Identificazione di fattori di virulenza di Mycobacterium abscessus per replica intracellulare nei fagociti

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Immunology and Infection

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Summary

Qui, presentiamo due protocolli per studiare le interazioni fagocita -abscessus del micobatterio : lo screening di una libreria di mutante trasposone per carenza intracellulare batterica e la determinazione del trascrittoma batterica intracellulare da RNA sequenziamento. Entrambi gli approcci forniscono approfondimenti i vantaggi genomici e trascrittomica adattamenti migliorare fitness batteri intracellulari.

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Dubois, V., Laencina, L., Bories, A., Le Moigne, V., Pawlik, A., Herrmann, J. L., Girard-Misguich, F. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (139), e57766, doi:10.3791/57766 (2018).

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Abstract

Ciò che differenzia abscessus del micobatterio da altri micobatteri saprofiti è la capacità di resistere alla fagocitosi dai macrofagi umani e la capacità di moltiplicarsi all'interno di tali cellule. Questi tratti di virulenza rendono M. abscessus patogeni, soprattutto in host vulnerabili con sottostante malattia polmonare strutturali, come la fibrosi cistica, bronchiectasie o tubercolosi. Come pazienti essere infettati con M. abscessus rimane poco chiaro. A differenza di molti micobatteri, M. abscessus non viene trovato nell'ambiente ma potrebbe risiedere all'interno di amebe, fagociti ambientali che rappresentano un potenziale serbatoio per M. abscessus. Infatti, M. abscessus è resistente alla fagocitosi amoebal e la vita intra-ameba sembra aumentare M. abscessus virulenza in un modello sperimentale di infezione. Tuttavia, piccolo è conosciuto circa M. abscessus virulenza in sé. Per decifrare i geni che conferiscono un vantaggio alla vita intracellulare M. abscessus , uno screening di una libreria di mutante del trasposone M. abscessus è stato sviluppato. In parallelo, è stato sviluppato un metodo di estrazione di RNA da micobatteri intracellulari dopo co-coltura con amebe. Questo metodo è stato convalidato e permesso il sequenziamento dell'intero M. abscessus trascrittomi all'interno delle cellule; fornire, per la prima volta, una visione globale su M. abscessus adattamento alla vita intracellulare. Entrambi gli approcci ci danno uno spaccato di fattori di virulenza di M. abscessus che permettono M. abscessus a colonizzare le vie aeree negli esseri umani.

Introduction

Il genere Mycobacterium comprende specie che vanno da organismi saprofiti innocui ai principali agenti patogeni umani. Ben note specie patogene come tubercolosi del micobatterio, Mycobacterium marinum e Mycobacterium ulcerans appartengono al sottogruppo di crescita lenta micobatteri (SGM). In contrasto, il sottogruppo di rapida crescita micobatteri (RGM) è caratterizzato dalla loro capacità di formare colonie visibili in meno di 7 giorni su agar. Il gruppo RGM comprende più di 180 specie, principalmente micobatteri saprofiti non patogeni. Studi sulle interazioni di RGM con i loro ospiti si sono concentrati principalmente su Mycobacterium smegmatis e dimostrano che questi micobatteri sono rapidamente eliminati mediante l'azione battericida dei macrofagi.

Mycobacterium abscessus è uno della RGM rari che sono patogeni per l'uomo ed è responsabile di una vasta gamma di infezioni che vanno dalla pelle e infezioni dei tessuti molli per le infezioni polmonari e diffuse. M. abscessus è considerato, insieme di avium del micobatterio, per essere il principale agente patogeno micobatterica in fibrosi cistica pazienti1.

Vari studi su M. abscessus indicano che questo micobatterio si comporta come un agente patogeno intracellulare, capace di sopravvivere la risposta battericida dei macrofagi e fibroblasti nei polmoni e pelle, che non è osservata solitamente in RGM 2 , 3 , 4. analisi del genoma di M. abscessus ha identificato le vie metaboliche in genere presenti nei microrganismi ambientali a contatto con il terreno, piante e ambienti acquatici, dove amebe libera sono spesso presentano5. Essi hanno anche dimostrato che M. abscessus è dotata di diversi geni di virulenza non trovate la RGM saprofiti e non patogeni, probabilmente si è acquistata dal trasferimento orizzontale del gene in una nicchia favorevole di scambio genetico che potrebbe raccogliere vari batteri resistenti ameba.

Sperimentalmente, uno dei primi risultati sorprendenti è stato l'osservazione di crescita intracellulare del M. abscessus in macrofagi anche per quanto riguarda la tubercolosi di M.6. M. abscessus resiste anche l'acidificazione del fagosoma, apoptosi e autophagy, tre meccanismi essenziali della resistenza cellulare all' infezione2. Si ha anche dimostrato che M. abscessus è in grado di stabilire una comunicazione immediata tra phagosome e citosol, un ambiente più ricco di nutrienti che potrebbe favorire la moltiplicazione batterica2. Pochissimo è conosciuto circa i vantaggi di genomici che M. abscessus possiede o ha acquisito per permettere la sopravvivenza in un ambiente intracellulare. Coculture ameba è un metodo efficace che ha permesso l'isolamento di molti nuovi batteri resistenti ameba come Mycobacterium massiliense7,8. Una capacità di moltiplicarsi all'interno di amebe è stata osservata, in un modello di nebulizzazione di M. abscessus in topi, che possono conferire una maggiore virulenza di M. abscessus4. Un'ipotesi è che M. abscessus aveva sviluppato tratti genetici all'interno di questo ambiente per sopravvivere nelle cellule fagocitiche, che sono diverse da altri non-patogeni RGM rilevate. Queste acquisizioni potrebbero favorire la capacità di diffondersi e sua virulenza nell'ospite umano.

Questo rapporto descrive metodi e strumenti per evidenziare i vantaggi genomici ha conferiti al M. abscessus di sopravvivere nell'ambiente di amebe. Per questo scopo, lo screening di mutanti di M. abscessus trasposone descritto prima, il ceppo di tipo Acanthamoeba castellanii , che permette l'identificazione di difettoso del mutante per crescita intracellulare. Una seconda proiezione nei macrofagi è anche segnalata, per confermare se questo difetto persiste nell'ospite umano. In secondo luogo, per capire quali meccanismi sono imbrigliati in M. abscessus per adattarsi alla vita in fagocitica cellule e aumento sua virulenza nell'animale ospite, un metodo adattato specificamente per M. abscessus è stato sviluppato, dopo co-coltura in presenza di amebe che ha permesso l'estrazione di RNA totale da batteri intra-amoebal. Di conseguenza, una visione completa di M. abscessus geni che sono necessari per una vita intracellulare è stata sviluppata.

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Protocol

1. Biblioteca Screening

  1. Costruzione della biblioteca mutante Tn
    1. Ottenere una libreria di trasposoni.
      Nota: Per questo esperimento, una libreria di mutante trasposone è stata ottenuta da E.J. Rubin, Harvard School of Public Health, Boston, USA. La biblioteca è stata costruita da un ceppo clinico liscio (43S) di M. abscessus complesse (M. abscessus subsp. massiliense) con un phagemid introdotto nel M. abscessus permettendo l'inserimento casuale di un singolo Tn in un dinucleotide TA (91.240 sequenze di TA nel genoma di M. abscessus ). Per maggiori dettagli vedere la Guida di riferimento di Rubin et al. 9 e Laencina et al. 10.
  2. Titolazione della biblioteca e della conservazione dei mutanti di M. abscessusTn in piastre
    Nota: Questo richiede una settimana.
    1. Scongelare la libreria sul ghiaccio. Determinare la concentrazione batterica effettuando diluizioni in 1 mL di acqua (10-1 per 10-15). Piastra di una goccia di ogni diluizione su una piastra Petri contenente 7H 11 terreno agar con kanamicina 250mg/mL. Incubare le piastre a 37 ° C per 3-4 giorni.
      Nota: Qui, una titolazione di 1011 batteri/mL sono stati recuperati.
    2. Dopo aver determinato la concentrazione della biblioteca, diluire la libreria ad una concentrazione finale di 3.000 batteri/mL in 10 mL di glicerolo-acqua del 25%. Aliquotare la libreria in 10 provette per criogenia con 1 mL della libreria in ogni provetta. Conservare le aliquote a-80 ° C.
    3. Quando pronto all'uso, scongelare un'aliquota della biblioteca diluita su ghiaccio e aggiungere 100 µ l della biblioteca a 10 piastre di agar Mueller-Hinton (MH) quadrato (dimensioni cm 12) per recuperare 200 a 300 diverse colonie dopo 3 – 4 giorni di incubazione a 37 ° C.
    4. Con stuzzicadenti sterili, trasferire le singole colonie (circa 6.000 colonie in piastre da 60 x 96 pozzetti) in piastre da 96 pozzetti riempita con 200 µ l di 7h 9 supplementato con 0,2% glicerolo, 1% glucosio, 250 mg/mL di kanamicina. Incubare a 37 ° C per 5 giorni senza agitare.
    5. Trasferire 100 µ l della coltura (passaggio 1.2.4) di una piastra a 96 pozzetti contenenti 100 µ l di 7h 9 medie con 40% glicerolo. Archiviare la libreria ordinata a-80 ° C.
    6. Ripetere i passaggi da 1.2.3. a 1.2.5. con il resto della biblioteca fino a 10.000 singoli cloni vengono recuperati (circa 100 x 96 pozzetti e 30 piastre MH).
  3. Preparazione delle amebe
    1. Ameba cultura Acanthamoeba castellanii (AC) in recipienti di coltura del tessuto2 75 cm a temperatura ambiente (TA) in 30 mL di mezzo PYG (tabella 1) per l'amplificazione della cella linea11.
      Nota: Maturi trofozoiti da grandi cellule adesive con numerosi vacuoli digestivi sono chiaramente visibili su un microscopio. Il tempo di raddoppiamento di cella è stimata per essere cellule h. 25 sono stati amplificati ogni 3 giorni da spalmare un terzo della cultura iniziale in recipienti di coltura del tessuto2 75 cm.
    2. Rimuovere il mezzo PYG con una pipetta da 25 mL. Lavare le cellule con 10 mL di tampone di AC (tabella 2), che non contiene alcun carbonio o azoto fonti12. Ripetere il lavaggio due volte di più.
      Nota: Buffer di AC che non contiene nessun fonti di carbonio o azoto evita la crescita extracellulari dei micobatteri. Questo minimo mezzo conduce per l'incistamento delle amebe. Per limitare questo, inattivati e. coli sono state aggiunte come substrato (passo 1.4) amebe e tempi molto brevi di cultura sono stati promossi (48 h per mutante di screening) e 4 h o h 16 cultura per gli esperimenti RNAseq. In alternativa, è possibile utilizzare questo mezzo ma arricchito con medio PYG (solitamente 10%).
    3. Staccare l'ameba dal fondo del matraccio con una singola scossa vigorosa del matraccio di cultura del tessuto.
    4. Numero di celle con un emocitometro per regolare la concentrazione di cellule a 5 x 105 amebe/mL diluito in un tampone AC.
  4. Preparazione di inattivati Escherichia coli batteri per sfamare ameba dopo infezione
    1. Crescere il ceppo isolato clinico di Escherichia coli da uno stock di glicerolo in 100 mL di brodo di Luria (LB) durante la notte a 37 ° C.
    2. Raccogliere i batteri mediante centrifugazione a 1.835 x g per 10 min in provette da 50 mL. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet con 10 mL di acqua glicerolo al 10%. Ripetere il lavaggio due volte di più.
    3. Risospendere il pellet con 5 mL di acqua glicerolo al 10%. Aliquotare 0,5 mL in provette da 1,5 mL. Determinare la quantità di batteri/mL effettuando diluizioni seriali e aggiunta di diluizioni su piastre di agar LB. Conservare le aliquote a-80 ° C.
    4. Il giorno prima dell'infezione di ameba, scongelare un'aliquota sul ghiaccio e procedere al calore-uccisione incubando il tubo a 70 ° C per 60 min.
      Nota: Controllare l'inattivazione di placcatura 100 µ l di batteri inattivati su piastre di agar LB durante la notte a 37 ° C. Nessun colonie dovrebbero essere visibili dopo una notte di cultura.
    5. Diluire i batteri calore-ucciso a una concentrazione di 107 batteri in 50 µ l di tampone di AC e memorizzare i batteri diluiti a 4 ° C per non più di una settimana.
  5. Co-coltura delle amebe -M. abscessus Tn mutante: prima schermata
    Nota: Questo richiede 3-4 mesi per lo screening di 6.000 mutanti.
    1. Sviluppa 5 x 104 amebe/pozzetto di una piastra a 96 pozzetti in 100 µ l di tampone di AC. Incubare per 1 h a 32 ° C senza agitare. Consentire il tempo di trophozoïtes di ameba galleggiante per aderire ai pozzetti.
      1. Durante l'incubazione, scongelare i batteri sul ghiaccio per 1h.
    2. Aggiungere 5 µ l delle culture di batteri scongelati con una pipetta elettronica multicanale. Infettare per 1,5 h. schermo intorno 6.000 cloni individualizzati dalla piastra a 96 pozzetti Stock in mutanti di Tn .
      Nota: Il MOI è sconosciuto in questo passaggio del protocollo; Tuttavia, tutte le piastre da 96 pozzetti contenenti Tn mutanti erano coltivate esattamente nello stesso modo. Questa prima schermata mira a identificare rapidamente intracellulare mutanti carenti, senza considerare le variazioni nella densità dell'inoculo.
    3. Dopo le h 1,5 di infezione, capovolgere la piastra 96 pozzetti su garze sterili, collocato in un vassoio di metallo sterilizzato per rimuovere il mezzo AC sotto cappa aspirante. Rabboccare con 200 µ l di terreno di AC. Ripetere questo lavaggio due volte di più.
    4. Aggiungere 200 µ l di fresco supplementato con 100 µ g/mL amikacina per eliminare micobatteri extracellulari rimanenti.
    5. Incubare per 2 h prima di procedere con ulteriori 3 lavaggi (come descritto al punto 1.5.3). Dopo il lavaggio, mantenere le culture con 50 µ g/mL amikacina a 200 µ l di tampone di AC.
    6. Aggiungere batteri di Escherichia coli di 5 x 107 inattivati (dal punto 1.4) alla fine dell'infezione e ogni 24h per prevenire incistamento delle amebe.
    7. Dopo 48 h di co-coltura, lisare le cellule aggiungendo 10 µ l di 10% SDS (sodio dodecil solfato) ad ogni pozzetto e incubare per 30 min a 32 ° C. Procedere con la diluizione seriale e aggiungere su piastre di agar Columbia contenente 5% sangue di montone (piastre di COS) per valutare il numero di micobatteri intracellulari. Sigillare la piastra con il parafilm e incubare a 37 ° C.
    8. Quando le colonie appaiono sulle piastre di agar dopo 3-4 giorni, fotografare la piastra e identificano i mutanti alterati per crescita intracellulare osservando i depositi con il minor numero di colonie batteriche.
      Nota: Non mente circa la forma, l'altezza o la densità della Colonia (Figura 1A). 136/6000 mutanti sono stati identificati.
  6. Co-coltura delle amebe -M. abscessusTn mutante: seconda schermata dei mutanti identificati durante la prima schermata
    Nota: Questo richiede 2 settimane. Un secondo schermo deve essere eseguito con i 136 mutanti attenuati ottenuti dopo la prima schermata per quantificare precisamente il numero di batteri inoculati e il numero di sopravvivenza intracellulare batteri 2 giorni dopo l'infezione.
    1. Cresciuta 1 Colonia di ogni mutante incastrati in 50 mL di tubi riempiti con 20 mL di 7h 9 supplementato con 0,2% glicerolo, 1% glucosio e 250 mg/mL di kanamicina. Permettere ai batteri di raggiungere la fase esponenziale (0,6 < OD < 0,8).
    2. Lavare la cultura mediante centrifugazione (1.835 x g per 10 min) nel mezzo di AC. Scartare il surnatante. Ripetere l'operazione due volte questo lavare più con 20 mL di 7h 9 supplementato con 0,2% glicerolo, 1% glucosio e 250 mg/mL di kanamicina.
    3. Risospendere i batteri in 5 mL di tampone AC.
    4. Determinare la concentrazione di unità (CFU) dei mutanti di formazione di colonie. In piastre da 24 pozzetti, aggiungere 1 mL di acqua per le prime due righe. Aggiungere 100 µ l della sospensione batterica per il primo pozzo. Con una micropipetta, mescolare tre volte. Quindi, di aspirare bene 100 µ l e deposito al secondo.
    5. Con una nuova punta, ripetere il passaggio 1.6.4 dal secondo pozzo a quello terzo, ecc. fino al dodicesimo bene.
    6. Aspirare 30 µ l della diluizione 10-12 e aggiungerlo ad una piastra di COS. Ripetere per le altre diluizioni.
    7. Avvolgere la piastra COS con parafilm e incubare per 3 – 4 giorni a 37 ° C. Determinare la concentrazione contando le colonie.
    8. Eseguire analisi di co-coltura come descritto in precedenza in triplice copia in una piastra a 24 pozzetti con 5 x 104 ameba per pozzetto in 1 mL di mezzo di co-coltura di AC. Inoculare con una molteplicità di infezione (MOI) di 10.
    9. Dopo 48 h di co-coltura, procedere con la lisi cellulare come descritto al punto 1.5.7. Eseguire diluizioni in acqua (10-1 a 10-6) e aggiungere 30 µ l per le piastre di COS. Incubare le piastre per 4 giorni a 37 ° C prima di procedere con il conteggio di CFU.
      Nota: Dopo questa seconda schermata, 60 di 136 mutanti sono stati conservati.
    10. Memorizzare i mutanti colpiti per la loro sopravvivenza all'interno delle cellule. Aggiungere una colonia di un stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA contenente mezzo LB con glicerolo (20% finale) o in un stoccaggio PROVETTE CRIOGENIA contenente soluzione commerciale e microsfere per favorire una conservazione a lungo termine e facilitare futuro inoculazione e quindi conservare a-80 ° C.
    11. Valutare la crescita in vitro mutante misurando la densità ottica (OD) a 600 nm ogni 2 giorni.
      1. Crescere 1 Colonia di ogni mutante incastrati in provette da 50 mL riempita con 20 mL di 7h 9 supplementato con 0,2% glicerolo, 1% glucosio e 250 mg/mL di kanamicina. Permettere ai batteri di raggiungere la fase esponenziale (0,6 < OD < 0.8) prima di regolare il OD a 0,01 per iniziare la cinetica.
      2. Escludere i mutanti con un in vitro difetto di crescita se confrontato con il ceppo WT dal set di mutanti carenti intracellulare.
  7. Co-coltura di macrofagi -M. abscessus Tn mutante difettoso per un vita intra-ameba
    Nota: Questo richiede 1 mese.
    1. Diffusione: 5 x 104 J774.2 macrofagi murini per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti in 1 mL di terreno ricco, DMEM supplementato con 10% di siero fetale di vitello (FCS). Incubare le piastre per 24 h a 37 ° C e 5% di CO2 per consentire l'adesione dei macrofagi. Fornire 3 replicati.
    2. Eseguire l'infezione. Inoculare Tn mutanti, con un MOI di 10, diluito in DMEM con 10% FCS in un volume di 100 µ l.
    3. Dopo 3 ore di infezione, è necessario effettuare tre lavaggi con 1 mL di DMEM (può essere utilizzata una pompa a vuoto). Poi trattare con 250 µ g/mL amikacina (in DMEM con 10% FCS) per 1 h eliminare le restanti micobatteri extracellulari.
      1. Dopo 3 ulteriori lavaggi con 1 mL di DMEM, mantenere le colture in 250 µ g/mL amikacina (in DMEM con 10% FCS) ad un volume finale di 1 mL per prevenire la moltiplicazione micobatterica extracellulare.
    4. 72 h dopo co-coltura, rimuovere il mezzo e lisare i macrofagi aggiungendo 1 mL di acqua fredda. Incubare per 30 min a 4 ° C.
    5. Effettuare saggi CFU sulle piastre di COS per valutare il numero di batteri intracellulari.
      1. In una piastra a 24 pozzetti, aggiungere 1 mL di acqua per le prime due righe. Aggiungere 100 µ l del lysate co-delle cellule il primo pozzo. Con una micropipetta, mescolare tre volte. 100 µ l di aspirare e li depositi nel secondo bene.
      2. Con una nuova punta, ripetere alla diluizione dal pozzo secondo quello terzo, ecc. fino al dodicesimo bene. Poi aspirare 30 µ l della diluizione 10-12 e aggiungerlo ad una piastra di COS.
      3. Ripetere per le altre diluizioni. Avvolgere la piastra COS con parafilm e aspettare 3-4 giorni per osservare e contare le colonie.
  8. Identificazione e sequenziamento del sito di inserimento di Tn nei mutanti di M. abscessus
    Nota: Questo richiede 1,5 mesi per 60 mutanti.
    1. Estrazione genomico di identificati M. abscessus mutanti
      1. Crescere i mutanti in una provetta da 50 mL con 20 mL di 7h 9 medium completato con 0,2% glicerolo, 1% glucosio e kanamicina 250 mg/mL di fase esponenziale (OD600= 0,8).
      2. Raccogliere 10 mL delle culture (2.396 x g, 5 min). Scartare il surnatante. Sospendere i batteri in 500 µ l di soluzione ho (25% di saccarosio, Tris 50 mM a pH 8, lisozima 10 mg/mL, tiourea 40 mM). Trasferire la soluzione in provette da 2 mL con tappo a vite e incubare per 2 ore a 37 ° C.
      3. Aggiungere 500 µ l di soluzione II (25% di saccarosio, 50 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM EDTA). Dopo il pipettaggio fino e giù 5 - 10 volte, aggiungere perline di zirconio fino ad un volume di 500 µ l nella provetta.
      4. Procedere con la lisi delle cellule con un omogeneizzatore (3 x 6.000 giri/min, 45 s) con un'incubazione di 1 min su ghiaccio tra ogni round.
      5. Aggiungere 5 µ l di proteinasi K 20 mg/mL (finale di 100 µ g/mL) e incubare i campioni durante la notte a 55 ° C.
      6. Aggiungere 1 mL di freddo di fenolo/cloroformio/alcool isoamilico (25:24:1) sotto una cappa aspirante. Mescolare i campioni nel vortex prima di procedere con centrifugazione a RT e 16.500 x g per 30 min.
      7. Dopo la centrifugazione, recuperare la fase acquosa e aggiungere un volume equivalente di soluzione fredda fenolo/cloroformio/alcool isoamilico sotto una cappa. Centrifugare i campioni a 16.500 x g per 30 min recuperare la fase acquosa nuovamente.
      8. Aggiungere 0,7 volume di isopropanolo RT alla fase acquosa recuperata sotto cappa aspirante. Capovolgere lentamente i tubi per consentire la precipitazione del DNA e incubare per 5 minuti a TA. Poi Centrifugare per 10 min a 16.500 x g e RT.
      9. Eliminare il surnatante e lavare la pallina con 500 µ l di etanolo al 70% sotto una cappa. Centrifugare le provette per 10 min a 16.500 x g a RT prima di rimuovere l'etanolo. Incubare per 10 minuti consentire l'evaporazione dell'alcool residuo.
      10. Infine, è possibile sospendere il pellet di DNA in 100 µ l di acqua gratuita dnasi/RNAsi. Determinare DNA DNA resa e purezza con uno spettrofotometro.
      11. Rimuovere 1 µ g di DNA genomico e digest con 10 U di ClaI per una notte per sub-clonazione il sito di inserimento di Tn . Utilizzare il protocollo del produttore.
        Nota: Il Claho enzima è uno degli enzimi di restrizione più altamente rappresentati nel genoma di M. abscessus (2.173 siti di restrizione). Un Claho sito di restrizione si trova anche nella sequenza Tn a Monte della cassetta di resistenza alla kanamicina del mutante Tn. Quindi, la Clami-mediata subcloning permette di identificare il sito di inserimento di Tn.
    2. Sub-clonazione in un plasmide del DNA genomico contenente il Tn
      Nota: Prima di procedere con il Tn-subcloning in 2.686 plasmide ampicillina-resistente bp pUC19, aggiungere un Claho sito di restrizione nel polylinker del plasmide. La sequenza del plasmide pUC19 può essere trovata a questo link https://www.addgene.org/50005/sequences/.
      1. Segui produttore di protocollo da digerire il plasmide pUC19 con EcoRI e HindIII, che rilascia un frammento di 51 bp e un frammento di 2635 b.p. purificare il doppio vettore digerito con un kit di purificazione di PCR commerciale per eliminare il 51 bp rilasciato il frammento.
      2. Mix 1 µ l (concentrazione 25 pmol / µ l) di due oligonucleotidi complementari (5 'AGCT TATA AGATCT TATA ATCGAT TATA3' e 5 'AAT TAA TAA TCG ATT ATA AGA TCT TAT A3') di 28 bp ciascuno contenente la Clami sito di restrizione e alle estremità HindIII e EcoR I siti di restrizione. Riscaldare a 100 ° C per 10 min e poi raffreddare per associarle.
      3. Digerire i primer accoppiati di EcoRI e HindIII secondo il protocollo del produttore.
      4. Lega i 150 ng di EcoRho /HindIII-limitata pUC19 plasmide con diversa concentrazione di primer accoppiati (50 pmol / µ l, 25 pmol / µ l, 2,5 pmol / µ l) per 1 h a RT con 1 U di T4 DNA ligasi in un volume finale di 20 µ l. Check la clonazione di un diverso digestione enzimatica.
      5. Digerire il plasmide modificato con Claio per 2 ore a 37 ° C.
      6. Lega i 50 ng di pUC19 io-limitati Claplasmide e 50 ng di DNA genomic digerito dal ClaI per 1h a RT con 1 U di T4 DNA ligasi in 10 µ l.
      7. Procedere alla trasformazione di batteri electrocompetent e. coli con 5-10 µ l della legatura (2500 V, 200 ohm, 25 µF). Selezionare i cloni su piastre di agar LB completati con kanamicina di 50 µ g/mL e 50 µ g/mL ampicillina per selezionare i batteri cuscinetto plasmidi con porzioni di sequenze di Tn.
      8. Coltivare cloni resistenti durante la notte in mezzo liquido LB con la selezione antibiotica appropriata (50 µ g/mL kanamicina e ampicillina di 50 µ g/mL).
      9. Estrarre il DNA del plasmide. Verificare la presenza dell'inserto di restrizione enzimatica e l'estremità 3' di Tn per identificare il gene perturbato con un oligonucleotide (5' TTGACGAGTTCTTCTGA 3') corrispondente le ultime 17 coppie di basi della kanamicina Tn di sequenza Cassetta di resistenza.
      10. Allineare la sequenza contro il ceppo di andare 06 M. abscessus eseguendo un esplosione del nucleotide (BLAST-N).

2. RNA estrazione dei micobatteri intracellulari per analisi Rnaseq

Nota: Questo richiede 4 mesi per esperimenti e 4 mesi per analisi RNAseq.

  1. Co-coltura delle amebe-M. abscessus in lotti
    Nota: Nel seguente esperimento, co-coltura è eseguita in provette da 50 mL con agitazione a favorire contatti cellula dei batteri.
    1. Crescere M. abscessus in 7h 9 supplementato con 0,2% glicerolo, glucosio 1% per la fase di metà-esponenziale a 120 giri/min.
    2. Lavare i batteri due volte con 10 mL di buffer di AC.
    3. Stimare la concentrazione di batteri misurando il OD600nm (1 OD600= 4 x 108 micobatteri). Aggiungere 8,5 x 108 micobatteri a 8,5 x 106 amebe in 10 mL di terreno di AC.
    4. Incubare per 1 h a 30 ° C con agitazione delicata (circa 80 giri/min).
    5. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 253 x g per 12 min. rimuovere il surnatante e sospendere le cellule in 10 mL di buffer di AC. Ripetere questo lavaggio due volte di più.
    6. Risospendere le cellule in 10 mL di tampone di AC contenente 50 µ g/mL amikacina per eliminare batteri extracellulari e incubare per 4 h a 30 ° C con agitazione delicata (80 giri/min). Lavare le cellule ancora due volte.
  2. Estrazione di RNA totale da intracellulare M. abscessus
    Nota: Eseguire passaggi 2.2.1–2.2.3 sotto la cappa a causa dell'uso dei reagenti tossici.
    1. Dopo i lavaggi finali, risospendere le amebe infetti in 4 mL di soluzione fredda III (tabella 3) con estemporaneamente 280 µ l di β-mercaptoetanolo per distruggere amebe. Questo è il passo di guanidinio tiocianato (GTC). Mantenere la sospensione in ghiaccio per 10 min. centrifuga la cella lysate per 30 min a 2.396 x g e 4 ° C per pellet i batteri intracellulari rilasciati.
    2. Rimuovere il supernatante e sospendere il pellet batterico in 1 mL di soluzione fredda III. Raccogliere i batteri a 2396 x g per 30 min a 4 ° C. Risospendere il pellet in 1 mL di tampone di estrazione e trasferimento in una provetta di vite di 2 mL contenente microsfere di zirconio (fino alla gradazione di 500 µ l del tubo). Conservare le provette per almeno 24 ore a-80 ° C.
      Nota: Storage nel reagente di lisi permette l'inattivazione della dissoluzione di RNAsi e cella.
    3. Quando si è pronti per l'uso, scongelare i campioni su ghiaccio e lisare loro con un omogeneizzatore eseguendo due turni a 6.000 giri/min per 25 s, seguita da un giro a 6.000 rpm per 20 s con un'incubazione di 1 min su ghiaccio tra ogni round.
    4. Per raffreddare il campione, li Incubare in ghiaccio per 10 min. Quindi aggiungere 200 µ l di cloroformio diluito in alcool isoamilico. Dopo Vortex i campioni per 1 min, centrifugare per 15 min a 16.500 x g e a 4 ° C.
    5. Aggiungere 0,8 mL di isopropanolo freddo alla fase acquosa e incubare i campioni per 2 – 3 h a 20 ° C. Centrifugare i campioni per 35 min a 16.500 x g e a 4 ° C. Scartare il surnatante.
    6. Lavare la pallina del RNA aggiungendo 500 µ l di etanolo 70% freddo (non mescolare).
    7. Centrifugare i campioni a 16.500 x g per 10 min rimuovere l'etanolo. Aspirare la soluzione e asciugare in un concentratore centrifugo.
    8. Una volta essiccato, risospendere il pellet in 100 µ l di acqua gratuita dnasi/RNAsi.
      Nota: I campioni devono essere trattati due volte con dnasi per rimuovere i contaminanti di DNA secondo le raccomandazioni del produttore.
    9. Valutare l'integrità di RNA su un gel di agarosio e confermare misurando il numero di integrità di RNA (RIN) ed il rapporto di ribosomal con un metodo basato su chip elettroforesi capillare.
      Nota: Il RIN prende tutto il tracciato elettroforetico in considerazione. Il RIN algoritmo software permette per la classificazione di RNA totale, basato su un sistema di numerazione da 1 a 10, con 1 è il profilo più degradato e 10 è il più intatto. Per procedere con la preparazione di cDNA library, il RINs deve essere sopra 8 e il rapporto ribosomal [28S/18S] più in alto possibile, il valore ideale essendo 2, a seconda dell'organismo e delle sue specificità.
    10. Conservare i campioni di RNA a-80 ° C fino alla preparazione della libreria di cDNA per il sequenziamento.
  3. Preparazione di cDNA library
    1. Per procedere con la preparazione di libreria, utilizzare un kit di sintesi di cDNA disponibili in commercio (Tabella materiali) utilizzando il protocollo del produttore.
    2. Controlla la libreria per concentrazione e qualità su un Chip di DNA.
      Nota: Più precisa ed accurata quantificazione devono essere eseguita con dosaggi di quantificazione basati su fluorescenti sensibili.
  4. Sequenziamento di biblioteca
    1. Normalizzare i campioni a 2 nM e procedere alla multiplazione secondo l'organizzazione di cella di flusso.
    2. Denaturare i campioni ad una concentrazione di 1 nM utilizzando 0,1 N NaOH per 5 minuti a TA.
    3. Diluire i campioni alle 22. Caricare ogni campione nella cella di flusso alle 22.
    4. Procedere con la sequenza ordinata con un sistema di sequenziamento ad alte prestazioni che consente genomica su larga scala. Qui la corsa è stata una corsa SRM (SR: sola lettura, PE: fine accoppiato letture, m: multiplexed campioni) di 51 cicli con 7 basi Indice leggere.
    5. Valutare la qualità della sequenziazione con l'esterno FastQC programma13.
    6. Dopo la rifilatura delle sequenze di adattatore, procedere con gli allineamenti leggi contro un genoma di riferimento. Allineare contro il genoma della cellula eucariotica per valutare la contaminazione del campione e, se del caso, procedere con il taglio della legge non batterica.
  5. Analisi statistica
    1. Usare diversi programmi software disponibili online per definire insiemi di geni differenzialmente espressi: R software, pacchetti Bioconductor tra cui DESeq2 e il pacchetto di PF2tools (versione 1.2.12) sviluppato presso la piattaforma "Transcriptome et Epigénome" (Pasteur Istituto, Parigi).

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Representative Results

M. abscessus ha la capacità di resistere e fuggire le risposte battericide dei macrofagi e protozoi ambientali come amebe. M. abscessus esprime fattori di virulenza quando cresciuto a contatto con amebe, che lo rende più virulento in topi4. Il primo obiettivo di questi metodi era di identificare i geni presenti in M. abscessus permettendo la sua sopravvivenza e moltiplicazione all'interno di amebe.

Per questo, una libreria di mutanti di M. abscessus subsp. massiliense, ottenuti da Tn consegna9, è stata proiettata in seguito co-coltura in presenza di amebe, per identificare i mutanti con crescita attenuato in questo intracellulare ambiente (Figura 1). Il comportamento dei mutanti stessi inoltre è stato valutato dopo co-coltura con i macrofagi per analizzare se questa attenuazione della crescita è stata conservata nei macrofagi di topi.

Questa libreria cieco trasposone approccio, di screening ha confermato un fenotipo replica difettosa per 47 di 6.000 mutanti che hanno avuti una sopravvivenza pari al 50% o meno in amebe e/o macrofagi, rispetto ai controlli10. Per escludere i mutanti con la sopravvivenza intracellulare attenuato che potrebbe essere a causa di un difetto di crescita intrinseca del micobatterio, la crescita curve di tutti i selezionati Tn mutanti sono stati valutati in un in vitro terreno di coltura liquido arricchito (1% glucosio - 7 H 9). In vitro la crescita di tutti i mutanti è stata monitorata seguendo OD600 delle culture ogni 2 giorni. I diversi mutanti che visualizzato un difetto in vitro crescita rispetto al ceppo wild type corrispondente sono stati esclusi dallo studio.

Esso era di vitale importanza per questo test cieco apparire ogni giorno utilizzando esattamente lo stesso protocollo. La limitazione di questa tecnica è stata la prima proiezione visiva, fotografie sono state scattate di ogni CFU per fornire un'immagine precisa per riferimento. In questo gruppo di mutanti, 12 M. abscessus mutanti (inclusi i duplicati) sono stati identificati in cui il trasposone è stato inserito in geni appartenenti al locus ESX-4 del tipo sistema di secrezione di VII che sottolinea la sua importanza in intracellulare crescita di M. abscessus10.

Fino ad ora, l'analisi di virulenza di M. abscessus essenzialmente è stato basato sull'analisi comparativa del genoma di M. abscessus con quello di M. chelonae, un micobatterio appartenendo allo stesso gruppo, ma causano solo infezioni della pelle negli esseri umani. L'obiettivo era quello di ottenere un catalogo dei geni espressi durante condizioni di diversi co-coltura al fine di comprendere meglio l'adattamento e, potenzialmente, meccanismi di virulenza coinvolti durante la co-cultura in presenza dell'ambiente professionale fagociti. Analisi di questa maggiore virulenza attraverso un approccio globale di RNA messaggeri di sequenziamento totale di M. abscessus, è stata effettuata al fine di rilevare il RNAs indotta o repressa durante ameba co-colture rispetto al RNA trascritti sotto condizioni in vitro . L'espressione differenziale di questi RNA può conferire al M. abscessus un'avanzata "virulenza" spiegando la colonizzazione delle vie aeree superiori in esseri umani.

Questi co-colture sono stati nuovamente effettuate in una minima media (nessuna fonte di carbonio o azoto) come descritto sopra, al fine di prevenire la crescita extracellulare di M. abscessus e rappresentative delle condizioni ambientali che devono affrontare questi micobatteri e sotto la pressione della selezione di un antibiotico per tutta la durata della co-cultura per selezionare i micobatteri intracellulari.

Di conseguenza, una tecnica è stata sviluppata per isolare il RNA da micobatteri intracellulari. La principale difficoltà con questa estrazione di RNA micobatterica è stato evitando la contaminazione con RNA amoebal (tipo eucariote). Per evitare questo, lisi di ameba è stata effettuata in tempi diversi post co-coltura, utilizzando tiocianato di guanidinium (GTC); Poiché i micobatteri intracellulari sono resistenti. Dopo questo passaggio, un'estrazione meccanica degli RNA micobatterici è stata effettuata usando un cellulare-omogeneizzatore in presenza di perline di zirconio. Questa tecnica ha permesso di ottenere micobatterico RNA di buona qualità, con un numero RIN di alta qualità, essenziali per migliorare la capacità di effettuare un'analisi completa del trascrittoma M. abscessus , usando il sequenziamento di RNA messaggero (mRNA) tecnica (Figura 2). Questo non è mai stato fatto prima e ci ha dato una visione fondamentale delle famiglie genica indotta o repressa, raggruppandoli in base al loro ruolo: la risposta di M. abscessus a un ambiente limitato nella sua fonte di sostanze nutritive e minerali, per un'ipossia o ambiente acido e resistenza di M. abscessus all'ossidativo e stress nitrosativo e infine espressione della virulenza di M. abscessus in ameba ambientale.

Figure 1
Figura 1 : A. prima schermata visual di M. abscessus Tn mutanti in ameba. (A) schermo su larga scala di Tn mutanti su amebe viene eseguito in piastre da 96 pozzetti con una molteplicità casuale di infezione per identificare rapidamente i mutanti attenuati. (B) identificazione dei mutanti attenuati Tn perturbato geni. Il DNA genomico dei mutanti di TN è frammentato con il Claio per clonare il sito di inserimento di Tn . M. abscessus genomi porti 2500 Claho siti di restrizione che favorisce l'ottenimento di DNA breve frammenti ma ha abbassato la probabilità per clonare il sito di inserimento di Tn (1/2500). I cloni sono selezionati con kanamicina, orso di resistenza dal trasposone. Il gene interrotto è identificato mediante sequenziamento con un primer all'interno della cassetta di resistenza alla kanamicina Tn (freccia nera). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Analisi di estrazione del RNA micobatterica. (A), RNA estrazione di intracellulare M. abscessus durante amebe -M. abscessus co-coltura. Amebe co-culture con M. abscessus vengono eseguite ad un'elevata molteplicità di infezione (cioè, 100), in grandi volumi, con agitazione delicata, a favore delle cellule ai contatti di batteri. Dopo co-coltura, le cellule vengono raccolte e lisate con una combinazione di GTC e ß-mercaptoetanolo. I batteri contenenti lisato cellulare è trattata con GTC nuovo per indebolire la parete cellulare di batteri per facilitare il Lisi meccanico batteri prima dell'estrazione di RNA. (B) RNA valutazione qualità e integrità con un bioanalyzer. Un gel di elettroforesi è dato su cui rRNA è osservato (23S, 16S e 5S). RIN deve essere superiore a 8 per procedere con la preparazione di libreria per rapporti di sequenziamento e rRNA (23S/16S) più in alto possibile, a seconda del microrganismo, il valore ideale è 2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il comportamento di M. abscessus è molto più simile al comportamento di SGM patogeni come M. tuberculosis rispetto a qualsiasi altri micobatteri appartenendo a RGM2. L'elemento chiave nella patogenicità di SGM è la loro capacità di sopravvivere o addirittura si moltiplicano all'interno di cellule presentanti l'antigene, quali i macrofagi e cellule dendritiche.

M. abscessus ha acquisito alcuni vantaggi genomiche come mostrato dalla sequenza totale del suo genoma14 per poter sopravvivere all'interno di una cellula eucariotica fagocitica. Il genoma di M. abscessus ha dimostrato di essere in rapida evoluzione e molto plastica, con molti recentemente introdotte sequenze di inserimento come profagi e nuovi geni15. Anche se c'è meno dati sulla virulenza fattori in M. abscessus rispetto a M. tuberculosis, M. abscessus sembra di essere in grado di evolversi rapidamente e attivamente verso una maggiore virulenza. Fino ad ora, l'analisi di virulenza di M. abscessus si basava essenzialmente sull'analisi comparativa del genoma di M. abscessus con quello di M. chelonae, un micobatterio appartenendo allo stesso gruppo, ma che causano infezioni limitate a la pelle in esseri umani. Alcuni geni non presenti nel M. chelonae , ma presente in M. abscessus, come la fosfolipasi C, parzialmente hanno spiegato la resistenza di M. abscessus dopo fagocitosi da amebe ambientale4.

Lo sviluppo di una tecnica di co-coltura di ameba completato con campioni ambientali ha dimostrato inequivocabilmente ameba-micobatterica interazioni16,17. Quindi, i micobatteri potrebbero essere isolati da lisati co-coltivate in presenza di amebe in un impianto di trattamento acqua18, e M. massiliense è stato isolato dall'espettorato di un paziente dopo co-coltura con amebe, mentre la cultura da solo non ha fatto consentire l'isolamento di questo di micobatteri8. Amebe sono sempre più considerate come un'incubatrice per micobatteri4 e Acanthamoebasp. come un ospite naturale ambientale per molti micobatteri non-tubercolotico. Ameba plus micobatteri co-coltura sistemi sempre più sono state proposte come modelli di semplice e rapide per caratterizzare fattori coinvolti nella crescita intracellulare di micobatteri19,20,21, 22,23,24.

Nell'ambiente, l'interazione tra i micobatteri e amebe è scarsamente documentata. Il primo articolo che descrive la prova di un'associazione tra i micobatteri e amebe nel campo è venuto fuori nel 2014, e questo studio si è concentrato sull'analisi di una rete di acqua potabile25.

A nostra conoscenza, questo è il primo screening descritto nel corso di una co-coltura con amebe. Questo studio ci ha permesso di dimostrare il ruolo svolto dai fagociti ambientale nell'acquisizione della virulenza dell'agente patogeno opportunistico che interessano gli esseri umani. Al fine di evidenziare quei geni richiesti per la sopravvivenza intracellulare del M. abscessus, una schermata di una libreria mutante di recepimento è stata effettuata in una sottospecie di M. abscessus complesso e in un ceppo clinico. Questa libreria mutante è stata proiettata con amebe, questa ultima avendo dimostrato come un "campo di addestramento" per aumentare la virulenza di M. abscessus in topi4, simile a quello osservato con M. avium26. Il risultato principale è stato la scoperta per la prima volta in micobatteri del ruolo essenziale del locus ESX-4 codifica un sistema di secrezione di tipo VII e antenato del locus ESX-1 considerato essenziale per la virulenza e la sopravvivenza intracellulare di M. tuberculosis Mycobacterium microti e M. marinum27,28,29,30,31.

Il secondo obiettivo era quello di ottenere un catalogo dei geni espressi durante condizioni di diversi co-coltura al fine di comprendere meglio l'adattamento e potenziali meccanismi di virulenza coinvolti durante la co-coltura in presenza di ambientale fagociti professionali. Analisi di questa maggiore virulenza attraverso un approccio globale del sequenziamento totale di RNA messaggeri di M. abscessus, è stata effettuata al fine di rilevare il RNAs indotta o repressa durante ameba co-colture rispetto al RNA trascritti sotto condizioni in vitro . L'espressione differenziale di questi RNA può conferire al M. abscessus un'avanzata "virulenza" spiegando la colonizzazione delle vie aeree superiori in esseri umani. Tra le specie RGM, M. abscessus è un'eccezione al fenotipo non patogeni insieme a M. chelonae. La capacità di M. abscessus di causare patologie simili ai micobatteri tubercolotici rende ancora più unica. Molti studi hanno riferito gli adattamenti intracellulari del M. tubercolosi alla vita all'interno di macrofagi32,33 , ma nessuno si sono concentrati sulla M. abscessus adattamenti in vivo. Risposta di transcriptional di M. abscessus all'ipossia è stato descritto34 però, evidenziando il ruolo di mycobactins e il regulone di dormienza come descritto in M. tuberculosis. Analisi del trascrittoma M. abscessus all'interno di amebe e macrofagi dà uno spaccato di adattamenti dei batterici a vita intracellulare di per sé. Un confronto tra quelli trascrittomi permette la valutazione del ruolo delle amebe nell'innescare la virulenza di s M. abscessuin esseri umani e per la decifrazione di adattamenti specifici di cellule fagocitiche dei mammiferi. Una supposizione è stato fatto che l'ambiente amoebal potrebbe costituire un 'training ground' per M. abscessus prima trasferimento alle cellule umane, al fine di descrivere la virulenza abscessus M. in termini di adattamenti evolutivi, rende questo approccio originale .

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Acknowledgments

Riconosciamo notevolmente Pr. E.J. Rubin (Harvard Medical School, Boston, USA) per il dono prezioso del mutante biblioteca e Dr. Ben Marshall (facoltà di medicina, Università di Southampton, UK) per le correzioni del manoscritto. Riconosciamo notevolmente l'associazione paziente francese per fibrosi cistica "Vaincre la Mucoviscidose" e "L'Association Gregory Lemarchal" per il loro sostegno finanziario (RF20150501377). Ringraziamo anche l'Agenzia nazionale per la ricerca (programma ANR DIMIVYR (ANR-13-BSV3-0007-01)) e la Région Ile de France (Domaine d'Intérêt Majeur Maladies Infectieuses et Emergentes) la borsa di post-dottorato a VL-M. L. L. è un dottorato dalla "Ministère de il L'Enseignement Supérieur et de la Recherche".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of Material/ Equipment
24-well plates Thermofisher 11874235
96-well plates Thermofisher 10687551
Beadbeater  Bertin Precellys 24
Bioanalyzer Agilent
Genepulser Xcell Biorad
Nanodrop spectrophotometer 2000 Thermofisher
QuBit fluorometer Thermofisher Q33226
zirconium beads/silica beads Biospec products 11079101Z Beads
Name of reagent/cells
Acanthamoeba castellanii  ATCC 30010 strain
Amikacin  Mylan 150927-A powder
B-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250 solution
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016 >93% granular anhydrous
Chloroform  Fluka 25666 solution
ClaI enzyme New England Biolabs R0197S enzyme
Columbia agar  Biomerieux 43041 90 mm
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270  powder
DMEM  Thermofisher 11500596 medium
DNase and RNase free water  Invitrogen 10977-035 solution
E. coli electrocompetent  Thermofisher 18265017 bacteria
EDTA Sigma-Aldrich E4884 powder
Escherichia coli  Clinical isolate personal stock bacteria
Fe(NH4)2(SO4)-6H2 EMS 15505-40 sulfate solution 4% aqueous
Fetal Calf Serum Gibco 10270 serum
Glycerol Sigma-Aldrich G5516 solution
Guanidium thiocyanate  Euromedex EU0046-D powder
Isopropanol  Sigma-Aldrich I9516 solution
J774.2 macrophages Sigma-Aldrich J774.2 Strain
kanamycin  Sigma-Aldrich 60615 powder
KH2PO4 Sigma-Aldrich P0662 Monobasic, anhydrous
LB liquid medium  Invitrogen 12795-027 powder
Lysozyme Roche 10837059001 powder
MgSO4 Labosi M275 pur
Microbank TM (cryotubes with beads) Pro-Lab Diagnostic PL.170/M
Middlebrook 7H11 medium Sigma-Aldrich M0428 powder
Middlebrook 7H9 medium Thermofisher 11753473 powder
Müller-Hinton agar Biorad 3563901 powder
N-Lauryl-sarcosine Merck S37700 416 powder
Na2HPO4-7H2O Sigma-Aldrich S9390 98-102%
Phenol/chloroforme  Sigma-Aldrich 77617 solution
Proteinase K Thermofisher EO0491 powder
proteose peptone BD 211684 enzymatic digest of animal tissue
pUC19 plasmid New England Biolabs 54357 plasmid
SDS  20% Biorad 1610418 solution
Sodium citrate Calbiochem 567446 powder
Thiourea Sigma-Aldrich 88810 powder
Tris Sigma-Aldrich 154563 powder
Trizol  Thermofisher 12044977 solution
Tween 80 Sigma-Aldrich P1754  solution
Yeast extract  BD 212750
Kit
AMBION DNase kit  Thermofisher 10792877 kit
DNA Agilent Chip Agilent 5067-1504 kit
GeneJET Plasmid Miniprep kit  Thermofisher K0503 kit
PureLink PCR Purification kit Invitrogen K310001 kit
Quant-It" assays kit Thermofisher Q33140/Q32884 kit
T4 DNA ligase  Invitrogen Y90001 kit
TruSeq Stranded RNA LT prep kit Illumina 15032611 kit

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References

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