Imagerie des approches pour les évaluations toxicologiques stress oxydatif, à l’aide de capteurs codés génétiquement fluorogène

Cancer Research

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Summary

Ce manuscrit décrit l’utilisation de reporters fluorogène génétiquement encodé dans une application de l’imagerie de cellules vivantes pour l’examen du stress oxydatif induit par les xénobiotiques. Cette approche expérimentale offre inégalée de résolution spatio-temporelle, sensibilité et spécificité tout en évitant beaucoup des défauts des méthodes conventionnelles utilisées pour la détection du stress oxydatif toxicologique.

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Corteselli, E. M., Samet, J. M., Gibbs-Flournoy, E. A. Imaging Approaches to Assessments of Toxicological Oxidative Stress Using Genetically-encoded Fluorogenic Sensors. J. Vis. Exp. (132), e56945, doi:10.3791/56945 (2018).

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Abstract

Alors que le stress oxydatif est un mécanisme toxicologique souvent cité, les méthodes conventionnelles de l’étudier souffrent d’un certain nombre de lacunes, y compris la destruction de l’échantillon, introduction d’éventuels artefacts et un manque de spécificité pour les réactifs espèce en cause. Ainsi, il y a un besoin actuel dans le domaine de la toxicologie pour les méthodes non destructives, sensibles et spécifiques qui peut être utilisé pour observer et quantifier les perturbations redox intracellulaire, plus communément appelée stress oxydatif. Nous présentons ici une méthode pour l’utilisation de deux capteurs codés génétiquement fluorogène, roGFP2 et HyPer, à être utilisés dans les études d’imagerie de cellules vivantes pour observer les réponses oxydatifs induites par des xénobiotiques. roGFP2 s’équilibre avec le potentiel redox de glutathion (GSHde E), tandis que l’HyPer détecte directement le peroxyde d’hydrogène (H2O2). Les deux capteurs peuvent être exprimées en divers types cellulaires par transfection ou par transduction et peuvent être ciblées à des compartiments cellulaires spécifiques. Surtout, microscopie de cellules vivantes à l’aide de ces capteurs offre haute résolution spatiale et temporelle qui n’est pas possible en utilisant des méthodes conventionnelles. Changements dans l’intensité de fluorescence mesuré à 510 nm sert comme la lecture pour les deux capteurs codés génétiquement fluorogène lorsqu’il est excité séquentiellement par 404 nm et 488 nm lumière. Cette propriété en fait les deux capteurs ratiométrique, éliminant les artéfacts communs de microscopie et de correction des différences dans l’expression de la sonde entre les cellules. Cette méthodologie peut être appliquée à travers une variété de plates-formes fluorimétrique capables d’émissions passionnantes et collecteurs dans les longueurs d’onde prescrites, ce qui convient pour une utilisation avec des systèmes d’imagerie confocale, microscopie à champ large conventionnelle et la plaque lecteurs. Les deux capteurs codés génétiquement fluorogène ont été utilisés dans une variété de types de cellules et les études toxicologiques pour surveiller les cellulaires EBA et H2O2 production en temps réel. Présentée ici est une méthode normalisée qui est largement adaptable sur des plates-formes fluorimétrique pour l’application des roGFP2 et HyPer en cellules vivantes les évaluations toxicologiques du stress oxydatif et les types de cellules.

Introduction

Pourtant, le terme « stress oxydatif » est souvent cité comme un mécanisme en toxicologie, est rarement ce terme décrit plus précisément. Le stress oxydatif peut faire référence à plusieurs processus intracellulaires, y compris la production d’espèces réactives de l’oxygène, dommages causés par les radicaux libres, l’oxydation des molécules antioxydantes, et même l’activation de la signalisation spécifique des cascades. Un large éventail de contaminants environnementaux1,2 et agents pharmaceutiques3,4 ont été documentés pour induire un stress oxydatif par une action directe du composé xénobiotique5 ,6 ou secondairement par la production d’espèces oxydantes dans le cadre d’une réponse cellulaire7,8,9,10. Il est donc d’un grand intérêt en toxicologie d’observer avec précision et de caractériser les processus oxydatifs conduisant à des résultats indésirables. Les méthodes classiques de mesure du stress oxydatif impliquent identification des biomolécules oxydé11,12,13,14,15 ou antioxydants16 ,17,18,19,20, ou mesure directe d’espèces réactives elles-mêmes21,22,23, 24. Cependant, ces méthodes nécessitent des perturbations cellulaires, qui consomment souvent l’échantillon, élimine la résolution spatiale et potentiellement présente des artefacts25. Le développement de méthodes plus sensibles et spécifiques pour la détection d’espèces oxydantes et marqueurs de stress oxydatif est largement applicable à l’enquête sur les effets néfastes de l’exposition xénobiotique.

Microscopie de cellules vivantes à l’aide d’une nouvelle génération de capteurs codés génétiquement fluorogène a émergé comme un outil puissant pour surveiller l’état redox intracellulaire des cellules vivantes. Ces capteurs sont généralement exprimées à l’aide d’un vecteur sous le contrôle d’un promoteur viral qui est introduit par l’intermédiaire de méthodes de transfection ou transduction. Efficacité de haute expression n’est pas nécessaires, étant donné que les cellules exprimant la sonde fluorescente peuvent être facilement identifiés visuellement. Pour les évaluations toxicologiques, les cellules exprimant ces capteurs peuvent être observés à l’aide de la microscopie en fluorescence, car ils sont exposés à des composés xénobiotiques en temps réel. Ce dispositif expérimental permet des mesures répétées dans la même cellule, permettant ainsi la base établie de chaque cellule servir son propre contrôle. La résolution temporelle élevée accordée par imagerie de cellules vivantes est bien adaptée pour la détection des événements oxydatifs, particulièrement ceux qui sont modestes en amplitude ou transitoires dans la nature. En plus d’être sensible et spécifique à leurs molécules cibles, la fluorescence de certains de ces capteurs peut être excitée en utilisant deux longueurs d’onde de la lumière. Ce phénomène permet l’émission fluorescente s’exprimer sous forme d’un rapport qui permet le discernement des modifications de signal associé à réponses authentiques capteur de ceux causés par des objets tels que des variations dans l’expression de capteur, épaisseur de la cellule, lampe intensité, photobleaching et la sensibilité du détecteur fluorescence26. Un autre avantage de l’utilisation de capteurs fluorogène est qu’ils peuvent être ciblés pour les compartiments cellulaires spécifiques, la création d’un niveau de résolution spatiale qui est inégalée par les méthodes conventionnelles de26,25,27.

Une grande famille de capteurs codés génétiquement basés sur la protéine fluorescente verte (GFP) ont été développés et caractérisés à ce rapport sur un grand nombre de marqueurs physiologiques, y compris le pH, la température, concentrations de calcium et le rapport ATP/ADP25 ,28,29,30,31. Parmi ceux-ci sont des capteurs de la glutathion le potentiel redox (EBA) et le peroxyde d’hydrogène (H2O2). Alors que ces capteurs ont été développés pour des applications en biologie de l’oxydo-réduction et de la physiologie, ils ont également été adaptés pour étudier le stress oxydatif induit par les xénobiotiques. Plus précisément, le protocole décrit ici décrit l’utilisation de la roGFP2 de capteur EBA et le capteur de2 H2O HyPer.

roGFP2 des rapports sur le potentiel redox de glutathion intracellulaire réduit et oxydé (GSH/GSSG) via un relais d’oxydo-réduction impliquant la glutathion peroxydase (GPx), glutarédoxine (Grx) et la glutathion réductase (GR) (Figure 1)25, 32 , 33. glutathion est l’antioxydant cellulaire prédominante molécule et est présente principalement dans sa forme réduite (GSH) à des concentrations millimolaires dans le cytosol25,34. Alors que EBA n’a pas été liée à n’importe quel résultat fonctionnel, elle est reconnue comme un important indicateur de statut oxydatif intracellulaire34. Une augmentation relativement faible de la concentration de GSSG entraîne une augmentation en EBA qui est détectable par roGFP2. Tout aussi important, suivi de EBA à l’aide de roGFP2 au cours d’expositions xénobiotiques peut potentiellement révéler beaucoup sur le mécanisme d’action à plusieurs reprises dans le relais de l’oxydo-réduction et les voies associées, tels que le phosphate de pentose shunt (Figure 1 )35. Le second capteur discuté ici, HyPer, est une intracellulaire H2O2 sonde dérivée de l’insertion de la protéine fluorescente jaune (YFP) dans le domaine réglementaire bactérienne H2O2-transcription sensible facteur OxyR136. Bien qu’il a été considérée une oxygénées nuisibles intermédiaire, H2O2 n’est plus en plus reconnu comme une molécule de signalisation intracellulaire importante sous des conditions physiologiques37, 38, ce qui suggère que les rôles non reconnus pour H2O2 existent en toxicologie ainsi. Par exemple, excès H2O2 induite par une exposition xénobiotique pourrait être un précurseur du dérèglement dans la signalisation cellulaire ou d’un changement dans la bioénergétique.

Les deux capteurs codés génétiquement fluorogène ont été exprimés dans plusieurs lignées cellulaires établies, dont la lignée de cellules de carcinome épidermoïde humain A431 et la ligne de cellules épithéliales bronchiques humaines BEAS-2 b, pour observer les changements EBA et H2 O2 en réponse à une variété d’expositions toxicologiques. Il s’agit de gaz polluants (ozone,35), des composants solubles de particules (1,2 naphtoquinone39,40 et zinc41) et de nanoparticules de nickel (données non publiées). Ces études représentent seulement un petit sous-ensemble des applications possibles de ces deux capteurs. En théorie, n’importe quel type de cellule qui est capable de recevoir et d’exprimer l’ADN de ces capteurs grâce à des techniques classiques de biologie moléculaire peut être utilisé pour évaluer les effets des xénobiotiques soupçonnés d’altérer l’état oxydatif cellulaire. A ce jour, un ou plusieurs de ces capteurs a été exprimée dans divers procaryotes et eucaryotes, y compris plusieurs mammifères, plantes, bactéries et levure cellule types25,26,36,42. L’affichage pour les EBA et H2O2 capteurs est un changement dans l’intensité de la fluorescence émise à 510 nm à excitation à 488 et 404 nm. Cette méthode est largement adaptable sur plates-formes fluorimétrique, comme divers types de microscopie (confocale et grand champ) et des lecteurs de plaques. La méthode présentée ici permet une observation sensible et spécifique d’intracellulaire EBA et H2O2 dans les systèmes de toxicologiques in vitro .

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Protocol

1. préparation des cellules

Remarque : Cette procédure décrit la transduction des gènes d’une lignée de cellules immortalisées (BEAS-2 b ; ATCC, Manassas, VA) pour exprimer le journaliste désiré (roGFP2 ou HyPer). Autres lignes/types de cellules ou les méthodes de transfert de gènes, y compris de transfection, peuvent être utilisés tant qu’ils résultent en un niveau d’expression du journaliste adéquate pour visualiser un nombre suffisant de cellules exprimant le capteur / champ de vision (en général 5 à 10 cellules). Si vous utilisez des méthodes de transfection, la procédure doit être effectuée dans le plat qui sera finalement utilisé pour la méthode d’analyse (p. ex., transfecter les cellules dans le même plat qui sera présenté au microscope). Les étapes décrites ci-dessous fournissent des détails pour la préparation de transductions cellule sera effectué dans une plaque de culture de cellules de 6 puits. Si ce format n’est pas une taille appropriée pour l’application souhaitée, les autres navires peuvent être remplacés.

  1. La croissance de cellules à environ 40-60 % confluent dans les milieux de croissance normale.
    Remarque : Cette étude a utilisé la ligne de cellules épithéliales bronchiques humaines, BEAS-2 b, cultivée dans un milieu de croissance des kératinocytes (KGM).
  2. Juste avant de transduction, remplacez les milieux de croissance sur les cellules avec 500 µL de milieux sans sérum contenant la quantité appropriée de virus, telle que calculée par la formule :
    Equation 1
    1. Pour la transduction des cellules BEAS-2 b, utilisez milieu basal de kératinocytes sans sérum (KBM) pour remplacer les milieux de croissance KGM durant des incubations virales.
      NOTE : Le calcul ci-dessus est pour une seule transduction d’un puits de cellules dans un format de 6 puits. Si nécessaire, allez transductions de plusieurs puits peuvent être effectuées en ajustant la formule avec une multiplication par le nombre de puits à être transduites. Pour des gènes transductions, utilisez une multiplicité d’infection (MOI) entre 5 et 20. Pour les transductions adénovirale, utilisez un MOI entre 100 et 500.
  3. Incuber les cellules avec le mélange viral à 37 ° C pendant 4 h, redistribuant les particules virales dans le plat toutes les 30 à 60 min avec une brève de la bascule ou tourbillonnant motion.
  4. Ajouter 1 mL de milieu de culture complet au plat et incuber à 37 ° C pendant 4 à 16 h supplémentaires.
  5. Supprimer tous les médias et remplacez-les par les milieux de culture complet frais.
  6. Continuer à croître et passage de cellules, élargir selon les besoins.
    Remarque : Les cellules devraient commencer sensiblement exprimant le capteur sous 12-48 h. Si un vecteur lentiviral a été utilisé pour la transduction, expression stable du capteur souhaité devrait continuer à travers des passages.
  7. Pour les évaluations basées sur la microscopie, cellules de semences en verre à fond plats de microscope et croître jusqu'à confluence désiré (≥70 - 80 %) avant l’imagerie.
    Remarque : La densité de semis dépendra de la taille du plat, taux de croissance de la lignée cellulaire utilisée et le moment de l’évaluation après l’ensemencement. Par exemple, 300 000 cellules BEAS-2 b des graines dans un plat de 35 mm pour produire environ 70-80 % confluent après 1 jour de croissance.

2. microscopie Set-up

Remarque : Le protocole décrit ci-dessous est réalisé à l’aide d’un microscope confocal équipé de lignes laser à 404 et 488 nm. Autres moyens de donner des évaluations fluorimétrique des capteurs décrits dans le présent protocole à leur excitations / d’émission devrait également obtenir des données viables. Ce qui est important, les paramètres de matériel peuvent varier considérablement selon le type, âge et état de l’instrument utilisé ; ainsi, toute valeur d’instrument mentionné peut-être pas spécifiques à l’équipement utilisé dans d’autres laboratoires.

  1. Effectuer toutes les analyses d’imagerie utilisant des contrôles environnementaux à maintenir une température appropriée (p. ex., 37 ° C), humidité (généralement > 95 % d’humidité relative), et/ou de gaz de concentration (par exemple, 5 % de CO2) adaptée pour les cellules tout au long de la durée de l’expérience.
  2. Si vous utilisez des valeurs élevées de l’humidité relative, garder toutes les surfaces pouvant entrer en contact avec l’atmosphère humidifiée (e.g., l’objectif de microscope) à ou légèrement au-dessus de la température à laquelle l’humidité est générée afin de prévenir la condensation. Ceci peut être accompli à l’aide d’un appareil de chauffage objective et/ou chauffage ruban et une commande de chauffage approprié.
  3. Activer tous les composants du microscope et mis en place tout le matériel requis pour l’excitation séquentielle à 488 et 404 nm avec des émissions à 510 nm. S’assurer que tous les composants de la configuration optique sont définies convenablement pour l’acquisition en temps réel.
  4. Mettre en place une chambre environnementale phase-haut pour maintenir une température constante à 37 ° C, une atmosphère 5 % CO2 , et de > 95 % d’humidité. Avant de commencer l’acquisition d’images, équilibrer la chambre environnementale pendant au moins 10 min après l’installation initiale de tous les contrôles environnementaux.
    NOTE : Conditions environnementales peuvent être éliminées ou ajustées selon la durée de l’expérience, type de cellules et l’exposition utilisé.
  5. Posez le plat de cellules (étape 1.7) sur le sommet de la scène au sein de l’enceinte.
  6. Avec l’objectif souhaité, trouver le plan focal de cellules à l’aide de l’oculaire et la lumière blanche et assurer la morphologie normale.
    Remarque : Un 1.4 NA 60 X violet-corrigée, immergés dans l’huile porte-objectif est couramment utilisé, qui permet l’identification des compartiments intracellulaires tout en maximisant la résolution optique du système confocal.
  7. Contrôler l’expression de la fluorescence des cellules dans le champ de vision. Faites-le tout en visualisant les cellules sous illumination par fluorescence grand champ avec un jeu de filtre approprié, l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC). À ce stade, à l’aide de grand champ éclairage tout en regardant dans l’oculaire est plus pratique car il est plus facile de déplacer le plat pour sélectionner un champ de cellules à étudier. En règle générale, choisissez un champ de vision qui contient au moins 5 à 10 cellules qui expriment le capteur, comme indiqué par fluorescence verte.
    1. Vous pouvez également effectuer cette évaluation confocally utilisant l’excitation de laser à une longueur d’onde qui n’est plus compatible avec le capteur étant exprimé (488 nm fonctionne généralement mieux).
      Remarque : En raison de leurs propriétés intrinsèques fluorescentes, il sera plus difficile de visualiser les cellules exprimant HyPer que ces roGFP2 exprimant en utilisant soit FITC ou à 488 nm. Toutefois, il devrait être encore possible de voir les cellules faibles.
  8. Une fois trouvé un champ de vision souhaité, fermer l’enceinte.
    Remarque : Utiliser la fonctionnalité maintenant la mise au point, souvent disponible sur les stands de microscope perfectionné, pour faciliter la maintenance d’un plan focal stable tout au long de l’étude.
  9. Définir les paramètres d’acquisition afin d’assurer une évaluation optimale du capteur d’intérêt dans l’ensemble de la période d’exposition souhaitée. Voici les recommandations et les approches pour l’imagerie confocale des réponses de la sonde :
    1. Ajuster la puissance du laser pour l’excitation à 488 nm et d’émission à 510 nm. Choisir un niveau de puissance de laser qui permet la visualisation des cellules et garder cette constante entre les échantillons ou les plats répétées.
      Remarque : Pour cette étude, 12 % et la puissance du laser de 1,5 % ont été utilisés pour les lignes 488 et 404 nm laser, respectivement.
    2. Utilisez les commandes confocal du logiciel d’acquisition pour s’assurer que le plan focal sélectionné a été optimisé pour l’intensité de la fluorescence maximale d’émission dans le Centre des cellules (axe z) par balayage à 488 nm pendant que vous ajustez le plan z. Ceci est rendu plus facile en utilisant un réglage de gain élevé tout en recherchant le plan z qui se traduit par les cellules plus sur-exposées. Une fois le plan focal approprié a été trouvé, retourner le gain à un État qui n’est plus optimal pour la fluorescence du reporter utilisé sans sursaturer les pixels étant observées.
      Remarque : Les paramètres laser et gain qui sont appropriés pour trouver et observer des cellules au cours de l’expérimentation est complètement dépendant du système confocal utilisé. En général, une fois que les cellules ont été trouvés dans le champ de vision, il est recommandé qu’une quantité minimale de la puissance du laser utilisé (généralement ≤ 20 %), comme la numérisation excessive des cellules à l’aide de la lumière laser haute puissance peut induire des changements oxydatifs détectables par le capteur.
    3. Le gain permet d’affiner la fluorescence de la ligne de base. Avec roGFP2, établir la ligne de base près de la limite supérieure (intensité relative de ≈ 90 %) de l’instrument sans saturation excessive, car ces cellules perdra 510 fluorescence nm induit par une excitation 488 nm quand EBA augmente. En revanche, l’intensité de fluorescence avec une excitation 488 nm devrait être faible (intensité relative de ≈ 10 %), au départ pour HyPer exprimant des cellules, comme ces cellules gagnera l’intensité de fluorescence 510 nm quand H2O2 est détecté.
    4. Répétez les étapes 2.9.2 et 2.9.3 avec excitation à 404 nm et d’émission à 510 nm. Réglages de gain pour la longueur d’onde d’excitation 404 nm sont contraires à ceux utilisés avec une excitation 488 nm pour chaque capteur (c.-à-d., base faible fluorescence (intensité relative de ≈ 10 %) à 404 nm pour roGFP2, la fluorescence (intensité relative de ≈ 90 %) de base élevées pour la H2 Capteur2 O).
      Remarque : en général, la fluorescence (émission 510) à une excitation 404 nm sera considérablement inférieure qu’obtenue avec une excitation 488 nm dans les cellules exprimant les roGFP2 et HyPer, comme la 404 nm crête est une excitation relativement mineure maximum pour ces deux capteurs.

3. Acquisition de données

  1. Mis en place le logiciel d’acquisition pour exciter successivement les deux longueurs d’onde d’excitation (première 488 nm, puis 404 nm) et recueillir des émissions pour les deux à 510 nm à un intervalle de temps prédéterminé sur toute la longueur désirée de l’expérience (par exemple capture images toutes les 60 s pendant 60 min).
    1. Vous pouvez également acquérir des images manuellement avant et après les expositions si le moment approximatif de l’évolution EBA ou H2O2 est connu pour les xénobiotiques mis à l’essai. Toutefois, cela peut conduire à la perte de résolution temporelle.
  2. Pour une évaluation en temps réel des paramètres expérimentaux, choisissez les cellules exprimant le capteur au moins 5-10 dans le champ et les établir en tant que région d’intérêt (« ROIs ») pour surveiller leurs changements de fluorescence au cours de l’expérience.
    Remarque : Cette étape est facultative et peut être réalisée après l’expérience si l’observation directe en temps réel n’est pas souhaitable ou logiciels limitations empêcher une surveillance continue. Selon la population de cellules, la sélection du capteur exprimant des cellules comme ROIs pourrait représenter une gamme de niveaux d’expression dans les cellules.
    1. Pour ces études, ajoutez l’environnement toxique 9,10-PHÉNANTHRÈNEQUINONE (9,10-PQ) ou le peroxyde d’hydrogène (H2O2) après une période de référence de 5 min.
    2. Préparer tous les réactifs pour une utilisation ultérieure dans le présent protocole.  Dissoudre 9,10-PQ dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) à une concentration de 15 mM et diluer dans les médias de carcinome baso-cellulaire pour produire une solution de travail 250 µM.  En outre, préparer une solution de peroxyde d’hydrogène dans l’eau qui permettra d’obtenir une concentration finale de 1mM à injection.
  3. Une fois les paramètres expérimentaux ont été définis, commencer l’acquisition de cours du temps. Mettre en place une période de référence au moins 5 min (ou 5 points de données) avant de commencer l’exposition xénobiotiques.
  4. Exposer les cellules à la substance toxique étudiées à l’aide d’approches conventionnelles pour un dosage in vitro . Préparer les composés solubles dans l’eau ou autre solvant approprié et injecter directement dans les médias.
    1. Si des solvants organiques (p. ex. le diméthylsulfoxyde ou éthanol) sont requises, garder la concentration finale de solvant égale ou inférieure à 0,1 %. Vérifiez que le solvant ne produit pas d’effet sur la EBA ou H2O2 production avec un contrôle de véhicule dans un plat séparé des cellules.
    2. Pour les composés avec la plus faible solubilité, ajouter une étape de mélange à l’aide d’une micropipette au protocole après que l’injection est faite. Pompe expositions gazeuses directement dans la chambre environnementale en utilisant le mélange de gaz porteur approprié.
  5. Surveiller les changements dans la fluorescence au cours de la période d’exposition. Effectuer des injections subséquentes selon les besoins. Prenez grand soin de ne pas passer le plat pendant les injections, afin que les mêmes cellules sont suivies tout au long du temps ensemble tandis que photographiée sur le même plan focal.
  6. À la fin de l’expérience, exposer les cellules d’un contrôle approprié. Pour les deux capteurs codés génétiquement fluorogène, ajouter des concentrations spécifiques des composés connus à oxyder et à réduire ces capteurs dans une démonstration pointue de leur réactivité ratiométrique. H2O2 et le dithiothréitol (DTT) servent de contrôles appropriés afin d’oxyder et réduire les deux capteurs. En règle générale, une concentration finale de 100-1 000 µM H2O2, suivie de 1 à 5 mM le dithiothréitol (DTT), permet à l’utilisateur de pleinement s’oxydent et réduire ces capteurs.
    1. Pour ces études, utiliser 1 mM H2O2 , puis 5 mM TNT pour déterminer la réponse du capteur maximale.
    2. Attendre au moins 5 min pour permettre au capteur de répondre et ensuite injecter un agent réducteur, comme TNT, pour réduire le senor et retourner à un niveau de fluorescence à ou près de sa base établie.
      Remarque : L’utilisation des contrôles dans cette étape est cruciale pour la normalisation et doit être effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer la plage dynamique du capteur dans chaque cellule. Pour roGFP2, les aldrithiol peuvent également être ajoutés à la fin de l’expérience. Aldrithiol permet de contourner le relais d’oxydo-réduction roGFP2 pour oxyder le capteur directement. Ceci est utile pour évaluer la fonction capteur après exposition xénobiotique.

4. analyse des données

  1. Si pas déjà établie, dessiner des ROIs autour des cellules à analyser. Utilisez le logiciel approprié pour mesurer l’intensité de la fluorescence de chaque ROI à chaque longueur d’onde tout au long de l’évolution temporelle. S’assurer que les cellules ne bougea pas ou la plaque déplace pas pendant la course.
    Remarque : La mise en place de ROIs est plus facilement réalisable en dessinant une région fermée qui suit le modèle d’expression fluorescent de chaque cellule. Afin d’aider avec ce processus, une image de lumière (ou fond clair) transmise des cellules dans le champ de vue établi peut être superposée sur l’image de fluorescence dans les efforts visant à définir les limites d’une cellule. Cependant, l’utilisation d’une image de lumière transmise oblige l’utilisateur à saisir un canal supplémentaire (ensemble d’images) tout au long de l’expérience. Alternativement, certains fabricants incorporent algorithmes dans leurs logiciels d’imagerie qui permet d’établir des ROIs dans une méthode plus quantitative, moins subjective, des paramètres spécifiques tels que les seuils d’intensité.
  2. Exporter les données vers le logiciel d’analyse souhaité (par exemple, un chiffrier électronique).
  3. Calculer la réponse du capteur ratiométrique pour chaque ROI à chaque point de temps en utilisant les formules :
    Equation 2
    Equation 3
  4. Pour chaque point dans le temps moyen des valeurs ratiométrique calculée de tous les ROIs.
  5. Calculer la valeur de référence, qui sera utilisée pour normaliser les données, en faisant la moyenne des valeurs ratiométrique calculé précédemment (étape 4.4) recueillies avant d’ajouter les xénobiotiques (p. ex., les premiers points cinq fois).
  6. Normaliser les valeurs ratiométrique étape 4.4 en divisant chaque valeur par la valeur de référence calculée en 4,5. Les ratios normalisés seront Centre autour d’une valeur de 1 au départ, tout en augmentation EBA ou H2O2 injections suivantes provoquera le ratio d’augmenter. Quotes-parts de xénobiotiques qui induisent des modifications oxydatives ont tendance à obtenir des valeurs dans une gamme de 3 - 6 fois la valeur de référence.
  7. Pour vous aider à comparer les réponses au sein et entre les expériences, exprimer les données normalisées en pourcentage de la réponse du capteur maximale en faisant de la réponse à l’oxydant de contrôle (par exemple, 1 mM H2O2) 100 %.
    Remarque : Si exprimant les données sous forme de pourcentage de réponse du capteur maximale, il est essentiel de s’assurer que la même concentration de l’oxydant de contrôle est utilisée systématiquement à travers des expériences. Toutes les données dérivées de l’analyse d’imagerie de cellules vivantes se prête à l’analyse statistique par paires et plu conventionnelle d’être choisi à la discrétion de l’enquêteur.

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Representative Results

L’utilisation de roGFP2 et HyPer dans la détection de changements dans EBA et intracellulaire H2O2 a été bien décrite précédemment25,36,42,43 et est démontré ici. Images confocales de cellules exprimant roGFP2 au départ et addition suivante de H2O2 et sur la TNT sont indiquées à la Figure 2. Données d’images collectées tout au long de l’expérience étaient ensuite exportées et analysées comme décrit à l’article 4 du protocole. Comme le montre, l’ajout exogène H2O2 comme témoin positif produit reproductibles réponses lorsque les données sont normalisées à leur base respective et une plage dynamique définie est établie par addition de connu exogène oxydants/réducteurs (H2O2 et TNT) (Figures 3, 4 et 5).

Réponses à des stimuli toxicologiques sont généralement plus variables que celles induites par les contrôles. C’est à prévoir, car composés xénobiotiques peuvent avoir des effets pléiotropiques sur les cellules, allant de redox cyclisme à adduction de protéines intracellulaires. Exemples de roGFP2 et HyPer réponses induites par l’exposition aux produits toxique 9,10-PQ, un polluant atmosphérique comburant formé par les réactions atmosphériques du phénanthrène44, sont présentés dans les Figures 6 et 7. Les graphiques dans ces chiffres illustrent la progression de chaque étape de l’analyse des données énoncée à l’article 4 du protocole. Comme indiqué, normalisation de chaque cellule pour sa propre ligne de base et le contrôle positif (Figure 6B), réduit la variabilité intercellulaire dans l’amplitude de la réponse du capteur de données brutes (Figure 6A). Dans les cas où l’écart dans la réponse cellulaire est d’intérêt, normalisation des données peut être effectuée jusqu'à présent, avec des cellules individuelles, représentés par leurs propres lignes sur le graphique. Variation de la grandeur ou la cinétique des réponses entre les cellules dans le même plat peut révéler mécanistes précieuses informations qui reflètent des différences dans le cycle cellulaire, par exemple. Par ailleurs, la réponse moyenne des cellules dans le plat peut être présentée ainsi que l’écart-type (Figure 6C). Dans le cas contraire, si les répétitions d’expériences distinctes sont présentées, les données peuvent être présentées comme les valeurs d’intensité de fluorescence relative normalisé ou un pourcentage de la réponse maximale induite par l’oxydant de contrôle (Figures 3, 4, 5 et 6 D), affichage de la moyenne de toutes les répétitions, accompagné de l’erreur-type de la moyenne. L’air ambiant contaminant 9,10-PQ est connu pour être un cycler puissants oxydo-réduction, qui nous émettons l’hypothèse est responsable par les pics cycliques de la production de peroxyde d’hydrogène détecté par HyPer (Figure 7) et augmente progressivement EBA détecté par () roGFP2 Figure 6 ( D).

Figure 1
Figure 1 . Le relais de redox de glutathion roGFP2. Glutathion peroxydase (GPx) oxyde le glutathion réduit (GSH) à GSSG en réponse au peroxyde d’hydrogène (H2O2), ce qui augmente le potentiel redox de glutathion (GSHde E). Le roGFP2 de capteur fluorogène s’équilibre avec intracellulaire EBA quand oxydé par le glutarédoxine (Grx). Dans la voie réductrice, Grx catalyse la réduction de roGFP2 par le biais de deglutathionylation comme les niveaux GSSG diminuent et les niveaux normaux de GSH sont rétablis par la glutathion réductase (GR) au détriment de la NADPH. NADPH est fournie par le glucose par la voie des pentoses phosphate (PPP). Adapté de Gibbs-Flournoy et coll.35. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 . Images de microscopie confocale de cellules épithéliales bronchiques humaines ligne BEAS-2 b exprimant cytosolique roGFP2. Les cellules étaient allumés à 488 nm (A-D), suivie de 404 nm (E-H). Les images montrent la fluorescence émise à 510 nm pour les conditions suivantes : ligne de base (A, E), 100 µM H2O2(B, F), 1 mM H2O2 (C, G)et 5 mM DTT (D, H). Objectif strate ' 60 X Plan Apo VC. Barres d’échelle représentent 25 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 . Dose dépendantes changements roGFP2 induite par H2O2 dans les cellules BEAS-2 b. Les cellules ont été équilibrés pendant 30 min en kératinocytes gratuit-rouge de phénol milieu de base (KBM) avant l’exposition. Tous les ajouts de H2O2 a eu lieu après une période de référence de 5 min. roGFP2 fluorescence émise à 510 nm ont été recueillie à l’aide d’une passe bande de 525/30 nm filtrer suivant l’excitation de laser à 404 et 488 nm. Les réponses cellulaires ont été normalisés à leur base respective et la réponse du capteur maximale après l’addition de 1 mM H2O2. Les valeurs sont présentées comme moyenne ± écart-type, n = 3, où n est constitué d’une moyenne de 5 à 10 cellules indépendantes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 . Réponse de glucose affamés BEAS-2 b cellules exprimant roGFP2 à des doses différentes de H2O2. Les cellules ont été équilibrés pendant 2 heures dans un milieu minimal de sel qui ne contient pas de glucose avant l’exposition. Tous les ajouts de H2O2 a eu lieu après une période de référence de 5 min. roGFP2 fluorescence émise à 510 nm ont été recueillie à l’aide d’une passe bande de 525/30 nm filtrer suivant l’excitation de laser à 404 et 488 nm. Les réponses cellulaires ont été normalisés à leur base respective et la réponse du capteur maximale après l’addition de 1 mM H2O2. Les valeurs sont présentées comme l’écart-type moyenne ±, n = 3, où n est constitué d’une moyenne de 5 à 10 cellules distinctes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5Réponse de BÉA-2 b cellules exprimant HyPer à diverses doses de H 2 O 2 . Les cellules ont été équilibrés pendant 30 min dans le rouge de phénol KBM libre avant l’exposition. Tous les ajouts de H2O2 a eu lieu après une période de référence de 5 min. de Fluorescence émise à 510 nm ont été recueillie à l’aide d’une passe bande de 525/30 nm filtrer suivant l’excitation de laser à 404 et 488 nm. Les réponses cellulaires ont été normalisés à leur base respective et la réponse du capteur maximale après l’addition de 1 mM H2O2. Les valeurs sont présentées comme l’écart-type moyenne ±, n = 3, où n est constitué d’une moyenne de 5 à 10 cellules distinctes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
La figure 6. Les réponses induites par le PQ-9,10 de BEAS-2 b cellules exprimant roGFP2. Les cellules ont été équilibrés pendant 30 min dans le rouge de phénol KBM libre avant l’exposition. Ajout de 25 µM 9,10-PQ avec le mélange s’est produite à 5 min, suivie par l’addition de 1 mM H2O2 à 20 min et 5 mM TNT à 24 min. paroi A dépeint le ratio brut roGFP2 de cellules individuelles dans le plat, chaque cellule représentée par une ligne distincte. Panneau B montre la normalisation des valeurs de chaque cellule individuelle à la fluorescence de capteur de niveau de référence, et la moyenne et l’écart de ces données est superposée sur les ratios normalisés individuels dans le groupe C. Le pourcentage de réponse du capteur maximale moyennée de toutes les cellules est représenté dans le groupe D. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 . Les réponses induites par le PQ-9,10 de BEAS-2 b cellules exprimant HyPer. Les cellules ont été équilibrés pendant 30 min dans le rouge de phénol KBM libre avant l’exposition. Ajout de 25 µM 9,10-PQ avec le mélange s’est produite à 5 min, suivie par l’addition de 1 mM H2O2 à 20 min et 5 mM TNT à 25 min. Fluorescence émise à 510 nm ont été recueillie à l’aide d’une passe bande de 525/30 nm filtrer suivant l’excitation de laser à 404 et 488 nm. Les réponses cellulaires ont été normalisés à leur base respective et la réponse du capteur maximale après l’addition de 1 mM H2O2. Les valeurs sont présentées sous forme de moyenne de 5 à 10 cellules distinctes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

L’utilisation de roGFP2 et HyPer en détectant les changements en intracellulaire EBA et H2O2, respectivement, a été bien décrite dans les précédentes études physiologiques et toxicologiques 25,35,36 ,39,40,41,42,43. Le protocole décrit ici signale un moyen efficace de mettre en œuvre ces capteurs codés génétiquement rédox dans les études toxicologiques pointues visant à évaluer les perturbations induite sur les xénobiotiques de l’homéostasie redox intracellulaire. Plus important encore, l’utilisation appropriée de ces capteurs relie toutes les modifications observées à une paire d’oxydo-réduction spécifique ou ROS EBA ou H2O2, en fin de compte précisant le manque de spécificité avec beaucoup d’approches conventionnelles de stress oxydatif. En assurant la qualité des données obtenues de ces capteurs, quelques aspects doit prendre en considération lors de la conception des expériences et analyse/interprétation des données. Ils comprennent : 1) l’utilisation de mesures de contrôle appropriées, 2) vérification des réponses de capteur approprié et 3) manipulation des paramètres expérimentaux à élucider les mécanismes. Parmi ceux-ci, l’ajout d’exogène H2O2 et sur la TNT comme témoins à la fin de la période d’observation sert à plusieurs fins. Tout d’abord, il offre l’occasion d’évaluer l’ampleur de la réponse à l’exposition toxique par rapport aux réalisable de signaux maximales et minimales de la sonde. Ceci est particulièrement utile en normalisant les réponses pour les comparaisons entre les expériences. En outre, mettre fin à l’expérience avec l’ajout de fort oxydant exogène et des stimuli réductrices peut évaluer l’effet de l’exposition précédente sur l’intégrité de capteur/relais. En outre, les aldrithiol peuvent être ajoutés à la fin de la course pour contourner le relais et tester la fonctionnalité du capteur directement pour des dommages potentiels que l’exposition peut avoir infligé au fluorophore lui-même.

Tout comme avec les autres techniques, lors de l’application de cette méthodologie d’examen des résultats toxicologiques spécifique, il est important de procéder à une évaluation qualitative quant à l’exactitude des observations faites. Lorsque vous utilisez roGFP2 ou HyPer avec n’importe quel nouveau xénobiotiques, il est important de d’abord tester un éventail de doses, tout en veillant à ce que l’intensité de la fluorescence (émission de 510 nm) de chaque longueur d’onde d’excitation (404 nm et 488 nm) change de manière appropriée (c.-à-d. augmentation ou diminuer) pour le senor de redox utilisé. L’objectif est d’identifier une dose à laquelle une réponse du capteur est détectable, mais il n’est pas submergée par manipulation manifeste du capteur ou d’autres effets non spécifiques du composé. Adduction directe ou endommager le capteur peut se manifester comme altérations atypiques en fluorescence à chaque longueur d’onde d’excitation (488 ou 404 nm). Dans les situations où un capteur a été observée de répondre constamment mal à l’ajout d’une substance toxique à travers des expositions, il est recommandé que l’enquêteur envisager d’examiner les paramètres expérimentaux en ce qui concerne la dosimétrie, cellule viabilité, expression de capteur et/ou des anomalies optiques/chromatique de l’instrumentation servant à observer les réponses.

Comme avec n’importe quel affichage toxicologique, les données acquises sont généralement plus significative quand les réactions sont examinées ou validées en utilisant une approche mécaniste et les limitations expérimentales sont considérés. À cette fin, plusieurs paramètres expérimentaux, combinées avec les propriétés intrinsèques du capteur peuvent être utilisés pour générer des évaluations robustes oxydo-réduction. Enquêtes spécifiques à l’utilisation du capteur roGFP2 concernent finalement le relais d’oxydo-réduction par quels sens roGFP2 EBA (Figure 1). Le relais implique les enzymes intracellulaires, notamment glutarédoxine (Grx), glutathion réductase (GR) et glutathion peroxydase (GPx). Différences dans les taux endogènes de Grx sur les deux compartiments cellulaires et les types de cellules peuvent influencer les mesures des EBA et faire des comparaisons entre des expériences difficiles43. Pour résoudre ce problème, une série de « fusion sondes » ont été synthétisés, quel lien l’enzyme pertinente directement sur le capteur roGFP2. Plus récemment, Grx-1 humain était liée à roGFP2 par Gutscher et collègues32 à forme Grx1-roGFP2. Outre une plage dynamique supérieure roGFP1 et pH insensible, Grx1-roGFP2 peut surveiller EBA dans types de cellules ou un compartiment dans lequel Grx limiterions autrement l’activité. Différences dans les niveaux de NADPH dans l’ensemble de types de cellules ou même parmi les cellules dans le même plat peuvent également contribuer à la variabilité dans les réponses de roGFP2. NADPH est produite à partir du glucose par la voie des pentoses-phosphates et peut être utilisé par la glutathion réductase (GR) pour réduire le GSSG en GSH (Figure 1). Si les cellules dans le même champ commencent l’expérience avec réduction des capacités différentes, leurs changements EBA et qui en résulte roGFP2 réponses à un stimulus peut-être pas uniformes. Ce problème peut être surmonté par une période de jeûne de glucose avant l’expérience, qui épuise les stocks cellulaires de NADPH et harmonise les réponses de roGFP2. Une capacité réduite pour récupération EBA sont visibles également au 25 µM H2O2 dosage dans les cellules qui sont privées de glucose par rapport aux cellules additionné de concentrations de glucose normal (Figures 3 et 4). Thusly, manipulation des NADPH par inanition de glucose peut servir comme un moyen de vérifier l’implication de plusieurs composants de relais dans la transduction de l’effet d’une xénobiotique exposition du capteur. Une autre préoccupation lors de l’utilisation de roGFP2 dans un contexte toxicologique est le potentiel pour les xénobiotiques d’interagir directement en oxydant le capteur, et non par l’intermédiaire du relais d’oxydo-réduction de modifier EBA. L’oxydation directe des roGFP2 peut être déterminée par chaque point du relais redox de palpage et évaluer son effet sur le signal de roGFP2. Un exemple de cette technique utilisant l’ozone comme un stimulus est démontré dans l’étude par Gibbs-Flournoy et coll. 35.

Pour des expériences avec le capteur de2 H2O, préoccupations susmentionnées sont pas selon le cas, que le domaine OxyR1 de HyPer détecte H2O2 directement plutôt que par un relais d’oxydo-réduction. Toutefois, contrairement à roGFP2, capteur de H2O2 est sensible aux variations de pH, ce qui peut provoquer des changements dans la fluorescence non imputable à H2O2 pendant une expérience. Pour cette raison, l’utilisation des médias dûment tamponnées, une chambre pour maintenir la température désirée et l’utilisation des commandes du véhicule sont essentiels à toute expérience utilisant le capteur de2 H2O. En outre, fluorogène capteurs ont été développées spécifiquement les pH de moniteur, tels que le programme REDSP, qui émet de fluorescence dans le canal rouge et peut être conjointement exprimée dans les cellules exprimant également HyPer45. Le contrôle du pH idéal pour le capteur de2 H2O est SypHer, qui est une version du capteur H2O2 qui a une mutation ponctuelle rendant incapable de sens H2O2, conserve encore la réactivité à pH 46. on a également observé que les cellules exprimant le capteur de H2O2 nécessitent une plus longue période de référence s’équilibrer, notamment après être transportée sur le site de l’analyse, au cours de laquelle ils éprouvent un incubateur légers changements de température du liquide et de pH. Il est recommandé d’acquérir des points de données au moins 5 fois la ligne de base stabilisé avant de commencer toute exposition.

Les capteurs discutés dans cette méthode, les roGFP2 et les HyPer, sont deux des nombreux capteurs fluorogène qui ont une variété d’applications émergentes dans le domaine de la toxicologie. Cela comprend des capteurs conçus pour détecter non seulement EBA et H2O2, mais47de peroxynitrite, l’oxyde nitrique48,49et même l’ozone50. Ces capteurs peuvent être utilisées dans les études d’imagerie de cellules vivantes à spécifiquement et avec sensibilité de surveiller l’espèce oxydante d’intérêt. Grâce aux progrès techniques comme la déconvolution spectrale, il est également possible d’exprimer conjointement deux capteurs ayant les mêmes caractéristiques spectrales (moins de 5 nm de l’autre) dans la même cellule et séparer la proportion de la fluorescence émise par chaque capteur51 . Cette technique est particulièrement intéressante pour les roGFP2 et HyPer, car elles impliquent des excitations et des émissions sur la même longueur d’onde. Comme mentionné brièvement ici, certains détecteurs peuvent être ciblées à des compartiments intracellulaires spécifiques, tels que les mitochondries, d’observer les événements oxydatives d’intérêt. Alors que ces nouveaux capteurs et techniques dépassent les limites de cette méthode, on se reportera à plusieurs publications récentes sur le sujet des sondes redox intracellulaire, telles que l’examen par les salaires et les collègues52. L’utilisation de capteurs codés génétiquement fluorogène avec l’imagerie de cellules vivantes est un outil solide pour le contrôle des réponses oxydatifs lors de l’évaluation toxicologique.

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Disclosures

La recherche décrite dans cet article a été revue par le National Health et l’Environmental Effects Research Laboratory, la U.S. Environmental Protection Agency et approuvée pour publication. Le contenu du présent article ne doit pas être interprété pour représenter la politique de l’Agence, ni la mention de noms commerciaux ou de produits commerciaux constitue un endossement ou recommandation d’utilisation.

Acknowledgements

Les auteurs tiens à remercier Katelyn Lavrich d’assistance avec la conception expérimentale et les modifications de manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
roGFP2 Plasmid University of Oregon N/A Generous gift of S.J. Remington
HyPer Plasmid Evrogen FP941
Hydrogen Peroxide Sigma Aldrich H1009
Dithiothreitol Sigma Aldrich 10708984001
9,10-Phenanthrenequinone Sigma Aldrich 156507
Black Wall Glass Bottomed Dishes Ted Pella 14029-20
BEAS-2B cell line American Type Culture Collection CRL-9609
Keratinocyte Basal Medium Lonza 192151
Keratinocyte Growth Medium BulletKit Lonza 192060
Excel  Microsoft Office Suite N/A
NIS-Elements AR Imaging Software Nikon N/A
Nikon C1si Confocal Imaging System Nikon N/A

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