Ekstraktion af Hemocytes fra Drosophila melanogaster larver for mikrobiel infektion og analyse

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne metode viser, hvordan man visualisere patogen invasion i insekt celler med tre-dimensionelle (3D) modeller. Hemocytes fra Drosophila larver var smittet med virale eller bakterielle patogener, enten ex vivo eller i vivo. Inficerede hemocytes blev derefter fast og farvet for billeddannelse med en Konfokal mikroskop og efterfølgende 3D cellulære genopbygning.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Hiroyasu, A., DeWitt, D. C., Goodman, A. G. Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis. J. Vis. Exp. (135), e57077, doi:10.3791/57077 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Under den patogene infektion i Drosophila melanogaster, spille hemocytes en vigtig rolle i immunresponset i hele infektionen. Målet med denne protokol er således, at udvikle en metode til at visualisere patogen invasion i en specifik immun rum af fluer, nemlig hemocytes. Ved hjælp af den metode, der præsenteres her, op til 3 × 10 kan6 live hemocytes fås fra 200 Drosophila 3rd instar larver i 30 min for ex vivo infektion. Alternativt kan hemocytes være inficeret i vivo gennem indsprøjtning af 3rd instar larver efterfulgt af hemocyte udvinding til 24 timer efter infektionen. Disse inficerede primærelementer blev fastsat, farves og afbildet ved hjælp af Konfokal mikroskopi. Derefter, 3D repræsentationer blev genereret fra billeder til endeligt Vis patogen invasion. Derudover høj kvalitet RNA for qRT-PCR kan fås til påvisning af patogenet mRNA følgende infektion og tilstrækkelig protein kan udvindes fra disse celler til vestlig skamplet analyse. Taget sammen, præsenterer vi en metode til konkret forsoning af patogenet invasion og bekræftelse af smitte ved hjælp af bakterielle og virale patogen typer og en effektiv metode til hemocyte udvinding for at få nok live hemocytes fra Drosophila larver for ex vivo og i vivo infektion eksperimenter.

Introduction

Drosophila melanogaster er en veletableret model organisme for studiet af medfødt immunitet1. Under den medfødte immunrespons spille hemocytes en vigtig rolle i svaret på patogen udfordring. Hemocytes er afgørende for indkapsling parasitter, samt at have en vigtig funktion i bekæmpelse af patogenet gennem fagocytiske aktion under svampe, virale og bakterielle infektion2,3.

For bedst forstå værtens medfødte immunresponset patogene mikrobielle infektioner, er det vigtigt at visualisere, hvordan patogenet invaderer værtsceller under infektion. Denne visualisering bidrager til en forståelse af mekanismen for invasion. Sammen med detaljer af patogenet intracellulære lokalisering og den cellulære reaktion, kan disse data give et fingerpeg om host reaktion på infektion og de cellulære organeller som mikrobe interagerer. Således er kan 3D model genopbygning efter billeddannelse ved mikroskopi være hjælpsomt at bestemme den nøjagtige placering af patogener i værtsceller. I denne undersøgelse visualiseret vi invasion af Coxiella burnetii (C. burnetii), det agens af Q-feber, en zoonotisk sygdom, der udgør en alvorlig trussel mod både menneskers og dyrs sundhed, i primære Drosophila hemocytes. For nylig, blev det påvist, at Drosophila er modtagelige for Biosikkerhed niveau 2 Nine Mile fase II (NMII) klon 4 stamme af C. burnetii og at denne stamme er i stand til at replikere i Drosophila4, der angiver, at Drosophila kan bruges som en model organisme for at studere C. burnetii patogenese.

Tidligere undersøgelser har brugt hemocytes til at undersøge værtens medfødte immunrespons. Hemocytes har været brugt til morfologiske observationer5,6,7, morfometrisk analyse2,8, fagocytose analyse2,3, qRT-PCR2 , 9, immunoprecipitation10,11, immunfluorescent analyse10,12, immunfarvning13, immunoblotting3,10, 11 og Immunhistokemi9,14. Selvom Drosophila S2 celler er også tilgængelige for forskellige in vitro- eksperimenter, ændre immortalization og potentielle allerede eksisterende virusinfektion deres opførsel15,16. Brug af primære celler i modsætning til en udødeliggjort cellelinie, såsom S2 celler, tillader for studiet af medfødte immun funktion i et system mere repræsentativ for hele organismen. Derudover tillader infektion af hemocytes i vivo, før udvinding, cellerne til at interagere med andre vært proteiner og væv, en fordel i forhold til udvinding af hemocytes før ex vivo infektion. En række forskellige metoder har været udnyttet til at opnå et tilstrækkeligt antal hemocytes i en kort periode af tid til at holde hemocytes i live8,17,18,19.

I denne undersøgelse præsenterer vi en metode til at udtrække hemocytes fra Drosophila 3rd instar larver for patogene mikrobiel infektion med C. burnetii, Listeria monocytogenes (Listeria) eller hvirvelløse iriserende virus 6 (IIV6). Vi beskriver metoder til både i vivo og ex vivo hemocyte infektioner. In vivo- og ex vivo-inficerede hemocytes blev visualiseret med Konfokal mikroskopi og bruges til at opbygge 3D-modeller af C. burnetii invasion. Derudover bruger udvinding protokol, ex vivo-inficerede hemocytes blev brugt til gen- og protein udtryk assays. Specifikt, for at undersøge omfanget af infektion med IIV6 og Listeria, blev total RNA eller protein isoleret fra cellerne for qRT-PCR eller Western blot analyse. Tilsammen, protokollen indeholder metoder til hurtigt at indsamle høje antal hemocytes fra 3rd instar larver og beviser at primære hemocytes, inficeret enten i vivo eller ex vivo, er en velegnet platform for mikrobielle patogen infektion og gældende downstream undersøgelsesfelt mikroskopi, transcriptomics og proteomics.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ex vivo infektion

  1. Medium og udstyr
    1. Under sterile forhold, forberede frisk Drosophila Hemocyte isolere Medium (DHIM) der indeholder 75% Schneider Drosophila medium med 25% føtal bovin Serum (FBS) og filter sterilisere den.
    2. Layer 2-3 stykker af 10 cm x 10 cm paraffin film under et stereomikroskop.
    3. Forbered glas kapillær. Indstille kapillær puller varmelegeme til 55% af maksimum. Trække den kapillarrør til en skarp punkt af ca 10 µm.
    4. Opfyldning kapillær med mineralsk olie.
    5. Samle fyldt kapillarrør på nanoinjector (fig. 1A), og Åbn sammenvoksede kapillarrør tip ved at afbryde spidsen med pincet (figur 1B). Den udvendige diameter af spidsen bør være 100 µm til nem optagelse af hemocytes.
    6. Skubbe så meget olie som muligt fra kapillarrør tip, derefter udfylde med DHIM. For nem visualisering af grænsen op-taget hemolymph og olien, omfatter en luftboble mellem olie og DHIM (figur 1B').
  2. Hemolymph udsugning
    1. Pick 3rd instar Drosophila larver indefra mur af mad hætteglas forsigtigt bruge pincet og placere dem i en 100 µm si (figur 1C). 3rd instar larver er fundet 3-6 dage efter frugtbare æglægning af en voksen kvinde.
      Bemærk: Disse forsøg anvendes genotype, w1118; P {w+ mC= Hml-GAL4.Δ} 2, P {w+ mC= UAS-2xEGFP} AH2, da hemocytes fra disse dyr udtrykke øget grøn fluorescerende proteiner (EGFP) til at støtte i identifikationen af cellerne ved mikroskopi.
    2. Hæld 5 mL sterilt vand over larver og ryste sien for 5 s. sted si på opgave tør at fjerne det overskydende vand (figur 1C').
    3. Overføre larverne til en 1,5 mL microcentrifuge tube. Bedøver dem med CO2 gas til 5 s (fig. 1D).
    4. Placer larver på paraffin film under stereomikroskopet, med dorsal-side opad (fig. 2A).
    5. Sted glas kapillær let på larve bageste kroppen til at holde det på plads og forstyrrer bagerste neglebånd åbne ved hjælp af fine spids pincet (figur 2B).
    6. Tillade hemolymph at strømme ind på filmens paraffin (figur 2C).
    7. Gøre en pulje af hemolymph herunder hemocytes fra 20-50 larver på et tidspunkt på paraffin-film.
    8. Tage op poolet hemolymph ved hjælp af glasset kapillær på nanoinjector (figur 2D).
      Bemærk: Der skal være ca 10-20 µL af hemolymph.
    9. Skubbe hemolymph i en 1,5 mL microcentrifuge tube indeholder 500 µL af DHIM (figur 2E).
    10. Gentag trin 1.2.4) - 1.2.9) for hver batch af larver.
  3. Tæl antallet af hemocytes.
    1. Der afpipetteres 5 µL af 0,4% Trypan blå opløsning i et 0,6 mL microcentrifuge rør til at plette de døde celler. Forsigtigt Bland DHIM og hemocytes i 1,5 mL rør med pipette, og overføre 5 µL af DHIM herunder hemocytes til 0,6 mL microcentrifuge tube og bland forsigtigt.
    2. Der afpipetteres 10 µL af celler fra 1:1 Trypan blå: hemocyte blandingen i hemocytometer.
    3. Tæl antallet af levende hemocytes, der ikke farves med Trypan blå i hvert af felterne 4 hjørne af hemocytomter og beregne koncentrationen af hemocytes pr. milliliter ved hjælp af formlen:
      Equation 1
      hvor X er koncentrationen af levende hemocytes pr. milliliter; a, b, c og d er antallet af levende celler (som bestemt af Trypan blå udelukkelse) i hver 4 felter tælles i hemocytometer. Division med 2 af det samlede antal celler tælles er 1:1 fortynding af celler med Trypan blå. Celler farves med Trypan blå betragtes døde.
  4. Ex vivo Infektioner
    1. Bestemme antallet af brønde skal forhåndsudfyldes med celler baseret på timepoints og biologiske replikater behov for hvert forsøg. 5.0 × 104 hemocytes er ønskværdigt for RNA og protein oprensning efter infektion.
    2. Beregne omfanget af patogenet materiel, der skal fortyndes med DHIM for infektion ved hjælp af følgende formel:
      Equation 2
      hvor mangfoldighed af infektion (MOI) er antallet af viral eller bakterier ønskede pr. celle.
      Bemærk: MOI bruges afhænger af individuelle eksperiment og assays udføres. Her, 10 genom ækvivalenter (GE) / celle af C. burnetii, 10 CFU/celle af Listeriaeller 1 TCID50/cell af IIV6 blev brugt.
    3. Forberede 500 µL af patogenet medium til hver brønd med en 24-godt plade ved at tilføje den passende mængde af DHIM til viral eller bakteriel mængden i et rør.
    4. Sted en 12 mm runde dækning glas (no. 1 tykkelse) i en brønd på en 24-godt plade.
    5. Delt af DHIM, herunder hemocytes i wells af en 24-godt plade.
    6. Tilføje 500 µL af patogenet medium til hemocytes i en brønd.
    7. Der centrifugeres plade på 1.000 x g i 5 min.
    8. Inkuber plade i 1 time ved 28 ° C. Hver 15 min, forsigtigt vippe plade fra tilbage til forsiden og derefter fra venstre mod højre for 5 s i hånden.
    9. Efter invasionen/udlæg trin 1.4.8 1 h) forsigtigt afpipetteres off patogen medium og vaske hemocytes med friske DHIM, og genopfylde den med 500 µL af friske DHIM.
    10. Inkuber de inficerede hemocytes til den ønskede tid. I disse eksperimenter, C. burnetii- eller IIV6-inficeret hemocytes inkuberes i 24 timer og Listeria-inficerede hemocytes inkuberes i 1, 2 eller 4 h.

2. in vivo infektion

  1. Infektion
    1. Varm Drosophila frugt juice agar plade ved stuetemperatur til 15 min. plader er lavet som tidligere beskrevet20.
      1. Tilsættes 30 g agar til 700 mL vand og autoklave det til 40 min.
      2. Opløs 0,5 g af methyl parabener i 10 mL af absolut ethanol.
      3. Tilføje methyl parabener løsning til 300 mL af frugt saft koncentrat.
      4. Hurtigt Bland saft koncentrat oploesningen autoklaveres agar og afpipetteres 5 mL til 10 × 35 mm petriskåle.
      5. Når pladerne er afkølet til 15 min, gemme dem på 4 ° C.
    2. Forbered 3rd instar larverne efter trin 1.2.1) - 1.2.3).
    3. Placer gær pastaen på en agar plade. Gøre et fint skåret i agar plade hvor larverne kan migrere til undgå tørring (fig. 3A). Samle en 0,001 mm spidse wolfram nål med holding pincet med paraffin film (fig. 3B, C).
    4. Tilsæt 50 µL af høj-titer mCherry udtrykker -C. burnetii (5,95 × 109 GE/mL) til paraffin film under stereo-mikroskop og placere larverne i puljen af bakterier.
    5. Placere larverne i puljen af bakterier. Punktere larverne med en wolfram nål (figur 3D). Overføre larver på en agar plade (figur 3E).
    6. Overføre de resterende patogen medium på agar plade og forsegle pladen med paraffin film.
    7. Holde larverne på pladen i fugtig luft indtil den ønskede tid efter infektionen (figur 3F). I dette eksperiment, C. burnetii-inficerede larver er på pladen i 24 timer.
  2. Hemolymph udvinding og klædningen af hemocytes
    1. Forberede medium og udstyr efter trin 1.1).
    2. Sted en 12 mm runde dækning glas (no. 1 tykkelse) i en brønd på en 24-godt plade. Tilsæt 500 µL af DHIM i brønden.
    3. Ekstrakt af hemolymph fra inficerede larverne efter trin 1.2.4) - 1.2.8).
    4. Skubbe hemolymph i den godt følgende trin 2.2.2).
    5. Gentag 2.2.3) og 2.2.4) for flere partier af larver.
    6. Der centrifugeres plade på 1.000 x g i 5 min.

3. visualisering

  1. Fastsættelse og farvning
    1. Efter at tillade hemocytes at bosætte sig på den runde dækning glas i brønden, forsigtigt fjerne medium fra hver brønd.
    2. Forsigtigt tilføje 200 µL af 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) til hvert hul i fast hemocytes. Inkubér hemocytes i 20 min. ved stuetemperatur.
    3. Fjern 4% PFA og forsigtigt tilføje 200 µL af PBS, som indeholder 0,1% Triton X-100 og 1% bovint serumalbumin (BSA) til hver brønd. Inkubér hemocytes i 10 min ved stuetemperatur.
    4. Fjerne PBS og forsigtigt tilføje 200 µL af 1 × 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) til hver brønd. Inkubér hemocytes i 10 min. i mørke ved stuetemperatur.
    5. Fjerne DAPI løsning og forsigtigt tilføje PBS til hver brønd. Inkubér hemocytes i 5 min ved stuetemperatur.
    6. Drop 10 µL af antifade montering medium på en glas objektglas.
    7. Efter fjernelse af PBS fra hver brønd, skal du fjerne dækslet glas fra 24-godt pladen ved hjælp af fine spids pincet. Anbring forsigtigt dækslet glas på antifade montering medium på glas dias, med hemocytes nedad.
    8. Tillad dias til at tørre ved at placere den i den mørke natten.
  2. Konfokal Imaging
    1. Konfigurere Konfokal mikroskop for tre farve imaging DAPI, EGFP og mCherry. Brug følgende indstilling: DAPI excitation (ex) 405 nm, emission (em) 415-480 nm; EGFP ex 488 nm, em 493-564 nm; mCherry ex 587 nm, em 597-700 nm.
    2. Prøven anbringes på mikroskop og fokus på prøve ved hjælp af en 63 X / 1.4 numerisk blænde (NA) mål. Find ønskede hemocytes i synsfelt for billeddannelse.
    3. Justere laser power og detektor gevinster for at opnå passende eksponering af prøven. Tjek flere z-fly for at sikre niveauet eksponering er passende for hele stikprøven tykkelse.
    4. Find den øverste og nederste position på z-aksen af en hel hemocyte. Sæt disse positioner som start- og slutpositioner for z-skæring.
    5. Kun bruge scanning zoom til billedet området med hemocyte. 3 X zoom faktorer bruges ofte.
    6. Indsamle billede-serien med passende opløsning såsom 1024 x 1024 pixels i x-y plane og 0,3 µm afstand i z-dimension.
  3. 3D model genopbygning
    Bemærk: Open source software findes der udfører mange af de funktioner beskrevet nedenfor for 3D model genopbygning.
    1. Import filen z-sectioned billede serie til softwaren tilknyttet Konfokal mikroskop for 3D model genopbygning.
    2. Vælg en celle, der viser Co lokalisering af cellekerner farves med DAPI og mCherry udtrykker C. burnetii i et EGFP udtryk for hemocyte. Beskær billede-serien indeholder kun en enkelt celle.
    3. Vælg 3D Viewer som rekonstruerer 3D-modellen ved hjælp af softwarens færdigpakkede algoritme. Vælg den ønskede type af 3D repræsentation blandt blanding, overflade og blandet muligheder. I denne metode vises hemocytes, kerner og C. burnetii ved hjælp af overflade modeller.
    4. Observere den 3D rekonstruerede celle fra forskellige visning positioner ved at holde museknappen nede og trække markøren rundt på skærmen. Justere celle orientering og holdning den modellerede lyskilde til at optimere billedet. Andre indstillinger for opacitet, Minimum og maksimum grænse, Specular, Ambient, Shineness og Gamma eksisterer for at optimere billedet.
    5. Tage tværsnit gennem modellen ved hjælp klipning og skæring kommandoer til at visualisere de indvendige indholdet af hemocyte.

4. ansøgning om gen og/eller protein analyse

  1. Efter infektion med IIV6 og Listeria, lyse celler for efterfølgende qRT-PCR eller Western blot analyse som tidligere beskrevet21 og følgende producentens anvisninger.
    Bemærk: Se Tabel af materialer for primere for qRT-PCR og antistoffer for vestlige skamplet.
  2. Analysere PCR produkter ved agarosegelelektroforese gelelektroforese, som tidligere beskrevet22, for at sikre ordentlig længden af den forstærkede produkt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at indsamle live hemocytes for ex vivo infektion, til 3 × 10 blev6 hemocytes udvundet fra 200 Drosophila 3rd instar larver. For at udvikle vores metode, blev en række forskellige teknikker forsøgt. Enkelte larver dissektion ville tage op til 1,5 h, og et gennemsnit på ~ 8000 celler blev opnået ved hjælp af denne metode18, hvoraf de fleste ikke var i live ved udgangen af samling. Næste, vi forsøgte at udtrække hemolymph, som indeholdt hemocytes, fra 20 larver i en tid med et glas kapillarrør19, men kapillar blev tilstoppet med neglebånd materiale og hemolymph var ikke købedygtig tages effektivt op af glasset kapillar. Endelig, vi mekanisk forstyrret neglebånd af 20-50 larver pr. parti med fine pincet12, og lavet en pulje af hemolymph for nem optagelse. Dette gav let samling af en stor mængde af hemocytes fra et stort antal larver (tabel 1).

For at angive, at de udpakkede hemocytes var i live og egnet til infektionen, blev en Trypan blå udstødelse analyse udført for at beregne procentdelen af levende hemocytes udvundet ved hjælp af den metode, der præsenteres her (fig. 6A). Derudover vi sammenlignet vores metode for hemocyte ekstraktion med en tidligere udgivne metode, hvor målet var at udvikle en mekanisk afbrydelse metode til at isolere og differentiere mellem cirkulerende og resident hemocytes fra enkelte Drosophila larve23. Ved sammenligning mellem de to metoder fra 10 uafhængige eksperimentelle isolering observerede vi, at cellernes levedygtighed var lidt større, ved hjælp af metoden præsenteres her (fig. 6A); men metoden fra Petraki mfl. givet tæt på dobbelt så mange hemocytes fra hver 10 dissekeret larverne (fig. 6B). En årsag til det øgede antal hemocytes fra Petraki mfl. metoden er, at denne metode indsamler bopæl (siddende) hemocytes, såvel som cirkulerende hemocytes. For at bekræfte, at cellerne ekstraheres med metoden præsenteres her faktisk var hemocytes, udnyttede vi en fluelinen indeholdende transgener til hemolectin (Hml) selskabet kører GAL4 i cirkulerende hemocytes, der binder opstrøms aktivator sekvens (UAS) til aktivere udvidet grøn fluorescerende proteiner (EGFP) transskription og udtryk i hemocytes. Hemocytes fra hml-GAL4 > UAS-EGFP larver blev udtrukket på chambered daekglas dias, fast, permeabilized og farves med DAPI som tidligere beskrevet21. Figur 7 viser, at de fleste DAPI-positive celler er også EGFP-positive. Kvantificering af co udtryk blev udført fra flere billeder, fra hvilke vi beregnet at 86±9% af celler isoleret var hemocytes.

Protokollen i innovative 3D modeller af patogenet invasion i Drosophila hemocytes udvundet af 3rd instar larverne efter ex vivo eller in vivo C. burnetii infektion. Vi var i stand til at afbilde C. burnetii infektion, da bakterierne express mCherry. Når inficerede hemocytes var fast og farves, blev de filmede for DAPI, EGFP og mCherry ved hjælp af Konfokal mikroskopi. Hemocyte smittespredningen, som bestemmes af procentdelen af EGFP-positive celler, som også udstillede mCherry signal, for både ex vivo og i vivo C. burnetii infektioner var næsten 100%. Det var forventet da en MOI af 10 GE/celle blev brugt til ex vivo infektion, som skal resultere i infektion i 100% af celler24. Vedrørende i vivo infektionerne, da larverne er placeret i en høj-titer dråbe af mCherry udtrykker -C. burnetii (5,95 × 109 GE/mL), antallet af bakterier er nogenlunde 10,000-fold højere end antallet af hemocytes pr. larve. En 100% infektion sats forventes derfor, for i vivo infektioner.

Næste, Z-dele blev indsamlet gennem hemocyte at visualisere hele cellen i 3D, og at bekræfte tilstedeværelsen af C. burnetii i indre af cellen. Figur 4 viser, gennemsigtige tværsnit af en hemocyte (med grønt) med C. burnetii (i rødt) set i indre af cellen. Billederne blev også rekonstrueret til en 3D model (figur 5) repræsenterer hemocyte og C. burnetii, igen viser C. burnetii i indre af de cross-sectioned hemocytes overflade. Interessant, i vivo-inficerede hemocytes udstillet større cytoplasmatisk udvidelser og blev fladere i naturen, mens ex vivo-inficerede hemocytes var mere sfærisk (figur 5). Dette kunne tyde på en større population af lamellocytes i i vivo-inficeret befolkning og plasmatocytes i ex vivo befolkning7. Mens lamellocyte differentiering er generelt induceret under parasitære hveps infektion25, er såret af Drosophila larver også tilstrækkeligt til at fremkalde lamellocyte differentiering26. Endelig, mens ikke udnyttes i de eksperimenter, der præsenteres her, der er normal god landbrugspraksis-udtrykker former af Listeria27 og IIV628 , der kunne bruges til at skabe 3D-modeller af hemocyte infektion. I stedet, Listeria- og IIV6-inficeret hemocytes blev brugt til Western blotting og qRT-PCR eksperimenter.

Ved hjælp af den metode, der præsenteres her, infektioner udføres både ex vivo og i vivo til billedbehandling. Derudover fulgte patogen mRNA og protein analyse ex vivo infektioner. Specifikt, uddraget hemocytes var inficeret med IIV6 og blev anvendt på qRT-PCR analyse. Det viste signifikant højere niveauer af IIV6-193R, en viral gen, der koder for en formodet hæmmer af apoptose29, mellem mock - og IIV6-inficerede celler (fig. 8A). Elektroforese af de forstærkede produkter bekræftet tilstedeværelsen af et band for IIV6-193R-gen produktet i eksemplet inficerede, men ikke mock-inficerede prøven (figur 8B). Forstærket bands til RpII endogen kontrol blev fundet i alle prøver, og IIV6 infektion i S2 celler blev udført som en positiv kontrol. Da IIV6 infektioner blev udført på en MOI af 1 TCID50/cell, var ca 50% af cellerne forventet at være inficeret, baseret på Poisson-fordelingen24.

Total protein fra mock - eller Listeria -inficeret hemocytes blev indsamlet på 1, 2 og 4 h efter infektionen og proteinkoncentration blev fastsat af Bicinchoninic syre (BCA) assay. 100% om cellerne forventedes at blive inficeret ex vivo , da MOI var 10 CFU/celle24. Western blotting bekræfter tilstedeværelsen af Listeria-afledte proteinprodukter i de inficerede hemocytes, med høje niveauer af 4 h efter infektionen (figur 9). Listeria inokulum bruges som positiv kontrol til påvisning af Listeria-specifikke bands. Tilstedeværelsen af actin er vist i hemocyte prøver at bekræfte niveauer af protein lastning. Taget sammen, viser disse resultater, at for hemocytes udvundet ved hjælp af den metode, der præsenteres her var egnet til både virale og bakterielle infektion eksperimenter.

Figure 1
Figur 1 : Oversigt over udstyr og materialer, der anvendes til hemocyte udvinding. Udstyr blev først udarbejdet før dissektion. A) den trak glas kapillær blev indsat i nanoinjector efter at være blevet tilbage-fyldt med mineralsk olie. B) sammenvoksede spidsen af glas kapillær blev brudt med pincet til at oprette en 100 µm ydre diameter. B') DHIM blev taget af kapillar til celle kontaminering og luftbobler blev indført for at foretage en klar sondring mellem olie og DHIM. C) larver er plukket fra mad hætteglas og placeret i en celle si. C') larver er vasket i sterilt vand og vandet er fjernet med en opgave tørre, D) larver er flyttet ind i et microcentrifuge rør og bedøvede med CO2 gas. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Tidslinje og flow chart for udvinding af hemocytes. A) larver er placeret på deres dorsale side før du åbner neglebånd. B) kutikula er afbrudt med fine spids pincet og kapillær nålen. C) hemolymph er blødte på paraffin film. D) puljer af hemolymph fra 20-50 larver er taget med glas kapillær- og nanoinjector. E) hemolymph og hemocytes overføres til et microcentrifuge rør indeholdende 500 µL DHIM regnet med en hemocytometer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: In vivo infektion. En) Drosophila frugt juice agar plader og gær pasta bruges til inkubation af i vivo inficeret larver. Snit er lavet i agar plade til at lette larver levetid (grå pile). B) en 0,001 mm spidse wolfram nålen er fastgjort til pincet med paraffin film. C) spidsen af 0.001 mm spidse wolfram nål. D) larve er prikkes med wolfram nål i patogenet pool på paraffin film i stereo mikroskop. E) de pricked larver er placeret på agar plade. F) pladen er forseglet med paraffin film og holdt på fugtige papirservietter i beholderen indtil passende tid. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Tværsnit af patogenet invasion i hemocytes. Sektioner udvundet fra 3D Konfokal scanning af patogen-inficeret hemocytes. A, B) i xy-afsnit viser C. burnetii (i rød markeret med hvide pilespidser) i indre af hemocyte. De grå pilespidser Vis kerner af hemocytes. A ", en", B') visninger herunder yz - og xz-sektion billeder vise invasion af C. burnetii i hemocytes fra 2 ekstra udsigtspunkter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : 3D-modeller af patogenet invasion i hemocytes. Rekonstrueret 3D modeller af C. burnetii invasion i hemocytes genereres efter ex vivo og i vivo infektion. Model kan frit drejes ved hjælp af softwaren; 6 visning punkter er her vist med hemocyte i grøn, C. burnetii i rød (hvid pilespidser), og kernen i blå (grå pilespidser). Tværsnit billeder viser indre af patogen-invaderede celler er også vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Den procentdel og befolkningen i live hemocytes. Hemocytes blev udvundet fra grupper af 10 3rd instar larver ved hjælp af metoden af Petraki et al. og metoden, der præsenteres her. A) procentdelen af de levende hemocytes blev beregnet for hver teknik ved Trypan blå udstødelse assay. B) den samlede population af hemocytes var i forhold mellem de to teknikker. Bar grafer repræsenterer gennemsnit ± standardafvigelse fra N = 10 biologiske replikater pr. metode til udvinding og assay type. P-værdier angives fra en tosidede Student's T-test antager forskellig varians. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 : Billeder af udpakkede hemocytes du bruger driveren, hemolectin. Hemocytes blev udvundet fra 80 larver af w1118; P {w [+ mC] = Hml-GAL4.Δ} 2, P {w [+ mC] = UAS-2xEGFP} AH2. Promotor for Hml drev GAL4 i cirkulerende hemocytes, som binder UAS hen til aktivere EGFP transskription og udtryk. Hemocytes var fast og farves med DAPI som tidligere beskrevet20. Hemocytes er monteret på chambered coverslips og afbildet af differential interferens kontrakt (DIC) og Fluorescens mikroskopi. Den blå kanal viser kernen farves med DAPI og den grønne kanal viser hemocytes udtryk for EGFP. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8 : qRT-PCR og gel elektroforese. Udtryk for IIV6-193R-gen blev observeret af qRT-PCR kun i IIV6-smittede hemocytes. A) 193R genekspression var normaliseret til den interne kontrol, RpII, og præsenteret som en ratio. Cyklus antallet for de mock-inficeret hemocytes blev vilkårligt sat til en maksimal cyklus antal 40 for analyse siden 193R ikke blev fundet i disse prøver. Data repræsenterer gennemsnit ± standardafvigelse fra N = 3 biologiske replikater pr. gruppe. P-værdien angiver en tosidede Student's T-test antager forskellig varians. B) qRT-PCR produkterne er vist ved agarosegelelektroforese gelelektroforese. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9 : Western Blot analyse. Udtryk af Listeria antigener og aktin i mock- og Listeria-inficerede hemocytes fra 3rd instar Drosophila larver på 1, 2 og 4 h efter infektionen (PI) bestemmes af Western blotting. Total protein koncentrationer blev bestemt af Bicinchoninic syre (BCA) analysen til at normalisere samlede mængde af protein er indlæst i hver vognbane af gelen. Inokulum bruges til at inficere hemocytes blev brugt som en positive kontrolprøve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Metode Gennemsnitligt antal larver
for hemocyte udvinding
Gennemsnitligt antal samlede hemocytes
hemolymph
kapillar udvinding
(denne metode)
192.44 (SD: 86.05) 4.56 x 105 celler (SD: 5,83 x 105)
(Række: 70-390, N = 25 forsøg) (Række: 1,20 x 105 - 2,95 x 106 celler)
individuelle
Larverne dissektion
26.67 (SD: 11,55) 8.33 x 103 celler (SD: 6,66 x 103)
(Række: 20-40, N = 10 forsøg) (Række: 4.00 x 103 - 1,60 x 104 celler)
larve
kapillar udvinding *
/ T * / T *
* hemocytes ikke var i stand til at være udvundet ved hjælp af denne metode på grund af tilstopning af kapillar nålen

Tabel 1: antal dissekeret larver og udvindes hemocytes ved hjælp af forskellige teknikker. Det gennemsnitlige antal dissekeret larver og udpakkede hemocytes blev sammenlignet mellem metoden præsenteres her og andre metoder. Vores metode resulterede i indsamling af et højere antal larver og hemocytes. Larve kapillær ekstraktion metode blev også forsøgt, men hemocytes har ikke kunnet blive udtrukket på grund af tilstopning af kapillar spidsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For bedre at forstå hvordan værtsceller bliver smittet, er det vigtigt at præcisere lokalisering af patogenet i cellerne, især når eksperimentere på tidligere uprøvet patogen og celle type kombinationer4. Mens studerer den cellulære reaktion kaskade efter infektion kan angive produktive patogen invasion, er kombinationen af imaging og cellulære svardata vigtigt at vise patogen invasion og infektion. Mens rapporter viser 2D billeder af patogenet invasion i værtsceller tendens til at angive produktive infektion, forbliven nogle spørgsmål med hensyn til timingen af indledende patogen invasion i værtsceller. Således kan 3D modeller rekonstrueret fra z-afsnittet scanning af 2D-billeder behandle disse spørgsmål og angive patogen placering i værtsceller (tal 4 og 5). En begrænsning af brug af primære hemocytes er dog deres levetid i cellekultur. En tidligere rapport, at hemocyte overlevelse i celle kultur medier er kun 8 h18, og i vores infektion protokol, vi var i stand til at udføre assays op til 24 timer, men ikke længere. Det var derfor ikke muligt at observere høje niveauer af C. burnetii replikering eller dannelsen af den parasitophorous vakuole, som ikke begynder at danne indtil 2 dage efter infektionen og er ikke observably store indtil 4-6 dage efter infektionen30 .

For mange eksperimenter hvor endpoint assays udnytte protein eller RNA til analyse, er stort antal celler normalt kræves for at producere tilstrækkeligt materiale til forhør. For eksempel, her bruger vi slutpunkt analyser som Western blotting og qRT-PCR til sonde omfanget af patogen infektion i primære hemocytes stammer fra 3rd instar Drosophila larver. Således, metoden, der præsenteres her fokuserer på hurtig larve dissektion og samlingen af hemolymph indeholder tilstrækkelige live hemocytes for ex vivo patogen infektion. Denne metode introducerer brugen af en nanoinjector til at tage op i hemolymph og hemocytes hurtigt. Placere hemocytes i DHIM der indeholder 25% er FBS vigtigt for hemocyte overlevelse. Derudover for ex vivo infektioner præsenteres her, er et stort antal hemocytes nødvendige. For at undgå melanization31,32,33, skal dissektion og hemocyte samling ske hurtigt. Mens andre metoder for hemocyte udvinding findes18,19,23, var varigheden af disse metoder til at indsamle et tilstrækkeligt stort antal hemocytes for ex vivo infektion for lang tid. 100 µm fin spids er gavnligt for optagelsen af hemolymph uden at optage andre organer, der kan føre til tilstopning af kapillar nålen. Brug af en nanoinjector kan også automatiseres, når det er knyttet til en micromanipulator fase og fodpedal, så brugeren kan fokusere på hurtig dissektion af Drosophila larver og reducere den tid, hemocytes er uden omgivende larve vævs- eller dyrkningsmedier. Ikke desto mindre er brug af en pipette også tilgængelig til at tage op hemolymph for overførsel til DHIM. Hertil kommer, udnytter vores metode CO2 gas for at bedøver larver før dissektion; Brug af en kold blok med paraffin film dækker er en anden levedygtige metode23. Endelig dissektion af larver i en dråbe af DHIM under frigivelse af hemolymph kan reducere antallet af hemocytes, der er tabt klistrer til paraffin film men vil øge optagelsen tid for kapillær nålen.

En fælles immunrespons i Drosophila til skade, som opstår under åbningen og dissektion af larve neglebånd, er melanization31,32,33. Under udvinding af hemocytes, ville vi observere melanization af hemocytes i DHIM så tidligt som 10 min efter ekstraktion. Som melanization er en hurtig proces, vil disse celler blive udelukket fra patogen infektion eksperimenter. Derudover kan den antikoagulerende phenylthiourea føjes til DHIM at hæmme phenoloxidase-aktivering system og melanization under såret9. Ikke desto mindre, som melanization og apoptose medfødte immunrespons i Drosophila, deres niveauer kan være kvantificeret følgende hemocyte udvinding og stimulation ved hjælp af de metoder, der beskrives her.

Mens inddrive store mængder protein eller RNA materiale er et krav for teknikker som vestlige skamplet og qRT-PCR, kræver nye teknikker, som RNAseq meget mindre tilført materiale, så lidt som 10 pg af høj kvalitet total RNA fra en enkelt celle34. Eksperimenter som disse hæve interessant eksperimentelle spørgsmål, og da Drosophila hemocytes er en heterogen population indeholdende krystal celler, plasmatocytes og lamellocytes7, man kunne begynde at afhøre den transkriptionel svar af hver celle type35. For eksempel Kurucz et al., har udviklet antistoffer, der kunne bruges til at isolere Drosophila hemocyte delmængder, der kunne bruges til transcriptional eller proteom profilering følge forskellige stimuli. Desuden, kunne den seneste udvikling af enkelt celle RNAseq teknologi definere transcriptomes for hver celletype uden brug af antistoffer i første omgang adskille hver celle type36,37,38, 39. Desuden, man kunne spørge spørgsmål vedrørende RIBOREGULATION i hemocyte delmængder, der kan hjælpe os med at forstå hvordan menneskers blod celle lineages stammer og udviklet sig fra gamle organismer gennem Komparativ genomforskning indsats. At tackle problemer kræver en kombination af en lang række eksperimentelle teknikker, og den teknik beskrevet her kan være nyttigt for sådanne bestræbelser, når isolering af et stort antal hemocytes fra hvirvelløse larver er påkrævet.

Her foreslår vi, at kombinationen af 3D modeller med numerisk, biokemiske data for bekræftelse af smitte. I fremtidige undersøgelser, kan vi bruge metoderne beskrevet her til at observere immunrespons og mekanisme af patogenet invasion i værtsceller ved farvning co vært proteiner til mikroskopi analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgements

Vi er taknemmelige for Dr. Robert Heinzen for at give bestandene af mCherry-udtrykker Coxiella burnetii. Vi takker Dr. Luis Teixeira for hvirvelløse iriserende virus 6 og Bloomington Stock Center for at levere flyve bestande. Dette projekt var delvis finansieret af NIH grant R00 AI106963 (til A.G.G.) og Washington State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Schneider's Drosophila Medium  Thermo Fisher Scientific (Gibco) 21720024 1.1.1), 2.1.2)
Fetal Bovine Serum GE Healthcare Life Sciences  (HyClone) SH30070.03HI 1.1.1), 2.1.2)
Filter (0.22 µL) RESTEK 26158 1.1.1)
Strainer (100 µm) Greiner bio-one 542000 1.2.1), 2)
Stereo microscope Amscope SM-1BSZ-L6W 1.2), 2)
Glass capillary Fisher Scientific 21-171-4 1.1), 1.2), 2)
Capillary puller Narishige International USA, Inc. PC-10 1.1.3)
Mineral oil Snow River Products 1.1.4)
Nanoinjector Drummond Scientific Company 3-000-204 1.1), 1.2), 2.2)
Forceps VWR 82027-402 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)
CO2 delivery apparatus Genesee Scientific 59-122BC 1.2), 2)
Trypan Blue Thermo Fisher Scientific (Gibco) 15250061 1.3)
Hemocytometer Hausser Scientific 3100 1.3)
24 well plate Greiner bio-one 662160 1.4), 2.2)
Coxiella burnetii - mCherry Dr. Heinzen, R. 1.4), 2.2)
Drosophila fruit juice plates Cold Spring Harbor Protocols 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full
Agar Fisher Bioreagents BP1423-500 2.1.1.1)
Methyl paraben Amresco 0572-500G 2.1.1.2)
Absolute ethanol Fisher Bioreagents BP2818-500 2.1.1.2)
Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL Amazon B0025UJVGM 2.1.1.3)
Petri dishes, 10 x 35 mm Fisher Scientific 08-757-100A 2.1.1.4)
Microscope cover glass Fisher Scientific 12-545-80 1.4.4), 2.2.2)
Yeast, Bakers Dried Active MP Biomedicals 0210140001 2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v)
Tungsten needle Fine Science Tools 10130-20 2.1)
Holding forceps VWR HS8313 2.1)
Paraformaldehyde Fisher Scientific FLO4042-500 3.1.3)
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 3.1.3)
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP9706-100 3.1.3)
4',6-diamidino-2-phenylindole Thermo Fisher Scientific 62247 3.1.4)
Antifade mounting medium Thermo Fisher Scientific P36930 3.1.6)
Confocal microsope Leica TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope 3.2)
3D imaging reconstruction software Leica LASX with 3D visualization module 3.3)
Microscope slides Fisher Scientific 12-552-3 3.1.6)
Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6) Dr. Teixeria, L. 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)
Listeria monocytogenes ATCC strain: 10403S 4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 µg/ml streptomycin at 30 °C.
DNase I Thermo Fisher Scientific(Invitrogen) 18068015 gDNA degradation
cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
IIV6_193R_F IDT qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'
IIV6_193R_R IDT qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'
RpII_qRTPCR_fwd SIGMA-ALDRICH qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG
RpII_qRTPCR_rev SIGMA-ALDRICH qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG
SYBR Green qRT-PCR reagent Thermo Fisher Scientific K0251, K0252, K0253 qRT-PCR
Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific 4351107, 7500 Software v2.0 qRT-PCR
Anti-Listeria monocytogenes antibody abcam ab35132 Western blot
Anti-Actin antibody produced in rabbit SIGMA-ALDRICH A2066 Western blot
Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate Promega W4011 Western blot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426, (6962), 33-38 (2003).
  2. Regan, J. C., et al. Steroid hormone signaling is essential to regulate innate immune cells and fight bacterial infection in Drosophila. PLoS Pathog. 9, (10), 1003720 (2013).
  3. Yano, T., et al. Autophagic control of listeria through intracellular innate immune recognition in Drosophila. Nat Immunol. 9, (8), 908-916 (2008).
  4. Bastos, R. G., Howard, Z. P., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Host and Bacterial Factors Control Susceptibility of Drosophila melanogaster to Coxiella burnetii Infection. Infect Immun. 85, (7), (2017).
  5. Kacsoh, B. Z., Schlenke, T. A. High hemocyte load is associated with increased resistance against parasitoids in Drosophila suzukii, a relative of D. melanogaster. PLoS One. 7, (4), 34721 (2012).
  6. Tsuzuki, S., et al. Switching between humoral and cellular immune responses in Drosophila. is guided by the cytokine GBP. Nat Commun. 5, 4628 (2014).
  7. Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila. hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, Suppl 95-111 (2007).
  8. Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68, (1), 116-128 (2014).
  9. Arefin, B., et al. Apoptosis in Hemocytes Induces a Shift in Effector Mechanisms in the Drosophila. Immune System and Leads to a Pro-Inflammatory State. PLoS One. 10, (8), 0136593 (2015).
  10. Rus, F., et al. Expression pattern of Filamin-240 in Drosophila blood cells. Gene Expr Patterns. 6, (8), 928-934 (2006).
  11. Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. P Natl Acad Sci USA. 100, (5), 2622-2627 (2003).
  12. Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. P Natl Acad Sci USA. 106, (12), 4805-4809 (2009).
  13. Bretscher, A. J., et al. The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster. Biol Open. 4, (3), 355-363 (2015).
  14. Zettervall, C. J., et al. A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation. P Natl Acad Sci USA. 101, (39), 14192-14197 (2004).
  15. Flynt, A., Liu, N., Martin, R., Lai, E. C. Dicing of viral replication intermediates during silencing of latent Drosophila viruses. P Natl Acad Sci USA. 106, (13), 5270-5275 (2009).
  16. Jovel, J., Schneemann, A. Molecular characterization of Drosophila cells persistently infected with Flock House virus. Virology. 419, (1), 43-53 (2011).
  17. Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. A simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. J Vis Exp. (69), e4173 (2012).
  18. Sampson, C. J., Williams, M. J. Protocol for ex vivo incubation of Drosophila primary post-embryonic haemocytes for real-time analyses. Methods Mol Biol. 827, 359-367 (2012).
  19. Nehme, N. T., et al. A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 3, (11), 173 (2007).
  20. Drosophila fruit juice egg plates. Cold Spring Harbor Protocols. (9), pdb.rec11113 (2007).
  21. Ahlers, L. R., Bastos, R. G., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Invertebrate Iridescent Virus 6, a DNA Virus, Stimulates a Mammalian Innate Immune Response through RIG-I-Like Receptors. PLoS One. 11, (11), 0166088 (2016).
  22. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  23. Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
  24. Figliozzi, R. W., Chen, F., Chi, A., Hsia, S. C. Using the inverse Poisson distribution to calculate multiplicity of infection and viral replication by a high-throughput fluorescent imaging system. Virol Sin. 31, (2), 180-183 (2016).
  25. Rizki, T. M., Rizki, R. M. Lamellocyte differentiation in Drosophila. larvae parasitized by Leptopilina. Dev Comp Immunol. 16, (2-3), 103-110 (1992).
  26. Markus, R., Kurucz, E., Rus, F., Ando, I. Sterile wounding is a minimal and sufficient trigger for a cellular immune response in Drosophila melanogaster. Immunol Lett. 101, (1), 108-111 (2005).
  27. McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infect Immun. 84, (4), 1083-1091 (2016).
  28. Ozgen, A., et al. Construction and characterization of a recombinant invertebrate iridovirus. Virus Res. 189, 286-292 (2014).
  29. Jakob, N. J., Muller, K., Bahr, U., Darai, G. Analysis of the first complete DNA sequence of an invertebrate iridovirus: coding strategy of the genome of Chilo iridescent virus. Virology. 286, (1), 182-196 (2001).
  30. Ghigo, E., Colombo, M. I., Heinzen, R. A. The Coxiella burnetii parasitophorous vacuole. Adv Exp Med Biol. 984, 141-169 (2012).
  31. Liu, F., et al. Drosophila melanogaster prophenoloxidases respond inconsistently to Cu2+ and have different activity in vitro. Dev Comp Immunol. 36, (3), 619-628 (2012).
  32. De Gregorio, E., et al. An immune-responsive Serpin regulates the melanization cascade in Drosophila. Dev Cell. 3, (4), 581-592 (2002).
  33. Kari, B., et al. The raspberry Gene Is Involved in the Regulation of the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11, (3), 0150910 (2016).
  34. Wu, A. R., et al. Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods. Nat Methods. 11, (1), 41-46 (2014).
  35. Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single-cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nat Biotechnol. 33, (2), 155-160 (2015).
  36. Nevil, M., Bondra, E. R., Schulz, K. N., Kaplan, T., Harrison, M. M. Stable Binding of the Conserved Transcription Factor Grainy Head to its Target Genes Throughout Drosophila melanogaster Development. Genetics. 205, (2), 605-620 (2017).
  37. Yang, C. P., et al. Transcriptomes of lineage-specific Drosophila neuroblasts profiled by genetic targeting and robotic sorting. Development. 143, (3), 411-421 (2016).
  38. Jaitin, D. A., et al. Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq. Cell. 167, (7), 1883-1896 (2016).
  39. Karaiskos, N., et al. The Drosophila embryo at single-cell transcriptome resolution. Science. 358, (6360), 194-199 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics