एक उपंयास संतृप्ति Mutagenesis दृष्टिकोण: आरएनए में नियामक प्रोटीन बाध्यकारी साइटों के एकल चरण लक्षण वर्णन Phosphorothioates का उपयोग

Genetics

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Summary

प्रोटीन कि विशिष्ट आरएनए अनुक्रम बांध जीन अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । इन बाध्यकारी साइटों की विस्तृत लक्षण वर्णन जीन विनियमन की हमारी समझ के लिए महत्वपूर्ण है । यहां, आरएनए में प्रोटीन-बाइंडिंग साइटों की संतृप्ति mutagenesis के लिए एक एकल कदम दृष्टिकोण का वर्णन किया गया है । यह दृष्टिकोण सभी प्रोटीन-आरएनए में बाध्यकारी साइटों के लिए प्रासंगिक है ।

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Singh, R. A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates. J. Vis. Exp. (138), e57816, doi:10.3791/57816 (2018).

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Abstract

जीन विनियमन विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । कई डीएनए और आरएनए-बंधन प्रोटीन जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए उच्च विशिष्टता के साथ अपने लक्ष्य दृश्यों बांध । ये विनियामक प्रोटीन जीन अभिव्यक्ति को या तो डीएनए (प्रतिलेखन) के स्तर पर या आरएनए के स्तर (प्री-mRNA ब्याह, polyadenylation, mRNA ट्रांसपोर्ट, क्षय और अनुवाद) पर नियंत्रण करते हैं । विनियामक अनुक्रम की पहचान को समझने में मदद करता है न केवल कैसे एक जीन चालू या बंद है, लेकिन यह भी जो नीचे की ओर जीन एक विशेष नियामक प्रोटीन द्वारा विनियमित रहे हैं । यहां, हम एक एक कदम दृष्टिकोण है कि आरएनए में एक प्रोटीन बंधन साइट के संतृप्ति mutagenesis की अनुमति देता है का वर्णन । यह डोपिंग के साथ डीएनए टेम्पलेट शामिल है गैर-जंगली-प्रकार न्यूक्लियोटाइड के भीतर बाइंडिंग साइट, प्रत्येक phosphorothioate न्यूक्लियोटाइड के साथ अलग RNAs के संश्लेषण, और प्रोटीन के साथ बाध्य अंश निम्नलिखित मशीन के अलगाव. गैर से हस्तक्षेप-जंगली-प्रकार न्यूक्लियोटाइड प्रोटीन से बाध्य अंश से उनके तरजीही अपवर्जन में परिणाम । यह phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis या PTM) युक्त phosphodiester बांड के आयोडीन के साथ चयनात्मक रासायनिक दरार निम्नलिखित जेल ट्रो द्वारा निगरानी की जाती है. इस एकल कदम संतृप्ति mutagenesis दृष्टिकोण आरएनए में किसी भी प्रोटीन बंधन साइट के लक्षण वर्णन करने के लिए लागू है ।

Introduction

जीन विनियमन जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । जीन प्रतिलेखन के स्तर पर विनियमित किया जा सकता है, पूर्व mRNA ब्याह, 3 ' अंत गठन, आरएनए निर्यात, अनुवाद, mRNA स्थानीयकरण, क्षय, पद-अनुवाद संशोधन/दोनों डीएनए-और आरएनए- बंधन प्रोटीन जीन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं विनियमन. जबकि आणविक आनुवंशिक विश्लेषण कई नियामक प्रोटीन की पहचान की है, उनमें से केवल एक छोटे सबसेट पूरी तरह से अपने सेलुलर कार्यों या vivo मेंबाध्यकारी साइटों के लिए विशेषता है । वंशावली अनुक्रम विश्लेषण और mutagenesis डीएनए या आरएनए-प्रोटीन बातचीत की विशेषता के लिए पूरक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं ।

आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन विकास प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण हैं, जिनमें यौन विभेद शामिल है । Drosophila प्रोटीन सेक्स घातक (SXL) या मास्टर सेक्स स्विच प्रोटीन पुरुषों में अनुपस्थित है, लेकिन महिलाओं में मौजूद है । यह uridine-रिच दृश्यों या न्यूक्लियोटाइड-बहाव पूर्व mRNA लक्ष्य (ट्रांसफार्मर, सेक्स घातक, और पुरुष विशिष्ट lethal2) में विशिष्ट ब्याह साइटों से सटे इलाकों पहचानता है दैहिक कोशिकाओं में1,2 ,3,4. इसके अलावा, यह uridine के लिए बाध्यकारी द्वारा polyadenylation साइट स्विचन-अमीर polyadenylation बढ़ाने के अनुक्रम को विनियमित (ई (नि.)) प्रलेख5,6। SXL की संभावना महिला germline में अतिरिक्त लक्ष्य है कि1,7,8,9,10,11की पहचान की जा रह नियंत्रित करता है, 12 , 13.

आमतौर पर, एक बाध्यकारी साइट के लक्षण वर्णन mutagenesis, उदाहरण के लिए, हटाने या एकल या एकाधिक न्यूक्लियोटाइड के प्रतिस्थापन द्वारा शामिल है । प्रत्येक उत्परिवर्ती बंधन साइट, जंगली प्रकार आरएनए अनुक्रम के सापेक्ष, तो ब्याज की प्रोटीन के लिए अपने बाध्यकारी संबध (Kd या संतुलन पृथक्करण स्थिरांक) निर्धारित करने के लिए प्रोटीन सांद्रता की एक श्रृंखला का उपयोग कर विश्लेषण किया जाता है; Kd प्रोटीन एकाग्रता के लिए ५०% आरएनए बाइंडिंग प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । विस्तृत mutagenesis की इस श्रम-गहन प्रक्रिया में कई म्यूटेंट का उत्पादन और विश्लेषण शामिल है — बाइंडिंग साइट में प्रत्येक स्थान के लिए तीन गैर-जंगली प्रकार न्यूक्लियोटाइड । इस प्रकार, वहां तेज, सरल, और शाही सेना में प्रोटीन बाध्यकारी साइटों की सस्ती संतृप्ति mutagenesis के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के लिए एक की जरूरत है ।

यहां, हम एक एक कदम दृष्टिकोण है कि आरएनए में एक प्रोटीन बंधन साइट के संतृप्ति mutagenesis की अनुमति देता है का वर्णन । यह डोपिंग के साथ डीएनए टेम्पलेट शामिल है गैर-जंगली-प्रकार न्यूक्लियोटाइड के भीतर बाइंडिंग साइट, प्रत्येक phosphorothioate न्यूक्लियोटाइड के साथ अलग RNAs के संश्लेषण, और प्रोटीन के साथ बाध्य अंश निम्नलिखित मशीन के अलगाव. गैर से हस्तक्षेप-जंगली-प्रकार न्यूक्लियोटाइड प्रोटीन से बाध्य अंश से उनके तरजीही अपवर्जन में परिणाम । यह phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis या PTM) युक्त phosphodiester बांड के आयोडीन के साथ चयनात्मक रासायनिक दरार निम्नलिखित जेल ट्रो द्वारा निगरानी की जाती है. इस एकल कदम संतृप्ति mutagenesis दृष्टिकोण आरएनए में किसी भी प्रोटीन बंधन साइट के लक्षण वर्णन करने के लिए लागू है ।

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Protocol

नोट: चित्रा 1 phosphorothioate mutagenesis का एक सिंहावलोकन प्रदान करता है और इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम संक्षेप ।

1. म्यूटेंट के एक पुस्तकालय की पीढ़ी-गैर जंगली प्रकार न्यूक्लियोटाइड के साथ डोपिंग डीएनए टेम्पलेट

  1. एक डीएनए सिंथेसाइज़र पर रासायनिक संश्लेषण द्वारा T7 प्राइमर (5 '-GTAATACGACTCACTATAG-3 ') संश्लेषित ।
  2. प्रोटीन बाइंडिंग साइट के लिए इसी पर एक डीएनए सिंथेसाइज़र पर रासायनिक संश्लेषण द्वारा एक मैगनीज oligonucleotide (पूरक किनारा) संश्लेषित । डोपिंग के प्रत्येक साइट के लिए रासायनिक संश्लेषण के दौरान phosphoramidites के एक उपयुक्त मिश्रण का उपयोग करें (नीचे X) ९०% के अनुपात के साथ एक के रूप में जंगली प्रकार न्यूक्लियोटाइड और गैर के रूप में 10% टी जंगली प्रकार न्यूक्लियोटाइड (इस अनुपात पर और अधिक विस्तार के लिए प्रतिनिधि परिणाम देखें) ।
    नोट: यहां पर मैगनीज oligonucleotide की परिक्रमा 5 '-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGसीसीCTATAGTGAGTCGTATTAC-3 ' है । रेखांकित अनुक्रम SXL प्रोटीन बंधन साइट के रिवर्स पूरक है, साथ ही बाध्यकारी साइट है कि उपयोगी नियंत्रण प्रदान करने के बाहर अतिरिक्त न्यूक्लियोटाइड है कि आरएनए में हर परिवर्तन बाध्यकारी को प्रभावित करता है, साथ ही साथ के लिए नियंत्रण लोड किया जा रहा है बाइंडिंग साइट के भीतर न्यूक्लियोटाइड की तुलना और सामान्यीकरण. SXL-बाइंडिंग साइट अनुक्रम UUUUUGUUGUUUUUUUU, जो ट्रांसफार्मर पूर्व में मौजूदहै mRNA14,15,16,17, प्रस्तावित कार्यप्रणाली को ईजाद करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । इटैलिक्स में अनुक्रम T7 प्राइमर अनुक्रम के पूरक है और इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए T7 प्रमोटर है ।

2. आरएनए का संश्लेषण

  1. एक 20 µ एल प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में संश्लेषण आरएनए, पहले18वर्णित के रूप में.
    1. मिश्रण T7 प्रतिलेखन बफर आणि १ µ मी T7 oligonucleotide, 1 µ मीटर मैगनीज oligonucleotide, 10 एमएम dithiothreitol (डीटीटी), 2 एमएम GTP, 1 एमएम प्रत्येक एटीपी, CTP, और UTP (guanosine, adenosine, cytidine, और uridine ट्राइफॉस्फेट), और 2 यू/µ एल T7 आरएनए पोलीमरेज़ ।
    2. जोड़ें, दो अलग microcentrifuge ट्यूबों में, ०.१६७ मिमी α-thio एटीपी या ०.०५ मिमी α-thio UTP शामिल करने के लिए phosphorothioates ( 2 चित्रमें योजनाबद्ध देखें) RNAs में.
      नोट: वैकल्पिक प्रोटोकॉल के लिए, जोड़ें ०.२ mm α-thio CTP या ०.२ mm α-thio GTP एक उचित प्रतिलेखन प्रतिक्रिया करने के लिए दो शेष oligonucleotide प्रतिस्थापन परीक्षण करने के लिए एक मैगनीज न्यूक्लियोटाइड युक्त ।
    3. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए आरएनए संश्लेषण प्रतिक्रिया मिश्रण गर्मी ।
  2. आरएनए नमूना करने के लिए २.५ µ एल हीट-labile alkaline फॉस्फेट और २.५ µ एल 10xphosphatase बफर जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 10-30 मिनट के लिए इस 25 µ एल प्रतिक्रिया मशीन 5 ' फॉस्फेट को दूर करने के लिए ।
  3. 2-5 मिनट के लिए ८० ° c पर हीटिंग द्वारा alkaline फॉस्फेट एंजाइम को निष्क्रिय ।
  4. Radiolabel 5 ' अंत dephosphorylated आरएनए (5 pmole) का उपयोग कर 1 µ l टी-4 polynucleotide कळेनासे और 1 µ l γ-३२P एटीपी एक 10 µ l प्रतिक्रिया मात्रा में. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30-60 मिनट के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण की मशीन ।
  5. 20-30 मिनट के लिए ६५ ° c पर हीटिंग से टी-4 polynucleotide कळेनासे एंजाइम को निष्क्रिय ।
  6. जेल एक 10% denaturing polyacrylamide जेल में ट्रो द्वारा आरएनए शुद्ध । autoradiography द्वारा जेल पर आरएनए का पता लगाएँ । radiolabeled आरएनए युक्त जेल टुकड़ा एक्साइज, एक पिपेट टिप के साथ दीवारों के खिलाफ दबाकर एक microcentrifuge ट्यूब में क्रश, और proteinase कश्मीर (पीके) बफर (१०० मिमी Tris, पीएच ७.५, १२.५ मिमी EDTA, १५० मिमी NaCl, 1% सोडियम dodecyl सल्फेट) में भिगोने । रात को 2 घंटे से कमरे के तापमान पर ट्यूब घुमाएं ।
  7. जेल घोल केंद्रापसारक, जेल त्यागें और बफर समाधान इकट्ठा ।
  8. phenol-क्लोरोफॉर्म और क्लोरोफॉर्म के साथ एक बार के बराबर मात्रा के साथ दो बार समाधान निकालने और जलीय चरण इकट्ठा ।
  9. ०.१ 3m सोडियम एसीटेट, पीएच ५.२, वाहक tRNA या ग्लाइकोजन, और इथेनॉल के २.५ मात्रा की मात्रा जलीय चरण में जोड़ें । नमूना पर-८० ° c 1 एच के लिए रखें ।
  10. 5 के लिए नमूना केंद्रापसारक-10 मिनट में एक उच्च गति microcentrifuge में १६,८७३ x जी आरएनए गोली परेशान बिना बफर समाधान ध्यान से निकालें ।
  11. ७०% इथेनॉल के साथ गोली धो और 2 के लिए केंद्रापसारक-5 min. इथेनॉल सावधानी से निकालें । हवा में गोली सूखी ।
  12. 20 में गोली स्थगित-50 µ एल diethyl pyrocarbonate (DEPC)-इलाज पानी । उपयोग करने तक-20 ° c पर संग्रहीत करें ।
    नोट: रेडियोधर्मिता से बचाने के लिए उचित एहतियात और एक सामिल शील्ड का उपयोग कर radiolabeled आरएनए के साथ सभी कदम निष्पादित करें । वर्तमान में, स्पिन कॉलम और अधिक सामांयतः उपयोग किया जाता है और अधिक सुविधाजनक को हटाने के लिए एक विकल्प के रूप में, आरएनए के शोधन जेल ।

3. प्रोटीन बाध्यकारी प्रतिक्रिया और बाध्य आरएनए की जुदाई

  1. एक्सप्रेस में रिकॉमबिनेंट प्रोटीन और ई. कोलाईसे शुद्ध ।
  2. spectrophotometry द्वारा या एक ज्ञात प्रोटीन मानक, गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) के बगल में एक एसडीएस-polyacrylamide जेल में अलग करके रिकॉमबिनेंट प्रोटीन एकाग्रता का अनुमान लगाएं । Coomassie शानदार नीले आर-२५० के साथ जेल दाग द्वारा ब्याज और BSA मानक के प्रोटीन कल्पना । Quantitate एक ही जेल पर BSA कमजोर पड़ने की ज्ञात मात्रा की तुलना में प्रोटीन ।
    नोट: रिकॉमबिनेंट प्रोटीन पर-८० डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें और 20 मिमी 4 में पतला-(2-Hydroxyethyl) पिपेराजीन-1-ethanesulfonic एसिड (HEPES), पीएच ८.०, 1 मिमी dithiothreitol (डीटीटी), ०.२ मिमी Ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), ०.०५% NP-४०, 20% ग्लिसरॉल । 0.5 मिमी का उपयोग करें-phenylmethane sulfonyl फ्लोराइड (PMSF) का प्रयोग वैकल्पिक है ।
  3. 10 मिमी Tris-एचसीएल में आरएनए-बाध्यकारी प्रतिक्रिया (20-100 µ एल) प्रदर्शन, pH ७.५, 1 mm डीटीटी, ५० mm KCl, ०.५ यूनिट्स/µ l RNase अवरोध करनेवाला, ०.०९ µ g/µ l acetylated गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन, 1 mM EDTA, ०.१५ µ g/µ l tRNA, 5 '-समा radiolabeled आरएनए, और 6 µ l of उपयुक्त एकाग्रता (a एकाग्रता जिस पर ~ ५०% आरएनए प्रोटीन के लिए बाइंड कर देता है ।
    नोट: यह बाध्यकारी बफर तीन आरएनए के लिए काम करता है – बंधन प्रोटीन (SXL, U2AF६५, और PTB), लेकिन ब्याज की एक प्रोटीन के लिए मानकीकृत किया जाना चाहिए. अनुमान प्रोटीन एकाग्रता empirically, एक दिया प्रोटीन तैयारी के लिए विभिंन कमजोर पड़ने का उपयोग कर, कि लगभग ५०% आरएनए बाइंडिंग प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । यह स्थिति या Kd आरएनए-बाइंडिंग वक्र के सबसे संवेदनशील भाग का प्रतिनिधित्व करता है ।
  4. 20 के लिए प्रोटीन बाइंडिंग प्रतिक्रिया मशीन-30 मिनट में 25 डिग्री सेल्सियस (या बर्फ पर) ।
  5. दो तरीकों में से एक का उपयोग कर असीम अंश से प्रोटीन बंधे आरएनए भिन्न अलग:
    1. Nitrocellulose फ़िल्टर बाइंडिंग
      1. एक nitrocellulose फ़िल्टर कमरे के तापमान पर एक निर्वात कई गुना से जुड़ा पर बाध्यकारी प्रतिक्रिया (20-100 µ एल) लागू करें ।
        नोट: केवल आरएनए-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स फिल्टर के माध्यम से और असीम आरएनए बहती पर रखा जाता है । फिल्टर बाध्यकारी दृष्टिकोण बाध्य आरएनए के उच्च वसूली की अनुमति देता है और तेजी से और सरल है, जेल गतिशीलता पारी परख की तुलना में । nitrocellulose फिल्टर के नीचे एक डीएए झिल्ली रखकर यह भी असीम आरएनए भिन्न या बाध्य अंश के साथ तुलना के लिए मुक्त आरएनए इकट्ठा करने के लिए संभव है.
      2. एक microcentrifuge ट्यूब में फिट करने के लिए छोटे टुकड़ों में बनाए रखा रेडियोधर्मी आरएनए युक्त nitrocellulose फिल्टर के हिस्से में कटौती, फिल्टर टुकड़े को विसर्जित करने के लिए पर्याप्त PK बफर (300-500 µ एल युक्त 10 – 20 µ जी पीके) में भिगोने, और फिल्टर से elute आरएनए के लिए 2-3 ज या रात भर ।
      3. phenol-क्लोरोफॉर्म, क्लोरोफॉर्म के साथ निकालें, और जलीय चरण इकट्ठा । सोडियम एसीटेट और इथेनॉल जोड़ें और, फ्रीजर में गर्मी के बाद, केंद्रापसारक, धोने, सूखी और DEPC में आरएनए-इलाज पानी resuspend । चरणों में विस्तृत के रूप में २.१० से २.१४ ऊपर इन चरणों का पालन करें ।
    2. जेल गतिशीलता बदलाव
      1. तैयार और polymerize एक 5% देशी polyacrylamide जेल (60:1 Acrylamide: बीआईएस-Acrylamide) में 0.5 x TBE (मानक Tris-बोराटे-EDTA बफर) बाइंडिंग प्रतिक्रिया शुरू करने से पहले, फ़िल्टर बाइंडिंग विधि के लिए एक विकल्प के रूप में ।
      2. पूर्व एक ठंडे कमरे में २५० V पर 15 मिनट के लिए जेल चलाने (4 डिग्री सेल्सियस) ।
      3. ऊपर पूर्व चलाने के जेल के अलग कुओं में प्रत्येक बाध्यकारी प्रतिक्रिया (ऊपर) लोड ।
        नोट: प्रोटीन भंडारण बफर कुओं में नमूना लदान के लिए पर्याप्त ग्लिसरॉल प्रदान करता है ।
      4. एक ठंडे कमरे में २५० वी पर 1 से 2 ज, आरएनए आकार और विशिष्ट प्रोटीन पर निर्भर करता है के लिए जेल ट्रो द्वारा प्रोटीन से बंधे आरएनए अलग ।
      5. autoradiography द्वारा जेल पर आरएनए-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स की स्थिति का पता लगाएँ. आरएनए-प्रोटीन कॉम्प्लेक्स युक्त जेल स्लाइस एक्साइज. जेल टुकड़ा कुचल द्वारा जेल टुकड़ा से आरएनए Elute और पीके बफर में भिगोने ।
      6. phenol-क्लोरोफॉर्म, क्लोरोफॉर्म के साथ निकालें, और जलीय चरण इकट्ठा । सोडियम एसीटेट और इथेनॉल जोड़ें और, फ्रीजर में मशीन के बाद, केंद्रापसारक, धोने, हवा सूखी, और DEPC-इलाज पानी में आरएनए resuspend । चरणों में विस्तृत के रूप में २.१० से २.१४ ऊपर इन चरणों का पालन करें ।

4. के उत्परिवर्ती न्यूक्लियोटाइड पदों का पता लगाने के लिए आयोडीन-सट Phosphorothioate उत्पादों का विश्लेषण

  1. एक 20 µ एल DEPC-इलाज पानी में 1 मिमी आयोडीन जोड़ें 10 µ जी वाहक tRNA RNAs निगमन के स्थलों पर RNAs (सीमा और कुल phosphorothioate) सट करने के लिए युक्त । 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
    नोट: आयोडीन दरार पर अधिक विवरण के साथ थोड़ा अलग शर्तों-7% (v/iodoethanol, ९५ डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए हीटिंग-ङीष् और Eckstein १९८८19में पाया जा सकता है ।
  2. ऊपर वर्णित के रूप में सोडियम एसीटेट/इथेनॉल जोड़कर हाला सट आरएनए । denaturing जैल के लिए एक लोडिंग डाई में resuspend । एक 15 – 20% denaturing polyacrylamide जेल में ट्रो द्वारा आरएनए अंशों को अलग करने के लिए नमूना हीट और लोड करें ।
  3. एक एक्स-रे फिल्म के लिए polyacrylamide जेल बेनकाब ।
  4. autoradiography का उपयोग कर कुल पूल बनाम बाध्य अंश में बैंड का पता लगाने ।
    नोट: एक निकास हुड में आयोडीन के साथ सभी चरणों का प्रदर्शन । आरएनए जुदाई के लिए यहां दिखाया गया है, एक कील के आकार का जेल कार्यरत है, जो जेल के नीचे एक अतिरिक्त इंच लंबी स्पेसर डालने के द्वारा जेल प्लेटों के तल पर दोनों स्पेसर्स की मोटाई दोहरीकरण द्वारा हासिल की है । यह आकृति छोटी आरएनए अंशों के बीच अधिक समान या घनिष्ठ रिक्ति की अनुमति देती है. वैकल्पिक रूप से, एक phosphorimager का पता लगाने और रेडियोधर्मिता के quantitation के लिए एक्स-रे फिल्मों के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Representative Results

संतृप्ति mutagenesis के सिद्धांत डोपिंग का उपयोग:

जंगली प्रकार और अंय न्यूक्लियोटाइड के एक उचित दाढ़ अनुपात के लिए, सभी चार न्यूक्लियोटाइड के एक समान मिश्रण का उपयोग करें यदि केवल एक ही स्थिति का विश्लेषण किया जाना है । हालांकि, अगर एक साथ कई पदों का विश्लेषण कर रहे हैं, गैर जंगली प्रकार के न्यूक्लियोटाइड प्रकार के अनुपात को समायोजित किया जाना चाहिए, यानी, कम है । अंयथा, एकल प्रतिस्थापन है, जो वांछित है के अलावा, वहां भी एक अणु में कई गैर जंगली प्रकार न्यूक्लियोटाइड के साथ टेंपलेट्स, एकल न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन के प्रभाव का precluding विश्लेषण होगा । इस प्रकार, अंगूठे के एक नियम के रूप में, गैर जंगली प्रकार के एक अनुपात का उपयोग जंगली-1 के प्रकार न्यूक्लियोटाइड/n, जहां n पदों की संख्या है विश्लेषण किया जाना है । यहां, हम एक साथ 10 पदों का विश्लेषण और जंगली प्रकार न्यूक्लियोटाइड के ९०% और गैर के 10% से युक्त मिश्रण का इस्तेमाल किया डीएनए टेंपलेट डोपिंग के लिए जंगली प्रकार न्यूक्लियोटाइड । अलग प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं, जिसमें प्रत्येक प्रतिलेखन प्रतिक्रिया चार phosphorothioates में से एक के साथ किया जाता है किया जाता है । इस प्रकार, प्रत्येक प्रतिक्रिया मैगनीज पदों पर एक विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड पर नज़र रखता है ।

हस्तक्षेप के कारण विभाजन के सिद्धांत:

यहां प्रस्तुत mutagenesis दृष्टिकोण में, RNAs एक औसत से कम एक अणु प्रति phosphorothioate अवशेष पर है । बाध्यकारी की प्रक्रिया के दौरान, आरएनए प्रोटीन बाध्य अंश और असीम अंश के बीच विभाजन अणु । के बाद से एक विशेष न्यूक्लियोटाइड एक phosphorothioate लिंकेज से जुड़ा हुआ है, phosphorothioate रीढ़ लिंकेज की दरार उस स्थिति में एक विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड की उपस्थिति का एक readout है । यह अपेक्षित है कि किसी भी स्थिति में, जब एक न्यूक्लियोटाइड बदल गया है यह या तो बाध्यकारी पर कोई प्रभाव नहीं हो सकता है या यह बाध्यकारी, आंशिक रूप से या पूरी तरह से बाधित कर सकते हैं । एक विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड की उपस्थिति यह प्रोटीन बाध्य और असीम भागों के बीच समान रूप से विभाजन होगा बाध्यकारी पर कोई प्रभाव नहीं है । हालांकि, अगर किसी दिए गए स्थान पर एक विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड प्रोटीन बाध्यकारी यह तरजीही से प्रोटीन बाध्य अंश से बाहर रखा जाएगा के साथ हस्तक्षेप । हस्तक्षेप की डिग्री मात्रात्मक जेल ट्रो निंनलिखित एक ही प्रतिक्रिया में पदों में से प्रत्येक के लिए निगरानी की जा सकती है । इस अवधारणा को एक योजनाबद्ध (चित्रा 3) में सचित्र है । कुल आरएनए अंश (लेन टी) में, बैंड तीव्रता लगभग सभी मैगनीज पदों (बैंड 1, 3-7) के लिए बराबर है । प्रोटीन बंधे आरएनए अंश (लेन बी) में, 1, 4, और 7 पदों पर, न्यूक्लियोटाइड बाइंडिंग पर कोई प्रभाव नहीं है । हालांकि, स्थिति 3 और 6 पर, यह बाइंडिंग के साथ हस् तक्षेप करती है और इस प्रकार बाउंड अंश से बाहर रखा गया है । स्थिति 5 में, हस्तक्षेप आंशिक है । इस प्रकार, चार युग्मित गलियों की तुलना, टी और बी प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड के लिए, सभी चार न्यूक्लियोटाइड के विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि जंगली-प्रकार की एक दी गई स्थिति के लिए न्यूक्लियोटाइड प्रभाव को दर्शाता है, अगर कोई भी, में सल्फर की, आरएनए रीढ़ पर प्रोटीन बाध्यकारी.

साथ autoradiograph (चित्रा 4) एक thio जेल से लेन के दो जोड़े (α-thio ए और α-denaturing यू) से पता चलता है (कुल पूल और बी के लिए बाध्य अंश के लिए टी) । कई टिप्पणियों की गलियों के प्रत्येक जोड़ी के बीच प्रत्येक स्थिति में बैंड की तीव्रता की तुलना द्वारा किया जा सकता है (टी और बी) । सबसे पहले, संकेत के बहुमत जेल के शीर्ष पर है, यानी, uncleav उत्पाद, दोनों α-thio एक लेन और α-thio यू लेन के लिए. दूसरा, α-thio एक जोड़ी गलियों के लिए, कई बैंड (आयोडीन दरार उत्पादों) बंधे और कुल आरएनए भिन्न उदाहरण के लिए, 1 ऊपर बैंड के बीच समान हैं; α-thio एक लेन के लिए बाध्यकारी साइट के भीतर प्रासंगिक बैंड संदर्भ के लिए गिने जाते हैं । तीसरा, जेल के नीचे बैंड और अधिक बारीकी से स्थान (जैसे, बैंड 6 से नीचे) की तुलना में एक अनुक्रमण जेल के लिए सामांय है । चौथा, कई बैंड कुल आरएनए अंश में मौजूद हैं लेकिन अनुपस्थित या बाउंड आरएनए भिन्न (जैसे, बैंड 1, 2, 3, और 5) में काफी कम. पांचवां, α-thio यू लेन जोड़ी के लिए, जबकि सबसे बैंड कुल और समयबद्ध लेन के बीच तुलना कर रहे हैं, कुछ बैंड अपेक्षाकृत सीमित अंश में कम तीव्र (जैसे, बैंड 7 और 8) हैं ।

इन टिप्पणियों इस नई विधि के सफल विकास के लिए सबूत प्रदान करते है और निंनलिखित निष्कर्ष के लिए नेतृत्व: सबसे पहले, दोनों α-thio एक जोड़ी गलियों और α-thio यू पेयर लेन के लिए, क्योंकि आरएनए के अधिकांश अनसट है, यह सबूत है कि केवल एक छोटे से अंश प्रदान करता है आरएनए संशोधित या phosphorothioate अवशेषों शामिल हैं । यह महत्वपूर्ण है क्योंकि यह पता लगाने कि आरएनए अणुओं कोई एक से अधिक phosphorothioate अवशेषों होते हैं । दूसरा, दो लेन के बीच बंधन साइट के बाहर कई बैंड के लिए समान या समान तीव्रता, दोनों α के लिए-thio एक और α-thio यू, कि लोडिंग दोनों गलियों के लिए तुलनीय है, गलियों के बीच आसान तुलना की अनुमति । तीसरा, अधिक बारीकी से अंतरिक्ष बैंड हासिल कर रहे हैं, α के लिए-thio एक और α-thio यू, जेल के कील-आकार से (नीचे पतली शीर्ष पर और मोटा), इस प्रकार अब अनुक्रम के विश्लेषण की अनुमति पढ़ता है और उच्च संकल्प की पेशकश की । आम तौर पर, छोटे टुकड़े और अधिक व्यापक रूप से वर्दी मोटाई के साथ एक जेल में स्थान पर हैं । चतुर्थ, प्रकट या सीमित अंश में कुछ बैंड्स की कम तीव्रता इंगित करता है कि गैर-वाइल्ड-प्रकार न्यूक्लियोटाइड को तरजीही रूप से बाउंड अंश (α-thio A) से बाहर रखा गया है । बंधे लेन के भीतर अलग बैंड के सापेक्ष तीव्रता भी विभिंन स्थानों पर गैर जंगली प्रकार के अवशेषों से हस्तक्षेप की सीमा के बारे में मात्रात्मक जानकारी प्रदान करते हैं । दूसरे शब्दों में, उत्परिवर्ती या गैर-जंगली प्रकार विशिष्ट पदों पर न्यूक्लियोटाइड प्रोटीन बाध्यकारी के साथ हस्तक्षेप । अंत में, गैर-ब्रिजिंग ऑक्सीजन (α-thio यू) में से एक पर रीढ़ सल्फर प्रतिस्थापन (phosphorothioate) के प्रभाव का परीक्षण, पता चलता है कि तीन पदों रीढ़ सल्फर (जैसे, 6, 7 और 7 से नीचे एक) से मामूली प्रभाव दिखाते हैं । हमारे संयुक्त परिणाम बताते है कि बाध्यकारी साइट के भीतर कई पदों अधिमानी गायब या सीमित अंश में विशिष्ट बैंड के कम तीव्रता दिखाने के । यह आधार के बजाय रीढ़ प्रतिस्थापन के कारण है, बाध्यकारी साइट (α-thio A) में विशिष्ट आधार के साथ प्रोटीन बातचीत का संकेत है । इस बीच, α के शामिल-thio सी एक हस्तक्षेप α-thio A के तुलनीय पैटर्न से पता चलता है । हालांकि, केवल 3-4 α-thio जी प्रतिस्थापन छोटे लेकिन पता लगाने के आसपास केंद्रित हस्तक्षेप दिखाने के लिए, उदाहरण के लिए, पदों 2 और 3 गिने (डेटा नहीं दिखाया गया है) । इस विधि में अंतर प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कैसे ब्याह दमन SXL और सामांय ब्याह कारक U2 snRNP सहायक कारक (U2AF६५) एक समान पूर्व mRNA ब्याह संकेत अनुक्रम को बांध (polypyrimidine-पथ) में अलग तरीके से15 .

Figure 1
चित्रा 1: phosphorothioate mutagenesis (PTM) में प्रमुख चरणों का प्रवाह चार्ट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: दो न्यूक्लियोटाइड, जो रासायनिक आयोडीन से सट जा सकता है के बीच एक phosphorothioate संबंध के योजनाबद्ध । सल्फर एक गैर-ब्रिजिंग फॉस्फेट ऑक्सीजन की जगह । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: हस्तक्षेप के कारण विभाजन के सिद्धांत । काल्पनिक आरएनए में एक प्रोटीन-बाइंडिंग साइट सहित छह पदों पर प्रतिनिधि α-thio न्यूक्लियोटाइड हैं । प्रोटीन बाइंडिंग के बाद, आरएनए आयोडीन द्वारा phosphorothioate निगमन की साइटों पर सट जाता है । पदों 1 – 7 के भीतर और आसपास के बंधन साइट मनमाने ढंग से पाठ में संदर्भ के लिए गिने जाते हैं । स्थिति 2 या लापता बैंड कोई phosphorothioate निगमन या गैर मैगनीज न्यूक्लियोटाइड का प्रतिनिधित्व करता है । लेन टी कुल आरएनए और लेन बी है प्रोटीन बंधे आरएनए है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: Phosphorothioate mutagenesis (PTM) दृष्टिकोण ट्रांसफॉर्मर पूर्व polypyrimidine में एक mRNA-पथ/3 ' ब्याह साइट के संतृप्ति mutagenesis की अनुमति देता है । लेन टी कुल आरएनए और लेन बी है प्रोटीन बंधे आरएनए है । α-thio एक α-thio एटीपी की उपस्थिति में संश्लेषित आरएनए का प्रतिनिधित्व करता है और अनुक्रम में α-thio adenosines के साथ मैगनीज की स्थिति को पहचानता है. तीन मजबूत बैंड उन पदों पर अनुक्रम में adenosines के अनुरूप हैं । α-thio यू α-thio UTP की उपस्थिति में संश्लेषित आरएनए का प्रतिनिधित्व करता है और अनुक्रम में मैगनीज की स्थिति सहित सभी uridines, पहचानता है । बाएं निशान पर अनुलंब रेखा SXL बाइंडिंग साइट है । 1 पदों-8 बाध्यकारी साइट के भीतर संदर्भ प्रयोजनों के लिए गिने और परिणाम अनुभाग में वर्णन की आसानी के लिए कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

Mutagenesis लंबे समय के लिए प्रोटीन बाध्यकारी साइटों की विशेषताएं किया गया है । सबसे पहले, म्यूटेंट की एक श्रृंखला का निर्माण किया जा सकता है और व्यक्तिगत बाध्यकारी परख में परीक्षण के लिए बाध्यकारी संबंध पर उनके प्रभाव का विश्लेषण । जबकि एक मानक mutagenesis दृष्टिकोण कई दृश्यों का विश्लेषण करने के लिए एक तरीका प्रदान करता है, कई कदम मानक दृष्टिकोण में शामिल, म्यूटेंट के निर्माण और प्रत्येक उत्परिवर्ती के लिए बाध्यकारी प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला के प्रदर्शन के रूप में, श्रमसाध्य और समय लेने और नहीं हो सकता है संतृप्ति mutagenesis की अनुमति दें, विशेष रूप से अब दृश्यों के लिए । दूसरा, एक अनुक्रम यादृच्छिक किया जा सकता है और बंधन और पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) प्रवर्धन के कई चक्र के लिए इस्तेमाल किया पूल । इन दृश्यों कि बाँध प्रोटीन के लिए क्लोन और अनुक्रम को पहचानने और सहमति अनुक्रम से एक बाध्यकारी साइट मांय होगा । बहरहाल, इस चलने बाध्यकारी और प्रवर्धन विकल्प कई कदम शामिल है और अवशेषों कि बाध्यकारी साइट के भीतर महत्वपूर्ण है की पहचान करने में श्रमसाध्य है । इसके अलावा, दोहराया अनुक्रम पीसीआर के लिए निहित प्रवर्धन अनुक्रम पूर्वाग्रह परिचय हो सकता है । तीसरा, यादृच्छिक पूल से चयनित अनुक्रम उच्च प्रवाह अनुक्रमण की एक तेजी से विकल्प का उपयोग कर अनुक्रम किया जा सकता है, हालांकि यह अपेक्षाकृत महंगा है. इसलिए, कई कदम, श्रमसाध्य और/या महंगी तरीकों की इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हम एक तेजी से तैयार, सस्ती, और सबसे महत्वपूर्ण बात यह एक एकल कदम विधि, यहां वर्णित है, एक बाध्यकारी साइट (PTM) के संतृप्ति mutagenesis पूरा करने के लिए ।

इस approach में महत्वपूर्ण चरणों की पहचान या टैगिंग गैर-वाइल्ड-प्रकार न्यूक्लियोटाइड (s) शामिल हैं । हम phosphorothioate न्यूक्लियोटाइड, जिसमें फॉस्फेट रीढ़ की ऑक्सीजन में से एक का इस्तेमाल किया सल्फर के साथ प्रतिस्थापित कर रहा है, के रूप में वर्णित (चित्रा 2). लाभ यह है कि आयोडीन phosphorothioate न्यूक्लियोटाइड की रीढ़ को रासायनिक से सट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रकार, एक phosphorothioate रीढ़ युक्त आरएनए सब्सट्रेट के आयोडीन दरार एक अनुक्रमण प्रकार सीढ़ी है, जहां क्लीवेज की साइट एक प्रॉक्सी है या उस स्थिति में चार ठिकानों में से एक की उपस्थिति के लिए टैग उत्पन्न करता है । अनबाउंड और कुल अंशों की तुलना ऐसे अवशेषों की पहचान करती है जो कि तरजीही अंश से अलग किए जाते हैं और इस प्रकार प्रोटीन बाइंडिंग के लिए महत्वपूर्ण होते हैं । इसके विपरीत, अवशेषों कि बाध्यकारी के लिए महत्वपूर्ण नहीं है समान रूप से दो भागों के बीच वितरित रहते हैं । इस दृष्टिकोण के लिए किसी भी आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन के लिए बाध्यकारी साइटों को परिभाषित किया जा सकता है ।

सारांश में, यह एक कदम संतृप्ति mutagenesis दृष्टिकोण, डोपिंग, phosphorothioates, और आयोडीन दरार के संयोजन, आरएनए में किसी भी बंधन साइट के लक्षण वर्णन के लिए एक शक्तिशाली साधन प्रदान करता है । हालांकि, इस approach की आवश्यकता है कि बाइंडिंग साइट पहले से ही mutagenesis करने के लिए जाना जाता है । इसके अलावा, प्रोटीन-बाध्यकारी शर्तों के लिए प्रत्येक प्रोटीन के लिए अनुकूलित की जरूरत है । निम्न सावधानियों को बल देने की आवश्यकता है । आरएनए हैंडलिंग के लिए सावधानियों का प्रयोग किया जाना चाहिए, जैसे दस्ताने पहने हुए, समाधान की तैयारी और DEPC-उपचारित पानी में बफ़र्स, autoclaving पिपेट टिप्स और ट्यूब, और आरएनए उपयोग के लिए केवल RNAses से बचने के लिए उपकरण समर्पित । इसी प्रकार, रेडियोधर्मी कवच, रेडियोधर्मी निगरानी का उपयोग करते हुए रेडियोधर्मी सामग्री आवश्यक है, और निकास हुड का उपयोग करने के लिए खतरनाक रसायनों का उपयोग करते समय शामिल देखभाल आवश्यक हैं ।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा की ।

Acknowledgments

लेखक धंयवाद पिछले वित्त पोषण के लिए स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों और धंयवाद माइकल आर ग्रीन synthesizing oligonucleotides के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Uridine 5’ a-thio triphosphate NEN (Boston, Massachusetts) NLP-017
Adenosine 5’ a-thio triphosphate NEN (Boston, Massachusetts) NLP-016
Vacuum manifold Fisher Scientific XX1002500 Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter
Vacuum manifold Millipore XX2702552 1225 Sampling Vacuum Manifold
Nitrocellulose Millipore HAWP
Nitrocellulose Schleicher & Schuell PROTRAN
Dephosphorlyation Kit NEB M0508
T4 Polynucleotide Kinase NEB M0201S
Proteinase K NEB P8107S
T7 RNA polymerase NEB M0251S
RNasin Promega RNase inhibitor
Glass Plates Standard Standard
Gel Electrophoresis equipment Standard Standard
X-ray films Standard Standard
Polyacrylamide gel solutions Standard Standard

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References

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