Hurtig In Vivo evaluering af Adjuverendes cytotoksiske T-lymfocytter Generation kapaciteter for Vaccine udvikling

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi præsenterer her en ansøgning om en standard immunologiske teknik (CFSE farves OT-jeg spredning) skal hurtigt overvåge adjuvans-medieret cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) generation in vivo. Denne hurtig estimering af CTL kapacitet er nyttige for udviklingen af forebyggende vacciner mod intracellulære patogener samt terapeutiske kræft vacciner.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lirussi, D., Ebensen, T., Schulze, K., Reinhard, E., Trittel, S., Riese, P., Prochnow, B., Guzmán, C. A. Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development. J. Vis. Exp. (136), e57401, doi:10.3791/57401 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Vurdering af moderne underenhed vacciner afslører, at generation af neutraliserende antistoffer er vigtige, men ikke tilstrækkelig til adjuverende udvalg. Derfor er adjuvanser med både humorale og cellulære immuno-stimulerende egenskaber, der er i stand til at fremme cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) svar tvingende nødvendigt. Således er trofaste overvågning af adjuverende kandidater, der inducerer cross-priming og efterfølgende forbedre CTL generation et afgørende skridt i vaccine udvikling. Her præsenterer vi en ansøgning om en metode, der bruger SIINFEKL-specifikke (OT-jeg) T-celler til at overvåge cross-præsentation af model antigen ægalbumin (æg) i vivo i overværelse af forskellige adjuvans kandidater. Denne metode repræsenterer en hurtig test at vælge adjuvanser med de bedste cross-priming kapaciteter. Spredning af CD8+ T celler er den mest værdifulde indikation af cross-priming og det betragtes også som et korrelat af adjuverende-induceret cross-præsentation. Denne funktion kan evalueres i forskellige immun organer som milt og lymfeknuder. Omfanget af CTL generation kan også blive overvåget, hvorved indsigter om en lokal karakter (dræning lymfeknude hovedsageligt) eller en systemisk reaktion (Fjern lymfeknuder og milt). Denne teknik yderligere giver mulighed for flere ændringer for at teste medicin, der kan hæmme specifikke cross-præsentation veje og tilbyder også mulighed for at blive brugt i forskellige stammer af konventionelle og gensplejsede mus. Sammenfattende er vil det program, vi præsenterer her være nyttig for vaccine laboratorier i industrielle eller akademiske kredse, udvikle eller ændre kemiske tilsætningsstoffer i vaccine forskning og udvikling.

Introduction

Cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) inducerende vacciner er vigtige terapeutiske interventioner, der er blevet udviklet til at bekæmpe visse former for kræft1. CTL er også vigtige for forebyggende vacciner mod intracellulære patogener2. Derudover liste over Tillidscertifikater er en af de få immun forsvar mekanismer funktionelt aktive i risikogrupper som nyfødte3,4 , som også afhænger af CTL at bekæmpe tidlige liv infektioner5. I denne henseende resulterede vacciner mod respiratorisk Syncytial Virus (RSV) der er blevet udviklet med en adjuvans, der ikke fremkalde CTL svar (alun) i en total fiasko af vaccinen fører til alvorlige komplikationer ved infektioner hos spædbørn6. Disse negative virkninger af vaccination kan vendes ved en CD8+ T-celle respons7. Vi har tidligere bevist, at de vigtigste cytokiner (type I-Interferoner) fremkaldes ved nogle stimulator af interferon gener (STING) agonister er afgørende for CTL svar genereret af disse adjuvanser8, dels ved at måle spredningen af OT-jeg T celler efter vaccination og ved hjælp af disse resultater, som en foranstaltning af CTL inducerende kapaciteter observeret i udvidet vaccination tidsplaner9. Måling af spredning af OT-jeg CD8+ T-celler i en vildtype (WT) C57BL/6 recipient mus af carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) farvestof fortynding er en robust vurdering af adjuverende en vaccine evne til at generere Cross-grunding af SIINFEKL, (den immuno-dominerende peptid af ægalbumin, æg). Variationer af denne teknik er meget udbredt til vurdering af spredning af OT-jeg CD8+ og OT-II CD4+ T celler. For eksempel, har det været brugt i mangel af valgte cytokiner (KO mus) eller til at måle vaccine effekten efter antigen tilbagekaldelse i WT dyr. Vi udtænkt en kort protokol (4 dage eksperiment) hvor efter passiv overførsel af CFSE-farvede OT-jeg CD8+ T-celler, en subkutant (s.c.) immunisering bestående af en dosis på 50 µg af endotoxin-gratis æg suppleret med test adjuvanter administreres (Figur 1). Opfølgning af resultater 48 h efter vaccination giver et pålideligt bevis for adjuvans evne til at generere CTL svar. Af denne strategi er det muligt at vurdere styrken af de lokale immunrespons i afdrypning lymfeknude efter immunisering samt omfanget af svaret ved at måle CTL aktiviteten i milten (eller fjern lymfeknuder).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle mus anvendes i denne undersøgelse var fra C57BL/6 baggrund. Alle dyrene blev holdt på patogenfrie betingelser. Alle eksperimenter blev udført ifølge den normative i den tyske dyreværnslovgivning (TierSchG BGBl. I S 1105; 25.05.1998) og blev godkendt af den lavere Sachsen på etik dyr eksperimenter og det statslige kontor (lavere Sachsen statslige kontor for forbrugerbeskyttelse og fødevaresikkerhed), under tilladelse nummer 33.4-42502-04-13/1281 og 162280.

1. CFSE farvning af OT-jeg T celler og adoptiv overførsel

Bemærk: OT-jeg mus er transgenically genereret dyr, der udtrykker en T-celle receptoren (TCR) med faste α og β-kæder, der sammen kan genkende immuno-dominerende peptid af æg, SIINFEKL10,11. Som et resultat, disse mus har et betydeligt stort antal SIINFEKL-specifikke CD8+ T-celler (97%)12 sammenlignet med normale eller æg-vaccinerede mus (≤ 1%)13.

  1. Isolering af sporbar CD8+ T celler fra OT-jeg mus udtrykker T-lymfocytter-specifikke Thy1en (Thy1.1)-allel:
    1. Aflive 6-9 uger gamle OT-jeg mus af CO2 inhalation efterfulgt af cervikal dislokation14. Dissekere milt og store lymfeknuder (lyskebrok, aksillær og cervikal par kun) ved at skære huden med kirurgisk saks, afmonterer hud fra kroppen ved hjælp af kirurgiske tænger og pincet og placere dem i petriskåle (60 x 15 mm) hver indeholder en 100 µm pore mesh cup væv slibning og celle frigivelse.
    2. Vedligeholde petriskåle, (hver med én maske cup) i 3-5 mL af komplet RPMI medium (RPMI 1640, 10% v/v FCS, 100 U/mL penicillin, 50 µg/mL streptomycin) holdes på is.
    3. Mash organer ved hjælp af en sprøjte stemplet eller en lignende sterile instrument (forudgående skæring er ikke nødvendigt) og indsamle den resulterende enkelt cellesuspension i 15 mL centrifugeglas.
    4. Centrifugeres cellesuspension ved 300 x g i 10 min. ved 4 ° C. Supernatanten. Vaske cellerne i 10 mL koldt PBS ved centrifugering og lyse erytrocytter fra milten af re suspension pellet i 1 mL/milt af ammoniumklorid buffer (ACK buffer, kommercielt tilgængelige). Inkuber celler for 1,5 min på is og efterfølgende vaske cellerne med 10 mL koldt PBS ved centrifugering (som gjort før).
    5. Genopslæmmes pellet i det samme rør i 1 mL PBS (pH 7,2) indeholdende 5% føtal bovint serum for magnetisk isolation.
  2. For at udføre magnetiske isolation, videre til den negative udvalg af CD8+ T celler ved hjælp af en magnetisk isolering kit ifølge producentens anvisninger eller offentliggjort protokollerne15.
  3. For at udføre CFSE farvning, først tælle antallet af CD8+ T celler fremstillet af OT-jeg mus ved hjælp af en automatiseret celle counter (partikel counter). Pletten 1-5 x 107 celler/mL i et volumen på 1-5 mL med 5 µM CFSE i PBS i 7 min. ved 37 ° C, beskyttet mod lys i en 15 ml falcon tube.
  4. Dæmpning af CFSE farvning af tilføjer den samme mængde (1:1) føtal bovint serum til cellerne, og dem der inkuberes i yderligere 7 minutter ved 37 ° C beskyttet mod lys. Cellerne vaskes med 10 mL PBS to gange.
  5. Tælle celler ved hjælp af en automatiseret celle counter. Angive cellen til 3-5 x 107 celler/mL PBS for at injicere 3-5 x 106 celler/mus i 100 µL intravenøst (i.v.) via hale vene.
  6. For at udføre hale vene injektioner, immobilisere mus i passende restrainers. Varm ryggen og halen af mus skal injiceres ved hjælp af et rødt-lys lampe, placeret mellem 20-25 cm fra mus til 1-3 min. at tillade hale vene vasodilation.
    Bemærk: Dette medvirker til at lette vene registrering og administration af cellesuspension.
  7. Sikre (med hånd placeret i mellem musene og lampen) at det ikke er for varmt for mus og når halen vener er klart synlig, gå videre til injektion. Indsprøjtes cellerne i den laterale eller dorsale hale vene ved hjælp af en 1mL sprøjte med en 25-gauge kanyle16.

2. vaccination (Endo-gratis æg +/-adjuvans)

  1. Placere mus transplanteret med OT-jeg celler (trin 1.7, figur 1) på en anæstesi-afdeling og administrere isofluran i ilt ved en anæstesi maskine14.
  2. Når musen er helt i søvn under bedøvelse, tage det fra salen og barbere pels med musen på området over gluteus superficialis (lateral lænden) ved hjælp af en elektrisk hår trimning maskine, for at udføre en ren injektion med en god udsigt over modulet.
  3. Injicér 50 µL af vaccinen, s.c. i området glatbarberet ved hjælp af en 25-gauge kanyle.

3. isolering af lymfocytter og farvning for Flow flowcytometri analyse

  1. Isolering af lymfocytter og splenocytes
    1. Aflive de vaccinerede mus af CO2 inhalation efterfulgt af cervikal dislokation.
    2. Uddrag den dræning og fjerne lymfeknuder og milt og placere dem i særskilte petriskåle, der indeholder 100 µm pore mesh kopper væv slibning og celle frigivelse. Følg trin 1.1.2 gennem 1.1.3.
    3. Dekanteres efter centrifugering og genopslæmmes celle pellets i den samme mængde af rest PBS (ca. 100 µL).
  2. Farvning for flow flowcytometri analyse
    1. I en 15 mL centrifugeglas forberede en master mix indeholdende farvning antistoffer i de koncentrationer, der er afbildet i tabel 1, hvilket giver en 2 x koncentreret farvning mix. Forberede nok volumen af master mix har 100 µL pr. prøve. Bland cellerne og master mix 1:1 og inkuberes det ved 4° C i 30 min.
      Bemærk: Den endelige farvning volumen pr. prøve skal være 200 µL (100 µL af celle pellet + 100 µL antistof master mix).
    2. Cellerne vaskes to gange ved centrifugering som beskrevet i 1.1.3, tilføje 10 mL PBS, to gange.
    3. Genopslæmmes i farvede celler i 0,5-1 mL PBS for erhvervelse og overdragelse suspension til flow forskellige rør. Altid holde prøver på is og beskyttet mod lys.

4. flowcytometri

  1. Altid pre filter celle prøver ved hjælp af 70-100 µm filtre.
  2. Forberede enkelt farvning kompensation kontrolelementer til fluorophores beskrevet i tabel 1 (perler eller celler).
    Bemærk: Kompensation bør udføres i forskellige eller analyse software17,18,19 og anvendes til alle prøver.
  3. Følg gating strategien afbildet i figur 2. Kort, gate populationer i forward scatter højde vs forward scatter område (figur 2A), og igen side scatter bred vs side scatter område (SSA, figur 2B) for at udelukke dubletter.
  4. Gate befolkning fra figur 2B af plotte BV 650 (auto-fluorescens) vs FITC (CFSE) for at skelne sande CFSE farvede celler fra høje auto-fluorescerende celler. Omfatte perler eller celler farves med antistof konjugeret til BV 650 i kompensation kontrolelementer. Dette plot (figur 2 c) af BV 650 vs. FITC bruges til gate OT-jeg CFSE farvede celler.
  5. Gate befolkning fra figur 2 C for Pe-Cy7 (Thy1.1 - CD90.1-) vs APC (CD8) for at skelne mellem celler, der stammer fra donor vs recipient mus.
    Bemærk: Celler stammer fra OT-jeg donor mus er Thy1.1+ (CD90.1), hvorimod WT (C57BL/6, modtager) mus-afledte celler er Thy1.2+ (CD90.2) (figur 2D). Nogle laboratorier har OT-jeg mus i en Thy1.2 baggrund og WT (C57BL/6) i en Thy1.1. I dette tilfælde skal du bruge et antistof mod Thy1.2 til OT-jeg celle gating.
  6. Re gate CD8+ celler fra Thy1.1+ population af plotte det på en gate bestående af BV 450 (CD4) vs APC (CD8) (figur 2E).
  7. Vise befolkningen låge i figur 2E ved hjælp af et histogram display af CD8+ celler viser CFSE (FITC, 530/15 kanal - blå laser-), gate den proliferated befolkning ved at inkludere intensiteter fra 102 indtil niveauet, hvor udelt kontrol populationer er (intensiteter ~ 105, afhængigt af effekten af CFSE farvning og voltage-indstillingen på flow-Flowcytometret) (figur 2F).
  8. Foretage en yderligere gate (ikke vist i figur 2) plotting FITC vs L/D markør (450/20 kanal, UV laser) for at vurdere døde celler sideløbende at spredning evaluering.
  9. Erhverve mindst 5000 begivenheder for kontrollen, kompensation og 10.000 begivenheder (gate E, figur 2) fra prøver på en flow Flowcytometret. Køre forskellige lav eller medium flow (ikke overstiger flowhastigheder på 20.000 begivenheder/s).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at teste de behandlinger ved hjælp af en anden kombination af adjuvans (ADJ1 og ADJ2), har vi vurderet CTL generation kapacitet ved at måle spredningen af adoptively overførte OT-jeg CD8+ T celler ved flowcytometri (figur 2). For det farves vi tidligere isolerede celler fra afdrypning lymfeknuder og milt (tabel 1). Ved at måle spredningen af CD8+ T-celler i lymfeknuder og milt, vi var i stand til at underbygge en højere CTL generation kapacitet på ADJ2 i afdrypning lymfeknuder (figur 3) i forhold til ADJ1, æg alene eller PBS kontrol. I modsætning hertil, vi har konstateret at ADJ2 ikke var i stand til at generere en liste over Tillidscertifikater svar i en systemisk rum (milten), mens ADJ1 var viser høje niveauer af spredning af milt CD8+ T celler, ikke kun i forhold til kontrol (PBS og æg) men også superior til ADJ1. Af dissekere handlingen af ADJ2 ved hjælp af denne hurtige i vivo spredning assay, kan vi bekræfte sin stærke handling som en lokal, men ikke en systemisk CTL generator. Desuden ADJ1 fungerer både på det lokale websted af injektion (afdrypning lymfeknuder) såvel som systemisk med en øget OT-jeg spredning i milten. De opnåede resultater tillade os at karakterisere den adjuverende aktivitet og dens omfang, eksemplificeret af de observerede virkninger af ADJ2 (lokale) og ADJ1 (systemisk).

Figure 1
Figur 1: assay tidslinjen. Assay tidslinjen repræsenterer den oprindelige OT-jeg T-celle overførsel på dag 0, s.c. vaccination på dag 1, og sampling-milt og dræning lymfeknuder 2 dage senere. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Flow diagram over den gating strategi efterfulgt for at måle spredningen af CD8+ T celler (OT-jeg, Thy1.1+) ved flowcytometri. To prøver er repræsenteret i forskellige farver (rød og lyseblå) for en bedre visualisering. A-B. Enkelt celler udsættes fra dubletter successivt i de første to porte af plotte forward scatter højde vs forward scatter area og side-scatter-bredde vs side-scatter-området. C. celler låge i B vises af deres fluorescens intensiteter på BV 650 kanal (auto fluorescens) plottes i deres CFSE intensitet (hvor sletten angiver celler divisioner/spredning) i 530/30 YG kanal. Denne port tillader valg af true CFSE positive celler ved at diskriminere dem, der har høje auto fluorescens. D. CFSE positive celler var gated med deres høje fluorescens-intensiteten af Pe-Cy7 (Thy1.1, markør for OT-jeg celler) vs deres APC intensitet (CD8). E. BV 450 (CD4) plottes APC (CD8) for tidligere gated Thy1.1 positive celler for at nøjagtigt vælge CD8+ T celler. F. tidligere gated CD8+ celler er afbildet i et histogram mod CFSE intensitet til endelig gate befolkningens proliferated. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: adjuverende drevet CTL generation. Evnen til at fremkalde lokal eller systemisk CTL svar er afbildet på 2 forskellige adjuvans behandlinger (ADJ1 og ADJ2) langs antigen og PBS kontrol. Spredning af adoptively overførte OT-jeg T celler er undersøgt i afdrypning lymfeknude (lyskebrok, eksemplificeret subkutant (s.c.) forvaltning) og i milten, som angivet i figur rækker. Celleproliferation måles i alle relevante behandlinger (kolonner) for at præcist for at sammenligne omfanget af immunresponset i sin lokale (afdrypning lymfeknude) eller systemisk (milten) række handling. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Farvestoffer - antistoffer Klon Kanal-Fluorophore-filter Koncentration 2 X
Thy1.1 (CD90.1) HIS51 PE-Cy7-780/60 YG 1: 750
CD8 53-6,7 APC - 670/14 RASMUSSEN 1:280
CD4 RM4-5 BV 421-450/50 V 1: 100
CFSE - FITC - 530/30 YG (i henhold til CFSE-farvning protokol)
DCM (død celle markør) - -/ U.V. - 450/50 UV 1: 500

Tabel 1: antistof stainings til flowcytometri. Fluorophore-konjugeret antistof kloner bruges og anbefales farvning koncentrationer (2 x).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Moderne vacciner er ideelt composedof renset antigen og adjuvanter, med den mulige tilsætning af en levering system som Liposomer, viruslignende partikler, nanopartikler eller live vektorer. Et centralt aspekt når du udformer en vaccine er at vælge den rigtige adjuverende kliniske behov. En del af anvendelsesområdet kunne inddrage favorisere en humorale vs cellulære immunrespons (eller begge), valg af en lokal vs en systemisk immunrespons (eller begge), og form for hukommelse, som vaccinen skal oprette i målpopulationen. Et afgørende aspekt af adjuverende evaluering er at hurtigt afgøre sin kapacitet til at generere CTL. Vi præsenteres her en metode baseret på allerede kendte teknikker til hurtigt afgøre funktioner i CTL svar vivo i en musemodel af måling OT-jeg CD8 T celle spredning. Denne metode giver mulighed for forudsigelse af styrken af immunresponset fremkaldes ved adjuvanser (spredning af OT-jeg T celler) i kun 4 arbejdsdage. Denne metode yderligere letter sammenligningen af aktionerne af tilsætningsstoffer i form af immunrespons (lokal vs. systemisk) og sin effektive indsats. Her har vi viste et eksempel på hvordan immunisering med forskellige adjuvans behandlinger (ADJ1 vs ADJ2) vil påvirke immunresponset. Handlingen af ADJ2 var begrænset til det lokale område af administration hvor det aktiverer immunrespons i afdrypning lymfeknuder, mens handlingen af ADJ1 med den samme dosis blev mere udbredt, genererer en liste over Tillidscertifikater svar både på den lokale og systemiske niveau, men med mindre styrke end ADJ2 i afdrypning lymfeknuder.

Kritiske trin til succesfuld evaluering af en adjuverende CTL kapacitet er valget af unge OT-jeg dyr (som en kilde til CD8 T-celler) og brugen af endotoxin-gratis æg til vaccination. Siden OT-jeg mus er transgene dyr genereret for at producere CD8 T-celler, der genkender æg peptid SIINFEKL i en MHC-jeg kontekst, dets kunstig selektion af musen TCR øger optrædener af hyper proliferativ CD8+ T celler20 med alderen. En betændelse i de aksil lymfeknuder er således en mere fælles funktion af alderen OT-jeg mus. Under hensyntagen hertil anbefales det at bruge unge OT-jeg dyr når det er muligt (6-9-uge-forhenværende dyr) og at undgå at isolere celler fra en udvidet organer (enten milten af lymfeknuder). Brugen af udvidet organer med CD8 T celler vil påvirke hele analysen, da sandsynligvis forskelle i spredning mellem kontrol og behandlinger ikke vil opnås. En lignende faldgrube for forskelsbehandling af adjuverende CTL produktionskapacitet kan genereres ved hjælp af æg protein med spor af endotoxin, som kan fremkalde en mere potent immunrespons i forhold til endotoxin-gratis æg21,22 (jf. Materialer og reagenser), da endotoksiner er stærk immuno-modulatorer i sig selv 23. ÆG protein bruges til vaccination skal derfor endotoxin-fri. Brugen af 20 eller 50 µg af endotoxin-gratis æg afhænger af ruten immunisering bliver 50 µg en passende dosis til subkutane test af adjuvans. Desuden brug af høje koncentrationer af CFSE er blevet rapporteret i litteraturen til at dræbe de farvede celler24 og kunne også resultere i svigt af analysen.

Nogle ændringer eller forbedringer til forskellige teknikker, der anvendes i protokollen blev gennemført for at reducere stress for dyrene, at øge reproducerbarhed af eksperimenterne. For eksempel, relateret at minimere opvarmning af dyr ved bare opvarmning ryggen og halen af mus og ikke hele dyret, eller at undgå subkutan injektion stress ved at bedøve dyrene før vaccination. Anæstesi er ikke kræves af dyrevelfærd forordninger til en subkutan injektion, men vores erfaring, det forbedrer reproducerbarhed ved faldende variationer indført ved stressrespons.

En stor begrænsning af denne metode er, at da CFSE pletter membranen af celler, svækker dets høje lysstyrke normalt påvisning af signaler fra cytosol. Derfor, hvis bekræftelsen af CTL kapacitet er nødvendig, udskillelsen af IFN-γ bør vurderes af en specifik sekretion assay 25, og ikke af intracellulære cytokin farvning.

Anvendelsen af måling af spredning til at anslå CTL generation kapacitet af adjuvanser på bare 4 dage har fordel af kortere tid behov end traditionelle CTL-undersøgelser,26 , og det er en god potentielle eksperimentere i tilfælde hvor yderligere bekræftelse af andre metoder er nødvendige.

Selv om begrænset til æg som en antigen, og derfor til brug af OT-jeg T celler, metoden præsenteres her tillader studiet af egenskaberne for aktivering induceret af forskellige adjuvanser efter sortering af proliferated celler. En af de mulige applikationer er undersøgelse af de metaboliske signaturer induceret af forskellige tilsætningsstoffer i den proliferated OT-jeg T celler og sine relationer med udviklingen af hukommelse27. Yderligere sekundære screeninger kunne evaluere de biologiske egenskaber af de stimuleret celler, såsom udtryk af cytokiner eller degranulering markører ved flowcytometri eller deres cytotoksiske kapacitet ved at udføre in vivo CTL tests8, 26 , 28. Da denne ansøgning har begrænsning af dets anvendelse i mus, kan ekstrapoleringer til mennesker udføres ved at udnytte screeninger baseret på humaniseret mus29,30,31.

Denne metode er som vi har præsenteret her robuste nok til at blive brugt som en første screening for udvælgelse af cellulære reaktion aktivatorer og også fleksibel nok til at blive ændret eller kobles til yderligere analyse af de proliferated T-celler. I Resumé er denne hurtig in vivo evaluering af adjuverende CTL produktionskapacitet et ideelt værktøj for vaccine laboratorier i den akademiske verden og industrien, der er interesseret i en hurtig karakterisering af virkningsmekanisme af deres adjuverende kandidat molekyler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi står i gæld til vores tekniske assistenter: U. Bröder og H. Shkarlet, der har hjulpet os under eksperimentelle procedurer. Dette arbejde var delvis finansieret af EU-tilskud (UniVax, kontrakt nr. 601738 og TRANSVAC2, kontrakt nr. 730964), og en Helmholtz Association grant (HAI-IDR). De finansieringskilder ikke indflydelse på forskningen design, generation af manuskript eller beslutning om at sende det til offentliggørelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD LSR Fortessa Cell Analyzer BD Special Order Flow Cytometer
CFSE Molecular Probes C34554 Proliferation Dye
MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit Biolegend 480007 Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells.
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Molecular Probes L23105 Dead Cell Marker
CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7 eBioscience 25-0900-82 antibody
APC anti-mouse CD8a Antibody BioLegend 100712 antibody
BV421 Rat Anti-Mouse CD4 BD 740007 antibody
Z2 coulter Particle count and Size Analyzer Beckman Coulter 9914591DA Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter
EndoGrade Ovalbumin (10 mg) Hyglos(Germany) 321000 Ovalbumin endotoxin free tested.
Cell Strainer 100µm nylon Corning 352360 Cell strainer (100 µm pore mesh cups).
Sample Vials Beckman Coulter 899366014 Sample vials for Z2 automated counter
C57BL/6 mice (CD90.2) Harlan (Rossdorf, Germany) Company is now Envigo
OT-I (C57BL/6 background, CD90.1) Harlan (Rossdorf, Germany) Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo
FACS tubes Fischer (Corning) 14-959-5 Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes
Falcon 15 mL tubes Fischer (Corning) 05-527-90 Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes
PBS (500 mL) Fischer (Gibco) 20-012-027 Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2
Red lamp (heating lamp) Dirk Rossmann GmbH (Germany) 405096 Heating infrred lamp (100 wats)
IsoFlo (Isoflurane) Abbott Laboratories (USA) 5260.04-05. Isoflurane anesthesic (250 mL flask).
Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber Parkland Scientific V3000PK Isoflurane anesthesia machine.
RPMI 1640 medium Gibco (distributed by ThermoFischer) 11-875-093 Base medium with Glutamine (500 mL)
Pen-Strept antibiotic solution (Gibco) Gibco (distributed by ThermoFischer) 15-140-148 Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)
Fetal Bobine Serum (Gibco) Gibco (distributed by ThermoFischer) 10082147 Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin
ACK Lysing Buffer (100 ml) Gibco (distributed by ThermoFischer) A1049201 Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also
Plastic Petri Dishes Nunc (distributed by ThermoFischer) 150340 60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated
Cell Clump Filter CellTrics (Sysmex) 04-004-2317 CellTrics® 50 μm, sterile

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krishna, S., Anderson, K. S. T-Cell Epitope Discovery for Therapeutic Cancer Vaccines. Methods Mol Biol. 1403, 779-796 (2016).
  2. Pinchuk, I., et al. A CD8+ T cell heptaepitope minigene vaccine induces protective immunity against Chlamydia pneumoniae. Journal of immunology. 174, 5729-5739 (2005).
  3. Zhang, J., Silvestri, N., Whitton, J. L., Hassett, D. E. Neonates mount robust and protective adult-like CD8(+)-T-cell responses to DNA vaccines. Journal of virology. 76, 11911-11919 (2002).
  4. Marchant, A., et al. Mature CD8(+) T lymphocyte response to viral infection during fetal life. J Clin Invest. 111, 1747-1755 (2003).
  5. Simmons, C. P., et al. Mucosal delivery of a respiratory syncytial virus CTL peptide with enterotoxin-based adjuvants elicits protective, immunopathogenic, and immunoregulatory antiviral CD8+ T cell responses. Journal of immunology. 166, 1106-1113 (2001).
  6. Fulginiti, V. A., et al. Respiratory Virus Immunizationa Field Trial Of Two Inactivated Respiratory Virus Vaccines; An Aqueous Trivalent Paratnfluenza Virus Vaccine And An Alum-Precipitated Respiratory Syncytial Virus Vaccine1. American journal of epidemiology. 89, 435-448 (1969).
  7. Olson, M. R., Varga, S. M. CD8 T cells inhibit respiratory syncytial virus (RSV) vaccine-enhanced disease. Journal of immunology. 179, 5415-5424 (2007).
  8. Lirussi, D., et al. Type I IFN and not TNF, is Essential for Cyclic Di-nucleotide-elicited CTL by a Cytosolic Cross-presentation Pathway. EBioMedicine. 22, 100-111 (2017).
  9. Ebensen, T., et al. Bis-(3',5')-cyclic dimeric adenosine monophosphate: strong Th1/Th2/Th17 promoting mucosal adjuvant. Vaccine. 29, 5210-5220 (2011).
  10. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  11. Clarke, S. R., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and cell biology. 78, 110-117 (2000).
  12. Topham, D. J., Castrucci, M. R., Wingo, F. S., Belz, G. T., Doherty, P. C. The role of antigen in the localization of naive, acutely activated, and memory CD8(+) T cells to the lung during influenza pneumonia. Journal of immunology. 167, 6983-6990 (2001).
  13. Le Bon, A., et al. Cross-priming of CD8+ T cells stimulated by virus-induced type I interferon. Nature immunology. 4, 1009-1015 (2003).
  14. Otto, K. The Laboratory Mouse. Bullock, G. Academic Press. 555-569 (2004).
  15. Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. Isolation and Activation of Murine Lymphocytes. Journal of visualized experiments: JoVE. (2016).
  16. Shimizu, S. The Laboratory Mouse. Bullock, G. Academic Press. 527-542 (2004).
  17. Breton, G., Lee, J., Liu, K., Nussenzweig, M. C. Defining human dendritic cell progenitors by multiparametric flow cytometry. Nature protocols. 10, 1407-1422 (2015).
  18. Kaminski, D. A., Wei, C., Rosenberg, A. F., Lee, F. E. -H., Sanz, I. Multiparameter Flow Cytometry and Bioanalytics for B Cell Profiling in Systemic Lupus Erythematosus. Methods in molecular biology. 900, Clifton, N.J. 109-134 (2012).
  19. Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry. Cytometry. Part B, Clinical cytometry. 72, 8-13 (2007).
  20. Newrzela, S., et al. T-cell receptor diversity prevents T-cell lymphoma development. Leukemia. 26, 2499-2507 (2012).
  21. Iwasaki, N., et al. Allergen endotoxins induce T-cell-dependent and non-IgE-mediated nasal hypersensitivity in mice. J Allergy Clin Immunol. 139, 258-268 (2017).
  22. Tsuchiya, K., Siddiqui, S., Risse, P. A., Hirota, N., Martin, J. G. The presence of LPS in OVA inhalations affects airway inflammation and AHR but not remodeling in a rodent model of asthma. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. L54-L63 (2012).
  23. Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation. Nature. 9, 558-566 (2008).
  24. Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cellular immunology. 79-85 (2009).
  25. Oelke, M., et al. Functional characterization of CD8(+) antigen-specific cytotoxic T lymphocytes after enrichment based on cytokine secretion: comparison with the MHC-tetramer technology. Scand J Immunol. 52, 544-549 (2000).
  26. Wang, W., Golding, B. The cytotoxic T lymphocyte response against a protein antigen does not decrease the antibody response to that antigen although antigen-pulsed B cells can be targets. Immunology letters. 100, 195-201 (2005).
  27. O'Sullivan, D., et al. Memory CD8(+) T cells use cell-intrinsic lipolysis to support the metabolic programming necessary for development. Immunity. 41, 75-88 (2014).
  28. Xu, H. C., et al. Type I interferon protects antiviral CD8+ T cells from NK cell cytotoxicity. Immunity. 40, 949-960 (2014).
  29. Volk, A., et al. Comparison of three humanized mouse models for adoptive T cell transfer. The journal of gene medicine. 14, 540-548 (2012).
  30. Safinia, N., et al. Humanized Mice as Preclinical Models in Transplantation. Methods Mol Biol. 1371, 177-196 (2016).
  31. Grover, A., et al. Humanized NOG mice as a model for tuberculosis vaccine-induced immunity: a comparative analysis with the mouse and guinea pig models of tuberculosis. Immunology. 152, 150-162 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics