用基因编码荧光传感器评估毒理学氧化应激的成像方法

Cancer Research

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Summary

这篇手稿描述了使用基因编码的荧光记者在一个应用的活体细胞成像检查异诱导氧化应激。这种实验方法提供了无与伦比的时空分辨率、灵敏度和特异性, 同时避免了用于检测毒理学氧化应激的常规方法的许多缺点。

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Corteselli, E. M., Samet, J. M., Gibbs-Flournoy, E. A. Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors. J. Vis. Exp. (132), e56945, doi:10.3791/56945 (2018).

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Abstract

虽然氧化应激是一种常用的毒理学机制, 但传统的研究方法存在许多缺陷, 包括样品的破坏、潜在的伪影的引入, 以及缺乏反应的特异性涉及的物种。因此, 目前需要在毒理学领域的非破坏性的, 敏感的, 和具体的方法, 可以用来观察和量化细胞内氧化还原摄动, 更常见的称为氧化应激。在这里, 我们提出了一种方法, 使用两个基因编码的荧光传感器, roGFP2 和超, 将用于活细胞成像研究, 以观察异诱导的氧化反应。roGFP2 均衡与谷胱甘肽氧化还原电位 (EGSH), 而超高直接检测过氧化氢 (H2O2)。这两种传感器都可以通过转染或转导的方式表达成各种细胞类型, 并且可以针对特定的细胞室。最重要的是, 使用这些传感器的活细胞显微镜提供了高的空间和时间分辨率, 这是不可能使用传统的方法。在 510 nm 监测的荧光强度的变化作为两个基因编码的荧光传感器的读数, 当连续兴奋 404 nm 和 488 nm 光。该属性使两个传感器比率, 消除了普通的显微工件, 并纠正了传感器在细胞之间的表达差异。这种方法可以应用于各种荧光平台, 能够激发和收集规定波长的排放, 使其适合于共焦成像系统、常规的广域显微镜和平板读者.两种基因编码的荧光传感器都被用于各种细胞类型和毒理学研究, 以实时监测细胞 EGSH和 H2O2生成。这里概述了一个标准化的方法, 广泛适用于细胞类型和荧光平台的应用 roGFP2 和超高活性细胞毒理学评估的氧化应激。

Introduction

"氧化应激" 这一术语经常被称为毒理学中的一种机制, 但这一术语很少被具体描述。氧化应激可以指几种细胞内的过程, 包括活性氧的生成、自由基的损伤、抗氧化分子的氧化, 甚至是特定信号的激活。范围广泛的环境污染物1,2和药物代理3,4已被记录为通过异化合物本身的直接作用来诱导氧化应激5 ,6或次要地通过生产氧化剂种类作为蜂窝响应的一部分78910。因此, 对毒理学有极大的兴趣, 能够准确地观察和描述导致不良结局的氧化过程。测量氧化应激的常规方法包括氧化生物分子的鉴定11,12,13,1415或抗氧化剂16 ,17,18,19,20, 或直接测量活性物种本身21,22,23, 24。但是, 这些方法通常需要蜂窝中断, 这通常会消耗样本, 消除空间分辨率, 并可能引入工件25。开发更灵敏和具体的方法来检测氧化剂种类和氧化应激标志, 广泛适用于研究异暴露的不利影响。

使用新一代基因编码的荧光传感器的活细胞显微镜已经成为监测细胞内氧化还原状态的有力工具。这些传感器通常是使用在病毒启动器的控制下通过转染或转导方法引入的载体来表达的。高表达效率是不必要的, 因为细胞表达的荧光传感器可以很容易地识别视觉。对于毒理学评估, 可以使用荧光显微镜观察表达这些传感器的细胞, 因为它们是实时接触异化合物的。这种实验设计允许在同一个单元中重复测量, 允许每个细胞的既定基线作为自己的控制。活细胞成像所提供的高时间分辨率非常适合于检测氧化事件, 特别是那些规模不大或瞬态性的。除了对它们的目标分子敏感和特异外, 这些传感器的荧光也可以用两种波长的光来激发。这种现象允许将荧光发射表达为一个比值, 它允许识别与真实传感器反应相关的信号变化, 如传感器表达的变化, 细胞厚度, 灯荧光探测器的强度、漂白和灵敏度26。使用荧光传感器的另一个优点是, 它们可以针对特定的蜂窝单元, 创建一个由常规方法25,26,27所无法比拟的空间分辨率级别。

一个以绿色荧光蛋白 (GFP) 为基础的基因编码的大家族被开发出来, 其特征是报告各种生理指标, 包括 pH 值、温度、钙浓度和 ATP/ADP 比值25 ,28,29,30,31。其中包括谷胱甘肽氧化还原电位 (EGSH) 和过氧化氢 (H2O2) 的传感器。虽然这些传感器是为应用于氧化还原生物学和生理学, 他们也已适应研究异诱导氧化应激。具体地说, 此处概述的协议描述了使用 EGSH传感器 roGFP2 和 H2O2传感器超级。

roGFP2 报告的氧化还原电位的细胞内还原和氧化谷胱甘肽 (GSH/GSSG) 通过一个氧化还原继电器涉及谷胱甘肽过氧化物酶 (GPx), 氧 (Grx), 谷胱甘肽还原酶 (GR) (图 1)25,32,33. 谷胱甘肽是主要的细胞抗氧化分子, 并存在于其还原形式 (GSH) 在 millimolar 浓度在胞25,34。虽然 EGSH尚未链接到任何功能结果, 但它被认为是细胞内氧化状态的重要指标34。GSSG 浓度的相对较小的增加会导致 EGSH的增加, 这是由 roGFP2 检测到的。同样重要的是, 在异暴露过程中使用 roGFP2 监测 EGSH , 可能会在氧化还原继电器和相关通路 (如戊磷酸盐分流器) 的几个点上揭示作用机理, 例如,图1)35。这里讨论的第二个传感器, 超, 是一个胞内 h2O2探针, 从插入黄色荧光蛋白 (YFP) 到细菌 H2O2敏感转录的规管领域中获得。因子 OxyR136。虽然它以前被认为是破坏性的活性氧中间体, H2O2越来越被认为是生理条件下的一个重要的细胞内信号分子37,38, 建议在毒理学中也存在用于 H2O2的无法识别的角色。例如, 由异曝光引起的过量的 H2O2可能是蜂窝信号中失调的前兆或生物的转移。

两个基因编码的荧光传感器都已被表达在几个既定的细胞线, 包括人表皮样癌细胞线 A431 和人支气管上皮细胞线 BEAS-2B, 以观察变化的 EGSH和 H2O2以响应各种毒理学暴露。这些包括气态污染物 (臭氧35)、微粒物质的可溶性组分 (12 醌3940和锌41) 和镍纳米颗粒 (未发布的数据)。这些研究只代表了这两种传感器可能应用的一个小子集。理论上, 任何能够通过常规分子生物学技术接收和表达这些传感器的 DNA 的细胞类型都可以用来评估物质怀疑改变细胞氧化状态的影响。到目前为止, 这些传感器中的一个或多个已经表达了各种原和真核生物, 包括几个哺乳动物, 植物, 细菌和酵母细胞类型25,26,36,42。EGSH和 H2O2传感器的读数是在激发时在 510 nm 发出的荧光强度随488和 404 nm 光的变化。该方法广泛适用于荧光平台, 包括各种类型的显微镜 (共焦和广域) 和平板阅读器。这里提出的方法允许对细胞内 EGSH和 H2O2体外毒理学系统的敏感和具体观察。

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Protocol

1. 细胞的制备

注: 本程序描述永生细胞系的慢转导 (BEAS-2B;ATCC, 马纳萨斯, 弗吉尼亚州) 表达所需的记者 (roGFP2 或超级)。其他的细胞线/类型和/或基因转移的方法, 包括转染, 可以使用, 只要他们导致一个水平的记者表达足够的可视化足够数量的传感器表达细胞的每个领域的看法 (通常是 5-10 细胞)。如果使用转染方法, 则应在最终用于分析方法的盘中执行该过程 (例如, 将在同一盘中的细胞染到显微镜中)。下面介绍的步骤提供了准备在6孔细胞培养板中进行细胞 transductions 的细节。如果这个格式不是适当的大小为期望的应用, 其他船可以被替换。

  1. 在正常生长培养基中, 细胞生长到大约 40-60% 的汇合处。
    注: 本研究采用人支气管上皮细胞系, BEAS-2B, 生长于角质生长介质 (魔芋)。
  2. 就在转导之前, 用500µL 的无血清培养基中含有适量病毒的细胞取代生长培养基, 如公式所计算的:
    Equation 1
    1. 为 BEAS-2B 细胞的转导, 使用无血清角质形成基培养基 (KBM) 取代魔芋生长培养基在病毒孵化。
      注: 上述计算是一个6井格式的一个细胞的单转导。如果需要, 执行 transductions 的几个井可以执行的调整公式乘以乘以数的转。对于慢 transductions, 使用在5和20之间的多重感染 (莫伊)。对于腺病毒 transductions, 使用100和500之间的莫伊。
  3. 孵育细胞与病毒混合物在37° c 为 4 h, 再分配病毒微粒在盘中每30到60分钟以一个短暂摇摆或盘旋的运动。
  4. 加入1毫升的完全生长培养基到盘中, 在37° c 下孵育 4-16 h。
  5. 删除所有媒体并替换为全新的完全增长介质。
  6. 继续生长和传代细胞, 根据需要进行扩张。
    注意: 在 12-48 小时内, 细胞应该开始明显地表达传感器。如果使用慢向量进行转导, 则所需传感器的稳定表达式应在通道中继续。
  7. 对于显微镜下的评估, 种子细胞到玻璃底的显微镜碟和成长到理想的汇合 (70-80%) 之前的成像。
    注: 播种密度将取决于盘的大小、所用细胞的生长速率以及播种后的评估时间。例如, 种子 30万 BEAS-2B 细胞成一个35毫米的盘子, 在1天的生长后产生大约 70-80% 的汇合。

2. 显微镜设置

注: 下面描述的协议是使用在404和 488 nm 上装有激光线的共聚焦显微镜进行的。对本协议中所描述的传感器进行荧光光谱评估的其他方法也应提供可行的数据。重要的是, 设备设置可以很大程度上取决于所使用的仪器的类型、年龄和条件;因此, 所提及的任何仪器价值可能并不具体于其他实验室使用的设备。

  1. 使用环境控制进行所有成像分析, 以保持适当的温度 (例如, 37 ° c)、湿度 (通常 > 95% 相对湿度) 和/或气体浓度 (例如, 5% CO2), 适用于整个实验的持续时间。
  2. 如果使用较高的相对湿度值, 请保持任何可能接触湿化气氛的表面 (e. g, 显微镜物镜), 或略高于产生湿度的温度, 以防止冷凝。这可以通过使用一个客观加热器和/或加热胶带和一个适当的加热器控制来完成。
  3. 打开所有显微镜组件, 并设置在488和 404 nm 的顺序励磁所需的所有设备, 其排放量在 510 nm。确保对光学配置的所有组件进行适当设置, 以便实时获取。
  4. 在37° c、5% CO2大气压和 > 95% 湿度的条件下, 设置一个舞台顶部环境室以保持恒定温度。在开始图像采集之前, 在所有环境控制的初始设定后, 平衡环境室至少10分钟。
    注意: 根据实验长度、细胞类型和所使用的暴露情况, 可以消除或调整环境条件。
  5. 将细胞盘 (步骤 1.7) 放在环境室内的舞台顶端。
  6. 用所需的物镜, 用目镜和白光找到细胞的焦平面, 确保正常的形态学。
    注: 1.4 NA 60X 紫校正, 油浸没物镜通常使用, 这允许识别细胞内的舱室, 同时最大化的光学分辨率的共焦系统。
  7. 在视场中检查细胞的荧光表达。在用合适的过滤器 (如荧光素异硫氰酸酯 (FITC)) 在广域荧光光照下对细胞进行可视化。在这一点上, 使用宽场照明, 而通过目镜看更方便, 因为它是更容易移动的菜选择一个领域的研究。一般情况下, 请选择包含至少5到10单元的视图字段, 它们表示传感器, 如绿色荧光所示。
    1. 或者, 执行此评估 confocally 使用激光激励的波长是最兼容的传感器被表达 (488 nm 通常最有效)。
      注: 由于其固有的荧光特性, 它将更难以可视化表达超高的细胞比那些表达 roGFP2 使用 FITC 或在 488 nm。然而, 仍然可以看到微弱的细胞。
  8. 一旦找到了理想的视野, 关闭环境室。
    注: 使用聚焦保持功能, 通常可在先进的显微镜支架上, 以方便维护一个稳定的焦平面在整个研究。
  9. 设置购置参数, 以确保在所需的曝光期内对传感器进行最佳评估。以下是传感器响应共焦成像的建议和方法:
    1. 调整激光功率为 488 nm 的励磁和发射在 510 nm。选择一个激光功率水平, 使细胞的可视化, 并保持这个常数之间的样品或复制菜肴。
      注: 对于这项研究, 分别使用了488和 404 nm 激光线的12% 和1.5% 激光功率。
    2. 使用采集软件的共焦控制, 以确保在调整 z 平面的同时, 在 488 nm 的情况下, 在单元中心 (z 轴) 上通过扫描, 对所选焦平面进行最大荧光发射强度的优化。在搜索导致最暴露的单元格的 z 平面时, 使用高增益设置会使这一点变得更容易。一旦找到适当的焦平面, 将增益返回到一个最理想的设置, 即在不 oversaturating 观察到的像素的情况下使用该报告的荧光。
      注: 在实验过程中, 适合于发现和观察细胞的激光和增益设置完全取决于所使用的共焦系统。一般而言, 一旦在视场中发现了细胞, 建议使用少量的激光功率 (通常是≤20%), 因为使用高功率激光照射的细胞过度扫描可能会引起传感器检测到的氧化变化。
    3. 利用增益来微调基线荧光。与 roGFP2, 建立基线附近的上限 (≈90% 相对强度) 的仪器没有过度饱和, 因为这些细胞将失去 510 nm 荧光诱导 488 nm 激发时, EGSH增加。相比之下, 488 nm 激发的荧光强度应低 (≈10% 相对强度) 在基线的超表达细胞, 因为这些细胞将获得 510 nm 荧光强度时, H2O2被检测到。
    4. 重复步骤2.9.2 和2.9.3 与励磁在 404 nm 和发射在 510 nm。增益设置为 404 nm 励磁波长是相对于那些使用与 488 nm 励磁为每个传感器 (即低基线荧光 (≈10% 相对强度) 在404毫微米为 roGFP2, 高基线荧光 (≈90% 相对强度) 为 H2O2传感器)。
      注: 一般而言, 荧光 (510 发射) 在 404 nm 激发将大大低于可获得的 488 nm 激发的细胞表达的 roGFP2 和超, 因为 404 nm 峰值是一个相对较小的励磁最大的两个传感器.

3. 数据采集

  1. 设置采集软件, 按顺序激发两个激发波长 (先是 488 nm, 然后是 404 nm), 并在预期的时间间隔内, 在整个试验长度内收集 510 nm 的排放量 (例如, 每60捕获图像s 为60分钟)。
    1. 或者, 如果在测试的异中已知 EGSH或 H2O2中更改的大致时间, 则在曝光前后手动获取图像。然而, 这可能会导致时间分辨率的丧失。
  2. 对实验参数进行实时评估, 在现场选择至少 5-10 传感器表达单元, 并将其作为感兴趣的区域 ("roi"), 以监测其在实验过程中的荧光变化。
    注意: 这一步是可选的, 并且可以在实验之后进行, 如果实时直接观察是不可取的, 或者是软件限制阻止了持续的监视。根据单元格的数量, 将单元格表示为 roi 的传感器的选择可能表示跨单元格的表达式级别范围。
    1. 对于这些研究, 在 5 min 基线周期之后添加环境毒物 910-醌 (910-PQ) 或过氧化氢 (H2O2)。
    2. 准备好所有的试剂以备以后在本协议中使用。 将二甲基亚砜中的 910 PQ 溶解到15毫米的浓度, 并在基底细胞介质中稀释, 产生250µM 的工作溶液。 此外, 准备一个水中过氧化氢的工作溶液, 将产生最终浓度为1mM 后注射。
  3. 一旦确定了实验参数, 就开始时间课程的获取。在开始异曝光前建立至少5分钟 (或5数据点) 的基线周期。
  4. 将细胞暴露在被调查的毒物中, 使用常规方法进行体外剂量。在水或其他合适的溶剂中制备可溶性化合物, 并直接注入介质。
    1. 如果需要有机溶剂 (如二甲基亚砜或乙醇), 请将最终溶剂浓度保持在或低于0.1%。验证溶剂不产生对 EGSH或 H2O2生产的影响, 并在单独的一盘单元中使用车辆控制。
    2. 对于溶解度较低的化合物, 在注射后使用微加入混合步骤。使用适当的载体气体混合物将气体暴露直接泵入环境室。
  5. 在曝光期间监测荧光变化。根据需要进行后续注射。注意不要在注射过程中转移盘子, 这样在整个时间过程中, 同样的细胞被跟踪, 同时在同一焦平面上成像。
  6. 在实验结束时, 将单元格暴露给适当的控件。对于这两种基因编码的荧光传感器, 添加特定浓度的化合物已知的氧化和减少这些传感器在一个尖锐的示范, 他们的比率反应。H2O2和糖 (德勤) 作为适当的控制来氧化和减少两个传感器。通常, 最终浓度为 100-1000 µM H2O2, 后跟 1-5 mM 糖 (德勤), 允许用户完全氧化和减少这些传感器。
    1. 对于这些研究, 请使用 1 mm2O2 , 后跟 5 mm 的 "", 以确定传感器的最大响应。
    2. 等待至少5分钟, 让传感器响应, 然后注入一个还原剂, 如, 以减少感光, 并返回到一个水平的荧光或附近的既定基线。
      注意: 此步骤中的控件的使用对规范化至关重要, 在每个实验结束时都应执行, 以确定每个单元格中传感器的动态范围。对于 roGFP2, 在实验结束时也可以添加 aldrithiol。Aldrithiol 绕过 roGFP2 氧化还原继电器直接氧化传感器。这对于评估异曝光后的传感器功能很有用。

4. 数据分析

  1. 如果尚未建立, 请在要分析的单元格周围绘制 roi。使用适当的软件来测量每个波长在整个时间过程中每个 ROI 的荧光强度。确保单元格不移动, 或在运行期间没有移出板。
    注: roi 的建立是最容易完成的, 绘制一个封闭的区域, 遵循每个细胞的荧光表达模式。为了进一步帮助这个过程, 在确定细胞边界的努力中, 可以将细胞内的透射光 (或明) 图像叠加到荧光图像上。但是, 使用透射光图像需要用户在整个实验过程中捕获一个附加的通道 (图像集)。或者, 某些制造商将算法引入到他们的成像软件中, 使用特定的参数 (如强度阈值) 来建立更定量、更少主观的 roi 方法。
  2. 将数据导出到所需的分析软件 (例如电子电子表格)。
  3. 使用公式计算每个时间点的每个 ROI 的比率传感器响应:
    Equation 2
    Equation 3
  4. 对于每个时间点, 平均所有 roi 的计算比率值。
  5. 计算基线值 (将用于对数据进行规范化), 方法是将以前计算的比率值 (步骤 4.4) 的平均值 (在添加异 (例如, 前五个时间点) 之前收集。
  6. 通过将每个值除以4.5 中计算的基线值, 将比率值正常化到步骤4.4。规范化比率将以基线值为1左右, 而在 EGSH或 H2O2以下注入的增加将导致比率增加。对诱导氧化改变的异的评估往往在基线值的 3-6 倍的范围内产生值。
  7. 为了帮助比较实验中和跨试验的响应, 通过定义对控制氧化剂的响应 (例如, 1 mM2O2) 为 100%, 将规范化数据表示为最大传感器响应的百分比。
    注意: 如果将数据表示为最大传感器响应的百分比, 则确保在实验中一致使用相同浓度的控制氧化剂是至关重要的。所有从活细胞成像分析得到的数据都可以根据研究者的判断选择常规的对智和群明智的统计分析。

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Representative Results

在检测 EGSH和胞内 H2O2中使用 roGFP2 和超高的方法时, 已经很好地描述了以前的25364243 , 并在此演示。在基线上表达 roGFP2 的细胞的共焦图像, 并在 H2O2和数字显示之后添加了图 2。然后按照《议定书》4节的描述, 对整个实验中收集的图像数据进行输出和分析。如图所示, 将外源 H2O2添加为正控制会在将数据正常化为其各自的基线时产生可重现的响应, 并通过添加已知的外源来建立定义的动态范围氧化剂/还原 (即, H2O2和数字显示) (图3、4和 5)。

对毒理学刺激的反应通常比对照组更有变数。这是意料之中的, 因为异的化合物可能对细胞有效的影响, 从氧化还原循环到内化蛋白质的引用不等。在图6和 7中, 暴露于毒物 910-PQ (一种由菲的大气反应形成的氧化空气污染物) 所诱发的 roGFP2 和超反应的例子。这些数字中的图表描述了《议定书》4节所概述的数据分析所涉及的每一步骤的进展情况。如图所示, 每个单元格到它自己的基线和正控制 (图 6B) 的规范化, 减少了来自原始数据 (图 6A) 的传感器响应大小的细胞间变异性。在细胞反应的方差是有兴趣的情况下, 数据的规范化可以被执行直到这一点, 由各自的细胞代表由他们自己的线在图。例如, 同一盘中细胞间反应的大小或动力学的变化可以揭示出反映细胞周期差异的重要机械洞察力。或者, 在盘中的单元格的平均响应可以与标准偏差一起显示 (图 6C)。否则, 如果提出单独的实验的复制, 数据可以被呈现为正常化的相对荧光强度值或控制氧化剂引起的最大响应的百分比 (图3、4、5和 6D),显示所有复制的平均值, 并伴有平均值的标准误差。环境空气污染物 910-PQ 已知是一个强有力的氧化还原循环, 我们假设是由超 (图 7) 检测到的过氧化氢生产周期峰值和 roGFP2 检测的逐步 EGSH增加图 6D)。

Figure 1
图 1.roGFP2 谷胱甘肽氧化还原继电器。谷胱甘肽过氧化物 (GPx) 氧化还原谷胱甘肽 (gsh), 以 GSSG 反应过氧化氢 (H2O2),从而增加谷胱甘肽氧化还原电位 (Egsh)。当氧 (Grx) 氧化时, 荧光传感器 roGFP2 均衡与胞内 EGSH 。在还原通路, Grx 催化 roGFP2 通过 deglutathionylation 的减少, GSSG 水平下降和正常水平的 GSH 是重建的谷胱甘肽还原酶 (GR) 的代价。由葡萄糖通过戊磷酸通路 (PPP) 提供。改编自吉布斯-弗卢努瓦et al35请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2.人支气管上皮细胞系 BEAS-2B 表达胞浆 roGFP2 的共焦显微图像.单元格的光照为 488 nm (A-D), 后跟 404 nm (E-H)。图像显示在以下情况下 510 nm 发出的荧光: 基线(A, E), 100 µM H2O2(B, F), 1 mm h2o2 (C, G), 和 5 mm 的数字广播 (D, H)。60X 计划的 VC 目标。刻度线代表25µm.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3.BEAS-2B 细胞中 H2O2诱发的 roGFP2 的剂量依赖性变化.在暴露前, 细胞被平衡为30分钟的苯酚-红游离角质形成基 KBM。所有添加的 H2O2都是在 510 nm roGFP2 荧光发射的基线周期之后进行的, 它是在525/30 和 404 nm 的激光激发后使用 488 nm 带通滤波器收集的。在添加 1 mM2O2之后, 蜂窝响应被正常化为各自的基线和最大传感器响应。值被显示为平均±标准误差, n=3, 其中 n 由 5-10 独立的细胞组成。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4.表达 roGFP2 的葡萄糖饥饿 BEAS-2B 细胞对不同剂量的 H2O2的响应.细胞被平衡2小时, 在一个最小的盐介质中, 在暴露之前不含葡萄糖。所有添加的 H2O2都是在 510 nm roGFP2 荧光发射的基线周期之后进行的, 它是在525/30 和 404 nm 的激光激发后使用 488 nm 带通滤波器收集的。在添加 1 mM2O2之后, 蜂窝响应被正常化为各自的基线和最大传感器响应。值被显示为平均值±标准错误, n = 3, 其中 n 由平均 5-10 不同的细胞组成。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5。对不同剂量的 H 表达超 BEAS-2B 细胞的反应2O2.细胞被平衡30分钟的苯酚-红色的自由 KBM 暴露前。所有添加的 H2O2在基线期间后发生, 在 510 nm 时, 使用 525/30 nm 带通滤波器, 在404和 488 nm 处进行激光激发。在添加 1 mM2O2之后, 蜂窝响应被正常化为各自的基线和最大传感器响应。值被显示为平均值±标准错误, n = 3, 其中 n 由平均 5-10 不同的细胞组成。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6910-PQ 诱导的 BEAS-2B 细胞表达 roGFP2 的反应。细胞被平衡30分钟的苯酚-红色的自由 KBM 暴露前。添加25µM 910-PQ 混合发生在5分钟, 其次是1毫米 H2O2在 20 min 和5毫米, 在 24 min. 面板A描述了盘中单个细胞的原始 roGFP2 比率, 每个细胞由一条单独的线表示。面板B显示从每个单个单元格到其基线传感器荧光的值的正常化, 并且此数据的平均值和标准偏差在面板C中的单个规范化比率上叠加。面板D中描述了在所有单元格中平均最大传感器响应的百分比。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 7
图 7. 910-PQ 诱导的 BEAS-2B 细胞表达超高的反应.细胞被平衡30分钟的苯酚-红色的自由 KBM 暴露前。添加25µM 910-PQ 混合发生在5分钟, 其次是1毫米 H2O2在 20 min 和5毫米, 在25分钟发射, 使用 510 nm 波段通滤波器, 在525/30 和 404 nm 激光激发后, 收集了 488 nm 的荧光。在添加 1 mM2O2之后, 蜂窝响应被正常化为各自的基线和最大传感器响应。值被显示为 5-10 不同的细胞的平均值。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

使用roGFP2 和超检测细胞内 EGSH和 H2O2的变化, 分别在以前的生理和毒理学研究中得到了很好的描述25,35,36 ,39,40,41,42,43。这里概述的协议报告了一种有效的方法来实现这些基因编码的氧化还原传感器的尖锐毒理学研究, 旨在评估异诱导的细胞内氧化还原稳态的扰动。最重要的是, 正确使用这些传感器链接任何观察到特定的氧化还原对或 ROS (EGSH或 H2O2), 最终澄清缺乏特异性与许多传统的氧化应激方法。在确保这些传感器生成的数据的质量时, 在设计实验和分析/解释数据时必须考虑几个方面。它们包括: 1) 使用适当的控制, 2) 验证适当的传感器响应, 和 3) 操纵实验参数, 以阐明机制。其中, 在观察期结束时添加外源 H2O2 , 并将其作为控件使用, 具有多种用途。首先, 它提供了一个机会来评估相对于传感器所能达到的最大和最小信号的毒性暴露的反应幅度。这在规范化响应以进行实验比较时非常有用。此外, 结束实验, 加上强大的外源氧化剂和还原刺激可以评估前暴露对传感器/继电器完整性的影响。此外, 还可以在运行结束时添加 aldrithiol, 以绕过中继并直接测试传感器的功能, 以了解暴露可能对荧光本身造成的潜在损害。

正如其他技术一样, 在对毒理学结果进行具体审查时采用这种方法时, 必须对所提出的意见的准确性进行定性评估。当使用 roGFP2 或超高的任何新的异是重要的第一次测试的剂量范围, 同时确保荧光强度 (510 nm 发射) 从每个激发波长 (404 nm 和 488 nm) 适当的变化 (增加或减少) 的氧化还原的传感器正在使用。目标是确定一个剂量, 传感器的反应是可探测的, 但不被淹没的显着操作的传感器或其他非特定的影响的化合物。直接内收或对传感器的损害可在任一激发波长 (488 或 404 nm) 中表现为不典型的荧光变化。在这种情况下, 任何一种传感器都被观察到对在接触中添加毒物的反应不恰当, 建议调查人员考虑检查与剂量测定、细胞用于观察响应的仪器的可行性、传感器表达和/或光学/色异常。

与任何毒理学读数一样, 获得的数据通常在使用机械方法检查或验证观察到的反应时更有意义, 并考虑实验限制。为此, 可以利用与传感器固有特性相结合的几个实验参数来生成可靠的氧化还原评价。特定于使用 roGFP2 传感器的调查最终涉及 roGFP2 感觉 EGSH (图 1) 的氧化还原继电器。继电器涉及胞内酶, 包括氧 (Grx), 谷胱甘肽还原酶 (GR) 和谷胱甘肽过氧化物酶 (GPx)。不同细胞间和细胞类型的 Grx 内源性水平的差异会影响 EGSH的测量, 并使实验比较困难43。为了解决这一问题, 合成了一系列 "聚变探针", 将相关酶直接链接到 roGFP2 传感器。最近, 人类的 Grx-1 被 Gutscher 和同事的 roGFP2 链接到了32 , 以形成 Grx1-roGFP2。除了具有比 roGFP1 更大的动态范围和不敏感的 pH 值外, Grx1-roGFP2 还可以在单元格类型或隔间中监视 EGSH , 在这种情况下, Grx 活动将受到限制。不同细胞类型甚至同一盘中细胞间的 roGFP2 差异也会导致反应的变异性。从葡萄糖通过戊-磷酸酶的途径产生, 并可利用谷胱甘肽还原 (GR), 以减少 GSSG 回 GSH (图 1)。如果同一字段中的单元格开始使用不同的还原容量进行实验, 则它们的 EGSH将发生变化, 并导致对刺激的 roGFP2 响应可能不一致。这个问题可以通过在实验之前的一段葡萄糖饥饿期克服, 这会耗尽细胞的 roGFP2 反应。在25µM H 2O2剂量中, 与正常葡萄糖浓度 (图3和 4) 相比较的细胞相比, 细胞中的葡萄糖摄入量也会减少。这样, 通过葡萄糖饥饿操作的浓度, 可以作为一种手段, 检查参与的多个中继组件在换的影响, 异暴露于传感器。在毒理学环境中使用 roGFP2 的另一个问题是异在氧化传感器时的潜在作用, 而不是通过氧化还原继电器来改变 EGSH。通过对氧化还原继电器各点的探测, 并评估其对 roGFP2 信号的影响, 可以确定 roGFP2 的直接氧化。弗卢努瓦et al 35的研究演示了使用臭氧作为刺激的技术的一个例子。

对于使用 h2O2传感器进行的实验, 上述关注点不相关, 如超感官的 OxyR1 域 h2O2直接而不是通过氧化还原继电器。然而, 与 roGFP2 不同的是, h2O2传感器对 pH 值的变化很敏感, 这会导致在实验中不引起对 h2o2的荧光变化。因此, 使用适当的缓冲介质、环境腔以保持所需的温度, 以及使用车辆控制对任何利用 H2O2传感器的实验都是至关重要的。此外, 还开发了荧光传感器, 专门监测 pH 值, 如 pHRed, 它在红色通道中发出荧光, 并且可以在表达超45的单元中共同表达。理想的 ph 控制为 h2O2传感器是 SypHer, 这是一个版本的 h2o2传感器, 它有一个单一的点突变渲染它无法感知 h2o2, 但保留对 ph 值的响应46. 还有观察到, 表示 H2O2传感器的单元格需要较长的基线周期才能平衡, 特别是在从孵化器传送到分析站点之后介质温度和 pH 值的细微变化。建议在基线稳定之后, 至少获得5数据点, 然后再开始任何曝光。

这种方法所讨论的传感器, roGFP2 和超高, 是在毒理学领域中有多种新兴应用的荧光传感器中的两个。这包括设计用于检测的传感器不仅有 EGSH和 H2O2, 但过47, 一氧化氮48,49, 甚至臭氧50。这些传感器可用于活细胞成像研究, 以明确和灵敏地监测的氧化物种的利益。随着技术的进步, 如光谱分解, 也可以共同表达两个相似的光谱特征的传感器 (在彼此 5 nm 以内) 在同一单元中, 并将每个传感器发出的荧光的比例分开51.这项技术对 roGFP2 和超高是特别感兴趣的, 因为它们涉及相同波长的激发和发射。如前所述, 某些传感器可以靶向特定的细胞内隔间, 如线粒体, 以观察感兴趣的氧化事件。尽管这些新兴的传感器和技术超出了这种方法的范围, 但读者被提到了关于细胞内氧化还原传感器这一主题的最近的一些出版物, 如工资审查和同事52。使用基因编码的荧光传感器与活细胞成像是一个强有力的工具, 监测氧化反应在毒理学评估。

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Disclosures

本文所述的研究成果已由美国环境保护署国家卫生与环境影响研究实验室进行了审查, 并获准发表。本条的内容不应解释为代表机构政策, 也不提及商号或商业产品构成背书或推荐使用。

Acknowledgements

作者想感谢凯特 Lavrich 在实验设计和稿件编辑方面的帮助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
roGFP2 Plasmid University of Oregon N/A Generous gift of S.J. Remington
HyPer Plasmid Evrogen FP941
Hydrogen Peroxide Sigma Aldrich H1009
Dithiothreitol Sigma Aldrich 10708984001
9,10-Phenanthrenequinone Sigma Aldrich 156507
Black Wall Glass Bottomed Dishes Ted Pella 14029-20
BEAS-2B cell line American Type Culture Collection CRL-9609
Keratinocyte Basal Medium Lonza 192151
Keratinocyte Growth Medium BulletKit Lonza 192060
Excel  Microsoft Office Suite N/A
NIS-Elements AR Imaging Software Nikon N/A
Nikon C1si Confocal Imaging System Nikon N/A

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