Синтез ядро оболочка легированный лантаноиды Upconversion нанокристаллов для сотовых приложений

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Протокол представляется для синтеза ядро оболочка легированный лантаноиды upconversion нанокристаллов (универсальные) и их клеточных приложений для регулирования белок канала на ближней ИК-области спектра (NIR) света освещение.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ai, X., Lyu, L., Mu, J., Hu, M., Wang, Z., Xing, B. Synthesis of Core-shell Lanthanide-doped Upconversion Nanocrystals for Cellular Applications. J. Vis. Exp. (129), e56416, doi:10.3791/56416 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Легированный лантаноиды upconversion нанокристаллов (универсальные) привлекли большое внимание в последние годы, на основе их перспективных и controllable оптическими свойствами, которые позволяют для поглощения в ближней ИК-области спектра (NIR) света и впоследствии может преобразовать его в мультиплексированных выбросов, которые охватывают более широкий спектр регионов от УФ до видимой в НДК. Эта статья представляет подробные экспериментальные процедуры для совместного осадки высокой температуры синтеза ядро оболочка универсальные, которые включают различные лантаноиды ионов в нанокристаллов для эффективного преобразования глубокие ткани проницаемые NIR возбуждения (808 Нм) в сильной синий выбросов на 480 Нм. Контролируя модификации поверхности с Биосовместимых полимеров (полиакриловой кислоты, ПАА), подготовлена как универсальные приобретает большой растворимость в буферных растворов. Гидрофильные нанокристаллов далее функционализированных с конкретными лигандами (dibenzyl cyclooctyne, DBCO) для локализации на клеточной мембраны. По НИР свет (808 нм) облучения, upconverted синий выбросов может эффективно активировать свет закрытый канал белка на мембране клеток и конкретно регулировать приток катионита (например, Ca2 +) в цитоплазме. Этот протокол предоставляет возможные методологии для синтеза ядро оболочка легированный лантаноиды универсальные и последующих биосовместимых модификации поверхности для дальнейшей сотовой приложений.

Introduction

В последние годы легированный лантаноиды upconversion нанокристаллов (универсальные) широко используются как альтернатива обычных органических красителей и квантовые точки в биомедицинских приложений, которые основаны главным образом на их выдающиеся химические и оптические свойства, включая большой биосовместимость, высокая устойчивость к Фотообесцвечивание и выбросов узкой полосой пропускания1,2,3. Что еще более важно они могут служить перспективных nanotransducer с отличным ткани проникновения глубины в естественных условиях для преобразования NIR регионах через несколько фотонных и ближней ИК-области спектра (NIR) возбуждения в широкий спектр выбросов от УФ, видимой, upconversion процесс4,5. Эти уникальные свойства делают легированный лантаноиды универсальные служить вектором особенно многообещающим для зондирования биологических, биомедицинских изображений и заболеваний theranostics6,,78.

Общие компоненты универсальные основаны главным образом на легированных лантаноиды ионов в матрице изолирующие хост, содержащий сенсибилизатор (например, Yb3 +, Nd3 +) и активатор (например, Tm3 +, Er3 +, Хо 3 +) в рамках кристалл однородно9. Различные оптического излучения от нанокристаллов приписывается локализованные электронных перехода в пределах 4f орбитали лантаноиды активаторов вследствие их лестница как аранжированный энергетический уровень10. Таким образом важно, чтобы точно контролировать размер и морфология синтезированных универсальные с многокомпонентных лантаноиды активаторов. По праву некоторые перспективные методы хорошо созданы для подготовки легированный лантаноиды универсальные, включая термического разложения, Сопредседатель осадки высокой температуры, гидротермального синтеза, золь гель обработки, т. д.11 , 12 , 13 среди этих подходов, метод высокотемпературной Сопредседатель осадков является одним из наиболее популярным и удобным стратегий для синтеза универсальные, который строго контролироваться подготовить желаемого высокого качества нанокристаллов с единообразной формой и распределение по размерам в относительно короткое время реакции и лоу кост14. Однако большинство наноструктур синтезируется этот метод главным образом ограничен с гидрофобным лигандами как олеиновой кислоты и oleylamine, которые обычно препятствуют их дальнейшему bioapplication из-за ограниченной растворимости гидрофобные лиганд в водном растворе 15. Таким образом, это необходимо для выполнения подходящей поверхности природную подготовить биосовместимых универсальные в биологических приложений в пробирке и в естественных условиях.

Здесь мы представляем подробную экспериментальной процедуры для синтеза ядро оболочка универсальные наноструктур через метод совместного осадки высокой температуры и возможности модификации технику для functionalize Биосовместимых полимеров на поверхности универсальные для дальнейшее сотовой приложений. Это универсальные nanoplatform включает в себя три лантаноиды ионов (Yb3 +, Nd3 +и Tm3 +) в нанокристаллов приобретать сильное синий выбросов (~ 480 Нм) на свет возбуждения NIR 808 нм, который имеет большую глубину проникновения в живой ткани. Хорошо известно, что Nd3 +-легированный универсальные отображения свернутого водные эффекты поглощения и перегрева на этом спектральные окна (808 нм) по сравнению с обычными UCNs на 980 нм облучения16,17, 18. Кроме того, использовать универсальные в биологических системах, гидрофобные лигандами (олеиновая кислота) на поверхности универсальные, sonication в раствор кислоты19, во-первых, удаляются. Затем лиганд свободной Универсальные дальнейшие изменения с Биосовместимых полимеров (полиакриловой кислоты, ПАА) приобрести большой растворимость в водных растворах20. Кроме того, в качестве доказательства в концепция в клеточных приложений, универсальные гидрофильные далее функционализированных с молекулярной лигандами (dibenzyl cyclooctyne, DBCO) для конкретных локализации на N3-меткой клеточной мембраны. По НИР свет (808 нм) облучения, upconverted синий выбросов на 480 Нм можно эффективно активировать свет закрытого канала белок, channelrhodopsins-2 (ChR2), на поверхности клеток и таким образом облегчить приток катионита (например, Ca2 + ионный) через мембраны клеток живых.

Это видео протокол предусматривает возможные методологии легированный лантаноиды универсальные синтеза, биосовместимых модификации поверхности и универсальные bioapplication в живых клетках. Любые различия в методах синтеза и химические реактивы, используемые в Нанокристаллические роста будет влиять на размер распределения, морфология и upconversion Спектры люминесценции (UCL) окончательный универсальные наноструктур, используемая в экспериментах по ячейке. Этот подробный видео-протокол готов помочь новых исследователей в этой области для улучшения воспроизводимость универсальные с методом высокотемпературной Сопредседатель осадков и избежать наиболее распространенных ошибок в универсальные биосовместимых модификации поверхности для дальнейшей Сотовый приложений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

внимание: пожалуйста, проконсультируйтесь с все соответствующие листы данных безопасности материалов (MSDS) перед использованием. Пожалуйста, используйте все практики безопасности при выполнении синтез UCNs при высокой температуре (~ 290 ° C), включая использование инженерного управления (Зонта) и средств индивидуальной защиты (например, защитные очки, перчатки, лабораторный халат, Полная длина штаны и закрыты носок ботинки).

1. синтез NaYF 4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: ядро оболочка нанокристаллов Nd(20%)

  1. синтез NaYF 4: наноструктурированных основные Yb/Tm/Nd(30/0.5/1%)
    1. Подготовка RE (CH 3 CO 2) 3, Стоковый раствор NaOH, NH 4 F метанола
      Примечание: редкоземельные (пере) ионов лантаноиды включают иттрия (Y), иттербий (ИБ), Thulium (Tm) и неодима (Nd).
      1. Распустить 500 мг Yttrium(III) ацетата гидрата в 5 мл метанола (100 мг/мл), 250 мг иттербия (III) ацетат гидрат в 5 мл метанола (50 мг/мл), 10 мг тулия (III) ацетат гидрат в 1 мл метанола (10 мг/мл) и 10 мг неодима (III) ацетат гидрат в 1 мл мета Нол (10 мг/мл) в стеклянных флаконах с ультразвуковой очистки ванна для 2 мин
      2. Объединить 400 мг NaOH в 50 мл пластиковых пробирок с 20 мл метанола с ультразвуковой очистки ванной подготовить раствор NaOH (20 мг/мл).
      3. Объединить 600 мг NH 4 F в 50 мл пластиковых пробирок с 30 мл метанола с ультразвуковой очистки ванной подготовить NH 4 F Стоковый раствор (20 мг/мл).
        Примечание: Место Стоковый раствор лантаноиды комплексов, NaOH и NH 4 F в стеклянных флаконах, печать с парафина и хранить их в холодильнике в ~ 4 ° C до тех пор, пока требуется. Подготовленные метанола акций решения заменяются каждые 2 недели.
    2. NaYF подготовка 4: Yb/Tm/Nd наноструктурированных основные
      1. Пипетка 3 мл олеиновой кислоты и 7 мл 1-octadecene в колбе три шеи 50-мл.
      2. Решение
      3. объединить 1.089 мл Y (CH 3 CO 2) 3 Стоковый раствор, 0,608 мл Yb (CH 3 CO 2) 3 Стоковый раствор, 83,6 мкл акций 3 ТМ (CH 3 CO 2), и 128,5 мкл раствора Nd (CH 3 CO 2) 3 штока в колбу.
      4. Установите термометр (диапазон 0 - 360 ° C) в колбу и пусть его кончик сенсорных решение. Место колбу в стеклянной таре с phenylmethyl силиконовое масло.
      5. Тепло решение до 100 ° C с плитой для испарения от метанола. Соедините колбу Шленк линию с двойной вакуум/газ коллектор, чтобы удалить остаточные метанола и сохранить реакционной смеси под вакуумом для 2-3 мин, помешивая.
      6. Увеличить температуру до 150 ° C и держать эту температуру 60 мин поддерживать перемешивания скорость 700 об/мин во время синтеза.
        Примечание: Установить умеренной перемешивания скорость избежать разбрызгивания раствора.
      7. Остановить поджарки и держать флакон при комнатной температуре, чтобы позволить решения остыть медленно.
        Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
      8. Стоковый раствор
      9. объединить 2 мл метанола NaOH и 2.965 мл NH 4 F-метанол Стоковый раствор в пластиковых пробирок 15мл. Затяните трубу с его шапку и mix решение на мощных vortexing для 5 s.
      10. Добавление NaOH-NH 4 F смесь медленно в колбу на стеклянной пипетки более 5 мин.
      11. Повышение температуры смеси до 50 ° C и поддержания этой температуры на 30 мин
        Примечание: Установите температуру на не более чем на 50 ° C, потому что высокая температура будет способствовать кристалл зарождения и роста.
      12. Повышение температуры (~ 100 ° C) испаряется от метанола и соединить настой Шленк линии с двойной вакуум/газ коллектор, чтобы удалить остаточные метанола и сохранить реакционную смесь под вакуумом для 2-3 мин
      13. Переключатель позиции запорный заполнить колбу с азотом.
      14. Увеличение температуры до 290 ° C ~ 5 ° C/мин со скоростью нагревания держать смесь реакции на 290 ° С в течение 1,5 ч.
      15. Остановить поджарки и удалить колбу разрешить реакционную смесь медленно остыть при комнатной температуре помешивая.
        Предупреждение: Будьте осторожны с горячей плиты с высокой температурой (> 400 ° C) чтобы избежать тяжелых ожогов при контакте кожи.
      16. Передача смеси в колбу в 50 мл пластиковых пробирок. Промойте колбу с 30 мл этанола и передать решение пластиковых пробирок.
      17. Центрифуга продукта на 4000 × g 8 мин при комнатной температуре и удалить супернатант.
      18. Добавить 10 мл гексана для пластиковых пробирок и повторно дисперсных продукт с sonication (60 кГц, 240 Вт) для 2 мин
      19. Добавить 30 мл этанола в трубку. Спин вниз продукт на 4000 × g 8 мин и затем удалить супернатант.
      20. Повторно дисперсных твердых продуктов в нижней части пластиковых пробирок с 5 мл гексана. Хранить в холодильнике в ~ 4 ° C для следующего шага решения.
        Примечание: Upconversion выбросов ядро оболочка универсальные проверяется путем облучения решения с 808 нм лазер (2 Вт).
  2. Подготовка NaYF 4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%) @NaYF 4: ядро оболочка нанокристаллов Nd(20%)
    1. объединить 3 мл олеиновой кислоты и 7 мл 1-octadecene в колбе три шеи 50-мл. Добавьте 1.082 мл раствора штока 3 Y (CH 3 CO 2) и 2,87 мл Nd (CH 3 CO 2) 3 Стоковый раствор в колбу.
    2. Добавить полученное ядро наноструктур (80 мг в 5 мл гексана из шага 1.1.2.18) в колбу помешивая.
    3. Установите термометр (диапазон 0 - 360 ° C) в колбу и пусть его кончик сенсорных смеси. Место колбу в стеклянной таре с phenylmethyl силиконовое масло.
    4. Тепло смеси на 100 ° C на верхней плитой для испарения метанола и гексан. Соедините колбу Шленк линию с двойной вакуум/газ коллектор для удаления остаточного растворителя и держать реакционной смеси под вакуумом для 2-3 мин, помешивая.
    5. Увеличить температуру до 150 ° C и держать его на 60 мин поддерживать скорость перемешивания на 700 об/мин в синтезе.
      Примечание: Установить умеренной перемешивания скорость избежать разбрызгивания раствора.
    6. Остановить поджарки и удалить колбу разрешить решение медленно остыть при комнатной температуре.
      Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
    7. Стоковый раствор
    8. пипетки 2 мл метанола NaOH и 2.965 мл NH 4 F-метанол Стоковый раствор в пластиковых пробирок 15мл. Затяните трубу с его шапку и mix решение на мощных vortexing для 5 s.
    9. Добавить смесь в колбу на стеклянной пипетки медленно более 5 мин.
    10. Повышение температуры смеси до 50 ° C и держать его на 50 ° C за 30 мин
      Примечание: Установить температуру не выше 50 ° C, потому что высокая температура будет способствовать кристалл зарождения и роста.
    11. Повышение температуры (~ 100 ° C) испаряется от метанола и соединить настой Шленк линии с двойной вакуум/газ коллектор для удаления остаточного метанола, сохраняя реакционную смесь под вакуумом для 2-3 мин
    12. Переключатель позиции запорный заполнить колбу с азотом.
    13. Повышение температуры до 290 ° C ~ 5 ° C/мин со скоростью нагревания держать реакционной смеси на 290 ° С в течение 1,5 ч.
    14. Остановить поджарки и удалить колбу разрешить реакционную смесь медленно остыть при комнатной температуре помешивая.
      Предупреждение: Будьте осторожны с горячей плиты с высокой температурой (> 400 ° C) чтобы избежать тяжелых ожогов при контакте кожи.
    15. Передача смеси в колбу в 50 мл пластиковых пробирок. Промойте колбу с 30 мл этанола и передать решение пластиковых пробирок.
    16. Центрифуга продукта на 4000 × g 8 мин при комнатной температуре и удалить супернатант.
    17. Добавить 10 мл гексана для пластиковых пробирок и повторно дисперсных продукт с sonication (60 кГц, 240 Вт) для 2 мин
    18. Добавить 30 мл этанола в трубку. Спин вниз продукт на 4000 × g 8 мин и затем удалить супернатант.
    19. Повторно дисперсных твердых продуктов в нижней части пластиковых пробирок с 5 мл гексана. Хранить в холодильнике в ~ 4 ° C до тех пор, пока необходимое решение.
      Примечание: Upconversion выбросов ядро оболочка универсальные проверяется путем облучения решения с 808 нм лазер (2 Вт).

2. Синтеза биологически универсальные наноструктур

  1. Подготовка лиганд свободной Универсальные наночастиц
    1. объединить 30 мл этанола с как подготовленные ограничен олеат универсальные решения (шаг 1.2.18) в 50 мл пластиковых пробирок. Центрифуга смеси на 4000 × g 8 мин при комнатной температуре и удалить супернатант.
    2. Объединить 10 мл кислоты водный раствор (pH = 4) регулируется HCl (0,1 М) с осадка в 50 мл пластиковых пробирок и растворить осадок sonication (60 кГц, 240 Вт) для 30 мин
    3. Передача решения в стакане флакон с энергичной перемешивании в течение 2 ч.
    4. Экстракт водный раствор с 30 мл диэтиловом эфире повторить три раза, чтобы удалить олеиновая кислота.
    5. Добавить 10 мл воды в слоях комбинированных эфира с нежным пожимая.
    6. Собирать водной фазы вместе (20 мл) и добавить 20 мл ацетона с vortexing для 5 s.
    7. Спин вниз продукта на 35000 g × 10 мин и затем удалить супернатант. Осадка в 2 мл воды растворяют.
  2. Подготовка полимера изменены универсальные (ПАА-UCNs)
    1. объединить 200 мг полиакриловой кислоты (ПАА, Mw = 1800) с 20 мл воды, sonication (60 кГц, 240 Вт) для 20 минут добавить вышеупомянутые универсальные лиганд бесплатно в раствор ПАА с энергичным перемешиванием.
    2. Настроить значение рН 7,4, раствор NaOH (1 М) с sonication (60 кГц, 240 Вт) за 30 мин держать смесь для 24 ч при комнатной температуре помешивая.
    3. Собрать осадок центрифугированием в 35 000 × g на 10 мин вновь приостановить продукт в 10 мл воды, sonication (60 кГц, 240 Вт) на 5 мин и центрифуги снова на 35000 g × 10 мин повторить этот шаг три раза.
    4. Повторно дисперсных продукт в 8 мл воды, sonication (60 кГц, 240 Вт) для 5 минут хранить решение в холодильнике на ~ 4 ° C до тех пор, пока требуется.
  3. Подготовка функциональной DBCO-универсальные наночастиц
    1. спин вниз как подготовлен PAA@UCNs (1 мг) центрифугированием в 35 000 × g на 10 мин вновь приостановить осадок в 1 мл сухого ДМФ, sonication (60 кГц, 240 Вт) за 1 мин и центрифуги снова на 35000 g × 10 мин повторить этот шаг два раза.
    2. Растворяют осадок в 200 мкл сухой ДМФ в стеклянный флакон. Добавить HOBT (12,2 мг), EDC (14 мг), DBCO-NH 2 (5 мг) и DIPEA (16 мкл) во флаконе с магнитным перемешивании за 24 ч.
    3. Собирать продукт центрифугированием на 35000 g × 10 минут удалить супернатант и вновь приостановить осадок в 1 мл ДМСО и центрифуги снова на 35000 g × 10 мин повторить этот шаг три раза.
    4. Разгонять продукт в 0,2 мл ДМСО и хранить в холодильнике в ~ 4 ° C перед использованием.

3. Bioapplications DBCO-универсальные правила мембраны каналах в живущих клетках

  1. HEK293 культуры клеток в Дульбекко ' s Modified Eagle ' s среднего (DMEM) с 10% FBS, 100 единиц/мл пенициллин, стрептомицин 100 мкг/мл и поддерживать в увлажненные инкубатор с 5% CO 2 при 37 ° C. семян 1 × 10-5 клеток в 1 мл DMEM/колодец в пластине 12-Ну и держать его в инкубаторе для 24 h.
  2. Объединить плазмида (pCAGGS-ChR2-Венера, 1 мкг) с P3000 трансфекции реагента (2 мкл) в Орел ' s минимум основных СМИ (MEM) (100 мкл) в microcentrifuge метро A и добавить трансфекции реагента (1,5 мкл) в MEM (100 мкл) в трубу б.
  3. Инкубировать смесь растворов в пробирках A и B за 10 мин при комнатной температуре.
  4. Сочетать решение в трубке A и B с 400 мкл MEM. Вымыть клетки с 1 мл сыворотки свободной среде DMEM дважды.
  5. Добавить смесь трансфекции 600 мкл в каждой скважине плиты 12-Ну и инкубировать клетки при 37 ° C инкубатор для 4 h. удалить носитель и мыть дважды с 1 мл DMEM.
  6. Добавьте 1 mL DMEM, содержащие 1 мкл Ac 4 Манназ (50 мм в ДМСО) в скважине и держать его в инкубаторе для 2 дней.
  7. Удалить носитель и мыть раз с 1 мл PBS. Добавьте 1 mL раствор трипсина-ЭДТА (0,25%) в каждой скважине 12-ну пластины и инкубировать при 37 ° C, до тех пор, пока клетки отдельный (~ 2 мин). Повторно культуры клеток в конфокальных блюдо на 1 × 10-5 клеток/хорошо в 1 мл DMEM для ночевки.
  8. Удалять среды и добавьте 1 mL свежих DMEM с 2 мкл DBCO-универсальные (50 мг/мл) в блюдо в течение 2 часов при 37 ° C. Конфокальная томография, вымыть клетки дважды с DMEM и добавить 1 мкл Rhod.-N 3 (10 мм) для 30 мин
  9. Для анализа внутриклеточного кальция, инкубации клеток со смесью 1 мкл кондицио-3 AM (10 мм), 10 мкл Пробенецид (250 мм) и 10 мкл загрузки буфера (плюрониевого ПАВ polyols,0.1% w/v)) в среде DMEM 1 мл за 30 мин в темноте.
  10. Мыть ячейки с сыворотка бесплатно DMEM и облучение светом NIR 808 нм в дозировке 0,8 Вт/см 2 для 20 минут (5 минут перерыв после освещения 5 мин).
  11. Запись изображений результаты на confocal микроскопа (лазерный источник: 561 Нм лазер; диапазон детектора: 610/75 Нм; линзы: 100 x 1.4 NA масло, время экспозиции: 100 мс). Добавьте 1 mL раствор трипсина-ЭДТА (0,25%) в каждой скважине и инкубировать при 37 ° C, до тех пор, пока клетки отдельный (~ 2 мин). Вновь приостановить клеток в 1 мл PBS для анализа потока цитометрии (FCM) (Ex: 561 Нм, Em: 582/15 Нм).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Процесс схема синтеза ядро оболочка легированный лантаноиды универсальные показаны на рисунке 1 и на рисунке 2. Соответственно были собраны просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) и электронной микроскопии (HRTEM) изображений с высоким разрешением передачи ядро и ядро оболочка универсальные наноструктур (рис. 1). Лиганд свободной Универсальные готовятся путем удаления гидрофобные олеиновой кислоты на поверхности универсальные в раствор кислоты и изменен с гидрофильного полимера (ПАА). Затем с DBCO-NH2 являются функционализированных СООН максимум ПАА-универсальные реакции конденсации Амида. ТЕА образы лиганд-универсальные, ПАА-универсальные и DBCO-универсальные показаны на рисунке 2. Динамическое рассеяние света (DLS), Зета потенциальных результатов и upconversion Спектры люминесценции (UCL) DBCO-универсальные собираются соответственно (рис. 3). Фурье преобразование инфракрасной спектроскопии (FTIR) DBCO-NH2, ЧУК-UCNs и DBCO-универсальные представлены на рисунке 4.

В ячейке экспериментов успешное выражение ChR2 на клеточной мембране подтверждается очевидный Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) маркер (Венера) с помощью конфокальной микроскопии (Рисунок 5A). DBCO-универсальные специально локализованы на поверхности клеток выразить ChR2 HEK293 нажмите реакции (рис. 5A). Анализ внутриклеточного кальция при легкой стимуляции NIR подтверждается также конфокальный цитометрии изображений и потока (FCM) на основе стандартных люминесцентных Ca2 + индикатор, кондицио-3 утра (Рисунок 5B, C).

Figure 1
Рисунок 1. Синтез ядро оболочка лантаноиды легированный UCNs. (A) схематическое изображение процесса синтеза универсальные. (B, C) ТЕА ядра (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1 %)) и ядро оболочка (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%)@NaYF4: Nd (20 %)) универсальные наноструктур. Линейки: 50 Нм. Вставка: HRTEM изображения ядро и ядро оболочка универсальные наноструктур. Линейки: 5 Нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2. Синтез функциональных наноструктур UCNs. (A) схематическое изображение процесса синтеза лиганд-универсальные, ПАА-универсальные и DBCO-универсальные, соответственно. (B, C, D) ТЕА образы лиганд-универсальные, ПАА-универсальные и DBCO-UCNs. Линейки: 100 Нм в группе B и 50 Нм в панели C/D. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3. Спектроскопия FTIR DBCO-NH2, ЧУК-UCNs и DBCO-универсальные, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4. Характеристика DBCO-универсальные в буферном растворе. (A) DLS результаты DBCO-универсальные. (B) Zeta потенциальные результаты ПАА-UCNs и DBCO-универсальные (средний ± SD). (C) UCL спектры ядро и ядро оболочка универсальные в гексане (1 мг/мл), ЧУК-UCNs и DBCO-UCNs в воде (1 мг/мл) отдельно (Ex: 808 нм). Врезные: фотография люминесценции универсальные с 808 нм облучения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5. Сотовый применения DBCO-универсальные по НИР свет освещение. (A) конфокальная томография ChR2-выражая N3-меткой HEK293 клетки инкубировали с DBCO-универсальные (вверху) и ПАА-универсальные (дне) за 2 ч при 100 мкг/мл. Зеленый: ChR2-Венера (Ex: 488 нм, Em: 530/50 Нм), синий: универсальные (Ex: 543 Нм, Em: 580/50 Нм). Линейки: 20 µm. (B) сотовых Ca2 + изображений с кондицио-3 утра до и после облучения NIR-свет (0,8 Вт/см2 20 мин). Ex: 561 Нм, Em: 610/75 Нм. Линейки: 10 мкм. (C) количественные ТСМ анализ интенсивности нормализованных флуоресценции клеточных Ca2 + с различные дозировки света освещение (среднее ± SD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Эта статья представил метод синтеза ядро оболочка легированный лантаноиды upconversion нанокристаллов (универсальные) и их модификации поверхности с функциональной постановление для сотовых приложений. Этот роман Наноматериал обладает выдающиеся оптические свойства, выделяющие УФ и видимый свет на НИР света возбуждения через несколько фотонных upconversion процесса. В этом протоколе, ядро оболочка универсальные наноструктур (NaYF4: Yb/Tm/Nd (30/0.5/1%)@NaYF4: Nd (20 %)) готовятся методом высокотемпературной Сопредседатель осадков в смесь олеиновой кислоты и 1-octadecene. ТЕА изображения продемонстрировать морфологии этих ядро и ядро оболочка нанокристаллов сферическую форму с диаметром 20 Нм и 30 Нм соответственно, подразумевая оболочка толщиной около 5 Нм (рис. 1). Ядро оболочка архитектура также свидетельствуют изображения с высоким разрешением ТЕА в врезные Рисунок 1, который показывает аналогичные решетка полосы с этим основные универсальные наноструктур. Кроме того типичной d-расстояние вокруг 0,52 Нм соглашается также с интервалом (100) плоскости β-NaYF4, указав, что все ядро и ядро оболочка универсальные наноструктур высоко кристаллизуется и поддерживать такую же структуру кристалла. Кроме того, Спектры люминесценции upconversion продемонстрировать ядро оболочка нанокристаллов испускают сильный синий выбросов с гораздо более высокой интенсивностью на 480 Нм чем частицы ядра после возбуждения с Лазер диода для достижения непрерывная волна 808 нм ( Рисунок 4 c). Повышение выбросов ядро оболочка универсальные приписывается подавлены поверхности тушения эффект Yb3 +, Nd3 +и Tm3 + ионов, которые внедряются в внутренний слой ядро оболочка нанокристаллов21. Эти результаты подтверждают сильно успешной подготовки легированный лантаноиды ядро оболочка универсальные Наноматериал в это предложение.

Есть несколько важных шагов в высокотемпературных Сопредседатель осадков синтез этих нанокристаллов. Во-первых, добавлен объем лантаноиды Ион Стоковый раствор в процессе синтеза UCNs ядро и ядро оболочка должна строго контролироваться (шаг 1.1.2.2). Высокий уровень допинг ионов приведет к связанные с концентрацией кросс релаксации или тушения эффект за счет взаимодействия иона Ион в нанокристаллов21. Во-вторых температура должна быть сохранена в менее чем на 50 ° C для обеспечения полной кристаллизации после добавления NaOH и NH4F в колбу (шаг 1.1.2.9 и шаг 1.2.9), который имеет решающее значение для обеспечения единообразного морфология путем поощрения роста кристаллов, основанный на Ostwald созревания эффекты22. В-третьих размер и оптические свойства наночастиц ядро оболочка может главным образом управляться, регулируя количество ионов лантаноиды прекурсорами оболочки (Y3 + и Nd3 +) и подготовлен как основных частиц (шаг 1.2.1). Важно также, что морфология ядро оболочка нанокристаллов основывается на анизотропной оболочки роста различных видов основных частиц, который является полезным для различных оптических выбросов универсальные по НИР света освещение23модулируя.

Кроме того это также значительный вызов эффективно конвертировать гидрофобные универсальные гидрофильные универсальные наночастиц для дальнейшего биологических приложений. Хотя некоторые методы, как сообщается, улучшить биосовместимость универсальные в буферном растворе, включая обмен лигандом, кремнезема покрытие, олеат укупорочные лигандом окисления и т.д., они страдают от неожиданных агрегации, много времени, и сложные процедуры24,25,26. Здесь, мы разрабатываем простой подход для получения воды дисперсных лиганд свободной Универсальные наноструктур, удалив олеиновой кислоты на поверхности ограничен олеат универсальные в растворе кислоты воды (рН = 4). Значение pH регулируется HCl имеет решающее значение для контроля выпуска олеат лиганда и влиять на люминесценции универсальные. Более важно биосовместимых полимерных (полиакриловой кислоты, ПАА) с большое количество карбоксильных, которую группы можно связать с ионами лантаноиды на поверхности универсальные по координации взаимодействия, который обеспечит более функциональные группы для дальнейшей химической модификация. Таким образом, мы functionalize DBCO-NH2 постановление на поверхности универсальные для дальнейших конкретных N3-меткой локализации клеточной мембраны. ТЕА образы лиганд-универсальные, ПАА-универсальные и DBCO-UCNs на рисунке 2 демонстрируют большой дисперсности и растворимость этих наноструктур в буферном растворе после модификации поверхности. Кроме того ИК-спектроскопии (FTIR) преобразование Фурье была проведена характеризовать модификации поверхности DBCO групп на универсальные nanoplatform. Как показано на рисунке 3, из-за растяжения вибрации карбоксильных групп H-O сильный полоса вокруг 3,430 см-1 , и две полосы, центрированного 1550 см-1 и 1458 см-1 связано с асимметричным и симметричный растяжения режимы вибрации карбоксилат анионов, указывающий успешное покрытие COOH группа содержащих полимеров (ПАА) на поверхности UCNP. После реакции с DBCO-NH2 постановление присутствует очевидный band в 1635 см-1 , основанный на C = C растяжения вибрации на ароматическое кольцо DBCO групп, которая согласуется с ФУРЬЕ спектр DBCO-NH2 постановление в то же волновое число. Кроме того, результат динамического рассеяния света (DLS) указывает на повышение гидродинамического диаметр DBCO-UCNs в водном растворе (96.4±10.4 Нм) (рис. 4A). Зета потенциальные результаты свидетельствуют также о негативных поверхности ПАА-универсальные (-26.1±4.4 мВ) и DBCO-UCNs (-11.9±5.6 МВ) соответственно (рис. 4B), демонстрируя большой растворимость и стабильности этих наноструктур в буферном растворе. Кроме того, UCL спектры ПАА-UCNs и DBCO-универсальные продемонстрировать, что они могут излучать аналогичные upconverted выбросов на 480 Нм на 808 нм света облучения (рис. 4 c), которые могут быть использованы для дальнейшего NIR-опосредованной photoactivation в биологических систем.

Кроме того, как доказательство концепции, с тем чтобы продемонстрировать bioapplication функционализированных универсальные в живых клетках свет закрытом канале белком (ChR2) разработан на поверхности клеток регулировать клеточных функций посредничества притока ионов катиона (например, Ca2 +) в цитоплазме27,,2829. Успешное выражение ChR2 на мембране клеточной линии HEK293 подтверждается присутствие зеленого флуоресцентного белка (ГПУП) маркера (Венера) с помощью конфокальной микроскопии (Рисунок 5A). Кроме того Локализация Универсальные на N3-тегами клеточной мембраны очевидно визуализируется на поверхности клеток (синий) после 2 ч инкубации, который можно объяснить тот факт, что остаточные группы DBCO на поверхности универсальные наноструктур окрашенные с Азид содержащих флуоресцентные краски (5-carboxytetramethylrhodamine азид, кондицио-N3) через bioorthogonal медно бесплатно нажмите реакции. Кроме того свет NIR (808 нм) используется, чтобы облучить локализованные универсальные nanotransducer на поверхности клеток, которые можно активироватьChR2 свет закрытый канал белков и облегчить Ca2 + ионный приток через мембрану. Как показано на рисунке 5B, наблюдается значительное увеличение красной флуоресценции в цитозоле стандартных люминесцентных Ca2 + индикатор, кондицио-3 утра, хотя нет очевидной флуоресценции приращение записывается в отсутствие света освещения. Цитометрии (FCM) анализ количественных потоков в рисунке 5 c также демонстрирует, что такие NIR-свет отзывчивым повышение флуоресценции свет дозозависимое, четко о том, что биосовместимых DBCO-универсальные может эффективно регулировать канал белков на клеточной мембране после облучения NIR-свет.

В целом основываясь на результатах вышеупомянутого, мы ожидаем, что настоящий Протокол не только предоставляет подробные экспериментальные процедуры для синтеза высокотемпературных Сопредседатель осадков ядро оболочка универсальные наноструктур, но и развивает простой техника для биосовместимых модификации поверхности универсальные для дальнейшего NIR-опосредованной photoactivation в биологических приложениях. Что еще более важно, основываясь на обоснование этого метода, оптические свойства универсальные далее регулируется допинг различные виды лантаноиды ионов (например, эрбия (III), гольмия (III), и т.д.) в кристаллах для излучают УФ, зеленый, красный, и NIR света на свет облучения 808 нм30. Кроме того универсальные поверхность может быть также изменен с различными функциональными группами (например, пептид, белков, липидов, ориентация лиганда и т.д.) для дальнейшего биомедицинских приложений31,32. Эти преимущества делают биосовместимых универсальные Наноматериал подходящим кандидатом для изучения физиологических процессов в пробирке и в естественных условияхи таким образом может действовать как персонализированные наномедицины для клинических theranostics в будущем.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У нас есть ничего не разглашать.

Acknowledgements

Эта работа была частично поддерживается НТУ-МТА-MUV ДН/16001, RG110/16 (S), (RG 11/13) и (RG 35/15) награжден в Nanyang технологический университет, Сингапур и национальные естественные науки фонд из Китая (NSFC) (№ 51628201).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Octadecene Sigma Aldrich O806 Technical grade
oleic acid Sigma Aldrich 364525 Technical grade
Methanol Fisher Scientific A412 Technical grade
Ethanol Fisher Scientific A405 Technical grade
Acetone Fisher Scientific A18 Technical grade
Hexane Sigma Aldrich H292 Technical grade
Thulium (III) acetate hydrate (Tm(CH3CO2)3) Sigma Aldrich 367702 99.9% trace metals basis
Neodymium (III) acetate hydrate (Nd(CH3CO2)3) Sigma Aldrich 325805 99.9% trace metals basis
Ytterbium (III) acetate hydrate (Yb(CH3CO2)3) Sigma Aldrich 326011 99.9% trace metals basis
Yttrium(III) acetate hydrate (Y(CH3CO2)3) Sigma Aldrich 326046 99.9% trace metals basis
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich S5881 reagent grade
Ammonium fluoride (NH4F) Sigma Aldrich 338869 ACS reagent
Hydrogen chloride (HCl) Fisher Scientific A144 reagent grade
polyacrylic acid (PAA) Sigma Aldrich 323667 average Mw 1800
1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT) Sigma Aldrich 54802 ACS reagent
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) Sigma Aldrich E7750 commercial grade
Dibenzocyclooctyne-amine (DBCO-NH2) Sigma Aldrich 761540 ACS reagent
N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Sigma Aldrich D125806 ACS reagent
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific BP231 Technical grade
HEK293 cell line ATCC CRL-1573 human embryonic kidney
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma Aldrich F1051 ACS reagent
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher 15140122 10,000 U/mL
plasmid (pCAGGS-ChR2-Venus) Addgene 15753 Plasmid sent as bacteria in agar stab
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher 11965092 High glucose
opti-Modified Eagle Medium (MEM) Thermo Fisher 51985034 Reduced Serum Media
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Thermo Fisher L3000015 Lipid-Based Transfection
N-Azidoacetylmannosamine, Acetylated (Ac4ManNAz) Sigma Aldrich A7605 ACS reagent
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher 25200056 Phenol red
Rhod-3 AM Calcium Imaging Kit Thermo Fisher R10145 Fluorescence dye
5-carboxytetramethylrhodamine-azide (Rhod-N3) Sigma Aldrich 760757 Azide-fluor 545
Confical dish ibidi GmbH 81158 Glass Bottom, 35 mm
50 ml conical centrifuge tubes Greiner Bio-One 227261 Polypropylene
15 ml conical centrifuge tubes Greiner Bio-One 188271 Polypropylene
1.5 ml conical microcentrifuge tubes Greiner Bio-One 616201 Polypropylene
Phenylmethyl silicone oil Clearco Products 63148-52-7 Less than 320 degrees Celsius
Glass thermometer GH Zeal L0111/10 From -10 to 360 degrees Celsius
12-well plate Sigma Aldrich Z707775 Polystyrene

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, F., et al. Tuning upconversion through energy migration in core-shell nanoparticles. Nat Mater. 10, (12), 968-973 (2011).
  2. Liu, Y., et al. Amplified stimulated emission in upconversion nanoparticles for super-resolution nanoscopy. Nature. 543, (7644), 229-233 (2017).
  3. Fan, W., Bu, W., Shi, J. On The Latest Three-Stage Development of Nanomedicines based on Upconversion Nanoparticles. Adv Mater. 28, (24), 3987-4011 (2016).
  4. Zhu, X., et al. Temperature-feedback upconversion nanocomposite for accurate photothermal therapy at facile temperature. Nat Commun. 7, 10437-10446 (2016).
  5. Li, W., Wang, J., Ren, J., Qu, X. Near-infrared upconversion controls photocaged cell adhesion. J Am Chem Soc. 136, (6), 2248-2251 (2014).
  6. Min, Y., Li, J., Liu, F., Yeow, E. K., Xing, B. Near-infrared light-mediated photoactivation of a platinum antitumor prodrug and simultaneous cellular apoptosis imaging by upconversion-luminescent nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53, (4), 1012-1016 (2014).
  7. Yang, D., Ma, P., Hou, Z., Cheng, Z., Li, C., Lin, J. Current advances in lanthanide ion (Ln(3+))-based upconversion nanomaterials for drug delivery. Chem Soc Rev. 44, (6), 1416-1448 (2015).
  8. Wang, C., Cheng, L., Liu, Z. Upconversion nanoparticles for photodynamic therapy and other cancer therapeutics. Theranostics. 3, (5), 317-330 (2013).
  9. Li, L. L., et al. Biomimetic surface engineering of lanthanide-doped upconversion nanoparticles as versatile bioprobes. Angew Chem Int Ed. 51, (25), 6121-6125 (2012).
  10. Wang, J., Ming, T., Jin, Z., Wang, J., Sun, L. D., Yan, C. H. Photon energy upconversion through thermal radiation with the power efficiency reaching 16%. Nat Commun. 5, 5669-5678 (2014).
  11. Zou, W., Visser, C., Maduro, J. A., Pshenichnikov, M. S., Hummelen, J. C. Broadband dye-sensitized upconversion of near-infrared light. Nat Photonics. 6, (8), 560-564 (2012).
  12. Liu, Y., Tu, D., Zhu, H., Li, R., Luo, W., Chen, X. A strategy to achieve efficient dual-mode luminescence of Eu(3+) in lanthanides doped multifunctional NaGdF(4) nanocrystals. Adv Mater. 22, (30), 3266-3271 (2010).
  13. Min, Y., Li, J., Liu, F., Padmanabhan, P., Yeow, E. K., Xing, B. Recent Advance of Biological Molecular Imaging Based on Lanthanide-Doped Upconversion-Luminescent Nanomaterials. Nanomaterials. 4, (1), 129-154 (2014).
  14. Li, X., Zhang, F., Zhao, D. Lab on upconversion nanoparticles: optical properties and applications engineering via designed nanostructure. Chem Soc Rev. 44, (6), 1346-1378 (2015).
  15. Gu, Z., Yan, L., Tian, G., Li, S., Chai, Z., Zhao, Y. Recent advances in design and fabrication of upconversion nanoparticles and their safe theranostic applications. Adv Mater. 25, (28), 3758-3779 (2013).
  16. Dong, H., Sun, L. D., Yan, C. H. Energy transfer in lanthanide upconversion studies for extended optical applications. Chem Soc Rev. 44, (6), 1608-1634 (2015).
  17. Ai, X., et al. In vivo covalent cross-linking of photon-converted rare-earth nanostructures for tumour localization and theranostics. Nat Commun. 7, 10432-10440 (2016).
  18. Lu, S., et al. Multifunctional Nano-Bioprobes Based on Rattle-Structured Upconverting Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 54, (27), 7915-7919 (2015).
  19. Bogdan, N., Vetrone, F., Ozin, G. A., Capobianco, J. A. Synthesis of ligand-free colloidally stable water dispersible brightly luminescent lanthanide-doped upconverting nanoparticles. Nano Lett. 11, (2), 835-840 (2011).
  20. Zheng, W., Huang, P., Tu, D., Ma, E., Zhu, H., Chen, X. Lanthanide-doped upconversion nano-bioprobes: electronic structures, optical properties, and biodetection. Chem Soc Rev. 44, (6), 1379-1415 (2015).
  21. Chen, X., Peng, D., Ju, Q., Wang, F. Photon upconversion in core-shell nanoparticles. Chem Soc Rev. 44, (6), 1318-1330 (2015).
  22. Wang, F., Deng, R., Liu, X. Preparation of core-shell NaGdF4 nanoparticles doped with luminescent lanthanide ions to be used as upconversion-based probes. Nat Protoc. 9, (7), 1634-1644 (2014).
  23. Chen, G., Agren, H., Ohulchanskyy, T. Y., Prasad, P. N. Light upconverting core-shell nanostructures: nanophotonic control for emerging applications. Chem Soc Rev. 44, (6), 1680-1713 (2015).
  24. Yang, Y., et al. In vitro and in vivo uncaging and bioluminescence imaging by using photocaged upconversion nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 51, (13), 3125-3129 (2012).
  25. Sedlmeier, A., Gorris, H. H. Surface modification and characterization of photon-upconverting nanoparticles for bioanalytical applications. Chem Soc Rev. 44, (6), 1526-1560 (2015).
  26. Hu, M., et al. Near infrared light-mediated photoactivation of cytotoxic Re(I) complexes by using lanthanide-doped upconversion nanoparticles. Dalton Trans. 45, (36), 14101-14108 (2016).
  27. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci USA. 100, (24), 13940-13945 (2003).
  28. Ai, X., et al. Remote Regulation of Membrane Channel Activity by Site-Specific Localization of Lanthanide-Doped Upconversion Nanocrystals. Angew Chem Int Ed. 56, (11), 3031-3035 (2017).
  29. Xie, R., et al. In vivo metabolic labeling of sialoglycans in the mouse brain by using a liposome-assisted bioorthogonal reporter strategy. Proc Natl Acad Sci USA. 113, (19), 5173-5178 (2016).
  30. Bansal, A., Zhang, Y. Photocontrolled nanoparticle delivery systems for biomedical applications. Acc Chem Res. 47, (10), 3052-3060 (2014).
  31. Yang, Y., Aw, J., Xing, B. Nanostructures for NIR light-controlled therapies. Nanoscale. 9, (11), 3698-3718 (2017).
  32. Ai, X., Mu, J., Xing, B. Recent Advances of Light-Mediated Theranostics. Theranostics. 6, (13), 2439-2457 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics