Evaluación sistemática de bienestar en ratones para procedimientos con anestesia General

Behavior

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Summary

Hemos desarrollado un protocolo para evaluar el bienestar en ratones durante procedimientos de anestesia general. Una serie de parámetros de comportamiento que indica los niveles de bienestar, así como se analizaron los metabolitos de glucocorticoides. El protocolo puede servir como una ayuda general para estimar el grado de severidad de una manera científica, centrada en el animal.

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Hohlbaum, K., Bert, B., Dietze, S., Palme, R., Fink, H., Thöne-Reineke, C. Systematic Assessment of Well-Being in Mice for Procedures Using General Anesthesia. J. Vis. Exp. (133), e57046, doi:10.3791/57046 (2018).

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Abstract

En consonancia con el 3R principio (reemplazo, reducción y refinamiento) desarrollado por Russel y Burch, la investigación científica debe utilizar alternativas a la experimentación animal siempre que sea posible. Cuando no existe alternativa a la experimentación animal, el número total de animales de laboratorio utilizados debe ser el mínimo necesario para obtener datos valiosos. Por otra parte, deberían aplicarse medidas de refinamiento apropiado para minimizar el dolor, el sufrimiento y la angustia que acompaña el procedimiento experimental. Las categorías utilizadas para clasificar el grado de dolor, el sufrimiento y la angustia son recuperación, leve, moderada o grave (Directiva 2010/63). Para determinar qué categorías se aplican en casos individuales, es fundamental utilizar herramientas científicamente sólidas.

El protocolo de evaluación de bien ser presentado aquí está diseñado para procedimientos durante los cuales se utiliza anestesia general. El protocolo se centra en comportamientos de actividad del Mouse Grimace escala y lujo Casa jaula como madriguera o nido edificio comportamiento como indicadores de bienestar. También utiliza el paradigma exploratorio libre de comportamiento relacionadas con la ansiedad rasgo. Metabolitos de corticosterona fecal como indicadores de estrés agudo se miden durante el periodo post anestésico de 24 h.

El protocolo proporciona información científicamente sólida sobre el bienestar de los ratones después de anestesia general. Debido a su simplicidad, el protocolo puede fácilmente adaptado e integrado en un estudio planificado. Aunque no proporciona una escala para clasificar el peligro en categorías de acuerdo a la Directiva 2010/63, pueden ayudar a los investigadores estimar el grado de severidad de un procedimiento utilizando datos científicamente sólidos. Proporciona una manera de mejorar la evaluación del bienestar de una manera científica, centrada en el animal.

Introduction

UE Directiva 2010/631 establece que el principio 3R (reemplazo, reducción, refinamiento) desarrollado por Russel y Burch2 debe ser aplicada siempre que los experimentos con animales es necesario. El objetivo final de la Directiva es eliminar gradualmente toda la experimentación con animales, pero la Directiva reconoce que, por el momento, algunos experimentos con animales son todavía necesarios para investigar que proteja la salud humana y animal. Así, si un experimento animal no puede ser reemplazado por cualquier otro método, sólo el número mínimo de animales de laboratorio es utilizado para obtener resultados fiables. Además, debe reducirse la cantidad de dolor, el sufrimiento y la angustia que acompaña a procedimientos experimentales utilizando medidas de refinamiento apropiado. UE Directiva 2010/63 establece que la severidad de un procedimiento debe ser clasificada por anticipado como recuperación, leve, moderada o grave1. Como clasificación de gravedad se decide caso por caso, es importante tener herramientas científicamente sólidas para estimar la severidad de un procedimiento dado.

Hojas de puntuación propuesto por Morton y Griffith3 son una herramienta esencial en la detección de cualquier desviación del estado normal, incluyendo efectos negativos sobre el bienestar4. Hojas de resultados se utilizan para determinar retrospectivamente el dolor, sufrimiento, y angustia causados por un experimento en cambios visibles en el estado físico del animal individual (por ejemplo, peso corporal, piel, marcha). Aunque VIII anexo de la Directiva 2010/63 proporciona ejemplos de cada categoría de severidad, los investigadores todavía falta herramientas para estimar el grado de severidad de un procedimiento determinado científicamente con base de datos.

La ausencia de indicadores que demuestran bienestar negativo no es la única manera de determinar el estado del animal; la presencia de indicadores apuntando al bienestar positivo es también importante5,6,7,8. Por ejemplo, animales Mostrar comportamientos de lujo como madrigueras y nidifican edificio comportamiento sólo cuando se cumplen todas sus necesidades esenciales. Si se reduce el bienestar, conductas de lujo son los primeros en rechazar5,7. Protocolos a utilizar en la evaluación de bienestar deben incluir indicadores apuntando a los físicos, fisiológicos/bioquímicos y estados psicológicos de los animales para evaluar su bienestar en una forma detallada y completa9.

En el contexto de refinamiento, un protocolo fue desarrollado para cumplir estos requisitos y para evaluar los efectos de un procedimiento con anestesia general en el bienestar de ratones10. Al mismo tiempo, el objetivo era minimizar cualquier tensión adicional para permitir la fácil integración del protocolo en un experimento dado. El protocolo considera madriguera comportamiento, comportamiento de jaula casera como actividad, la ingestión de alimentos y nidificación y comportamiento relacionados con la ansiedad rasgo. Además, incluye la escala de mueca de ratón (MGS) y el análisis no invasivo de metabolitos de corticosterona en las heces. El protocolo está diseñado para facilitar la evaluación del bienestar de una manera científica y centrada en el animal y proporcionar información sobre bienestar compatible con la clasificación del grado de severidad. Además de hojas de calificación, puede proporcionar información útil para la clasificación de la severidad de un procedimiento. El protocolo es fácil de realizar y no requiere equipo extensa, puede integrarse en un experimento continuo sin influir en los resultados de un estudio. Cabe señalar que la investigación Animal: informes de en Vivo experimentos (llegar) pauta11 debe ser observado en todos los estudios de experimentación animal, con el objetivo de mejorar el diseño, análisis y presentación de informes.

