نهجاً الطفرات تشبع رواية: وصف خطوة مفردة بروتين تنظيمي ملزم مواقع في الجيش الملكي النيبالي باستخدام فوسفوروثيواتيس

Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

البروتينات التي تربط تسلسل معين من الحمض النووي الريبي تلعب أدواراً حاسمة في التعبير الجيني. وصف مفصل لمواقع الربط هذه الأهمية الحاسمة لفهمنا لتنظيم الجينات. ويرد هنا، اتباع نهج خطوة واحدة للطفرات تشبع مواقع ربط البروتين في الجيش الملكي النيبالي. وهذا النهج ذات الصلة لجميع مواقع ملزمة البروتين في الجيش الملكي النيبالي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Singh, R. A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates. J. Vis. Exp. (138), e57816, doi:10.3791/57816 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تنظيم الجينات يلعب دوراً هاما في التنمية. ربط العديد الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات على تسلسلات الهدف مع خصوصية عالية للتحكم في التعبير الجيني. هذه البروتينات التنظيمية التحكم في التعبير الجيني أما على مستوى الحمض النووي (النسخ) أو على مستوى الحمض النووي الريبي (الربط مرناً قبل بوليادينيليشن، ومرناً، والانحلال والنقل والترجمة). تحديد تسلسل تنظيمي يساعد على فهم ليس فقط كيف يتم تبديل جين أو إيقاف تشغيله، ولكن أيضا الجينات المصب التي ينظمها بروتين تنظيمية خاصة. وهنا يصف لنا اتباع نهج خطوة واحدة يتيح الطفرات التشبع من موقع ملزمة البروتين في الجيش الملكي النيبالي. أنها تنطوي على تعاطي المنشطات قالب الحمض النووي مع النيوكليوتيدات غير-نوع البرية داخل الموقع ملزم، توليف للكشف منفصلة مع كل من النوكليوتيدات فوسفوروثيواتي، وعزله في كسر ملزمة بعد الحضانة مع البروتين. تدخل من نوع البرية غير النيوكليوتيدات النتائج في استبعادهم تفضيلية من الكسر البروتين زمنياً. ويرصد هذا التفريد جل عقب انشقاق الكيميائية انتقائية مع اليود سندات فوسفوديستير التي تحتوي على فوسفوروثيواتيس (الطفرات فوسفوروثيواتي أو PTM). يعتبر هذا الأسلوب الطفرات تشبع خطوة واحدة تنطبق على وصف أي موقع ملزمة البروتين في الجيش الملكي النيبالي.

Introduction

تنظيم الجينات يلعب دوراً هاما في مجال البيولوجيا. الجينات يمكن أن تنظم على مستوى النسخ، مرناً قبل الربط، 3 ' تشكيل نهاية، تصدير الجيش الملكي النيبالي، والترجمة، التعريب مرناً، تسوس، بوستترانسلاشونال التعديل/الاستقرار، إلخ كلا البروتينات الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي الملزمة تلعب أدواراً رئيسية في الجينات التنظيم. بينما حددت التحليلات الجينية الجزيئية البروتينات التنظيمية العديدة، اتسمت فقط مجموعة فرعية صغيرة من لهم تماما للوظائف الخلوية أو ربط المواقع في فيفو. تحليل تسلسل النشوء والتطور والطفرات نقدم نهج تكميلية لوصف التفاعلات الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي البروتين.

الجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات هامة في العمليات الإنمائية، بما في ذلك التمييز الجنسي. البروتين المورفولوجية الجنس الفتاكة (SXL) أو البروتين الرئيسي تبديل الجنس غائبا في الذكور، ولكن الوقت الحالي في الإناث. أنه يعترف بتسلسل الغنية uridine أو بيريميدين-مساحات المتاخمة لمواقع الوصلة المحددة في أهداف مرناً قبل المصب (المحولاتو الجنس الفتاكة، و lethal2 الخاصة بالذكور) في الخلايا الجسدية1،2 ،،من34. وباﻹضافة إلى ذلك، فإنه ينظم الموقع بوليادينيليشن التبديل بواسطة الربط إلى تسلسل محسن بوليادينيليشن الغنية أردين في5،نص محسن من بدائية (e(r))6. SXL المحتمل ينظم أهداف إضافية في germline الإناث التي لا يزال يتعين تحديد1،،من78،،من910،11، 12 , 13.

عادة، يشمل توصيف موقع الربط الطفرات، على سبيل المثال، بحذف أو استبدال واحد أو متعددة النيوكليوتيدات. كل موقع ملزم المسخ، بالنسبة لتسلسل الحمض النووي الريبي البرية من نوع، ثم يتم تحليل استخدام سلسلة من تركيزات البروتين لتحديد ما تقارب ملزم (الانفصالكد أو التوازن المستمر) لبروتين الاهتمام؛ كد هو تركيز البروتين اللازم للحصول على ربط الحمض النووي الريبي 50%. تتضمن هذه العملية ذات العمالة الكثيفة للطفرات مفصلة توليد وتحليل لطفرات عديدة – ثلاثة النيوكليوتيدات-نوع البرية لكل وظيفة في موقع الربط. وبالتالي، هناك حاجة إلى نهج بديل للطفرات تشبع أسرع وأبسط، وغير مكلفة لمواقع ربط بروتين في الجيش الملكي النيبالي.

وهنا يصف لنا اتباع نهج خطوة واحدة يتيح الطفرات التشبع من موقع ملزمة البروتين في الجيش الملكي النيبالي. أنها تنطوي على تعاطي المنشطات قالب الحمض النووي مع النيوكليوتيدات غير-نوع البرية داخل الموقع ملزم، توليف للكشف منفصلة مع كل من النوكليوتيدات فوسفوروثيواتي، وعزله في كسر ملزمة بعد الحضانة مع البروتين. تدخل من نوع البرية غير النيوكليوتيدات النتائج في استبعادهم تفضيلية من الكسر البروتين زمنياً. ويرصد هذا التفريد جل عقب انشقاق الكيميائية انتقائية مع اليود سندات فوسفوديستير التي تحتوي على فوسفوروثيواتيس (الطفرات فوسفوروثيواتي أو PTM). يعتبر هذا الأسلوب الطفرات تشبع خطوة واحدة تنطبق على وصف أي موقع ملزمة البروتين في الجيش الملكي النيبالي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: الشكل 1 يوفر لمحة عامة عن الطفرات فوسفوروثيواتي ويوجز الخطوات الرئيسية في هذه العملية.

1-إنشاء مكتبة لطفرات – المنشطات قالب الحمض النووي مع النيوكليوتيدات-نوع البرية

  1. توليف T7 التمهيدي (-جتاتاكجاكتكاكتاتاج 5 '-3') بالتوليف الكيميائي على المزج الحمض النووي.
  2. توليف اليغنوكليوتيد مخدر (حبلا التكميلية) بالتوليف الكيميائي على المزج الحمض النووي المقابلة للموقع ملزمة البروتين. استخدام مزيج مناسب من فوسفوراميديتيس خلال التوليف الكيميائي لكل موقع من المنشطات (العاشر أدناه) بنسبة 90% A النوكليوتيدات البرية من نوع و 10% T النوكليوتيدات-نوع البرية (انظر نتائج تمثيلية لمزيد من التفاصيل حول هذه النسبة).
    ملاحظة: هنا، هو تسلسل اليغنوكليوتيد مخدر CC 5 '--جتكاكتاكاكتكسجأكساكساكساكسكاكسككساكساكسجكستجكتاتاجتجاجتكجتاتاك-3'. التسلسل المسطر هو تكملة عكس SXL البروتين ملزمة الموقع، بالإضافة إلى النيوكليوتيدات إضافية خارج الموقع الملزمة التي توفر عناصر مفيدة تؤكد أن ليس كل تغيير في الجيش الملكي النيبالي يؤثر ملزمة، كما يتم تحميل عناصر التحكم مقارنة وتطبيع النيوكليوتيدات داخل الموقع ملزم. تسلسل الموقع ملزم SXL أوووووجووجوووووووو، وموجودة في محول مرناً قبل14،15،،من1617، استخدمت لوضع المنهجية المقترحة. تسلسل بالخط المائل هو مكملة لتسلسل التمهيدي T7 والمروج T7 للنسخ في المختبر .

2-تجميع الجيش الملكي النيبالي

  1. توليف الحمض النووي الريبي في رد فعل نسخ 20 ميليلتر، كما هو موضح سابقا18.
    1. المخزن المؤقت للنسخ T7 ميكس و 1 ميكرومتر T7 اليغنوكليوتيد، 1 ميكرومتر يخدر اليغنوكليوتيد، ديثيوثريتول 10 ملم (DTT)، 2 مم غتب، 1 مم ATP الأداء النظري المركب، و UTP (جانسين، أدينوسين، سيتيديني، واردين ثلاثي) و 2 يو/ميليلتر T7 رنا بوليميراز.
    2. إضافة، في اثنين ميكروسينتريفوجي منفصلة أنابيب، الايثير ATP أو مم 0.05 α α-الايثير مم 0.167 UTP لإدماج الكشف فوسفوروثيواتيس (انظر الخطط في الشكل 2).
      ملاحظة: لبروتوكولات بديلة، إضافة 0.2 مم α-الايثير CTP أو 0.2 مم α-الايثير أنشئ لفعل نسخ مناسبة التي تحتوي على اليغنوكليوتيد مخدر لاختبار بدائل النوكليوتيدات المتبقيين.
    3. احتضان الخليط رد فعل توليف الحمض النووي الريبي ح 2 في 37 درجة مئوية.
  2. إضافة 2.5 ميليلتر الحرارة مجا الفوسفاتيز القلوية وميليلتر 2.5 10xphosphatase المخزن المؤقت إلى عينة الجيش الملكي النيبالي. احتضان هذا الرد 25 ميليلتر لمدة 10 – 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية لإزالة 5 ' الفوسفات.
  3. إلغاء تنشيط إنزيم الفوسفاتيز القلوية بتدفئة في 80 درجة مئوية لمدة 2-5 دقائق.
  4. راديولابيل 5 ' نهاية ديفوسفوريلاتيد الحمض النووي الريبي (5 بمولي) باستخدام 1 ميليلتر T4 بولينوكليوتيدي كيناز و 1 ميليلتر γ-32ف ATP في حجم رد فعل 10 ميليلتر. احتضان هذا المزيج رد فعل لمدة 30 – 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  5. إلغاء تنشيط إنزيم كيناز بولينوكليوتيدي T4 بتدفئة في 65 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة.
  6. هلام تطهير الجيش الملكي النيبالي بالتفريد في 10 ٪ يشوه جل بولياكريلاميدي. تحديد موقع الجيش الملكي النيبالي على الجل أوتوراديوجرافي. المكوس جل الشريحة التي تحتوي على الحمض النووي الريبي راديولابيليد وسحق في أنبوب ميكروسينتريفوجي بالضغط على الجدران مع تلميح ماصة، ونقع في المخزن المؤقت ك (PK) البروتيناز (100 مم تريس، درجة الحموضة 7.5، 12.5 مم يدتا، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1% الصوديوم دوديسيل كبريتات). قم بتدوير الأنبوب في درجة حرارة الغرفة من 2 (ح) بين عشية وضحاها.
  7. الطرد المركزي الملاط جل وتجاهل الجل وجمع الحل المخزن المؤقت.
  8. استخراج الحل مرتين مع تساوي حجم الفينول كلوروفورم ومرة مع كلوروفورم وجمع المرحلة مائي.
  9. إضافة إلى أن حجم المرحلة المائية 0.1 م 3 خلات الصوديوم، 5.2 درجة الحموضة، حاملة الحمض الريبي النووي النقال أو الجليكوجين، وحجم 2.5 من الإيثانول. الاحتفاظ العينة في-80 درجة مئوية ح 1.
  10. الطرد المركزي العينة لمدة 5 – 10 دقيقة في ميكروسينتريفوجي سرعة عالية في س 16,873 ز. إزالة الحل المخزن المؤقت/الإيثانول بعناية دون إزعاج بيليه الجيش الملكي النيبالي.
  11. أغسل بيليه مع الإيثانول 70% والطرد المركزي على الإيثانول إزالة 2 – 5 دقيقة بعناية. بيليه في الهواء الجاف.
  12. ريسوسبيند بيليه في 20 – 50 ميليلتر إثيل بيروكاربوناتي (ديبك)-المياه المعالجة. تخزين في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات مع الحمض النووي الريبي راديولابيليد استخدام الاحتياطات المناسبة ودرع شبكي للحماية من الإشعاع. في الوقت الحاضر، هي أعمدة الدوران أكثر شيوعاً وأكثر ملاءمة لإزالة الإشعاع الفردية، كبديل لتنقية جل من الجيش الملكي النيبالي.

3-البروتين ملزمة الرد وفصل من الجيش الملكي النيبالي منضم

  1. التعبير عن البروتين المؤتلف في وتنقية من كولاي.
  2. تقدير تركيز البروتين المؤتلف كانت أو فصل في جل الحزب الديمقراطي الصربي-polyacrylamide جوار بروتين معروفة القياسية، والبقر ألبومين مصل (BSA). تمثيل البروتين الفائدة وجيش صرب البوسنة الموحدة تلطيخ الجل مع R-250 "أخذ الزرقاء الرائعة". كوانتيتاتي البروتين بالمقارنة مع كميات معروفة لتخفيف جيش صرب البوسنة على جل نفسه.
    ملاحظة: تخزين البروتين المؤتلف في-80 درجة مئوية وحتى الاستخدام وتمييع في 20 مم 4-(2-هيدروكسيثيل) الببرازين-1-اثانيسولفونيك حامض (حبيس)، الرقم الهيدروجيني 8.0، ديثيوثريتول 1 مم (DTT)، 0.2 مم حمض الإيثيلين (يدتا)، 0.05% NP-40، 20% والغليسيرول. استخدام 0.5 – 1.0 مم فينيلميثاني مثبط البروتياز فلوريد السلفونيل (بمسف) اختياري.
  3. القيام برد فعل ملزم الحمض النووي الريبي (20 – 100 ميليلتر) في 10 ملم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 1 مم DTT، 50 مم بوكل، 0.5 مثبط رناسي وحدات/ميليلتر، 0.09 ميكروغرام/ميليلتر أسيتيلاتيد ألبومين المصل البقري، 1 مم يدتا، 0.15 ميكروغرام/ميليلتر الحمض الريبي النووي النقال والجيش الملكي النيبالي 5 '-نهاية راديولابيليد ميليلتر 6 التركيز المناسب (أ التركيز الذي يربط ~ 50% من الحمض النووي الريبي للبروتين) من البروتين.
    ملاحظة: يعمل هذا المخزن المؤقت ملزم لثلاثة الحمض النووي الريبي – ملزم البروتينات (SXL، U2AF65، و PTB)، ولكن يجب أن تكون موحدة وتين فائدة. تقدير تركيز البروتين تجريبيا، استخدام تخفيف مختلفة لإعداد بروتين معين، ما هو مطلوب للحصول على ما يقرب من 50 ٪ ملزمة الجيش الملكي النيبالي. ويمثل هذا الشرط أو كد الجزء الأكثر حساسية من المنحنى ملزم الجيش الملكي النيبالي.
  4. تبني رد فعل ملزم البروتين لمدة 20-30 دقيقة عند 25 درجة مئوية (أو على الجليد).
  5. فصل الكسر الحمض النووي الريبي البروتين زمنياً من الكسر غير منضم باستخدام واحد من هذين النهجين:
    1. تصفية النيتروسليلوز ملزمة
      1. تطبيق رد فعل ملزم (20 – 100 ميليلتر) على عامل تصفية النيتروسليلوز متصلاً مشعب فراغ في درجة حرارة الغرفة.
        ملاحظة: فقط مجمع الجيش الملكي النيبالي بالبروتين هو الإبقاء على عامل تصفية وغير منضم الحمض النووي الريبي التدفقات من خلال عامل تصفية. نهج ربط عامل تصفية يسمح استرداد أعلى من الجيش الملكي النيبالي المنضم وهو أسرع وأبسط، مقارنة بمقايسة تحول التنقل هلام. عن طريق وضع غشاء دي تحت التصفية النيتروسليلوز من الممكن أيضا جمع الكسر الحمض النووي الريبي غير منضم أو مجاناً الحمض النووي الريبي للمقارنة مع الكسر منضم.
      2. قص جزء تصفية النيتروسليلوز التي تحتوي على يحتفظ الجيش الملكي النيبالي المشعة إلى أجزاء أصغر لتناسب في أنبوب ميكروسينتريفوجي، نقع في كافية من المخزن المؤقت PK (300 – 500 ميليلتر تحتوي على 10 – 20 ميكروغرام PK) أن تزج القطع عامل التصفية، والوت الجيش الملكي النيبالي من عامل التصفية 2 – 3 ح أو بين عشية وضحاها.
      3. استخراج مع الفينول-كلوروفورم، كلوروفورم، وجمع المرحلة مائي. إضافة خلات الصوديوم والإيثانول، وبعد حضانة في الثلاجة، الطرد المركزي، ويغسل، الجافة وريسوسبيند الجيش الملكي النيبالي في المياه المعالجة ديبك. اتبع الخطوات كما هو مفصل في خطوات 2.10 إلى 2.14 أعلاه.
    2. تحول التنقل هلام
      1. إعداد وبلمره هلام polyacrylamide أصلية 5% (شاهقا Acrylamide:bis-اكريلاميد) في 0.5 x TBE (من المخزن المؤقت تريس-بورات-يدتا القياسية) قبل البدء في رد فعل ملزم، كبديل لأسلوب ربط عامل تصفية.
      2. قبل تشغيل هلام لمدة 15 دقيقة على 250 الخامس في غرفة باردة (4 درجات مئوية).
      3. تحميل كل رد فعل ملزم (أعلاه) في آبار منفصلة من جل ما قبل التشغيل أعلاه.
        ملاحظة: يوفر المخزن المؤقت تخزين البروتين والغليسيرول كافية لتحميل عينة في الآبار.
      4. فصل الجيش الملكي النيبالي البروتين مرتبط بالتفريد جل في غرفة باردة في 250 الخامس ح 1 إلى 2، تبعاً لحجم الجيش الملكي النيبالي والبروتين محددة.
      5. تحديد موقع مجمع الجيش الملكي النيبالي بالبروتين على الجل من أوتوراديوجرافي. المكوس جل الشريحة التي تحتوي على مجمع الجيش الملكي النيبالي بالبروتين. الوت الجيش الملكي النيبالي من شريحة هلام بسحق شريحة جل ونقع في المخزن المؤقت لكية.
      6. استخراج مع الفينول-كلوروفورم، كلوروفورم، وجمع المرحلة مائي. إضافة خلات الصوديوم والإيثانول، وبعد حضانة في الثلاجة، الطرد المركزي، يغسل، الهواء الجاف، وريسوسبيند الجيش الملكي النيبالي في المياه المعالجة ديبك. اتبع الخطوات كما هو مفصل في خطوات 2.10 إلى 2.14 أعلاه.

4-تحليل المنتجات فوسفوروثيواتي المشقوق اليود للكشف عن مواقع النوكليوتيدات متحولة

  1. إضافة اليود 1 مم في 20 ميليلتر ديبك معاملة المياه التي تحتوي على يصل إلى 10 ميكروغرام الناقل الحمض الريبي النووي النقال تهزم الكشف (الكشف التام وغير المنضمة) في مواقع فوسفوروثيواتي التأسيس. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: مزيد من التفاصيل عن انشقاق اليود مع ظروف مختلفة قليلاً-إيودوثانول 7% (v/v)، تدفئة في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق — يمكن العثور في غيش & اكستين 198819.
  2. يعجل رنا ملصوق بإضافة خلات الصوديوم/الإيثانول، كما هو موضح أعلاه. ريسوسبيند بصبغة تحميل ليشوه المواد الهلامية. الحرارة وتحميل عينة لفصل الأجزاء رنا بالتفريد في جل polyacrylamide يشوه 15 – 20%.
  3. كشف جل polyacrylamide لأفلام الأشعة سينية.
  4. الكشف عن عصابات في الكسر منضم مقابل مجموع تجمع باستخدام أوتوراديوجرافي.
    ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات مع اليود في غطاء عادم. لفصل الحمض النووي الريبي هو موضح هنا، يعمل جل على شكل آسفين، الذي يتحقق من خلال مضاعفة سمك الفواصل كلا في الجزء السفلي من لوحات جل بإدخال فاصلة إضافية بوصة طويلة في الجزء السفلي من الجل. ويسمح هذا الشكل مزيد من التباعد موحدة أو أوثق بين الأجزاء رنا أقصر. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام فوسفوريماجير بدلاً من أفلام الأشعة السينية للكشف عن وكوانتيتيشن للنشاط الإشعاعي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مبدأ الطفرات التشبع باستخدام المنشطات:

لنسبة مولى مناسبة البرية من نوع وغيرها النيوكليوتيدات، استخدم خليط متساو من النيوكليوتيدات الأربعة جميع إلا إذا كان موقف واحد يتم تحليلها. ومع ذلك، إذا كان يتم تحليل مواقف متعددة في نفس الوقت، يجب تعديلها النسبة من نوع غير البرية إلى البرية من نوع النيوكليوتيدات، أي خفض. خلاف ذلك، بالإضافة إلى استبدال واحد، الذي هو المطلوب، كما سيكون هناك قوالب مع متعددة-نوع البرية النيوكليوتيدات في جزيء، النافية لتحليل أثر استبدال واحد-النوكليوتيدات. وبالتالي، وكقاعدة عامة، استخدام نسبة من نوع غير البرية إلى النيوكليوتيدات البرية من نوع من 1/n, حيث n هو عدد المواقع يتم تحليلها. هنا، قمنا بتحليل 10 مواقع في وقت واحد وتستخدم خليط يحتوي على 90% النوكليوتيدات البرية من نوع و 10% من النوكليوتيدات-نوع البرية لتعاطي المنشطات في قالب الحمض النووي. تتم نسخ منفصلة من ردود الفعل، التي تتم كل رد فعل النسخ مع واحد من فوسفوروثيواتيس الأربعة. وهكذا، ترصد رد فعل كل من النوكليوتيدات محددة في مواقف مخدر.

مبدأ التقسيم بسبب التدخل:

في نهج الطفرات المعروضة هنا، يكون الكشف في متوسط أقل من واحد من بقايا فوسفوروثيواتي كل جزيء. أثناء عملية الربط، وقسم جزيئات الحمض النووي الريبي بين الكسر البروتين زمنياً والكسر غير منضم. نظراً لارتباط النوكليوتيدات خاص بربط فوسفوروثيواتي، الانقسام وربط العمود الفقري فوسفوروثيواتي قراءات من وجود النوكليوتيدات محددة في هذا الموضع. ومن المتوقع أن عند تغيير النوكليوتيدات في أي موقف معين، فإنه قد يكون أما أي تأثير على الربط أو أنها قد تمنع ملزمة، جزئيا أو كلياً. في حالة وجود النوكليوتيدات محددة له أي تأثير على الربط سوف القسم التساوي بين الكسور بروتين محدد وغير منضم. ومع ذلك، إذا النوكليوتيدات محددة في موضع محدد يتداخل مع البروتين ملزمة سيتم تفضيلي استبعاده من الكسر البروتين زمنياً. يمكن رصد درجة تدخل الكمية لكل من الوظائف في نفس رد الفعل بعد التفريد هلام. ويتضح هذا المفهوم في تخطيطي (الشكل 3). في مجموع الكسر الحمض النووي الريبي (لين تي)، كثافة الفرقة مساو تقريبا لجميع المواقف مخدر (النطاقات 1، 3 – 7). في ربط البروتين يسير الجيش الملكي النيبالي (لين ب)، في مواقف 1 و 4 و 7، النوكليوتيدات ليس له تأثير على الملزمة. لكن في مواقف 3 و 6، يتداخل مع الربط وهكذا مستبعد من الكسر منضم. في موقف 5، التدخل الجزئي. وهكذا، مقارنات من أربع حارات المزدوجة، تي وب لكل النوكليوتيدات، تتيح إجراء تحليل لجميع النيوكليوتيدات الأربعة. ينبغي أن يكون لاحظت أن النوكليوتيدات البرية من نوع لموقف معين يعكس التأثير، إذا كان أي من الكبريت في العمود الفقري الجيش الملكي النيبالي على البروتين ملزمة.

ويبين أوتوراديوجراف المصاحبة (الشكل 4) اثنين من أزواج (α-الايثير A و U α-الايثير) الممرات من هلام يشوه (T لتجمع إجمالي) وب للكسر منضم. يمكن إجراء العديد من الملاحظات عن طريق مقارنة الكثافة للعصابات في كل موقف بين كل زوج من الممرات (T و B). أولاً، أن غالبية الإشارة من أعلى من الجل، أي، أونكليفيد المنتج، لكلا α-الايثير ممر يو لين و α-الايثير. ثانيا، للممرات زوج أ α-الايثير، عدة فرق (اليود الانقسام والمنتجات) متطابقة بين ربط والكسور الجيش الملكي النيبالي إجمالي العصابات على سبيل المثال أعلاه 1؛ يتم ترقيم العصابات ذات الصلة داخل الموقع ملزم ل α-الايثير ممر للرجوع إليها. ثالثا، العصابات في الجزء السفلي من الجل هم أكثر عن كثب متباعدة (مثلاً، عصابات أدناه 6) من المعتاد لجل تسلسل. ورابعاً، عدة فرق موجودة في كسر الجيش الملكي النيبالي إجمالي لكن غائبة أو انخفاض كبير في كسر الجيش الملكي النيبالي منضم (مثل النطاقات 1، 2، 3، و 5). خامسا، لزوج لين يو α-الايثير، بينما معظم العصابات قابلة للمقارنة بين الممرات المجموع وملزمة، بعض نطاقات نسبيا أقل كثافة في الكسر منضم (مثل عصابات 7 و 8).

هذه الملاحظات تقدم أدلة للتنمية الناجحة لهذا الأسلوب الجديد ويؤدي إلى الاستنتاجات التالية: أولاً، لزوج α-الايثير A زوج الممرات وش α-الايثير الممرات، لأن معظم من الجيش الملكي النيبالي أونكليفيد، يقدم أدلة إلا نسبة ضئيلة من الجيش الملكي النيبالي ويتضمن تعديل أو بقايا فوسفوروثيواتي. هذا أمر مهم لأنه أيقن أن جزيئات الرنا تحتوي على بقايا فوسفوروثيواتي لا يزيد عن واحد. كثافات الثانية، مماثلة أو مشابهة لعصابات عدة خارج موقع الربط بين مسارين، أجل α-الايثير A و U α-الايثير، تبين أن تحميل قابلة للمقارنة للممرات على حد سواء، مما يتيح سهولة المقارنة بين الممرات. وتتحقق العصابات أكثر المتقاربة، والثالث، ل α-الايثير A و U α-الايثير، لشكل الاسفين جل (أرق أعلى وأكثر سمكا في الأسفل)، مما يسمح بالتحليل ما يلي تسلسل أطول وتقدم دقة أعلى. بشكل عام، متباعدة شظايا أقصر على نطاق أوسع في جل مع سمك موحد. رابعا، اختفاء أو انخفاض كثافة بعض العصابات في الكسر المنضم يشير إلى أن النوكليوتيدات نوع البرية غير تفضيلي مستبعدة من الكسر منضم (α-الايثير A). الكثافات النسبية من نطاقات مختلفة داخل الممر منضم كما توفر معلومات كمية عن مدى تدخل من المخلفات غير نوع البرية في مواقع مختلفة. وبعبارة أخرى، متحولة أو النيوكليوتيدات-نوع البرية في مواقف معينة تتداخل مع البروتين ملزمة. وأخيراً، اختبار تأثير استبدال الكبريت العمود الفقري (فوسفوروثيواتي) في واحد من أوكسيجينس غير سد (ش α-الايثير)، يوضح أن ثلاثة مواقع لإظهار آثار طفيفة من العمود الفقري سولفورس (مثلاً، 6 و 7 و 7 أدناه). إظهار النتائج التي توصلنا إليها مجتمعة أن عدة مناصب داخل موقع الربط تظهر اختفاء تفضيلية أو تخفيض كثافات نطاقات محددة في الكسر منضم. هذا سبب استبدال قاعدة بدلاً من العمود الفقري، مما يشير إلى تفاعلات البروتين مع القواعد المحددة في الموقع ملزم (α-الايثير A). ومن ناحية أخرى، إدراج C α-الايثير يظهر نمط تدخل قابلة للمقارنة إلى α-الايثير ألف فقط 3-4 α-الايثير ز استبدالات تظهر صغيرة ولكن تدخل يمكن كشفها تتمحور حولها، وعلى سبيل المثال، مواقع ذات تعداد رقمي 2 و 3 (البيانات لا تظهر). وقد استخدمت هذه الطريقة للكشف عن الاختلافات في كيفية ربط قامع الربط SXL وعامل الربط العام U2 سنرنب "عامل مساعد" (U2AF65) تسلسل إشارة الربط مرناً قبل متطابقة (بوليبيريميديني-المسالك) بطريقة متميزة15 .

Figure 1
رقم 1: خطوات الرسم البياني للمفتاح في الطفرات فوسفوروثيواتي (PTM). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: التخطيطي لربط النيوكليوتيدات اثنين، التي يمكن أن تكون المشقوق كيميائيا باليود فوسفوروثيواتي. ويحل محل الكبريت واحدة من أوكسيجينس فوسفات غير سد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: مبدأ التقسيم بسبب التدخل. رنا افتراضية تحتوي على الممثل α-الايثير النيوكليوتيدات في ست وظائف، بما في ذلك موقع البروتين ملزمة. بعد ربط البروتين، هو المشقوق الجيش الملكي النيبالي في مواقع فوسفوروثيواتي التأسيس باليود. يتم ترقيم المواقف 1-7 داخل وحول موقع الربط تعسفاً للإشارة في النص. موقف 2 الفرقة مفقود أو يمثل لا إدماج فوسفوروثيواتي أو غير يخدر النوكليوتيدات. تي لين هو مجموع الجيش الملكي النيبالي ولين ب رنا البروتين زمنياً. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: فوسفوروثيواتي الطفرات (PTM) نهج يسمح الطفرات تشبع من بوليبيريميديني-المسالك/3 ' لصق الموقع الحالي في المحولات قبل-مرناً- تي لين هو مجموع الجيش الملكي النيبالي ولين ب رنا البروتين زمنياً. Α-الايثير يمثل الحمض النووي الريبي توليفها حضور ATP α-الايثير، ويحدد مواقف مخدر مع أدينوسينيس α-الايثير في التسلسل. ثلاثة نطاقات قوية تتوافق مع أدينوسينيس في التسلسل في تلك المناصب. ش α-الايثير يمثل الحمض النووي الريبي توليفها حضور UTP α-الايثير، ويحدد جميع أوريدينيس، بما في ذلك المناصب مخدر، في التسلسل. خط عمودي على اليسار يمثل الموقع ملزم SXL. يتم ترقيم مواقف 1-8 ضمن الموقع ملزم للأغراض المرجعية، وتيسيرا لوصف في مقطع النتائج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الطفرات منذ فترة طويلة تستخدم لوصف مواقع ربط بروتين. أولاً، يمكن تبني سلسلة من طفرات واختبار فردي في ملزمة فحوصات لتحليل آثارها على ملزمة تقارب. بينما يقدم نهجاً الطفرات قياسية طريقة لتحليل عدة سلاسل، خطوات متعددة تشترك في نهج قياسية، مثل تشييد طفرات وأداء سلسلة ملزما ردود الفعل لكل متحولة وشاقة وتستغرق وقتاً طويلاً وقد لا تسمح الطفرات التشبع، خاصة بالنسبة لتسلسل أطول. ثانيا، يمكن أن تكون عشوائية تسلسل والتجمع تستخدم لدورات متعددة للربط وبوليميريز سلسلة ردود الفعل التضخيم (PCR). وسيكون هذه التسلسلات التي تربط البروتين المستنسخة ومتسلسلة لتحديد والتحقق من صحة موقع ربط من التسلسل إلى توافق في الآراء. ومع ذلك، هذا الخيار ملزمة والتضخيم تكرارية ينطوي على خطوات متعددة وشاقة في تحديد بقايا هامة داخل الموقع ملزم. وعلاوة على ذلك، قد يعرض تسلسل المتكررة إيضاحات مسهبة الملازمة لبكر التحيز القائم على التسلسل. ثالثا، يمكن متسلسلة تسلسل محدد من تجمع عشوائي باستخدام خيار أسرع من تسلسل عالية الإنتاجية، على الرغم من أنها مكلفة نسبيا. ولذلك، التغلب على هذه القيود لعدة خطوات، أساليب شاقة و/أو باهظة الثمن، ونحن استنباط أسرع، وغير مكلفة، والأهم من ذلك أسلوب خطوة واحدة, الموضحة هنا، لتحقيق الطفرات التشبع من موقع الربط (PTM).

وتشمل الخطوات الرئيسية في هذا النهج تحديد أو وضع علامات على nucleotide(s) غير-نوع البرية. ونحن النيوكليوتيدات فوسفوروثيواتي، في أي واحد من أوكسيجينس في الفوسفات يتم استبدال العمود الفقري مع الكبريت، وصف (الشكل 2). الميزة أنه يمكن استخدام اليود تنشق العمود الفقري النوكليوتيدات فوسفوروثيواتي كيميائيا. وهكذا يولد الانقسام اليود من الركازة الجيش الملكي النيبالي الذي يحتوي على العمود الفقري فوسفوروثيواتي سلم التسلسل من نوع، حيث موقع الانقسام ووكيل أو علامة لوجود واحدة من الأربعة قواعد في هذا الموضع. يحدد مقارنة الكسور غير منضم ومجموع المخلفات التي تستثني تفضيلي من الكسر المنضم، وبالتالي فهي هامة للبروتين ملزمة. على النقيض من ذلك، تظل البقايا التي ليست مهمة لربط الموزعة على قدم المساواة بين الكسور اثنين. يمكن استخدام هذا النهج لتحديد مواقع الربط لأي بروتين ملزمة الجيش الملكي النيبالي.

ويوفر هذا النهج الطفرات تشبع خطوة واحدة، الجمع بين تعاطي المنشطات، فوسفوروثيواتيس، والانقسام واليود، باختصار، وسيلة قوية لوصف أي موقع الربط في الجيش الملكي النيبالي. ومع ذلك، يتطلب هذا النهج أن الموقع الملزم هو معروف بالفعل قبل الطفرات. وعلاوة على ذلك، يلزم شروط البروتين – الربط الأمثل لكل البروتين. الاحتياطات التالية تحتاج إلى تأكيد. يجب أن تمارس الاحتياطات للتعامل مع الحمض النووي الريبي، مثل ارتداء القفازات، وإعداد الحلول والمخازن المؤقتة في المياه المعالجة ديبك، نصائح ماصة التعقيم وأنابيب، وتكريس المعدات للجيش الملكي النيبالي تستخدم فقط لتجنب رنسيس. وبالمثل، الرعاية التي تنطوي على الدروع الإشعاعية، المشعة الرصد أثناء استخدام المواد المشعة أمر ضروري، واستخدام غطاء العادم أثناء استخدام المواد الكيميائية الخطرة ضرورية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن المؤلف لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

المعاهد الوطنية للصحة لتمويل الماضية وذلك بفضل مقدم البلاغ وذلك بفضل مايكل ر الأخضر لتوليف النوكليوتيد.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Uridine 5’ a-thio triphosphate NEN (Boston, Massachusetts) NLP-017
Adenosine 5’ a-thio triphosphate NEN (Boston, Massachusetts) NLP-016
Vacuum manifold Fisher Scientific XX1002500 Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter
Vacuum manifold Millipore XX2702552 1225 Sampling Vacuum Manifold
Nitrocellulose Millipore HAWP
Nitrocellulose Schleicher & Schuell PROTRAN
Dephosphorlyation Kit NEB M0508
T4 Polynucleotide Kinase NEB M0201S
Proteinase K NEB P8107S
T7 RNA polymerase NEB M0251S
RNasin Promega RNase inhibitor
Glass Plates Standard Standard
Gel Electrophoresis equipment Standard Standard
X-ray films Standard Standard
Polyacrylamide gel solutions Standard Standard

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schutt, C., Nothiger, R. Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects. Development. 127, (4), 667-677 (2000).
  2. Mahowald, A. P., Wei, G. Sex determination of germ cells in Drosophila. Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).
  3. Steinmann-Zwicky, M. How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm. Bioessays. 14, (8), 513-518 (1992).
  4. Salz, H. K. Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary. Fly (Austin). 7, (1), 3-7 (2013).
  5. Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline. Embo J. 25, (6), 1263-1272 (2006).
  6. Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins. PLoS One. 2, (6), e520 (2007).
  7. Samuels, M. E., et al. RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo. Mol. Cell. Biol. 14, (7), 4975-4990 (1994).
  8. Fujii, S., Amrein, H. Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology. EMBO J. 21, (20), 5353-5363 (2002).
  9. Kelley, R. L., et al. Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila. Cell. 81, (6), 867-877 (1995).
  10. Hager, J., Cline, T. Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination. Development. 124, (24), 5033-5048 (1997).
  11. Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B. Dev Biol. 253, (2), 214-229 (2003).
  12. Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary. Genetics. 182, (1), 121-132 (2009).
  13. Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (24), 9465-9470 (2012).
  14. Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268, (5214), 1173-1176 (1995).
  15. Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal. RNA. 6, (6), 901-911 (2000).
  16. Sakashita, E., Sakamoto, H. Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection. Nucleic Acids Res. 22, (20), 4082-4086 (1994).
  17. Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA. EMBO J. 14, (18), 4530-4539 (1995).
  18. Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).
  19. Gish, G., Eckstein, F. DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry. Science. 240, (4858), 1520-1522 (1988).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics