코어-쉘 란타넘족 실수로 업 나노 세포 응용 프로그램의 합성

Chemistry

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Summary

프로토콜은 란타넘족 실수로 업 코어-쉘 나노 (UCNs)의 합성 및 근 적외선 (NIR) 빛 조명에 따라 채널 단백질 규제에 대 한 그들의 휴대 전화 애플 리 케이 션에 대 한 제공 됩니다.

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Ai, X., Lyu, L., Mu, J., Hu, M., Wang, Z., Xing, B. Synthesis of Core-shell Lanthanide-doped Upconversion Nanocrystals for Cellular Applications. J. Vis. Exp. (129), e56416, doi:10.3791/56416 (2017).

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Abstract

란타넘족 실수로 업 나노 (UCNs) 속성에 따라 그들의 유망 하 고 제어할 수 있는 광학, 근처-적외선 (NIR) 빛의 흡수에 대 한 허용 하 고 나중에 그것을 변환할 수 있습니다 최근 몇 년 동안에 많은 관심을 받고 있다 다중화는 NIR에 표시 하는 UV에서 지역의 광범위 한 범위에 걸쳐 있는 배출. 이 문서에서는 자세한 실험 절차를 효율적으로 변환 하는 깊은 조직 꿰 뚫을 수 NIR 여기 (808 나노도 다른 란타넘족 이온 통합 코어-쉘 UCNs의 높은 온도 공동 강수량 합성 제공 nm) 480에 강한 파란 방출에 nm. 생체 고분자 (polyacrylic 산, PAA)와 표면 처리를 제어 하 여로 준비 UCNs 버퍼 솔루션에서 좋은 용 해도 획득 합니다. 친수성 나노는 더 공업화 특정 ligands (dibenzyl cyclooctyne, DBCO)와 세포 막에 지역화에 대 한. NIR 빛 따라 (808 nm) 조사, upconverted 블루 방출 효과적으로 세포 막에 빛-문이 채널 단백질을 활성화 하 고 특히 세포질에 (예를 들어, 캘리포니아2 +) 양이온 유입 규제 수. 이 프로토콜의 코어-쉘 란타넘족 실수로 UCNs 및 후속 생체 표면 수정 추가 휴대 전화 응용 프로그램에 대 한 합성에 대 한 실현 가능한 방법론을 제공합니다.

Introduction

최근 몇 년 동안, 란타넘족 실수로 업 나노 (UCNs) 널리 사용 된 기존의 유기 염료와는 주로 그들의 뛰어난 화학 및 광학 속성에 따라, 생명 의학 어플리케이션에 양자 점 하는 대신 좋은 생체 적합성, photobleaching, 및 좁은 대역폭 방출1,2,3에 높은 저항을 포함 하 여. 더 중요 한 것은, 그들은 우수한 조직 침투 깊이 vivo에서 UV, 표시에서 방출의 광범위 한 범위에 근 적외선 (NIR) 여기와 다중 광자 통해 NIR 영역 변환 하는 유망한 nanotransducer로 사용할 수 있습니다. 업 프로세스4,5. 이러한 독특한 속성 란타넘족 실수로 UCNs 생물 감지, 생체 이미징, 및 질병 theranostics6,,78특히 유망한 벡터 역할을 확인 합니다.

UCNs의 일반적인 구성 요소는 주로 단 열 호스트 매트릭스 감광 (예를 들어, Yb3 +, Nd3 +) 및 (예를 들어, Tm3 +, 응급실3 +, 호는 활성기에에서도 핑된 란타넘족 이온 기반 3 +) 크리스탈 내에서 균질9. 나노에서 다른 광학 방출 그들의 사다리 같은 배열된 에너지 레벨10인 란타넘족 dopants의 4f 궤도 내에서 지역화 된 전자 전환에 기인 된다. 따라서, 그것은 정확 하 게 크기와 multicomponent 란타넘족 dopants와 합성된 UCNs의 형태를 제어 하는 중요 한입니다. 오른쪽으로 유망한 방법 몇 가지 잘 설립 되었습니다 란타넘족 실수로 UCNs, 열 분해, 높은-온도 공동 강 수, 열 수 합성, 솔-젤 처리, 11 등의 준비를 위해 , 12 , 13 이러한 방법 중 높은 온도 공동 강 수 방법 중 하나입니다 UCNs 합성, 균일 한 모양으로 원하는 양질의 나노 준비를 엄격 하 게 통제 될 수 있는 가장 인기 있는 하 고 편리한 전략 및 상대적으로 짧은 반응 시간 및 낮은 비용14크기 분포. 그러나,이 방법에 의해 합성 대부분 nanostructures는 주로 덮인 올레산 및 oleylamine, 일반적으로 수 용액에서 소수 성 리간드 가용성의 제한 때문에 그들의 더 bioapplication를 방해 같은 소수 성 ligands 15. 따라서, 그것은 생물 학적 응용 체 외생체 내에서생체 UCNs 준비에 적당 한 표면 처리 기법을 수행 하는 데 필요한.

여기, 우리는 높은 온도 공동 강수량 메서드 및 functionalize 위한 UCNs 표면에 생체 고분자를 가능한 수정 기술을 통해 코어-쉘 UCNs nanostructures의 합성에 대 한 상세한 실험 절차 제시 또한 휴대 전화 응용 프로그램입니다. 이 UCNs nanoplatform 통합 3 란타넘족 이온 (Yb3 +, Nd3 +및 Tm3 +) 강한 블루 방출 얻으려고 나노 (~ 480 nm) 808에서 NIR 빛 자극에 더 침투 깊이 nm에 조직 생활입니다. 그것은 잘 알려져 해당 Nd3 +-도 핑된 UCNs이 스펙트럼 창에 최소화 물 흡수 및 과열 효과 표시 (808 nm) 980 nm 방사선16,17, 에 따라 기존의 UCNs 비교 18. 또한, 생물 학적 시스템에는 UCNs 활용, UCNs의 표면에 소수 성 ligands (올레산) 첫째로 의해 제거 된다 산 성 솔루션19쥡니다. 다음 ligand 무료 UCNs 수성 솔루션20에서 좋은 용 해도 얻으려고 생체 고분자 (polyacrylic 산, PAA)와 수정 추가 됩니다. 또한,-의 증거-개념 셀룰러 애플리케이션에서 친수성 UCNs는 더 기능성 분자 ligands (dibenzyl cyclooctyne, DBCO) N3에 특정 지역화와-태그 세포 막. NIR 빛 따라 (808 nm) 조사, 480에서 블루 upconverted 방출 수 있습니다 효과적으로 빛-문이 채널 단백질, channelrhodopsins-2 (ChR2)를 활성화, 세포 표면에 및 따라서 양이온 (예를 들어, 캘리포니아2 + 이온) 유입 촉진 살아있는 세포의 막.

이 비디오 프로토콜 란타넘족 실수로 UCNs 합성, 생체 표면 개 질, 및 살아있는 세포에서 UCNs bioapplication에 대 한 실현 가능한 방법론을 제공합니다. 합성 기술과 nanocrystal 성장에 사용 되는 화학 시 약의 차이 세포 실험에 사용 되는 최종 UCNs nanostructures의 크기 분포, 형태, 및 업 컨버전 (UCL) 발광 스펙트럼을 좌우할 것 이다. 이 상세한 비디오 프로토콜은 높은 온도 공동 강수량 방법 UCNs의 재현성을 향상 하 고 추가 UCNs 생체 표면 수정에 대 한 가장 일반적인 실수를 피하기에이 분야에서 새로운 연구 수 있도록 준비 휴대폰 응용 프로그램입니다.

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Protocol

주의: 사용 하기 전에 모든 관련 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)를 참조 하십시오. 공학적 통제 (증기 두건) 및 개인 보호 장비 (예를 들어, 안전 고글, 장갑, 실험실 코트의 사용을 포함 하 여 고온 (~ 290 ° C)에서 UCNs의 합성을 수행할 때 모든 적절 한 안전 관행을 사용 하시기 바랍니다 전체 길이 바지, 그리고 폐쇄 발가락 신발).

1. 합성의 NaYF 4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: Nd(20%) 코어-쉘 나노

  1. 합성의 NaYF 4: Yb/Tm/Nd(30/0.5/1%) 코어 nanostructure
    1. 다시 (채널 3 CO 2) 3, NaOH, NH 4 F 메탄올 재고 솔루션의 준비
      참고: (재) 란타넘족 이온 희토류는 이트륨 (Y),이 터 븀 (Yb), Thulium (Tm), 및 네오디뮴 (Nd). 5 mL 메탄올 (100 mg/mL), 250 mg이 터 븀 (III) 아세테이트 수화물 5 mL 메탄올 (50 mg/mL), 10 mg에 1 mL 메탄올 (10mg/mL), 툴 륨 (III) 아세테이트 수화물에에서 고 10 mg 1 mL metha에 네오디뮴 (III) 아세테이트 수화물
      1. 분해 500 mg Yttrium(III) 아세테이트 수 화 2 분에 대 한 초음파 청소 욕실 유리 튜브에 nol (10mg/mL)
      2. NaOH 재고 솔루션 (20 mg/mL)을 준비 하 초음파 청소 욕실 20 mL 메탄올 50 mL 원심 분리기 튜브에 400 밀리 그램 NaOH 결합.
      3. NH 4 F 재고 솔루션 (20 mg/mL)을 준비 하 초음파 청소 욕실 30 mL 메탄올 600 mg NH 4 F 50 mL 원심 분리기 튜브에서 결합.
        참고: 배치 란타넘족 단지, NaOH와 뉴 햄프셔의 재고 솔루션 유리 튜브에서 4 F parafilm으로 밀봉 하 고 필요할 때까지 ~ 4 ° C에서 냉장고에 보관. 준비 된 메탄올 재고 솔루션 2 주마다 한 번 바뀝니다.
    2. 준비의 NaYF 4: Yb/Tm/Nd 코어 nanostructure
      1. 올레산 및 1 octadecene의 7 mL 3 mL 50 mL 3 목 플라스 크에 플라스틱.
      2. Y (채널 3 CO 2) 3 재고 솔루션, Yb (채널 3 CO 2) 3 재고 솔루션의 Tm (채널 3 CO 2) 3 주식의 83.6 µ L 0.608 mL의 결합 1.089 mL 솔루션 그리고 플라스 크에 Nd (채널 3 CO 2) 3 재고 솔루션의 128.5 µ L.
      3. 는 온도계 (0-360 ° C 범위) 플라스 크에 적합 하 고 솔루션을 터치 팁. Phenylmethyl 실리콘 오일 플라스 크를 유리 용기에 배치.
      4. 는 메탄올을 증발 하는 핫 플레이트와 100 ° C에 솔루션을 열. 잔여 메탄올을 제거 하 고 2-3 분 교 반 하면서 진공에서 반응 혼합물을 유지 하는 듀얼 진공/가스 매니폴드 Schlenk 라인에 플라스 크를 연결.
      5. 150 ° C의 온도 증가 시키고 60 분 유지에 대 한이 온도 700 rpm의 교 반 속도 합성 중.
        참고: 솔루션을 splashing 피하기 위해 적절 한 교 반 속도 설정.
      6. 핫 플레이트를 중지 하 고 플라스 크 솔루션 수 있도록 실내 온도에 차가운 유지 아래로 천천히.
        참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기.
      7. NaOH 메탄올의 결합 2 mL 재고 솔루션 그리고 NH 4 F 메탄올 15 mL 원심 분리기 관으로 재고 솔루션의 2.965 mL. 모자와 튜브를 강화 하 고 5에 대 한 강력한 vortexing 솔루션 혼합 미
      8. 추가 유리 피 펫 5 분 이상 하 여 플라스 크에 서서히 NaOH NH 4 F의 혼합물
      9. 50 ° C에 혼합물의 온도 증가 시키고 30 분이이 온도
        참고: 높은 온도 크리스탈 nucleation 및 성장을 추진 하기 때문에 더 이상 50 ° C에서 온도 설정.
      10. 잔여 메탄올을 제거 하 고 2-3 분 위한 진공에서 반응 혼합물을 유지 하는 듀얼 진공/가스 매니폴드 Schlenk 선 플라스 크를 연결 하 고 메탄올을 증발을 (~ 100 ° C) 온도 증가
      11. 질소로 플라스 크를 채우기 위해 자 지의 위치 전환.
      12. 증가 290 ° c ~ 5 ° C/분의가 열 속도로 온도 유지 1.5 헤 290 ° C에서 반응 혼합물
      13. 핫 플레이트를 중지 하 고 플라스 크를 천천히 교 반 하면서 실 온에서 반응 혼합물을 허용 하도록 제거.
        주의: 높은 온도와 뜨거운 접시의 조심 (> 400 ° C) 피부 접촉 시 심한 화상을 피하기 위해.
      14. 50 mL 원심 분리기 튜브에 플라스 크에서 혼합물을 전송합니다. 에탄올의 30 mL로 플라스 크를 헹 구 고 원심 분리기 튜브 솔루션 전송.
      15. 원심 실 온에서 8 분 4000 × g에서 제품 하 고는 상쾌한 삭제.
      16. 원심 분리기 튜브와 다시 분산 쥡니다 (60 kHz, 240 W) 2 분을 가진 제품을 헥 산의 추가 10 mL
      17. 튜브에 에탄올 30 mL를 추가합니다. 8 분 4000 × g에서 제품 아래로 회전 하 고 다음 삭제는 상쾌한.
      18. 다시 hexane 5 mL와 원심 분리기 튜브의 아래쪽에 고체 제품 분산. 다음 단계에 대 한 ~ 4 ° C에서 냉장고에서 솔루션을 저장.
        참고: 808 nm 레이저 (2 승) 솔루션을 해 하 여 코어-쉘 UCNs의 업 방출 테스트.
  2. 준비의 NaYF 4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: Nd(20%) 코어-쉘 나노
    1. 올레산 및 1 octadecene의 7 mL 3 mL 50 mL 3 목 플라스 크에 결합. Y (채널 3 CO 2) 3 재고 솔루션 및 Nd (채널 3 CO 2) 3 재고 솔루션의 2.87 mL 1.082 mL 플라스 크에 추가.
    2. 교 반 하면서 플라스 크에 얻은 핵심 nanostructure (단계 1.1.2.18에서에서 헥 산 5 mL에에서 80 밀리 그램)를 추가.
    3. 는 온도계 (0-360 ° C 범위) 플라스 크에 적합 하 고 혼합물을 터치 팁. Phenylmethyl 실리콘 오일 플라스 크를 유리 용기에 배치.
    4. 혼합물 메탄올, 헥 산 증발 하 핫 플레이트 위에 100 ° C에서 열. 잔류 용 매를 제거 하 고 2-3 분 교 반 하면서 진공에서 반응 혼합물을 유지 하는 듀얼 진공/가스 매니폴드 Schlenk 라인에 플라스 크를 연결.
    5. 150 ° C의 온도 증가 시키고 그것은 60 분 유지에 대 한 교 반 속도 합성에서 700 rpm에서.
      참고: 솔루션을 splashing 피하기 위해 적절 한 교 반 속도 설정.
    6. 핫 플레이트를 중지 하 고 실 온에서 천천히 냉각 솔루션을 수 있도록 플라스 크를 제거.
      참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기.
    7. NaOH 메탄올의 피 펫 2 mL 재고 솔루션 그리고 NH 4 F 메탄올 15 mL 원심 분리기 관으로 재고 솔루션의 2.965 mL. 모자와 튜브를 강화 하 고 5에 대 한 강력한 vortexing 솔루션 혼합 미
    8. 추가 유리 피 펫 5 분 이상 천천히 하 여 플라스 크에 혼합
    9. 50 ° C에 혼합물의 온도 증가 하 고 30 분 50 ° C에서 유지
      참고: 설정 온도 50 ° C 보다 높은 온도 크리스탈 nucleation 및 성장 촉진 것입니다 때문에.
    10. 2-3 분 위한 진공에서 반응 혼합물을 유지 하는 잔여 메탄올을 제거 하는 이중 진공/가스 매니폴드 Schlenk 선 플라스 크를 연결 하 고 메탄올을 증발을 (~ 100 ° C) 온도 증가
    11. 질소로 플라스 크를 채우기 위해 자 지의 위치 전환.
    12. 290 ° C의 온도 증가 ~ 5 ° C/분의가 열 속도로 1.5 헤 290 ° C에서 반응 혼합물을 유지
    13. 핫 플레이트를 중지 하 고 플라스 크를 천천히 교 반 하면서 실 온에서 반응 혼합물을 허용 하도록 제거.
      주의: 높은 온도와 뜨거운 접시의 조심 (> 400 ° C) 피부 접촉 시 심한 화상을 피하기 위해.
    14. 50 mL 원심 분리기 튜브에 플라스 크에서 혼합물을 전송합니다. 에탄올의 30 mL로 플라스 크를 헹 구 고 원심 분리기 튜브 솔루션 전송.
    15. 원심 실 온에서 8 분 4000 × g에서 제품 하 고는 상쾌한 삭제.
    16. 원심 분리기 튜브와 다시 분산 쥡니다 (60 kHz, 240 W) 2 분을 가진 제품을 헥 산의 추가 10 mL
    17. 튜브에 에탄올 30 mL를 추가합니다. 8 분 4000 × g에서 제품 아래로 회전 하 고 다음 삭제는 상쾌한.
    18. 다시 hexane 5 mL와 원심 분리기 튜브의 아래쪽에 고체 제품 분산. 필요할 때까지 ~ 4 ° C에서 냉장고에서 솔루션을 저장.
      참고: 808 nm 레이저 (2 승) 솔루션을 해 하 여 코어-쉘 UCNs의 업 방출 테스트.

2. 생체 UCNs Nanostructures의 합성

  1. ligand 무료 UCNs 나노의 준비
    1. 결합 30 mL 에탄올으로 준비 oleate 출장 UCNs 솔루션 (단계 1.2.18) 50 mL 원심 분리기 튜브에서. 실 온에서 8 분 4000 × g에서 혼합물을 원심 및 삭제는 상쾌한.
    2. 결합 10 mL 산 성 용액 (pH = 4) 50 mL 원심 분리기 튜브에 침전 된 HCl (0.1 M)으로 조정 하 고 침전 쥡니다 (60 kHz, 240 W) 30 분에 의해 분해
    3. 전송 활발 한와 유리에서 솔루션 유리병 2 헤에 대 한 교 반
    4. 올레 산을 제거, 3 번 반복을 30 mL diethyl 에테르와 용액 추출.
    5. 부드러운 떨고와 결합 된 에테르 층에 10 mL 물을 추가.
    6. 는 수성 수집 (20 mL)를 함께 상 고 5에 대 한 vortexing와 20 mL 아세톤을 추가 s.
    7. 스핀 10 분 35000 × g에서 제품 하 고는 상쾌한 다음 삭제. 2 물에 침전을 분해.
  2. 폴리머의 준비 수정 UCNs (PAA UCNs)
    1. 200mg polyacrylic 산의 결합 (PAA, Mw = 1800) PAA 솔루션에서 상기 ligand 무료 UCNs 쥡니다 (60 kHz, 240 W) 20 분 대에 의해 20 mL 물 추가 활발 한 교 반.
    2. 30 분 교 반 하면서 실 온에서 24 h에 대 한 혼합물을 계속 쥡니다 (60 kHz, 240 W)와 7.4에 pH 값 NaOH 솔루션 (1 M)을 조정.
    3. 35000 × g에서 원심 분리 하 여 침전을 5 분 및 10 분에 35000 × g에서 다시 원심이이 단계를 세 번 반복에 대 일 분 다시 쥡니다 (60 kHz, 240 W)에 의해 10 mL 물에 제품 일시 중단에 대 한 수집.
    4. 5 분 ~ 4 ° C까지 필요에 냉장고에서 솔루션을 저장 하는 동안 다시 쥡니다 (60 kHz, 240 W)에 의해 8 mL 물에 제품을 분산.
  3. 기능 DBCO UCNs 나노의 준비
    1. 스핀 35000 × g에서 원심 분리에 의해 서 준비 된 PAA@UCNs (1 mg) 다운 10 분 다시 1 mL에 침전을 일시에 쥡니다 (60 kHz, 240 W) 1 분 여 DMF 건조 그리고 원심 분리기 다시 35000 × g에서 10 분에 대 한이 단계를 반복 하 여 두 번.
    2. 디졸브 200 µ L에서 침전 DMF 유리 유리병에서 건조. HOBT (12.2 m g), EDC (14 mg), DBCO-NH 2 (5mg), 및 DIPEA 추가 (16 µ L) 24 헤에 대 한 자석 교 반으로 유리병에서
    3. 35000 × g에서 원심 분리 하 여 제품을 10 분은 상쾌한을 제거 하 고 다시 1 mL DMSO에에서 침전을 일시 중단 하 고 다시 10 분 35000 × g에서 원심 분리기는 세 번이이 단계를 반복 수집.
    4. 분산 0.2 mL DMSO에 제품 및 매장에서 냉장고에 ~ 사용 하기 전에 4 ° C.

3. 생활 세포에서 막 채널의 규칙에서 Bioapplications의 DBCO-UCNs

Dulbecco에
  1. 문화는 HEK293 세포 ' s 수정이 글 ' s 매체 (DMEM) 10 %FBS, 100 단위/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스 보충 및 24 h. 위해 인큐베이터에서 유지 하 고 12-잘 접시에 1 ml DMEM/잘 37 ° C. 씨앗 1 × 10 5 셀에 5% CO 2 습도 인큐베이터에서 유지
  2. 결합 플라스 미드 (pCAGGS-ChR2-금성, 1 µ g) P3000 transfection 시 약 (2 µ L)이 글에서와 ' s 최소 필수 미디어 (MEM) (100 µ L) microcentrifuge에 A, 튜브 및 메모리에 transfection 시 약 (1.5 µ L)를 추가 (100 µ L) 튜브 나
  3. 솔루션 실 온에서 10 분 관 A와 B의 혼합물을 품 어.
  4. 는 400 µ L MEM 관 A와 B에서에서 솔루션을 결합 한 제품. 1 mL로 세포 세척 혈 청 무료 DMEM 두 번.
  5. 12-잘 접시의 각 음에 600 µ L transfection 혼합물을 추가 하 고 품 어 4 h. 제거에 대 한 37 ° C 배양 기에서 세포 매체 1 mL DMEM 두 번 씻어.
  6. 1 mL DMEM 1 µ L Ac 4 ManNAz (DMSO에 50 m m)를 포함 하는 잘 추가 하 고 인큐베이터에 2 일 동안 그것을 유지.
  7. 매체를 제거 하 고 1 mL PBS로 한 번 씻어. 12-잘 접시의 각 음에 1 mL 트립 신-EDTA (0.25%) 솔루션을 추가 하 고 셀 (~ 2 분)를 분리 할 때까지 37 ° C에서 품 어. 다시 하룻밤을 위해 셀/잘 DMEM 1 mL에에서 1 × 10 5에서 confocal 접시에 셀 문화.
  8. 매체를 제거 하 고 1 mL을 추가 2 µ L로 신선한 DMEM DBCO-UCNs (50 mg/mL) 2 h 37 ° c.에 대 한 접시에 Confocal 영상에 대 한 셀 DMEM 두 번 세척 하 고 1 µ L 로드-N 3 (10 mM) 30 분에 대 한 추가
  9. 세포내 칼슘 분석, 셀 1 µ L의 혼합물을 품 어 로드-3 오전 (10 mM), 10 µ L Probenecid (250 m m), 및 10 µ L 로드 버퍼 (Pluronic 계면 활성 제 polyols,0.1% w/v)) 어둠 속에서 30 분 동안 1 mL DMEM 매체에서.
  10. 셀 세럼 무료 DMEM 세척 하 고 20 분 (5 분 조명 후 5 분 휴식) 0.8 W/c m 2의 복용량에 808 nm의 NIR 빛 비추는.
  11. Confocal 현미경에 이미징 결과 기록 (레이저 소스: 561 nm 레이저, 검출기 범위: 610/75 nm; 렌즈: 100 x 1.4 나 기름, 노출 시간: 100 ms). 각 잘에서 1 mL 트립 신-EDTA (0.25%) 솔루션을 추가 하 고 셀 (~ 2 분)를 분리 할 때까지 37 ° C에서 품 어. 다시 1 ml PBS 흐름 cytometry (FCM) 분석에 대 한 셀을 일시 중단 (예: 561 nm, Em: 582/15 nm).

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Representative Results

코어-쉘 란타넘족 실수로 UCNs의 도식 합성 과정은 그림 1그림 2에 표시 됩니다. 전송 전자 현미경 (TEM)와 코어 및 코어-쉘 UCNs nanostructures의 고해상도 전송 전자 현미경 (HRTEM) 이미지 각각 수집 했다 (그림 1). Ligand 무료 UCNs UCNs의 표면에 소수 올레산 산 성 솔루션을 제거 하 여 준비 하 고 친수성 폴리머 (PAA) 수정 됩니다. 다음 COOH 출장 PAA-UCNs는 기능성 DBCO-NH2 아 미드 응축 반응에 의해. Ligand 무료 UCNs, PAA UCNs 및 DBCO UCNs의 TEM 이미지는 그림 2에 표시 됩니다. 동적 산란 (DL), 제타 잠재적인 결과 DBCO UCNs의 업 (UCL) 발광 스펙트럼을 각각 수집 됩니다 (그림 3). DBCO-NH2, PAA UCNs 및 DBCO UCNs의 푸리에 변환 적외선 (FTIR) 분광학은 그림 4에 표시 됩니다.

세포 실험, 세포 막에 ChR2의 성공적인 식 confocal 현미경 검사 법 (그림 5A)를 사용 하 여 분명 한 녹색 형광 단백질 (GFP) 마커 (금성)에 의해 확인 된다. DBCO-UCNs 클릭 반응 (그림 5A)에 의해 ChR2 표현 HEK293 세포의 표면에 특히 지역화 됩니다. NIR 빛 자극에 따라 세포내 칼슘 분석은 또한 confocal 영상 및 흐름 cytometry (FCM)는 표준 형광 캘리포니아2 + 표시기, 로드-3에 기반 하 여 확인 오전 (그림 5B, C).

Figure 1
그림 1입니다. 코어-쉘의 합성 란타넘족 실수로 UCNs. UCNs의 합성 과정의 (A) 회로도 그림. (B, C) 코어의 가장 (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1 %)) 및 코어-셸 (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%)@NaYF4: Nd (20 %)) UCNs nanostructures. 눈금 막대: 50 nm. 코어 및 코어-쉘 UCNs nanostructures의 인세트: HRTEM 이미지. 눈금 막대: 5 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2입니다. 기능 UCNs nanostructures의 합성. Ligand 무료 UCNs, PAA UCNs 및 DBCO-UCNs의 합성 과정의 (A) 회로도 그림 각각. (B, C, D) Ligand 무료 UCNs, PAA UCNs 및 DBCO UCNs의 TEM 이미지. 눈금 막대: 100 패널 B에 50 nm nm 패널 C/D.에 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3입니다. DBCO-NH2, PAA UCNs 및 DBCO-UCNs의 FTIR 분광학 각각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4입니다. 버퍼 솔루션에 DBCO UCNs의 특성화. DBCO-UCNs의 (A) DL 결과. (B) 제타 PAA UCNs 및 DBCO-UCNs (평균 ± SD)의 잠재적인 결과. 제 초 제 (1 mg/mL), PAA UCNs와 물 (1 mg/mL)에 DBCO UCNs의 코어 및 코어-쉘 UCNs의 (C) UCL 스펙트럼 별도로 (예: 808 nm). 808 nm 방사선 조사와 UCNs의 인세트: 발광 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5입니다. NIR에 DBCO UCNs의 셀룰러 응용 프로그램 빛 조명. 표현 하는 ChR2 N3(A) Confocal 영상-100 µ g/mL에서 2 h에 대 한 DBCO-UCNs (위)와 PAA UCNs (아래) incubated HEK293 세포 태그. 그린: ChR2-금성 (예: 488 nm, Em: 530/50 nm), 파랑: UCNs (예: 543 nm, Em: 580/50 nm). 눈금 막대: 20 µ m. (B) 세포질 캘리포니아2 + 이미지 로드-3와 NIR 빛 조사 (0.8 W/c m2 20 분) 후. 예: 561 nm, Em: 610/75 nm. 눈금 막대: 10 µ m. (C) 양적 FCM 분석의 세포질 캘리포니아2 + 다른 빛 복용량 조명 (평균 ± SD)로 정규화 된 형광 강렬의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

이 문서는 휴대 전화 응용 프로그램에 대 한 기능 moieties 란타넘족 실수로 업 코어-쉘 나노 (UCNs)의 합성 및 그들의 표면 개 질에 대 한 메서드를 제시 했다. 이 소설을 접한 자외선과 NIR 빛 여기 다중 광자 업 과정에 따라 보이는 빛을 방출할 수 있다 뛰어난 광학 특성을 소유한 다. 이 프로토콜, 코어-쉘 UCNs nanostructures (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%)@NaYF4: Nd (20 %))는 준비 올레산 및 1 octadecene의 혼합물에서 높은 온도 공동 강 수 방법으로. 가장 이미지 보여 이러한 코어의 형태 및 코어-쉘 나노는 직경 20의 형태로 구형 및 30 nm 각각 암시 하는 쉘 두께 약 5 nm (그림 1). 코어-쉘 구조 또한 높은 해상도 가장 이미지 그림 1, 보여주는 핵심 UCNs nanostructures의 저것과 유사한 격자 변두리의 삽입에 의해 드러났습니다. 또한, 일반적인 d-0.52 nm β-NaYF4의 (100) 면의 간격 잘 동의 주위 간격, 모든에 코어 및 코어-쉘 UCNs nanostructures 높은 결정 하 고 동일한 결정 구조를 유지. 또한, 업 발광 스펙트럼 보여 코어-쉘 나노 480에 훨씬 더 높은 강도 가진 강한 블루 방출 방출 다이오드 레이저는 연속파 808에서 달성 하기 위해 여기에 코어 입자 보다 nm nm ( 그림 4C). 코어-쉘 UCNs의 향상 된 방출 억제 표면 냉각 하는 Yb3 +, Nd3 +, 그리고 코어-쉘 나노21의 내부 계층에 포함 된 Tm3 + 이온의 효과에 기인 된다. 이러한 결과 강력 하 게이 제안에 코어-쉘 UCNs 접한 란타넘족 첨가의 성공적인 준비를 확인합니다.

이러한 나노의 높은 온도 공동 강수량 합성에서 몇 가지 중요 한 단계가 있다. 첫째, 란타넘족 이온 재고 솔루션 코어 및 코어-쉘 UCNs의 합성 과정에서의 추가 볼륨 엄격 하 게 통제 한다 (단계 1.1.2.2). 높은 수준의 이온도 핑 농도 관련 크로스-휴식 또는 냉각 효과21나노에서 이온-이온 상호 작용 때문에 발생 합니다. NaOH와 NH4F 결정 성장 오 스 트 발트에 따라 홍보 하 여 균일 한 형태를 위해 중요 하다 (단계 1.1.2.9와 단계 1.2.9), 술병에 추가 된 후 완전 한 nucleation 되도록 미만 50 ° C에 온도 유지 한다 둘째, 숙성 효과22. 셋째, 크기 및 코어-쉘 나노 입자의 광학 속성은 셸 (Y3 + 와 Nd3 +)으로 준비 하는 코어 입자 (1.2.1 단계)의 선구자에서 란타넘족 이온의 양을 조정 하 여 주로 제어 수 있습니다. 그것은 또한 중요 한 코어-쉘 나노의 형태는 NIR 빛 조명23시 UCNs의 다른 광학 배출량을 조절 하는 데 유용 코어 입자의 다양 한 종류의 이방성 셸 성장에 기반으로 것입니다.

또한, 소수 UCNs 추가 생물 학적 응용에 대 한 친수성 UCNs 나노 효과적으로 변환할 상당한 도전 이기도 합니다. 버퍼 솔루션에 UCNs의 생체 적합성을 향상 시키기 위해 몇 가지 방법을 보고 되었습니다 비록 ligand 교환, 실리 카 코팅, ligand 산화 oleate 상한, , 등 그들은 시간이 걸리고, 예기치 않은 집계에서 고통 그리고 복잡 한 절차24,,2526. 여기, 우리 산 물 솔루션에서 oleate 출장 UCNs의 표면에 올레산을 제거 하 여 물 분산 ligand 무료 UCNs nanostructures를 간단한 방법 개발 (pH = 4). HCl에 의해 조정 하는 pH 값이 oleate ligand의 릴리스를 제어 하 고 UCNs의 발광에 영향을 미칠 중요 합니다. 더 중요 한 것은, 한 생체 고분자 (polyacrylic 산, PAA) carboxyl 그룹 추가 화학에 대 한 더 많은 기능 그룹을 제공할 것입니다 조정 상호 작용에 의해 UCNs의 표면에 란타넘족 이온와 연결할 수 있다의 많은 수 수정입니다. 따라서, 우리는 더 특정 N3를 위한 UCNs의 표면에 DBCO-NH2 moieties functionalize-세포 막 지역화 태그. Ligand 무료 UCNs, PAA UCNs 및 DBCO-UCNs 그림 2에서 편 이미지는 표면 처리 후 큰 dispersity 및 버퍼 솔루션에 이러한 nanostructures의 가용성을 보여 줍니다. 또한, 푸리에 변환 적외선 (FTIR) 분광학 특성 UCNs nanoplatform에 DBCO 그룹의 표면 수정 수행 되었다. 그림 3에서 보듯이 3,430 cm-1 주위에 강한 밴드 carboxyl 그룹의 H O 스트레칭 진동 때문 이며 가운데 1550 c m-1 과 1458 cm-1 에 2 개의 악대는 비대칭와 연결 하 고 UCNP 표면에 COOH 그룹 포함 된 고분자 (PAA)의 성공적인 코팅을 나타내는 카복실산 음이온의 대칭 스트레칭 진동 모드. DBCO-NH2 moieties, 반응 후 1,635 cm-1 에 분명 한 밴드는 C = C는 DBCO-NH2 moieties 동시의 FTIR 스펙트럼과 일치 DBCO 그룹의 향기로운 반지에 진동 기지개에 따라 wavenumber입니다. 또한, 동적 산란 (DL) 결과 수성 해결책에서 DBCO UCNs의 유체역학 직경 증가 나타냅니다 (96.4±10.4 nm) (그림 4A). 제타 잠재적인 결과 또한 PAA UCNs의 부정적인 면을 나타냅니다 (-26.1±4.4 mV) 및 DBCO UCNs (-11.9±5.6 mV) 각각 (그림 4B), 좋은 가용성 및 버퍼 솔루션에 이러한 nanostructures의 안정성을 보여주는. 또한, PAA UCNs 및 DBCO UCNs의 UCL 스펙트럼 그들이 480에서 비슷한 upconverted 방출 방출 수 있습니다 입증 nm 808 nm 빛 조사 (그림 4C), 추가 NIR 빛 중재 photoactivation 생물에 대 한 이용 될 수 있는 시 시스템입니다.

또한,-의 증거-개념, 살아있는 세포에서 기능성된 UCNs의 bioapplication를 설명 하기 위하여 빛-문이 채널 단백질 (ChR2)은 양이온 이온의 유입을 중재 하 여 세포 기능을 조절 하는 세포 표면에 설계 (예를 들어, 캘리포니아2 +) 세포질27,,2829에. HEK293 세포 라인의 막에 ChR2의 성공적인 식 confocal 현미경 검사 법 (그림 5A)를 사용 하 여 녹색 형광 단백질 (GFP) 마커 (금성)의 존재에 의해 확인 된다. 또한, N3에 UCNs의 지역화-태그 세포 막의 세포 표면에 (파란색) 2 h 부 화 후 UCNs nanostructures의 표면에 잔여 DBCO 그룹으로 얼룩이 사실에 기인 수 있습니다 분명히 시각 이다 포함 하는 아 지 드 형광 염료 (5-carboxytetramethylrhodamine-아 지 드, 로드-N3) 구리 무료 bioorthogonal 통해 클릭 반응 합니다. 또한, NIR 빛 (808 nm) 지역화 UCNs nanotransducer 활성화할 수 있는 세포 표면에 비추는 활용빛 문이 ChR2 단백질 채널 고 막에 걸쳐 캘리포니아2 + 이온 유입 촉진. cytosol에 빨간색 형광의 상당한 증가 관찰은 그림 5B같이 표준 형광 Ca2 + 표시기, 로드-3 오전, 동안 아무 명백한 형광 증가 빛 조명의 부재에 기록 됩니다. 그림 5C 에 양적 흐름 cytometry (FCM) 분석 또한 함을 보여 줍니다 이러한 NIR 빛 응답 형광 향상 빛-복용량-의존, biocompatible DBCO UCNs 효과적으로 통제할 수 있다 명확 하 게 제안 합니다 NIR 빛 조사 시 세포 막에 채널 단백질.

요약 하자면, 상기 결과에 따라, 우리가 기대 하 고 현재 프로토콜 뿐만 아니라 코어-쉘 UCNs nanostructures의 높은 온도 공동 강수량 합성에 대 한 자세한 실험 절차를 제공 하지만 간단한 개발 추가 NIR 빛 중재 photoactivation 생물 학적 응용에 대 한 UCNs의 생체 표면 개 질에 대 한 기술. 더 중요 한 것은,이 방법은 뒤에 있는 근거에 따라 UCNs의 광학 속성 추가 조정 될 수 있다 다른 종류 란타넘족 이온의도 핑에 의해 (예를 들면,에 르 븀 (III), Holmium (III), ) UV, 녹색, 빨강, 방출 결정에 고 NIR 빛 808 nm 빛 조사30에. 또한, UCNs 표면 수정할 수 있습니다 또한 다양 한 기능 그룹 (예:펩타이드, 단백질, 지질, 리간드, 을 대상으로) 더 생명 의학 어플리케이션31,32. 이러한 장점을 생체 UCNs 접한 생리 적 프로세스 시험관비보에, 연구에 대 한 적합 한 후보 만들고 따라서 역할을 수 있습니다 맞춤된 nanomedicine 임상 theranostics에 대 한 미래에.

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Disclosures

공개 하는 것이 없다.

Acknowledgements

이 작품은 NTU-AIT-MUV 남/16001, RG110/16 (S), (RG 11/13)에 의해 부분적으로 지원 하 고 (RG 35/15) 난 양 기술 대학교, 싱가포르, 국립 자연 과학 재단의 중국 (NSFC) (No. 51628201) 수상.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Octadecene Sigma Aldrich O806 Technical grade
oleic acid Sigma Aldrich 364525 Technical grade
Methanol Fisher Scientific A412 Technical grade
Ethanol Fisher Scientific A405 Technical grade
Acetone Fisher Scientific A18 Technical grade
Hexane Sigma Aldrich H292 Technical grade
Thulium (III) acetate hydrate (Tm(CH3CO2)3) Sigma Aldrich 367702 99.9% trace metals basis
Neodymium (III) acetate hydrate (Nd(CH3CO2)3) Sigma Aldrich 325805 99.9% trace metals basis
Ytterbium (III) acetate hydrate (Yb(CH3CO2)3) Sigma Aldrich 326011 99.9% trace metals basis
Yttrium(III) acetate hydrate (Y(CH3CO2)3) Sigma Aldrich 326046 99.9% trace metals basis
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich S5881 reagent grade
Ammonium fluoride (NH4F) Sigma Aldrich 338869 ACS reagent
Hydrogen chloride (HCl) Fisher Scientific A144 reagent grade
polyacrylic acid (PAA) Sigma Aldrich 323667 average Mw 1800
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) Sigma Aldrich 54802 ACS reagent
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) Sigma Aldrich E7750 commercial grade
Dibenzocyclooctyne-amine (DBCO-NH2) Sigma Aldrich 761540 ACS reagent
N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Sigma Aldrich D125806 ACS reagent
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific BP231 Technical grade
HEK293 cell line ATCC CRL-1573 human embryonic kidney
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma Aldrich F1051 ACS reagent
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140122 10,000 U/mL
plasmid (pCAGGS-ChR2-Venus) Addgene 15753 Plasmid sent as bacteria in agar stab
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher 11965092 High glucose
opti-Modified Eagle Medium (MEM) Thermo Fisher 51985034 Reduced Serum Media
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher L3000015 Lipid-Based Transfection
N-Azidoacetylmannosamine, Acetylated (Ac4ManNAz) Sigma Aldrich A7605 ACS reagent
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher 25200056 Phenol red
Rhod-3 AM Calcium Imaging Kit Thermo Fisher R10145 Fluorescence dye
5-carboxytetramethylrhodamine-azide (Rhod-N3) Sigma Aldrich 760757 Azide-fluor 545
Confical dish ibidi GmbH 81158 Glass Bottom, 35 mm
50 ml conical centrifuge tubes Greiner Bio-One 227261 Polypropylene
15 ml conical centrifuge tubes Greiner Bio-One 188271 Polypropylene
1.5 ml conical microcentrifuge tubes Greiner Bio-One 616201 Polypropylene
Phenylmethyl silicone oil Clearco Products 63148-52-7 Less than 320 degrees Celsius
Glass thermometer GH Zeal L0111/10 From -10 to 360 degrees Celsius
12-well plate Sigma Aldrich Z707775 Polystyrene

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