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Protocol

El estudio se realizó según las directrices establecidas por la ley de Bienestar Animal y fue aprobado por la autoridad del estado de Berlín ("Landesamt für Gesundheit und Soziales", permiso número: G0053/15).

Nota: El objetivo principal de este protocolo fue investigar el efecto de la anestesia repetida en metabolitos de glucocorticoides. Se realizó un cálculo de tamaño de muestra para determinar el número de animales a utilizar: n ≥ 2 × (s/μ1- μ2)2 x (zα + zβ)2. μ1- μ2 es la diferencia entre medias de la población a que potencia y muestra se hacen cálculos de tamaño (α = 5%, β = 80%); zα = 1.96 y zβ = 0.84 son los cuantiles de la distribución normal estándar. La figura 1 ilustra la línea de tiempo del presente Protocolo. Si un parámetro del protocolo muestra una diferencia con el nivel de control, el animal debe ser estrechamente vigilado, y el parámetro debe medirse otra vez después de un período adecuado. Por ejemplo, si comportamiento relacionadas con la ansiedad rasgo se incrementa, este comportamiento debe ser evaluado otra vez una semana más tarde, con el fin de ayudar a determinar el periodo hasta la recuperación completa. Momentos y periodos definidos en el presente Protocolo pueden ser adaptados para su uso con otros procedimientos. Al cambiar los puntos del tiempo, períodos de habituación deben mantenerse como se describe en el protocolo. Con el fin de reducir los factores que podrían influir en el comportamiento de los ratones, se deben realizar pruebas que requieran manipulación más después de pruebas que no perturban el normal comportamiento de los ratones. Figura 2 resume todas las pruebas del Protocolo con una hoja Resumen de puntuación. La figura 3 muestra simplificadas escalas del grado de bienestar, que dan una visión general de cómo interpretar los resultados de la prueba.

1. habituar ratones a manejo por experimentador

  1. Permiten ratones a habituarse a un centro de animales de al menos 2 semanas después de que se han obtenido de otro servicio o proveedor.
  2. Casa de ratones en los grupos y mantenerlos en condiciones normales (temperatura de 22 ± 2 ° C; humedad relativa 55 ± 10%) en un ciclo luz: oscuridad de 12:12 h.
  3. Proporcionar a todos los grupos un nestlets túnel y algodón como enriquecimiento de la norma y proporcionar comida y agua ad libitum.
  4. Habituarse a todos los ratones al túnel o taza de manejo por lo menos una semana antes de la prueba12.
    Nota: Recoger ratones por la cola puede inducir estrés o ansiedad, que afecta a su vez bienestar y también tiene un impacto en los resultados de este protocolo12.

2. preparación de la sala de pruebas conductual y aparatos

Nota: Proporcionar un cuarto separado para la prueba, idealmente cerca de la sala donde se guardan los animales. Transporte de los ratones en sus jaulas de inicio a la prueba sala al menos 60 min antes de que el procedimiento se lleva a cabo. Si es posible, llevar a cabo todas las pruebas del presente Protocolo en la misma sala de pruebas donde se realiza el procedimiento.

  1. Preparar una jaula de observación para probar madriguera comportamiento8 y para tomar las fotografías para su uso en el MGS13 (figura 4).
    1. Utilice una caja de vidrio con una superficie de aproximadamente 220 mm × 290 mm y una altura de 390 mm.
    2. Cubrir el piso de esta caja con aproximadamente 0,5 cm de material del lecho.
    3. Esparcir un puñado de ropa de cama usados material de la caja de página sobre el nuevo material de ropa de cama para reducir la angustia causada por el nuevo entorno.
    4. Proporcionar alimentos, la misma clase que normalmente se suministra como dieta y agua.
      Nota: si posible, use botellas de agua, porque los ratones pueden llenar recipientes de agua con material del lecho.
  2. Preparar una jaula (tipo III: 420 mm × 260 mm × 150 mm) para el período de observación de 24 h, para que los ratones están alojados individualmente (figura 5).
    Nota: Para minimizar la duración de la vivienda individual, recoger datos para nido edificio comportamiento, jaula Inicio actividad, ingesta de alimentos y metabolitos de corticosterona fecal (FCM) durante este período.
    1. Lugar del lecho nuevo material en la jaula (aproximadamente 0,5 cm de profundidad) y la dispersión de un puñado de material de cama utilizado sin las heces de la jaula casera sobre el nuevo material, con el fin de reducir la angustia.
    2. Proporcionar un nestlet normalizados cuadrado de algodón de un peso definido, como enriquecimiento ambiental (ver tabla de materiales) sólo14.
      Nota: Nestlets comerciales pueden diferir en peso. Por ello, modificó el peso de la nestlet descrito por diácono y usa 2,0 g en lugar de 2,7 g14.
    3. Monte el sensor de infrarrojos en la parte superior de la jaula, cuando se utiliza un sensor infrarrojo para medir la actividad de hogar jaula (véase tabla de materiales).
    4. Proveer alimentos, el mismo tipo que normalmente se suministra como dieta y agua ad libitum.

3. Mouse Grimace escala

Nota: Las fotografías para el MGS se toman en la jaula de observación en tres momentos: (i) 2 días antes del procedimiento para registro inicial MGS niveles, (ii) 30 min después del procedimiento y (iii) 150 minutos después del procedimiento. Cuando se deteriora el bienestar de las personas, aumentan los puntajes de la MGS. Si mayor puntuaciones MGS se observan aún después de 150 min, tomar fotografías adicionales en una etapa posterior.

  1. Utilizar una cámara de alta definición para la fotografía.
  2. Transferir el ratón en la jaula de la observación y permiten el ratón para habituarse al nuevo ambiente durante al menos 30 minutos.
  3. Tomar continuamente sobre 30-40 fotografías cada vez punto dentro de 1-2 minutos.
  4. Ordenar todas las fotografías seleccionando las fotografías frontales o laterales afiladas y descartando fotografías borrosas o fotografías que muestran caras de ratón desde otras perspectivas que vista frontal o lateral.
  5. Seleccione al azar una fotografía de cada momento, (es decir, 2 días antes del procedimiento, 30 minutos después del procedimiento y 150 minutos después del procedimiento) para cada ratón.
  6. Recortar las fotografías para mostrar sólo la cabeza del ratón para que la posición del cuerpo no es visible13.
  7. Crear un archivo de hoja de cálculo con una hoja para cada fotografía y agregar una tabla incluyendo las cinco unidades de acción facial de MGS a cada hoja.
    Nota: El archivo contiene fotografías de la línea de base, así como fotografías post procedimiento.
  8. Aleatorizar el orden de las hojas.
  9. Presentar el archivo en una pantalla de ordenador a tres personas independientes, que fueron previamente entrenadas para utilizar el MGS desarrollado por Langford et al. puntuación de las unidades de acción facial utilizando una escala de 3 puntos (0 = no presente, 1 = presente moderado, 2 = obviamente presente).
    Nota: Puntuación se basa siguiendo parámetros13: Orbital apretar ("estrechamiento de la zona orbital, con un párpado totalmente cerrado o un apretón de ojo"); abultamiento de la nariz ("redondeado extensión de piel visible en el puente de la nariz"); abultamiento de la mejilla "(apariencia convexa del de los músculos de la mejilla"); posición de la oreja ("oídos tirados aparte y detrás de su posición de línea de base o presenta estrías verticales que se forman debido a puntas de orejas siendo retirado"); cambio de barba ("movimiento de bigotes de su inicial posición ya sea hacia atrás, contra la cara o a la derecha, como si de pie en el extremo; los bigotes pueden también agruparse").
  10. Analizar resultados, como sigue (adaptado de Langford et al. 13).
    1. Promedio de todas las unidades de acción facial para cada fotografía para generar la puntuación de MGS.
      Nota: Si una de las unidades de acción facial no podría ser anotada, promedio de las restantes unidades de acción facial.
    2. Restar la media de las fotografías de la base de la media para el procedimiento de post de fotografías obtener una puntuación de diferencia MGS para cada ratón.
    3. Prueba para las diferencias en las puntuaciones de diferencia MGS entre las personas (prueba no paramétrica para muestras relacionadas).
      Nota: Si hay una diferencia significativa (p < 0,05), determinar si las calificaciones de todas las fotografías o sólo decenas de unas fotografías difieren entre las personas. Si esto último es cierto, repetir puntuación de estas fotografías. De lo contrario, las personas deben repetir el entrenamiento de MGS y luego marcar las fotografías otra vez.
    4. Promedio MGS diferencia de puntajes obtenidos de los goleadores diferentes para cada ratón, si los resultados de todas las personas no difieren significativamente.
    5. Utilizar una prueba estadística no paramétrica para comparar las puntuaciones de diferencia MGS un promedio entre los grupos de estudio.

4. madriguera comportamiento8,15,16

  1. Preparar madrigueras mediante la colocación de 140 pellets de alimentación de 2 g ± normalmente suministrados como dieta en estándar botella de agua plástica opaca (250 mL, longitud de 150 mm, diámetro 55 mm, 45 mm de diámetro de cuello de la botella)8.
    Nota: Como los ratones prefieren tubos amplia, madrigueras con un diámetro de 68 mm pueden utilizarse como se describe por diácono16.
  2. Lugar la madriguera llena de bolitas de comida en la jaula casa 5 días antes del procedimiento de aclimatación.
    Nota: La unidad regular de distribución de alimentos en la jaula no debe vaciarse pero también debe permanecer llenada de bolitas de comida, como ratones se utilizan para esto.
  3. Realizar la prueba dos veces, 2 días antes del procedimiento (línea base); llevar a cabo el pasado 30 min post procedimiento así.
    1. Deja el ratón habituarse por lo menos 30 minutos en la jaula de observación donde se tomaron fotografías para el MGS.
    2. Coloque la botella de agua plástica llenada de pelotillas de alimentos paralelos a la pared posterior de la jaula de observación.
    3. Pesar pellets de alimento (g) queda en la madriguera después de 2 h.
  4. Calcular el peso de pellets de alimento extraído de la madriguera de ratones en relación con el peso inicial (%).

5. 24 h período de observación

Nota: Ratones se alojan individualmente, como se describe en 2.2. (Figura 5), para un período de 24 horas, para medir alimentos ingesta, actividad de inicio de jaula, nido comportamiento del edificio y los niveles de la FCM. La observación de 24 h lleva a cabo dos veces: (i) 2 días antes del procedimiento para niveles iniciales, (ii) en el día del procedimiento.

  1. Ingestión de alimentos
    1. Pesan los ratones a intervalos regulares (por ejemplo 2 días antes de la anestesia, inmediatamente antes de la anestesia, dos días después de la anestesia y a la semana después de la anestesia), con el fin de evaluar los cambios en el peso corporal (parte de la hoja de puntuación).
      Nota: El peso corporal es necesaria para calcular la ingestión de alimentos por gramo de peso corporal. La ingesta de agua también puede ser medida durante el período de observación de 24 h. Si se reduce el consumo de alimentos, bienestar, puede reducirse.
    2. Determinar el peso inicial de dieta estándar (gramos) en la unidad de alimentos de la jaula (aproximadamente 100 g).
    3. Determinar el peso de la dieta estándar al final del período de observación de 24 h.
    4. Analizar el lado de la jaula debajo de la unidad de comida cuidadosamente para derrame de alimentos y agregar cualquier pellets de alimento adicional encontradas que el peso de los pellets de alimento restante en la unidad de alimentos.
    5. Calcular el consumo de alimentos por unidad de peso de cuerpo.
  2. Actividad de jaula casa
    Nota: Las siguientes instrucciones se refieren al uso de un sensor de infrarrojos (véase tabla de materiales), pero la actividad de hogar jaula también puede ser evaluada con programas alternativos. Desviación de la actividad de la casa jaula de niveles de control (por ejemplo, hipoactividad, hiperactividad) puede ser un signo de bienestar deteriorada.
    1. Inicie el programa.
    2. Elija un intervalo de muestreo de 1 min y un tiempo de adquisición de 24 h, lo que significa que los impulsos se registran cada minuto durante 24 h.
      Nota: Si el experimentador entra en la habitación varias veces después de que comenzó la grabación, utilice únicamente datos de épocas, cuando los ratones no fueron disturbados (es decir, durante el periodo oscuro).
    3. Resumen intervalos de 10 minutos de los impulsos.
    4. Calcular el área bajo la curva de tiempo (impulsos x minuto).
  3. Comportamiento de construcción de nido
    Nota: Jerarquías complejas y de altos pueden servir como un indicador de bienestar.
    1. Coloque un cuadrado de algodón nestlet (véase Tabla de materiales) con un peso definido (por ejemplo, 2.0 g) en medio de la jaula.
    2. Puntuación del nido en una escala de 5 puntos (véase abajo) según diácono14 a la mañana siguiente, aproximadamente 2 horas después de que la luz se enciende. Pesar cualquier parte nestlet que esté por lo menos el 5% del peso inicial nestlet. Marcar los nidos de la siguiente manera14
      1. Asignar la puntuación de "1" si el 90% de la nestlet intacto.
      2. Asignar la puntuación de "2" si es del 50-90% intacto.
      3. Asignar puntuación "3" si es rallado 50-90% de la nestlet.
      4. Asignar puntuación «4» si es destruir más del 90%, pero nido es plano, y menos del 50% de su circunferencia es mayor que la altura del cuerpo del ratón cuando se acurrucó.
      5. Asignar puntuación "5" si más de 90% nestlet es triturado y nido es alta, y más del 50% de su circunferencia es mayor que la altura del cuerpo de un ratón encrespado para arriba.
  4. Metabolitos de corticosterona fecal
    Nota: Aumentos del FCM por encima del nivel de control reflejan los niveles de estrés agudo durante el período de postanesthetic 24 h.
    1. Recopilar todos secos pellets fecales de la jaula con unas pinzas al final del período de observación de 24 h y eliminar pellets húmedos contaminados con orina.
    2. Extracto de la FCM según Palme et al. 17, como sigue.
      1. Muestras fecales secas a una temperatura de 60-70 ° C.
      2. Homogeneizar las muestras fecales utilizando un mortero.
      3. Agite una alícuota de 0,05 g con 1 mL de metanol al 80% en un tubo de centrífuga por 30 min en un vórtice múltiple.
      4. Centrifugar las muestras a 2500 x g durante 15 minutos.
      5. Pipetear 0.5 mL del sobrenadante en otro tubo de centrífuga.
      6. Almacenar muestras de heces (y extractos) un mínimo de-18 ° C.
      7. Analizar FCM usando un 5α-pregnane-3b,11b,21-triol-20-one enzima inmunoensayo (EIA)18,19 u otro EIA completamente validado.
    3. Calcular el porcentaje de cambio de las concentraciones de la FCM en relación con las concentraciones de FCM basal.

6. libre paradigma exploratorio

  1. Tomar la casa jaula fuera de la parrilla y coloque en una superficie de la mesa al final del período de observación de 24 h.
  2. Coloque una jaula cuadriculada (sin comida ni botellas de agua) en la jaula en un ángulo de 45° hacia el lado más largo de la jaula.
    Nota: No destruir el nido, que sirve como escondite para el ratón, pero Coloque la jaula diagonalmente sobre el nido.
  3. Monitor o registro de video los ratones durante 10 min a una distancia de aproximadamente 1,5 m.
    1. Iniciar el temporizador.
    2. Tenga en cuenta todas las veces cuando el ratón sube a la parte superior de la jaula (con los cuatro patas en la parte superior de la jaula) o se deja la parte superior de la jaula (con una o más patas en el piso de la jaula).
      Nota: Algunos ratones pueden subir por la parte superior de la jaula y dejarlo para caminar por el borde de la jaula. Algunos ratones también trasera en la parte superior de la jaula. Tratar estos casos como si los ratones estaban todavía en la parte superior de la jaula.
  4. Evaluar parámetros después de Bert et al. 20.
    1. Analizar la latencia a la primera exploración (en segundos).
    2. Analizar el número de exploraciones.
    3. Analizar la duración total (segundos) de exploración.
      Nota: Una alta latencia a la primera exploración, un bajo número de exploraciones y una baja duración total de la exploración puede indicar niveles más altos de ansiedad rasgo.

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Representative Results

Este protocolo fue desarrollado originalmente para evaluar el bienestar de ratones C57BL/6JRj después de una experiencia única de la anestesia isoflurano (una sesión de 45min anestesia, n = 13 hembras) o anestesia isoflurano repetidas (seis 45min anestesia sesiones con 3-4 días entre las sesiones de anestesia, números = 13 hembras) comparada con el bienestar de los ratones control (n = 6 hembras)10, que no recibió anestesia pero fueron probados según las mismas medidas. Se evaluó el impacto de una experiencia única de la anestesia isoflurano y anestesia isoflurano repetidas en el bienestar de ratones C57BL/6JRj en comparación con los ratones de control sin tratar. Aquí, resultados representativos de ratones C57BL/6JRj femeninos, incluyendo algunos datos publicados previamente en Hohlbaum et al. 10, así como resultados inéditos, se muestran.

Análisis estadístico

Se realizaron análisis exploratorio de datos y pruebas de normalidad para cada parámetro. Diferencias entre los grupos de estudio (es decir, control, anestesia isoflurano solo, repetido anestesia isoflurano fueron analizados utilizando la prueba respectiva, según lo indicado en las leyendas de la figura. Cuando los datos cumplen los supuestos de distribución normal, se realizó ANOVA de 1 vía. No-normal distribuido los datos se analizaron utilizando el test de Kruskal-Wallis-. diferencias se consideraron significativas a p < 0.05.

Valores basales

Valores basales, recogidos antes de que el procedimiento se lleva a cabo, son cruciales para determinar si los grupos difieren en el parámetro respectivo. Como se muestra en la figura 6, figura 7, figura 8, figura 9 y figura 10, puntuación de niveles basales de MGS (p = 0.762, prueba de Kruskal-Wallis), comportamientos de lujo como madriguera (p = 0.896, prueba de Kruskal-Wallis) y anidación (p = 0.723, prueba de Kruskal-Wallis), ingesta de alimentos (p = 0.398, ANOVA de 1 vía) y jaula de Inicio actividad (p = 0.208, prueba de Kruskal-Wallis) no difirió significativamente entre los grupos. Por otra parte, no encontraron diferencias significativas en las concentraciones de FCM basal fueron (rango intercuartílico, media entre corchetes [ng/50 mg]: control: 123,01 (82.70 193.46); solo anestesia: 118.31 (101.73-153.54); anestesia repetida: 129,55 (92.58 139.48)) (p) = 0,904, prueba de Kruskal-Wallis). Si se producen diferencias en los niveles de referencia, se pueden calcular valores de delta.

Escala de mueca de ratón

Cuando se comparan las puntuaciones medias de MGS, puntuaciones más altas significativas versus el control fueron encontrados después de la experiencia única de la anestesia (p = 0,001) y después de la última repite sesión de anestesia (p = 0.021) causado a los 30 min después de la última anestesia (figura 6A) . A 150 minutos después de la última anestesia, ya no hubo diferencias entre los grupos (p = 0.910).

Para tener en cuenta el hecho de que decenas MGS de línea de base no son iguales a 0 en todos los casos, se calculó la puntuación de diferencia MGS, como se describe en el protocolo. Ambos una sola experiencia de la anestesia (p = 0.002) y la anestesia repetida (p = 0,008) aumentaron las puntuaciones de diferencia MGS versus el control a los 30 min después de la anestesia. A 150 minutos después de la última anestesia, todos los ratones habían regresado a niveles de control (p = 0,617) (Figura 6B)10.

Madriguera comportamiento

Repite anestesia redujo significativamente el porcentaje de peso de los alimentos bolitas de ratones de la madriguera versus el control (p = 0.036, Kruksal-Wallis-Test) (figura 7)10.

Comportamiento de construcción de nido

No hubo diferencias significativas en las puntuaciones de nido entre una experiencia única de anestesia, la anestesia repetida y el control (p = 0.240, Kruksal-Wallis-Test) (figura 8)10.

Ingestión de alimentos

En 1 día después de la última anestesia, ratones que habían experimentado la anestesia repetida mostraron significativamente reducción en comparación con ratones que habían experimentado la anestesia solo la ingestión de alimentos (p = 0.047, ANOVA de 1 vía). En cambio, una semana más tarde, los ratones que habían recibido repitieron anestesia consume mucho más alimento que los controles (p = 0.012, ANOVA de 1 vía) o ratones que recibieron una sola anestesia (p = 0,001, ANOVA de 1 vía) (figura 9)10.

Actividad de jaula casa

En 1 día después de la última anestesia, actividad jaula casera durante el período oscuro, indicada por el área bajo la curva de actividad, no fue diferente significativamente entre los ratones que habían recibido una sola anestesia, anestesia repetida o tratamiento de control (p = 0.498, Kruskal-Wallis-Test) (figura 10)10.

Libre paradigma exploratorio

Todos los ratones exploran la parte superior de la jaula, cuando la prueba se llevó a cabo. Sin embargo, un día después de la última anestesia, ratones que habían recibido repitieron anestesia (rango intercuartílico, media entre corchetes [s]: 78.00 (55.00-89.00)) exploraron la parte superior de la jaula significativamente más adelante en el tiempo que lo hizo controles (31.00 (18.25-42.75); p = 0,009, Kruskal-Wallis-Test) y los ratones que recibieron una sola anestesia (27.00 (21.00-45.50); p = 0,001, prueba de Kruskal-Wallis), como se ha publicado10. La duración total de los parámetros de exploración (Figura 11A) y el número de exploraciones (figura 11B) son análogos a la latencia a la primera exploración. Repite anestesia redujo significativamente el número de exploraciones versus control (p = 0.023, prueba de Kruskal-Wallis) y la duración total de la exploración (p = 0.032, prueba de Kruskal-Wallis) versus una anestesia solo en 1 día después de la última anestesia. A los 8 días después de la anestesia pasada, todos los parámetros, es decir, la latencia a la primera exploración (control: 27.50 (13.50-47.25); solo anestesia: 18.00 (9.50-38.50); anestesia repetida: 20.00 (12.50 42.00); p = 0.722, prueba de Kruskal-Wallis), el número de exploraciones (p = 0.057), y duración de la exploración (p = 0.579), no diferenciaron entre los grupos de estudio (figura 11).

Metabolitos de corticosterona fecal

Para tener en cuenta los valores de referencia obtenidos, el porcentaje cambio correspondiente a la línea base se calculó y no se encontraron diferencias significativas entre los grupos (p = 0.119, prueba de Kruskal-Wallis) (figura 12)10.

Figure 1
Figura 1 : Time line del Protocolo de. Campos de color gris y blanco simbolizan la oscuridad y luz períodos de un día, respectivamente. Dependiendo del procedimiento, este protocolo puede ser adaptado. "La habituación a la madriguera" significa que ratones tienen que ser aclimatadas a usar la botella de agua plástica como una madriguera en su jaula casera, antes de la prueba de madriguera puede llevarse a cabo. B, valor de referencia; FCM, metabolitos de corticosterona fecal. Esta figura ha sido modificada desde Hohlbaum et al. 10. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Hoja de puntuación Resumen. Esta hoja incluye todas las pruebas y puede ser llenada para cada ratón individual. Fecha y hora deben añadirse cuando la prueba se lleva a cabo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Escalas del grado de bienestar. Las escalas van desde "bienestar intacto" (verde) a "bienestar deteriorada" (rojo) y expresar el significado de los resultados en una forma simplificada. En esta etapa de conocimiento sobre indicadores de bienestar, no podemos hacer una declaración definitiva sobre el grado de bienestar para cada prueba, sólo una declaración general. MGS, Mouse Grimace escala. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Jaula de observación. Esta jaula se utiliza para la prueba de madriguera comportamiento y tomar fotografías para ser analizados según la escala de mueca de ratón (MGS). La parte frontal de la jaula está clara y, dependiendo de los colores de la piel de los ratones, las otras tres paredes deben ser color negro o blanco para que contraste con los ratones. El piso de la caja de vidrio se cubre con aproximadamente 0,5 cm de material de ropa de cama incluyendo lecho usado material de la caja de página. Disponen de agua y alimentos. Si es posible, las botellas de agua en lugar de tazones de fuente deben utilizarse, porque los ratones pueden llenar recipientes con material del lecho. Después de un periodo de habituación de al menos 30 minutos, se agrega la madriguera. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : período de observación de 24 h. Evaluar nido edificio comportamiento, jaula Inicio actividad y consumo de alimentos y recoger muestras de heces de que medir los metabolitos de corticosterona fecal (FCM), ratones se alojan individualmente durante 24 h (jaula tipo III: 420 mm × 260 mm × 150 mm, material del lecho aproximadamente 0,5 cm de profundidad con usado cama material de la caja de página dispersos en la parte superior, un algodón nestlet, agua y alimentos de la dieta ad libitum). Se monta un sensor de infrarrojos en la parte superior de la jaula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : Ratón mueca escala (MGS). El cuadro representa el rango intercuartil (IQR), los bordes de la caja son el 25th y cuartil 75 deth . El bigotes representan valores no superan a 1,5 × de IQR. Los puntos son atípicos con valores entre 1.5-3.0 × IQR. Asteriscos de colores son atípicos con valores mayores que 3,0 × IQR. (A) significa MGS puntuación. (B) significa MGS diferencia de puntuación. valores de p se calcularon mediante la prueba de Kruskal-Wallis: * p < 0.05; ** p < 0.01. Debido a un fallo técnico (cámara, escala), cuatro ratones en el grupo de anestesia solo debían ser excluidos de las estadísticas. Esta figura ha sido modificada desde Hohlbaum et al. 10. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7 : Madriguera comportamiento. El cuadro representa el rango intercuartil (IQR), los bordes de la caja son el 25th y cuartil 75 deth . El bigotes representan valores no superan a 1,5 × de IQR. Asteriscos de colores son atípicos con valores mayores que 3,0 × IQR. valores de p se calcularon mediante la prueba de Kruskal-Wallis: * p < 0.05. Debido a un fallo técnico (cámara, escala), cuatro ratones en el grupo de anestesia solo debían ser excluidos de los análisis estadísticos. Esta figura ha sido modificada desde Hohlbaum et al. 10. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8 : Nido comportamiento del edificio. El cuadro representa el rango intercuartil (IQR), los bordes de la caja son el 25th y cuartil 75 deth . El bigotes representan valores no superan a 1,5 × de IQR. Los puntos son atípicos con valores entre 1.5-3.0 × IQR. valores de p se calcularon mediante la prueba de Kruskal-Wallis; día d. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9 : Ingestión de alimentos. Los datos son medias ± desviación estándar. valores de p fueron calculados utilizando ANOVA de 1 vía (post-hoc Tukey-HSD): * p < 0.05; ** p < 0.01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 10
Figura 10 : Inicio actividad jaula. El cuadro representa el rango intercuartil (IQR), los bordes de la caja son el 25th y cuartil 75 deth . El bigotes representan valores no superan a 1,5 × de IQR. Los puntos son atípicos con valores entre 1.5-3.0 × IQR. valores de p fueron calculados usando el test de Kruskal-Wallis-. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 11
Figura 11 : Paradigma exploratorio gratis. El cuadro representa el rango intercuartil (IQR), los bordes de la caja son el 25th y cuartil 75 deth . El bigotes representan valores no superan a 1,5 × de IQR. Los puntos son atípicos con valores entre 1.5-3.0 × IQR. Asteriscos de colores son atípicos con valores mayores que 3,0 × IQR. (A) total duración de la exploración. (B) el número de exploraciones. valores de p se calcularon mediante la prueba de Kruskal-Wallis: * p < 0.05. Esta figura ha sido modificada desde Hohlbaum et al. 10. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 12
Figura 12 : Metabolitos de corticosterona fecal (FCM). El cuadro representa el rango intercuartil (IQR), los bordes de la caja son el 25th y cuartil 75 deth . El bigotes representan valores no superan a 1,5 × de IQR. Asteriscos de colores son atípicos con valores mayores que 3,0 × IQR. Se midieron niveles FCM 2 días antes y 1 día post procedimiento. Se calculó el cambio de porcentaje [%] de las concentraciones de la FCM en relación con el valor de la línea de base respectiva. Los datos se analizaron utilizando el test de Kruskal-Wallis-. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El protocolo fue desarrollado originalmente para evaluar el bienestar de ratones C57BL/6JRj que recibió un solo anestesia o anestesia isoflurano repetidas. Los resultados confirman las pruebas de comportamientos de lujo, así como otras medidas (por ejemplo, el paradigma exploratorio libre, MGS, escarban la ingestión de alimentos) fueron métodos sensibles para evaluar el bienestar. Anestesia isoflurano repetidos causados a corto plazo efectos de comportamiento relacionadas con la ansiedad de rasgo, el MGS y el comportamiento de madriguera. Por otra parte, anestesia isoflurano repetido parece influir en la ingesta de alimentos10.

El paradigma exploratorio libre había indicado conducta exploratoria reducida y, en consecuencia, mayores niveles de ansiedad rasgo en los ratones que fueron anestesiados repetidamente en comparación con ratones anestesiados sólo una vez y los controles. Sin embargo, ratones de todos los grupos exploran la jaula cuadriculada top10,20. Al investigar el comportamiento relacionados con la ansiedad, es importante distinguir entre rasgo y estado de ansiedad21,22. Colocando el ratón en un ambiente desconocido induce ansiedad estado. En contraste, el paradigma exploratorio libre permite a los animales a permanecer en sus jaulas hogar y, así, investiga el rasgo de ansiedad.

La reducción de conducta exploratoria entre ratones después de anestesia repetida no se puede explicar por la disminución de la actividad motor. Actividad hogar jaula durante el período oscuro no difirió significativamente entre los grupos de estudio. Esto indica que ratones ya físicamente habían recuperado de la anestesia, cuando se realizó la prueba de libre paradigma exploratorio.

El MGS fue realmente desarrollado para evaluar el dolor, pero hay evidencia de que las expresiones faciales también son alteradas por el estrés y las emociones positivas13,23. Las fotografías de las caras del ratón indican que ambos anestesia isoflurano sola y repetida subieron puntaje MGS en el corto plazo en el periodo post anestésico inmediato. Como la puntuación de diferencia MGS se mantuvo por debajo de 1, el nivel de estrés parece suave10. Los resultados concuerdan con las observaciones recientes de Miller et al. 24 , 25 y demostró que ratones volvió a controlar el nivel 150 min post anestesia10.

Conductas de lujo como madriguera o nido edificio comportamiento son específicos y pueden servir como indicadores de bienestar7 y buena salud general en ratones26. Ratones sólo muestran comportamientos de lujo cuando se cumplen todas sus necesidades esenciales. Si se reduce el bienestar, conductas de lujo son los primeros en ser deteriorada5,7. Estudios anteriores han demostrado que madriguera y nidificación pueden ser deteriorados por dolor y angustia6,8, pero también hay evidencia que las lesiones hipocampales pueden afectar estos dos comportamientos15,27 , 28 , 29 , 30 , 31.

Comportamientos de lujo fueron investigadas en el periodo post anestésico temprano (madriguera comportamiento) y por la mañana del día siguiente (comportamiento de construcción del nido). La prueba de madriguera comportamiento elaborado por Deacon et al. y adoptado por Jirkof et al se modificó con respecto a la aclimatación (alojamiento en grupo en lugar de vivienda individual) y la duración de medición conductual (sólo 2 h en lugar de 24 h) 8 , 15 , 16.

Es notable que repite anestesia reducida madriguera comportamiento, lo que sugiere que hubo un deterioro del bienestar inmediato post anestesia10, que también fue reportado por Jirkof et al. 8. pero en la mañana del día siguiente, cuando los ratones habían tenido más tiempo para recuperarse de la anestesia, los alta y complejos nidos habían construido indicaron que estaban experimentando bienestar10. Estos resultados difieren de los informes anteriores que anotaron nidos en un tiempo anterior32. Por lo tanto, puede ser útil adaptar el protocolo y puntuación de nidos a un tiempo anterior. Sin embargo, el ritmo circadiano de nido comportamiento del edificio debe todavía considerar, como ratones tienden a preparar sus nidos en el final de la fase oscura32.

La ingestión de alimentos disminuyó marginalmente 1 día después de la anestesia repetida, pero pasó una semana más tarde. Como ratones no perdieron peso corporal (véase Hohlbaum et al. 10) puede estar ocurriendo algún tipo de mecanismo de compensación, y deterioro de bienestar con respecto a la ingesta de alimentos se debe clasificar como suave10. Consumo de alimentos proporciona una idea de sufrimiento postoperatorio, el bienestar y el apetito en los ratones, que puede ser deteriorada por náusea postoperatoria26 y27de estrés postoperatorio.

FCM confiablemente indicar estrés en ratones33,34,35. Las concentraciones pico FCM típicamente ocurren 8-10 h después de un estresante pero dependen el tiempo de tránsito intestinal18. Por lo tanto, es crucial también supervisar la actividad de la jaula de casa, tal y como figuran en el presente Protocolo. Debido al efecto del ritmo circadiano en excreta FCM18, es aconsejable recoger muestras de heces durante un período de 24 h. FCM concentraciones estrés agudo reflejado en el periodo post anestésico de 24 h. Como FCM los niveles varían de individuo a individuo, se calculó el cambio porcentual de los niveles de la FCM en relación a la línea de base. Los resultados de la FCM de la presente investigación indican que una experiencia de anestesia ni anestesia repetida había aumentado de actividad de eje hipotalámico-pituitario-suprarrenal (HPA)10.

Con todo, los resultados revelaron que repite anestesia isoflurano causa angustia leve a corto plazo y problemas de bienestar en el período temprano de postanesthetic un poco más de una experiencia única de isoflurano anestesia10.

Un protocolo para evaluar el bienestar debería imponer sufrimiento adicional en los animales. Una limitación del presente Protocolo es que incluye caja individual durante el período de observación de 24 h, que se sabe para aumentar el plasma de los niveles de corticosterona36. Sin embargo, cada vivienda es necesario recoger datos válidos para las personas con respecto a la actividad jaula casera, la ingestión de alimentos, comportamiento de construcción del nido y los niveles FCM. La duración de la vivienda individual se minimizó al investigar esos cuatro parámetros al mismo tiempo (es decir, durante el período de observación de 24 h). Para evitar que los resultados están sesgados por viviendas individuales, los ratones de control experimentaron las mismas pruebas y sus resultados fueron tomados en cuenta. Si los métodos están disponibles para medir esos parámetros en un entorno de alojamiento en grupo, deben ser usados (por ejemplo,un sistema de análisis automatizado de casa jaula jaula Inicio actividad37 y para la toma de comida). Sin embargo, sistemas de análisis automatizados jaula casa requieren equipo adicional, que puede no estar disponible. En estudios centrados en grupos de animales en lugar de individuos, actividad jaula casera, toma de comida, nido edificio comportamiento y niveles FCM también pueden evaluar un grupo de ratones. Lo mismo se aplica al paradigma de la libre exploración, que sólo requiere los ratones debe ser visiblemente marcado para que puedan ser distinguidos. Si se reduce el bienestar en un grupo, deben medirse cuidadosamente todos los ratones del grupo (usando la hoja de puntuaciones y examen clínico) identificar el ratón o los ratones. Otras observaciones a nivel de grupo son necesarios para determinar la sensibilidad de los valores de grupo.

En cuanto a refinamiento, este protocolo puede ser adaptado a e integrado en los estudios en curso para evaluar el impacto de un procedimiento particular para el bienestar de los ratones. Dependiendo del diseño particular del procedimiento y estudio, las pruebas más convenientes de este protocolo deben ser elegidas. Aquí, la madriguera y nido edificio prueba, MGS, paradigma exploratorio libre y medición de la ingesta de alimentos parecen ser especialmente beneficioso. Como comportamiento de ratones sigue ritmos circadianos38, es recomendable realizar pruebas de comportamiento en los ratones de todos los grupos en un momento definido. Los ratones son más activos en la mañana que en la tarde38. Sin embargo, si el diseño del estudio no permite para probar en la mañana, el examen se puede hacer en otro momento. También es importante asegurarse de que cada prueba individual se lleva a cabo en los mismos puntos de tiempo para todos los grupos. De lo contrario, el impacto del ritmo circadiano de los parámetros puede resultar en intra - o diferencias intergrupos. Por otra parte, ratones de control deben incluir en el estudio, por lo que pueden compararse con los resultados de ratones tratados y de control de ratones. Ratones de control deben probarse en el mismo momento como ratones tratados. Si el protocolo muestra que ese bienestar se deteriora, el procedimiento debe ser refinado, y repetir el protocolo. Este enfoque puede mostrar si los esfuerzos para refinar el procedimiento fueron efectivos.

El presente Protocolo puede servir como una ayuda general para estimar el grado de severidad causada por un procedimiento. Por lo tanto, ayuda a clasificar la severidad de un procedimiento en el ámbito científico - y animal-centrada. Sin embargo, el Protocolo no proporciona una escala para la clasificación de un procedimiento como leve, moderada o grave. Para clasificar la severidad de un procedimiento, es necesario referirse a los ejemplos en anexo VIII de la Directiva 2010/63.

En conclusión, el presente Protocolo apoya una evaluación sistemática del bienestar en ratones de una manera científica, centrada en animales, siguiendo procedimientos durante los cuales se utiliza anestesia general.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Gracias a Sabine Jacobs para ayudar con la recogida de muestras, Edith Klobetz-Rassam para análisis de FCM, PD Dr. med. veterinario. habil. Roswitha Merle para ayudar a análisis estadístico y Wiebke Gentner para corregir el manuscrito. El estudio es parte de la plataforma de investigación de Berlin-Brandenburg BB3R (www.bb3r.de) y fue financiado por el Ministerio Federal alemán de educación e investigación (número: 031A262A) (www.bmbf.de/en/index.html).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isofluran CP-Pharma Handelsgesellschaft mbH 1214
InfraMot - Sensore Units TSE Systems 302015-SENS
InfraMot - Control Units TSE Systems 302015-C/16
InfraMot - Software TSE Systems 302015-S
Nestlet N Ancare - Plexx NES3600
Camera EOS 350D Canon

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