毛细管阵列中多核酸的视觉检测

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Bioengineering

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Summary

该协议描述了一个小的, 现成的卡带的制作, 可用于视觉检测的多个核酸在一个单一的测试, 这是易于操作。在这种方法中, 用毛细管阵列对转基因生物的目标进行多重和高效的检测。

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Chen, J., Shao, N., Hu, J., Li, R., Zhu, Y., Zhang, D., Guo, S., Hui, J., Liu, P., Yang, L., Tao, S. C. Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array. J. Vis. Exp. (129), e56597, doi:10.3791/56597 (2017).

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Abstract

在疾病诊断、微生物监测、转基因生物体 (转基因) 检测中迫切需要多目标、短期和资源可承受的多种核酸检测方法, 并法医分析我们先前描述的平台称为平静 (Capillary Array-based Loop 介导的等温放大为Multiplex 视觉检测核酸)。在此, 我们描述了改进的制造和性能的过程, 这个平台。在这里, 我们应用一个小的, 现成的磁带组装的毛细管阵列的多重视觉检测核酸。毛细管阵列被预处理成疏水和亲水模式之前固定环介导的等温放大 (灯) 底漆集在毛细管。加载适配器组装后, 灯反应混合物被加载和孤立到每一个毛细管, 由于毛细管力由一个单一的移步骤。灯的反应在毛细血管中平行进行。结果是视觉读出的照明与 hand-held 紫外线手电筒。利用这个平台, 我们展示了对8种常见的元素和基因在转基因样品中具有高特异性和敏感性的监测。总之, 本文所描述的平台是为了方便检测多种核酸。我们相信它将广泛应用于需要高通量核酸分析的领域。

Introduction

在广泛的领域, 如临床诊断123、转基因检测4, 对多种核酸同时检测的系统来说, 需要低成本、快速且易于使用. 5,6, 微生物监视7,8,9, 鉴证分析10,11, 特别是点测试 (POCTs), 其中资源通常被限制为12,13,14

聚合酶链反应 (pcr), 包括其衍生物方法 real-time pcr 和多重 pcr, 是最广泛应用于这些领域的检测技术。但是, 这些方法通常只在一个测试15中检测一个目标, 并且需要电力和复杂的专业设备。

另一个有前途的技术检测核酸是环介导的等温放大 (灯), 这是第一次描述在 2000年16。灯是一种高效的 DNA 检测方法。理论上, 它可以放大1拷贝到 109副本的增在一个小时内, 所有执行在一个恒定的温度, (, 在 60-65 ° c)。成功的放大将产生大量的不溶性副产品焦磷酸盐和导致混浊的变化17, 这可以直接观察肉眼。还可以通过添加金属离子或荧光染料 (如素18、核酸染料19和羟基萘酚蓝20) 来观察颜色的变化。由于光源具有灵敏度高、操作方便等优点, 在核酸检测中得到了广泛的应用。

目前, 多路灯检测主要有两种策略。一是通过在一管21,22,23中的多个灯引套进行多灯检测。然而, 由于不同引物间的内在干扰和竞争, 其多样性和放大效率将受到限制。此外, 在同一反应中, 很难识别出不同的灯具产品。另一个策略是基于物理隔离。不同的引物集合被隔绝了入各自的小型化隔间, 并且多个灯反应然后同时执行24,25。这些方法, 通常是基于微流控芯片, 提供了一个潜在的解决方案的高通量灯的反应。然而, 生产的芯片和复合预的底漆集是复杂的, 这可能会增加成本和减少重复性。

最近, 有几项研究描述了在毛细血管中执行灯反应以绕过复杂的微流控芯片制造, 并实现了低成本检测26,27。然而, 在高通量分析中, 这些毛细血管与 PCR 条管的微型版本类似, 因为样品和反应试剂 (包括不同的底漆) 必须单独准备并送到不同毛细血管内的反应单位。为了实现并行和复用分析, 需要额外的设备, 例如多通道注射器泵, 是平行装载样品或试剂。

为了克服目前核酸多重检测方法的局限性, 我们开发了一种将视灯技术与毛细管阵列相结合的小型化平台。该平台具有多目标、体积小巧、成本低廉、易于操作的28。在此, 我们描述了如何制造毛细管阵列和执行在阵列中的灯反应的细节。这里描述的协议已被标准化使用转基因生物 (转基因) 检测作为一个模型。重要的是, 这个协议也可以用于高通量检测其他核酸靶。

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Protocol

注意: 本协议假定已为所需的微通道和加载适配器提供形状的不锈钢模具 (3D 文件为 补充文件 1 2).该协议还假定已经进行了植物 DNA 分离.

1. 制作毛细管阵列现成的盒式磁带

  1. 清洗不锈钢模具。
    1. 通过洗涤剂、乙醇和去离子水清洗不锈钢模具, 去除潜在的污染物。用氮气烘干模具.
  2. 清除毛细管
      戴上安全护目镜、实验室和 #160; 制服和化学防护手套.
    1. 将毛细管放入烧杯中。用30毫升丙酮清洁毛细血管5分钟去除有机物, 然后用去离子水冲洗毛细血管.
      注意: 在油烟罩中处理丙酮.
    2. 将10毫升 h 2 O 2 放入烧杯和 #160; 然后将 30 ml h 2 , 所以 4 加入到 h 2 O 2 中, 以防止过热。确保解决方案 (食人鱼溶液) 完全覆盖毛细血管至少30分钟.
      注意: 在处理食人鱼溶液时要小心 (H 2 , 以便 4 /h 2 O 2 = 3: 1, v/五) 。如果食人鱼溶液溢出, 用大量的水迅速冲洗溶液, 并用纸巾擦拭表面.
      注: 对毛细管进行彻底清洗是保证灯反应成功的关键之一。在清洗过程中必须摇动酸缸, 去除毛细管中的气泡, 必要时也可延长清洗时间.
    3. 用大量的水冲走食人鱼溶液。用乙醇和去离子水冲洗毛细血管5分钟。在干燥的烤箱中干燥毛细管.
  3. 倒烷 (硅橡胶)
      重出了在50毫升管中有1:1 的比值的硅橡胶底座和硫化试剂。通常, 混合5克的弹性体基地, 以5克的弹性体固化剂.
    1. 用玻璃棒将混合物彻底搅拌约5分钟。将该管与硅橡胶在真空钟罐中放置30分钟吸管.
    2. 将其慢慢倒入不锈钢模具的气缸中。允许硅烷在60和 #176 的干燥炉中固化3小时; C
      注意: 在浇注时要小心避免气泡。在浇注后, 让它站在5分钟的自然去除的气泡出的硅橡胶.
  4. 在硫化硅橡胶后将模具从 "硅橡胶"
      中卸下后, 通过用气缸拉出模具来拆卸模具。用手术刀把模具的边缘切掉, 从气缸中取出.
    1. 用乙醇和去离子水清洗三次。用氮气烘干的支持.
  5. 将该支持的下表面视为疏水性。在室温下, 用疏的外套浸泡1秒的硅橡胶支架.
  6. 干燥10分钟
  7. 将毛细管插入到 "支持"
    1. 中, 将已清洗的4毫米毛细管插入到该支持的孔中, 并将0.5 毫米的毛细管留在该支持的顶面外。确保毛细血管的两端处于同一水平.
  8. 将毛细管的外表面和该支持的顶面表面视为疏水性.
    1. 添加15和 #181; 我疏大衣上表面的支持。请注意, 涂层立即蔓延到所有的顶部表面 (包括表面的支持和外部表面的毛细血管外露部分) 的毛细管力.
    2. 空气干燥疏改性毛细管阵列.
  9. 将底漆固定到毛细管阵列
      准备底漆溶液中。重出0.65 克壳聚糖 (分子式: (C 6 H 11 4 ) n ), 并将其分解为50毫升去离子水, 通过调节 pH 值为 4.5-5.5, 用乙酸实现壳聚糖浓度为1.3%。根据 表 1 准备底漆组件组合。请参见 辅助表 1 以引物
    1. 添加1.6 和 #181; 一组底漆的混合物, 根据预先设计好的顺序填充毛细管阵列的一个相应毛细管.
      注: 其余的两个空白毛细管被设置为负控制.
    2. 将阵列锚定在标准平底96井板的透明井中, 并在60和 #176 处干燥阵列; C 至少 2 h.
FIP/毕普底漆 (20 和 #956; m) td>> 1.0/1.0
灯具底漆固定混合组件 (初始浓度) 音量 (#956; L)
ddH 2 O 17.0
壳聚糖 (1.3%) 1.0
2.0/2.0
LoopF/LoopB 底漆 (20 和 #956; m)
F3/B3 入门 (20 和 #956; M) 0.5/0.5
总卷 25.0

表 1: 灯的组成部分底漆固定试剂. 在表的左列中列出了灯具底漆固定组合件的组成, 并在右列中列出了每个组件的音量.

  1. 按如下方式组装卡带。将加载适配器放到固定阵列的顶部。确保适配器的碟只覆盖所有十毛细血管暴露的部分 (参见 图 1 ).

Figure 1
图 1: 磁带制作和组装。( a ) 不锈钢模具和硅橡胶支持。模具由3部分组成: 汽缸、坝板、柱板。( b ) 支持制造和组装毛细管盒的电路原理图。整个过程包含5步骤: 1. 在浇注, 2. 脱模, 3. 毛细管插入和表面涂层, 4. 底漆固定和5。磁带锚定。1. 将硅橡胶倒入模具的气缸中;2. 推出大坝板, 从支持的模式中取出模具;3. 将支持的下表面涂上涂层, 然后将毛细管插入到该技术支持中, 最后涂上表面的支持和暴露的毛细血管。粗蓝线表示疏外套;4. 将底漆装入单独的毛细血管;5. 将毛细管阵列固定在单96孔板上, 并在其上安装一个样品加载适配器。详细信息已在协议步骤 1.1-1.9 中描述。 请单击此处查看此图的较大版本.

2. 在毛细管阵列中灯反应的性能

  1. 准备反应组合
    1. 准备灯的反应混合, 每 T 能 2 .
    2. 添加试剂到混合物根据所选择的顺序, 如在 表 2 , 和涡流的反应混合物 5 s 后添加素。轻轻地在在添加 Bst 聚合酶后20次垂直于试管.
11.6 总卷 25.0
灯组件和 #160; #160; #160; #160; #160; #160; #160; #160; #160; #160; #160; #160; #160;和 #160; (初始浓度) 卷 (和 #956; L)
ddH MgSO
, 4 (100 mM) 2.0
dNTPs (25 mm) 1。4d >
甜菜碱 (5 米) 4.0
缓冲 (10x) 2.5
素 (1.25 mM) 0.5
MnCl 2 (25 mM) 0.5
/em > 聚合酶 (8 U/和 #956; l) 1.5
植物 DNA (10 ng/和 #956; l) 1.0
表 2: 毛细管阵列灯的反应系统。
在左列中列出了毛细管阵列灯组件的反应系统的组件, 并在右列中列出了每个组件的音量.

  1. 加载试剂并密封卡带
    1. 吸管20和 #181; 与标准的100和 #181 的灯反应混合物; 我的小费。将笔尖插入加载适配器的入口以锁定它。将反应混合物轻轻地注入适配器的碟中;反应混合物会迅速填满盘子, 然后通过毛细管力自动加载毛细管.
    2. 卸下带有锁定尖端的适配器, 并通过与 PCR 兼容的透明密封膜密封该井.
      注: 只有在亲水性盘中接触反应混合物的毛细血管才能填充。因此, 请确保所有毛细管的顶部都具有相同的高度 (请参见 图 2 ).

Figure 2
图 2: 使用加载适配器进行采样加载的图示. 图片显示使用蓝色解决方案的加载过程为例。将笔尖插入进风口, 然后缓慢地将样品注入适配器, 然后用锁定的笔尖卸下适配器。 请单击此处查看此图的较大版本.

  1. 在63和 #176 的恒温箱中孵育毛细管阵列; C 用于1小时

3. 结果读出和数据分析

  1. 获取荧光发射的图像.
    1. 在小型 hand-held uv LED 手电筒的顶面上修复 uv 滤镜, 以过滤可见光.
    2. 激发离解的素发出荧光与紫外线手电筒。通过数码相机或智能手机从毛细管阵列顶端捕获图像.
    3. 拍摄图像时, 确保摄像机在毛细血管的区域内尽可能地放大, 以获得高质量、清晰的图像.
  2. 分析结果
    1. 通过图像分析软件打开图像, 然后选择和 #34; 图像和 #62; 模具和 #62; 灰度和 #62; 是和 #34; 和 #34; 图像和 #62; 模具和 #62; 16bit 和 #62; 是和 #34;选择和 #34; 文件和 #62; 保存 #62; 格式和 #62; TIFF 和 #34; 将图像转换为16位 tiff 格式.
    2. 提取荧光强度值
      1. 打开微阵列分析软件。将16位 TIFF 格式图像拖动到软件的界面中, 然后选择波长 #34; 532 nm 和 #34; 以及 #34、绿色和 #34 的颜色; 显示图像.
      2. 创建一个新的块来定位来自毛细血管的荧光信号。选择和 #34; 工具和 #62; 新的块和 #34; 并输入列和行数, #34; 1; 1 和 #34; 和 #34; 2; 5 和 #34; 在和 #39; 块和 #39; 和 #39; 功能和 #39; 接口分开.
      3. 右键单击并选择和 #34; 功能和 #34; 模型, 然后调整位置和直径, 以适应毛细血管的荧光区域。选择和 #34; 分析和 #34; 提取荧光强度的值.
      4. 选择和 #34; 文件和 #62; 保存设置为和 #34; 保存块文档, 选择和 #34; 文件和 #62; 保存结果和 #34; 保存荧光强度结果。计算信噪比, 以确定是否成功地在毛细管中执行灯.
        注: 通过记录斑点的灰度值和信噪比 (棚), 得到了毛细管的信号, 定义为目标的前景信号的平均值与两个负的前向信号平均值的比值。控件.确定正信号的截止阈设置为信噪比和 #62; 2.

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Representative Results

在该方法中, 在试样加载过程中防止不同毛细管间的交叉污染是非常重要的。为此, 引入了壳聚糖, 可以保留单个毛细血管中的底漆。为了测试它是否工作, 我们 pre-fixed ADH1 (玉米内源性参考基因) 在毛细管盒中设置的 "T" 和 "U" 的模式, 如 图 3a中所示。如预期的那样, 只有毛细血管中包含了显示阳性信号 ( 图 3b) 的底漆集。

Figure 3
图 3: 毛细管结果的示例.(a) 毛细管阵列的布局。绿色斑点表明, ADH-1 底漆集是 pre-fixed 在毛细管。(b) 灯后两个毛细管阵列的荧光照片。绿色的颜色呈现出正灯放大。该测试重复执行。成功的放大只出现在底漆固定毛细血管和无污染之间的空白毛细血管。请单击此处查看此图的较大版本.

为了进一步评估监测转基因生物的能力, 我们选择了七种常用的转基因元素, 覆盖75% 的商业化转基因生物事件 (、P-CaMV35S、bar、cp4 epsps、P-FMV35S、pat、T-nos 和 nptII) (图 4, 布局)对应的毛细管数 1-7, 和一个内生的参考基因玉米 (ADH1)。为了说明这种方法的特殊性, 选择了三 GM 事件 (MON863、MON89034 和 59122), 并将其应用于平静。为了分析这些结果, 采用摄像机进行了荧光图像分析, 并对协议步骤进行了描述。所有测试都获得了预期的结果 (图 4)。例如, 对于转基因玉米 MON863, 分别获得了毛细管1、6、7和8的阳性信号, 其对应于靶 P-CaMV35S、T-nos、nptII 和内源性参考基因 ADH1。

Figure 4
图 4: 监测转基因生物的特异性.检测不同的 DNA 样本,, MON863, MON89034, 59122, 混合所有上述三 gm 事件 (转基因混合), 非转基因玉米和纯净水 (没有模板控制, NTC)。1-8: 毛细管 pre-fixed 与灯底漆集P-CaMV35S, 酒吧, cp4 epsps, P-FMV35S, pat, T-nos, nptII,ADH-1, 单独。9-10, 两个 no-primer 控制。测试是重复进行的, 我们发现所有的结果都与期望一致。有关数据分析, 请参见补充表 2 单击此处查看此图的较大版本.

为了测试我们的方法在实际应用中的性能, 选择了两种实用的玉米样品进行镇静分析。并与 real-time PCR 结果进行比较, 结果一致 (图 5,补充表 2)

Figure 5
图 5: 测试两个玉米样品的结果.1-8: 毛细管 pre-fixed 与灯底漆集P-CaMV35S, 酒吧, cp4 epsps, P-FMV35S, pat, T-nos, nptII,ADH-1, 单独。9-10, 两个 no-primer 控制。实验结果与 real-time PCR 方法进行了对比, 结果一致。有关比较结果, 请参见补充表 3 。有关数据分析, 请参见补充表 2请单击此处查看此图的较大版本.

补充表 1: 灯底漆序列列表.请单击此处下载此文件.

补充表 2: 灯阵实验的数据分析.表格中的绿色颜色编码单元格表示正结果。请单击此处下载此文件.

补充表 3: real-time PCR 结果报告表.请单击此处下载此文件.

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Discussion

这里展示的平静平台, 它结合了灯技术与毛细管阵列, 使同时检测多个转基因相关的基因目标在一个单一的, 高效, 易于操作的测试。

为了在卡带中成功地执行复用灯的反应, 需要注意三关键点。首先, 达到相同的高度, 在毛细血管的上部和亲水性和疏水性模式的毛细管阵列是关键的同时加载试剂到所有的毛细血管。在初始插入到 "支持" 后, 毛细血管应由一个板对齐, 以确保它们都能接触到加载适配器盘中的负载反应混合物。当用疏涂层处理毛细管阵列时, 不要让外衣浸入毛细血管的内表面。通过在顶部表面上装上一层涂层, 对毛细血管的外表面进行处理, 使镀层扩散到毛细血管上部的外表面。如果它偶尔发生, 并非所有的毛细血管都充满了试剂, 它可能是谨慎的加载试剂直接到一个特定的毛细管。

其次, 要注意灯试剂的配制。由于灯的反应温度相对较低, 以及Bst聚合酶的脆弱性, 整个过程应该在冰上缓慢而迅速地进行。在添加Bst聚合酶后, 最好轻柔地摇动灯管, 而不是涡流管。不当处理可能导致反应失败。本实验将 ADH1 (玉米内源性参考基因) 设置为阳性对照, 两个无引物的毛细血管设置为空白对照。因此, 如果正确处理灯的混合物, 正面控制将显示绿色和空白控制将保持不变在测试以后执行。

第三, 由于灯的反应效率高, 如果环境中有微量的 DNA 增, 可能会发生假阳性或携带性污染。因此, 应始终牢记 pre-reaction 和 post-reaction 的操作过程应在不同的区域严格分开, 并在经过分析后, 应严密密封和丢弃灯具产品。此外, 应设置一个空白控件, 以指示灯的充分性能。

从本质上来说, 镇定是一种具有良好的灵活性和可扩展性的通用多目标核酸检测方法。在毛细管中进行的灯的反应可以很容易地被其他类型的等温放大方法取代, 如滚圈放大 (RCA)29, 和重组聚合酶放大 (RPA)30。它也可以应用于其他检测领域, 如病原体检测27和疾病诊断31

在本方法的目前形式中, 虽然底漆与壳聚糖 pre-fixed, 但在试验过程中仍需进行灯合剂的制备, 降低了方法的简单性。为了解决这一问题, 我们将尝试在毛细管中预加载所有灯的试剂, 然后将样品移到卡带中。我们的方法的另一个限制可能是缺乏核酸提取, 但我们现在正在开发一个手机机, 将结合提取核酸, 自动图像采集, 和数据分析, 以实现一个真正的 "sample-in 和 results-out方法.

总之, 我们已经开发了平静的平台, 集成多路灯与毛细管阵列。作为一种通用的核酸检测方法, 镇静也可能在其它核酸分析应用中具有潜在的潜力。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

本研究部分由国家自然科学基金资助 (31370813、3147670、31670831和 31600672)、国家转基因植物专项基金 (2016ZX08012-003、2016ZX08012-005)、新世纪优秀人才项目大学, 中国国家重点研究开发项目 (2016YFA0500601) 和中国博士后科学基金 (2016M591667)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UltraEverDry(super-hydrophobic coat) UltraTech 4001 supplier:Exiron chemistry(CHINA) CO.,LTD.
PDMS Dow Corning 8332557
Bst polymerase New England BioLabs M0275L
betain Sigma-Aldrich B0300-1VL
calcein Sigma-Aldrich C0875-5G
MnCl2 Sigma-Aldrich MKBP0495V
MgSO4 New England BioLabs B1003S
dNTPs Shanghai Sangon B804BA0022
chitosan Shanghai Sangon LJ0805S309J
Photoshop 7.0 software Adobe Systems Inc., CA, USA Image analysis
GenePix Pro 6.1 Molecular Devices, CA, USA microarray analysis software
AutoCAD Adobe Systems Inc. 3D construction software
UV filter (ZWB2) YXSensing supplier : taobao

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References

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