. Lignende polymorfisme har også blitt rapportert for Aβ peptid, α-synuclein og tau. I denne forbindelse vist LCOs seg å være enestående verktøy for optisk tildeling av forskjellige aggregert morphotypes. Prion-belastning-spesifikk protein samler, protein innskudd i flere typer systemisk amyloidose, i tillegg til sammensatte Aβ og tau aggregater har vært utmerket på grunn av conformationally indusert optisk fenomenet fra LCOs.

Amyloid deponering er en begivenhet som finner sted i vev som er vanskelig å trenge biokjemiske eller Biofysiske metoder for molekylær presisjon. Muligheten til å granske hendelser ex vivo, vivoog i vitro bruker de samme LCO molekylene setter scenen for unraveling hendelser som oppstår i vivo bruke teknikker som bare er mulig å søke på ex vivo eller i vitro prøver11,17. En nylig rapportert høyoppløselig strukturelle modellen viser at LCO pentameric FTAA (pFTAA) binder i et hulrom formet av justert side kjeder parallelt med fibril aksen spanning 6 i registreringen parallelle beta-tråder18, viser at det er mulig å få atomic oppløsning kunnskap om enhetene i LCO målet. I hovedsak ligner bindende hulrom og bindende modus pFTAA på Kongo red19, diktert av en groove med repeterende positivt ladet Lys side-kjeder. Affinitet til LCOs synes å være bedre i forhold til Kongo red sannsyligvis kjeden fleksibilitet og sterk van der Waals vekselsvirkningene av svovel atomer av tiofen ringene mot hydrofobe hulrommet. Deteksjon av prefibrillar arter (før ThT svarer)5,20 vises avhengig av repeterende β ark, består av-registrere parallell-beta-tråder, som for hFTAA blir to tiofen enheter lenger enn pFTAA span krysset av opptil 8 beta-tråder.

Fargeprotokoll krever betaler oppmerksomhet til feilsøking på følgende: (i) fiksering: omfattende fiksering av vevsprøver kan forstyrre amyloid strukturen og begrense muligheten til å oppdage variasjon i fluorescens spektra av conformational forvrengning av hFTAA molekyl. Mild fiksering av cryosections fra ferske-frosne materiale er foretrukket å oppnå optimal spectral oppløsning. HFTAA vil imidlertid flekken og fluoresce amyloid fast vev, men med redusert effekt og mindre spectral variasjon. (ii) Epitope eksponering: pre-behandling av vev å oppnå epitope eksponering for antistoff binding kan noen ganger redusere muligheten for hFTAA å binde grunn av forstyrret amyloid struktur. Hvis dette er et problem, og epitope eksponering er et viktig skritt i antistoffer flekk protokollen, bruker etterfølgende avsnittene for antistoffer og hFTAA, kan henholdsvis betraktes. (iii) overstaining: hFTAA er svært følsom. Arbeider løsninger bør holdes på lav nM konsentrasjon. Redusere konsentrasjonen av hFTAA hvis bakgrunnen flekker er et problem. Hvis elementene som binder hFTAA er sparsomme i vevet, kan et overskudd av hFTAA samlet og akkumuleres i montering medium. Dette er anerkjent som fluorescens som ikke er i fokus flyet av vev selv. Hvis dette vises, fordype montert lysbildet i PBS før cover slip kan skyves avsnitt, vask med PBS og Monter med fersk montering medium og en ny cover slip. (iv) filter basert bildebehandling: Dette dokumentet beskriver det meste spectrally løst fluorescens bildevisning lang pass filter eller flere oppdagelsen kanalene. hFTAA kan også monitoreres med kort-pass-filtre. Vær oppmerksom på at dette vil redusere kontrasten og avskaffe det mulig å oppdage flere farger.

De siste årene har det blitt tydelig at som forskning verktøy, fluorescerende LCOs og spesielt hFTAA viser svært lovende egenskaper. Resultater har blitt vist for et stort utvalg av proteiner og sykdomstilstander, alt fra hFTAA oppdagelsen av aggregater i cellene (tau, inkludering kroppen myositt) systemisk amyloid serum amyloid A, transthyretin, immunglobulin lys kjeder (kappa og lambda) seminogelin 1, prion protein (inkludert klinisk prøver)21, Holme amyloid polypeptid og insulin7,15. En begrensende faktor for implementering av hFTAA som et diagnostisk verktøy er at fluorescens mikroskopi ikke brukes mye i rutinemessig amyloid patologi labs. Videre er hans ikke tilgjengelige i klinikken. Men hFTAA amyloid flekker og fluorescens mikroskopi er brukt i kliniske laboratorier i et filter basert fluorescens mikroskop og børbetraktes som en gratis diagnostisk metode. Dette ble nylig demonstrert på carpal tunnel biopsier med transthyretin amyloidose bruke grunnleggende innstillinger for fluorescens i et automatisert mote22.

Videre, i tillegg til ulike proteiner, hFTAA fluorescens gjenkjenner en rekke fibril typer og pre fibrillar amyloid aggregat, f.eks, veien fibrillar arter er funnet og karakterisert. I denne publikasjonen har vi vist en LCO på ulike utvalg typer med tre mikroskopi teknikker. Bruk av kontrollerte syntese er også tillatt for utviklingen av LCOs allsidig deteksjon av biomolecular mål, f.eksinnspilling av interaksjoner av overflaten plasmon resonans (SPR)23 og radiolabeling for fantes et positron utslipp tomografi (PET)24.

Hittil har over 25 forskjellige LCOs med publisert. Økt bruk av LCOs for bildebehandling av amyloid innskudd vil øke kunnskapen om og forståelsen av hvordan disse sykdomsassosierte aggregater montere, demontere og forstyrre organer og enkeltpersoner der de ligger.

Disclosures

PH PN MB SN er mindre aksjonærer i Ebba Biotech som kommersialiserer hFTAA under merkenavnet Amytracker545.

Acknowledgments

Forfatterne vil takke Mikael Lindgren og Chanan Sluzny for råd om fluorescens mikroskopi, og Adriano Aguzzi, Johan Bijzet, Bouke Hazenberg, Frank Heppner, Mathias Jucker, Therese Klingstedt, Karin Magnusson, Christina Sigurdson, Daniel Sjölander, Christoph Röcken, Gunilla Westermark, Per Westermark og Kurt Zatloukal for å bidra vev deler eller micrographs vises i denne publikasjonen. Samlingen av presentert data her er finansiert av bidrag fra svenske hjernen Foundation (Hjärnfonden), svenske Alzheimers association (Alzheimerfonden), svensk forskningsråd (VR), den Göran Gustafsson association, Georg & Astrid Olsson, EU FP7 helse prosjektet LUPAS og Linköping universitet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
hFTAA/Amytracker545 Ebba Biotech
Dako fluorescene mounting medium Agilent technologies GM304
LeicaDM6000 Leica
Lumen 200 Prior
Spectraview system ASI spectral imaging
Spectraview software ASI spectral imaging
LSM780 Zeiss
Zen 2010b v6.0 software Zeiss
FLIM system Becker & Hickl
Ar/ML 458/488/514 Zeiss
Tunable Laser In Tune Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sipe, J. D., et al. Amyloid fibril proteins and amyloidosis: chemical identification and clinical classification International Society of Amyloidosis 2016 Nomenclature Guidelines. Amyloid. 23, 209-213 (2016).
  2. Buxbaum, J. N. Animal models of human amyloidoses: are transgenic mice worth the time and trouble? FEBS letters. 583, 2663-2673 (2009).
  3. Hall, A. M., Roberson, E. D. Mouse models of Alzheimer's disease. Brain Res Bull. 88, 3-12 (2012).
  4. Westermark, G. T., Johnson, K. H., Westermark, P. Staining methods for identification of amyloid in tissue. Methods in enzymology. 3-25 (1999).
  5. Klingstedt, T., et al. Synthesis of a library of oligothiophenes and their utilization as fluorescent ligands for spectral assignment of protein aggregates. Org Biomol Chem. 9, 8356-8370 (2011).
  6. Klingstedt, T., et al. Luminescent conjugated oligothiophenes for sensitive fluorescent assignment of protein inclusion bodies. Chembiochem. 14, 607-616 (2013).
  7. Sjolander, D., et al. Establishing the fluorescent amyloid ligand h-FTAA for studying human tissues with systemic and localized amyloid. Amyloid. 23, 98-108 (2016).
  8. Magnusson, K., et al. Multimodal fluorescence microscopy of prion strain specific PrP deposits stained by thiophene-based amyloid ligands. Prion. 8, 319-329 (2014).
  9. Radde, R., et al. Abeta42-driven cerebral amyloidosis in transgenic mice reveals early and robust pathology. EMBO Rep. 7, 940-946 (2006).
  10. Sturchler-Pierrat, C., et al. Two amyloid precursor protein transgenic mouse models with Alzheimer disease-like pathology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 13287-13292 (1997).
  11. Nystrom, S., et al. Evidence for age-dependent in vivo conformational rearrangement within Abeta amyloid deposits. ACS chemical biology. 8, 1128-1133 (2013).
  12. Aslund, A., et al. Novel pentameric thiophene derivatives for in vitro and in vivo optical imaging of a plethora of protein aggregates in cerebral amyloidoses. ACS chemical biology. 4, 673-684 (2009).
  13. Nilsson, K. P., Herland, A., Hammarstrom, P., Inganas, O. Conjugated polyelectrolytes: conformation-sensitive optical probes for detection of amyloid fibril formation. Biochemistry. 44, 3718-3724 (2005).
  14. Mahajan, V., et al. Cross beta-sheet conformation of keratin 8 is a specific feature of Mallory-Denk bodies compared with other hepatocyte inclusions. Gastroenterology. 141, 1080-1090 (2011).
  15. Sjolander, D., Bijzet, J., Hazenberg, B. P., Nilsson, K. P., Hammarstrom, P. Sensitive and rapid assessment of amyloid by oligothiophene fluorescence in subcutaneous fat tissue. Amyloid. 22, 19-25 (2015).
  16. Arja, K., et al. Enhanced fluorescent assignment of protein aggregates by an oligothiophene-porphyrin-based amyloid ligand. Macromol Rapid Commun. 34, 723-730 (2013).
  17. Psonka-Antonczyk, K. M., et al. Nanoscale Structure and Spectroscopic Probing of Abeta1-40 Fibril Bundle Formation. Front Chem. 4, 44 (2016).
  18. Herrmann, U. S., et al. Structure-based drug design identifies polythiophenes as antiprion compounds. Sci Transl Med. 7, 299ra123 (2015).
  19. Schutz, A. K., et al. The amyloid-Congo red interface at atomic resolution. Angewandte Chemie (International ed). 50, (26), 5956-5960 (2011).
  20. Hammarstrom, P., et al. A fluorescent pentameric thiophene derivative detects in vitro-formed prefibrillar protein aggregates. Biochemistry. 49, 6838-6845 (2010).
  21. CORDIS. Final Report Summary - LUPAS (Luminescent polymers for in vivo imaging of amyloid signatures). European Commision, Community Research and Developement Information Service. (2013).
  22. Hahn, K., et al. Establishing and validating the fluorescent amyloid ligand h-FTAA (heptamer formyl thiophene acetic acid) to identify transthyretin amyloid deposits in carpal tunnel syndrome. Amyloid. 1-9 (2017).
  23. Johansson, L. B., et al. An azide functionalized oligothiophene ligand--a versatile tool for multimodal detection of disease associated protein aggregates. Biosens Bioelectron. 63, 204-211 (2015).
  24. Nordeman, P., et al. (11)C and (18)F Radiolabeling of Tetra- and Pentathiophenes as PET-Ligands for Amyloid Protein Aggregates. ACS Med Chem Lett. 7, 368-373 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics