Bir roman doygunluk Mutagenesis yaklaşım: Tek adım karakterizasyonu düzenleyici protein RNA Phosphorothioates kullanarak siteleri bağlama

Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Belirli RNA dizilere protein gen ekspresyonu önemli rol oynarlar. Bu bağlama sitelerin detaylı karakterizasyonu gen düzenlemesi bizim anlamak için önemlidir. Burada, bir tek adım yaklaşım doygunluk mutagenesis RNA protein bağlayıcı sitelerin için kullanılmıştır. Bu yaklaşım RNA içinde tüm protein bağlayıcı siteleri için geçerlidir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Singh, R. A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates. J. Vis. Exp. (138), e57816, doi:10.3791/57816 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Gen düzenlemesi gelişiminde önemli bir rol oynar. Çok sayıda DNA ve RNA bağlayıcı proteinler onların hedef sıraları gen ekspresyonu denetlemek için yüksek özgüllük ile bağlayın. Bu düzenleyici proteinler gen ekspresyonu ya DNA (transkripsiyon) düzeyinde veya RNA (pre-mRNA'ın porno versiyonunu, Poliadenilasyon, mRNA taşıma, çürüme ve çeviri) düzeyini kontrol eder. Düzenleyici diziler tanımlaması sadece açık veya kapalı bir gen nasıl açık, ama hangi aşağı akım genler tarafından belirli bir düzenleyici protein Ayrıca düzenlenir anlamanıza yardımcı olur. Burada, doygunluk mutagenesis RNA bir protein bağlayıcı sitesinin sağlar bir tek adımlı yaklaşım tarif. Bu DNA şablon bağlama site, her phosphorothioate nükleotit ile ayrı RNA'ların sentezi ve yalıtım kuluçka protein ile takip ilişkili fraksiyonunun içinde vahşi tipi nükleotit ile doping içerir. Vahşi tipi nükleotit müdahalelerden protein bağlı kesir Tercihli onların hariç sonuçlanır. Bu jel elektroforez ile iyot fosfodiester tahvil phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis veya PTM) içeren seçmeli kimyasal bölünme takip tarafından izlenir. Bu tek adım doygunluk mutagenesis yaklaşım herhangi bir protein bağlayıcı sitedeki RNA karakterizasyonu için geçerlidir.

Introduction

Gen düzenlemesi, biyolojide önemli bir rol oynar. Genlerin transkripsiyon, pre-mRNA'ın porno versiyonunu, 3' uç oluşumu, RNA verme, çeviri, mRNA yerelleştirme, çürüme, translasyonel modifikasyon/istikrar, vb her iki DNA ve RNA bağlayıcı proteinler gen anahtar rol oynarlar düzeyinde düzenlenmiş olması Yönetmelik. Moleküler Genetik analizlerle çok sayıda düzenleyici proteinler belirledik iken, yalnızca küçük bir alt kümesini ile karakterize tamamen hücresel işlevlerinin veya bağlama siteleri içinde vivoiçin. Filogenetik dizi analizi ve mutagenesis DNA veya RNA protein etkileşimleri niteleyen tamamlayıcı yaklaşımlar sunuyor.

RNA bağlanıcı proteinler cinsel farklılaşma da dahil olmak üzere gelişim süreçlerinde önemli. Drosophila protein seks-öldürücü (SXL) veya ana seks-anahtar protein yoktur erkek, ama şimdiki içinde dişi. Uridine zengini diziler veya pirimidin-yolları aşağı akım pre-mRNA hedefler (trafo, seks öldürücüve erkek özgü lethal2) somatik hücreler1,2'deki belirli splice sitelere bitişik tanır ,3,4. Buna ek olarak, uridine zengini Poliadenilasyon artırıcı dizileri artırıcı, ilkel (e(r)) transkript5,6bağlama yaparak geçiş Poliadenilasyon sitesi düzenler. SXL büyük olasılıkla olmak üzere kalan kadın germline ek hedefleri düzenleyen1,7,8,9,10,11, tespit 12 , 13.

Genellikle, bir bağlama sitesini karakterizasyonu mutagenesis, örneğin, silme veya değiştirme tek veya birden çok nükleotit tarafından içerir. Her mutant bağlama siteye göre yaban tipi RNA dizisinin sonra onun bağlama benzeşme belirlemek için bir dizi protein konsantrasyonları kullanılarak analiz (Kd veya denge ayrılma Sabit) protein ilgi; Kd protein konsantrasyonu % 50 RNA bağlama almak için gerekli olduğunu. Detaylı mutagenesis Bu emek yoğun işlem üretimi ve çok sayıda mutantlar analizini içerir — üç vahşi türü nükleotit bağlama sitedeki her pozisyon için. Böylece, daha basit ve ucuz doygunluk mutagenesis protein bağlayıcı sitelerin RNA için alternatif bir yaklaşım için bir ihtiyaç vardır.

Burada, doygunluk mutagenesis RNA bir protein bağlayıcı sitesinin sağlar bir tek adımlı yaklaşım tarif. Bu DNA şablon bağlama site, her phosphorothioate nükleotit ile ayrı RNA'ların sentezi ve yalıtım kuluçka protein ile takip ilişkili fraksiyonunun içinde vahşi tipi nükleotit ile doping içerir. Vahşi tipi nükleotit müdahalelerden protein bağlı kesir Tercihli onların hariç sonuçlanır. Bu jel elektroforez ile iyot fosfodiester tahvil phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis veya PTM) içeren seçmeli kimyasal bölünme takip tarafından izlenir. Bu tek adım doygunluk mutagenesis yaklaşım herhangi bir protein bağlayıcı sitedeki RNA karakterizasyonu için geçerlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: Resim 1 phosphorothioate mutagenesis genel bir bakış sağlar ve işleminin temel adımları özetlemektedir.

1. nesil bir kütüphane mutantların — DNA şablon vahşi türü nükleotit ile Doping

  1. T7 astar sentez (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') bir DNA synthesizer üzerinde kimyasal sentez tarafından.
  2. Katkılı oligonükleotid (iplikçik) protein bağlayıcı siteye karşılık gelen bir DNA synthesizer üzerinde kimyasal sentez tarafından sentez. Phosphoramidites uygun bir karışımı olarak vahşi türü nükleotit (bkz: Bu oran daha fazla ayrıntı için temsilcisi sonuçları) doping (X aşağıdaki) her site vahşi tipi nükleotid olarak % 90'a ve T % 10 oranında için kimyasal sentez sırasında kullanın.
    Not: Katkılı oligonükleotid dizisi 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3 burada '. Altı çizili sıra SXL protein bağlayıcı sitesi, artı faydalı kontroller RNA her değişiklik için yükleme kontrolleri olmasının yanı sıra bağlayıcı etkiler onaylayan sağlamak ek nükleotit bağlama sitesi dışında ters tamamlayıcıdır Karşılaştırma ve normalleştirme nükleotit bağlama site içinde. SXL-bağlama sitesi sıra trafo pre-mRNA14,15,16,17' mevcut olan UUUUUGUUGUUUUUUUU, önerilen metodoloji hazırlamak için kullanıldı. İtalik sırayla T7 astar dizisine tamamlayıcı ve vitro transkripsiyon T7 organizatörü.

2. RNA sentezi

  1. Yukarıda açıklanan18olarak 20 µL transkripsiyon tepki RNA sentez.
    1. Mix T7 transkripsiyon tampon ve 1 µM T7 oligonükleotid, 1 µM katkılı oligonükleotid, 10 mM dithiothreitol (DTT), 2 mM GTP, 1 mM ATP, CTP ve UTP (guanozin, adenozin, sitidin ve üridin trifosfat) ve 2 U/µL T7 RNA polimeraz.
    2. Ekleme, iki ayrı microcentrifuge tüplerde 0,167 mM α-thio ATP veya 0.05 mM α-thio UTP (bkz: Şekil 2' deki şemaları) phosphorothioates RNA'ların dahil etmek.
      Not: alternatif iletişim kuralları için 0.2 mM α-thio CTP veya 0.2 mM α-thio GTP nükleotit oyuncu değişikliği kalan iki test etmek için bir katkılı oligonükleotid içeren uygun transkripsiyon reaksiyon ekleyin.
    3. RNA sentezi tepki karışımı 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya
  2. 2.5 µL ısı değişken alkalen fosfataz ve 2.5 µL 10xphosphatase tampon RNA örnek ekleyin. Bu 25 µL reaksiyon 10 – 30 dk 37 ° C'de 5' fosfatlar kaldırmak için kuluçkaya.
  3. Alkalen fosfataz enzim Isıtma için 2-5 dk 80 ° C'de tarafından devre dışı bırakabilirsiniz.
  4. 5' ucuna dephosphorylated RNA'ın radiolabel (5 pmole) 1 µL T4 polinükleotit kinaz ve 1 µL γ -32P ATP 10 µL tepki birimindeki kullanarak. Reaksiyon karıştırmak için 30-60 dk 37 ° C'de kuluçkaya
  5. T4 polinükleotit kinaz enzim Isıtma için 20-30 dk 65 ° C'de tarafından devre dışı bırakabilirsiniz.
  6. Jel Elektroforez % 10 polyacrylamide jel denaturing tarafından RNA arındırmak. RNA üzerinde jel autoradiography tarafından bulun. Radiolabeled RNA içeren jel dilim tüketim, pipet ucu ile duvarlara basarak microcentrifuge tüpte ezmek ve İndinavir K (PK) arabellek (100 mM Tris, pH 7.5, 12,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, % 1 Sodyum Lauryl Sülfat) emmek. Gece için 2 h oda sıcaklığında tüp döndürün.
  7. Jel Bulamaç santrifüj kapasitesi, jel atmak ve arabellek çözüm toplamak.
  8. Fenol kloroform eşit hacmi ile iki kez ve bir kez kloroform ile çözüm ayıklamak ve sulu faz toplamak.
  9. Sodyum asetat, pH 5.2, taşıyıcı 3 M sulu faz 0.1 birim eklemek tRNA veya glikojen ve etanol 2.5 hacmi. Örnek 1 h için-80 ° C'de tutun.
  10. Örnek için bir yüksek hızlı microcentrifuge 16,873 x g, 5-10 dk santrifüj kapasitesi. Arabellek/etanol çözüm RNA Pelet bozmadan dikkatli bir şekilde çıkarın.
  11. Pelet % 70 etanol ile yıkama ve 2-5 dk. Kaldır etanol için dikkatle santrifüj kapasitesi. Pelet hava kuru.
  12. Pelet 20 – 50 µL dietil pyrocarbonate (DEPC) resuspend-tedavi su. -20 ° C'de kullanmak kadar saklamak.
    Not: radyoaktivite korumak için uygun önlemleri ve Pleksiglas kalkan kullanarak radiolabeled RNA ile tüm adımları gerçekleştirin. Halen, spin sütunları jel arıtma RNA'ın alternatif olarak adi radyoaktivite, daha yaygın olarak kullanılan ve kaldırmak daha kolay olur.

3. protein bağlayıcı tepki ve bağımlı RNA ayrılması

  1. Rekombinant protein hızlı ve E. coliarındırmak.
  2. Rekombinant protein konsantrasyonu spectrophotometry veya bir SDS-polyacrylamide jel bir bilinen protein standart, Sığır serum albumin (BSA) yanındaki ayıran tahmin ediyoruz. Faiz ve standart BSA proteini jel Coomassie parlak mavi R-250 ile boyama tarafından görselleştirin. İle karşılaştırıldığında BSA dilutions aynı jel üzerinde bilinen miktarda protein quantitate.
    Not: 0.2 mM Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA), % 0.05, - 80 ° C kadar kullanım ve 20 mm 4-(2-Hydroxyethyl) seyreltik piperazin-1-ethanesulfonic asit (HEPES), pH 8.0, 1 mM dithiothreitol (DTT), Rekombinant protein depolamak NP-40, % 20 gliserol. Kullanım 0.5-1.0 mM proteaz inhibitörü phenylmethane Sülfanil florür (PMSF) isteğe bağlı.
  3. RNA-bağlama tepki (20-100 µL) 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 olarak gerçekleştirmek, 1 mM DTT, 50 mM KCl, 0.5 birim/µL RNase inhibitörü, 0.09 µg/µL acetylated Sığır serum albümin, 1 mM EDTA, 0.15 µg/µL tRNA, 5'-son radiolabeled RNA ve uygun konsantrasyon (bir 6 µL konsantrasyon RNA'ın % ~ 50 protein bağlar) protein.
    Not: Bu bağlayıcı arabelleğe üç RNA – proteinler için çalışır (SXL, U2AF65ve PTB), faiz bir protein için standart olacak ama. Protein konsantrasyonu ampirik olarak, yaklaşık 50 %'si almak için gereken bir verilen protein hazırlık için çeşitli dilutions kullanarak tahmin RNA bağlama. Bu koşul veya Kd RNA-bağlama eğrisi en hassas bölümünü temsil eder.
  4. 20-30 dk 25 ° c (veya buz) protein bağlayıcı tepki kuluçkaya.
  5. Protein bağımlı RNA kesir iki yaklaşımdan birini kullanarak ilişkisiz kesir ayırmak:
    1. Nitroselüloz filtre bağlama
      1. Bağlama reaksiyon (20-100 µL) Oda sıcaklığında bir vakum manifold bağlı nitroselüloz filtre uygula.
        Not: Sadece RNA-protein kompleksi üzerinde filtre korunur ve RNA akar filtreden ilişkisiz. Filtre bağlama yaklaşım bağımlı RNA'ın yüksek kurtarma sağlar ve jel hareketlilik üst karakter tahlil için daha hızlı ve daha basit, karşılaştırılır. DEAE membran altında nitroselüloz filtre yerleştirerek ilişkisiz RNA kesir toplamak veya ilişkili kesir ile karşılaştırma için RNA ücretsiz mümkündür.
      2. Tutulan içeren nitroselüloz filtre bölümünü kesip radyoaktif RNA küçük parçalara microcentrifuge tüp içine sığacak şekilde filtre parçaları sokmak için yeterli PK arabellekte (300-500 µL içeren 10-20 µg PK) emmek ve RNA filtresinden elute 2-3 saat veya gece boyunca için.
      3. Fenol-kloroform ile kloroform, hulâsa ve sulu faz toplamak. Sodyum asetat ve etanol ekleyin ve, dondurucu kuluçka sonra santrifüj kapasitesi, yıkama, Kuru ve RNA DEPC tedavi suda resuspend. Adımda 2.10-2,14 yukarıda ayrıntılı olarak aşağıdaki adımları izleyin.
    2. Jel hareketlilik üst karakter
      1. Hazırlamak ve % 5 yerli polyacrylamide jel polimerize (60:1 Acrylamide:bis-akrilamid) 0.5 içinde filtre bağlama yöntemi alternatif olarak bağlama tepki başlamadan önce x TBE (Standart Tris-bor-EDTA arabellek).
      2. 15dk için jel 250 V (4 ° C) soğuk bir odada önceden çalıştırın.
      3. Her bağlama reaksiyon (üstte) Yukarıdaki ön çalışma jel ayrı kuyu yükleyin.
        Not: Örnek yükleme kuyu içine için yeterli gliserol protein depolama arabellek sağlar.
      4. Jel Elektroforez belirli protein ve RNA boyutu bağlı olarak 1-2 h için 250 V soğuk bir odada tarafından protein bağımlı RNA ayırın.
      5. Autoradiography tarafından RNA-protein kompleksi jel üzerinde konumunu bulun. RNA-protein kompleksi içeren jel dilim tüketim. Jel dilim kırma ve PK arabellekte nemlendirici jel dilim üzerinden RNA elute.
      6. Fenol-kloroform ile kloroform, hulâsa ve sulu faz toplamak. Sodyum asetat ve etanol ekleyin ve, dondurucu kuluçka sonra santrifüj kapasitesi, hava kuru, yıkama ve RNA DEPC tedavi suda resuspend. Adımda 2.10-2,14 yukarıda ayrıntılı olarak aşağıdaki adımları izleyin.

4. analiz Mutant nükleotit pozisyonlar algılanması için iyot i ciddi Phosphorothioate ürünlerin

  1. 1 mM iyot bir 20 µL DEPC tedavi su ilâ 10 µg taşıyıcı içeren eklemek tRNA phosphorothioate birleşme yerlerinde (ilişkili ve toplam RNA'ların) RNA'ların ayırmak için. 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
    Not: Daha fazla iyot bölünme biraz farklı koşulları ile ilgili ayrıntılar — %7 (v/v) iodoethanol, 95 ° c 3 dk Isıtma — Gish & Eckstein 198819' bulunabilir.
  2. İ ciddi RNA sodyum asetat/etanol, ekleyerek yukarıda açıklandığı gibi çökelti. Jelleri denaturing için bir yükleme boya resuspend. Isı ve örnek tarafından % 15-20 denaturing polyacrylamide jel elektroforez RNA parçaları ayırmak için yük.
  3. Polyacrylamide jel bir röntgen filmi için maruz.
  4. Grup autoradiography kullanma toplam havuz ile ilişkili kesir tespit edebilir.
    Not: bir yormak kukuleta iyot ile tüm adımları gerçekleştirin. Burada gösterilen RNA ayrılması için bir kama şeklindeki jel, istihdam hangi tarafından iki katına her iki çubukları alt jel plakaların kalınlığı jel alt kısmında bir ekstra inç uzunluğundaki spacer ekleyerek elde edilir. Bu şekli daha kısa RNA parçaları arasında daha fazla tek tip veya daha yakın aralığını sağlar. Alternatif olarak, bir phosphorimager algılama ve radyoaktivite Nefelometri için röntgen filmleri yerine kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Doping kullanarak doygunluk mutagenesis prensibi:

Eğer sadece analiz edilecek bir konumdur bir uygun molar oranı vahşi-türü ve diğer nükleotit için tüm dört nükleotit eşit bir karışımı kullanın. Ancak, aynı anda birden fazla pozisyonları incelenir, oranı, non-vahşi türü yaban tipi nükleotit için ayarlanması gerekir, azaltılmış yani . Aksi takdirde, hangi isteniyorsa, tek oyuncu değişikliği ek olarak, ayrıca olacak şablonlar tek nükleotid oyuncu değişikliği etkisini analiz iyileştirmelerden bir molekül içinde birden çok vahşi türü nükleotit ile. Bu nedenle, kural olarak bir oranı, non-vahşi türü için vahşi tipi nükleotid 1/n, n çözümlenmesi için pozisyonların sayısını nerede kullanın. Burada, aynı anda 10 pozisyonları analiz ve vahşi-türü nükleotit yüzde 90'ını ve DNA şablon doping için vahşi türü nükleotit yüzde 10'u içeren bir karışımı kullanılır. Her transkripsiyon tepki dört phosphorothioates biri ile gerçekleştirildiği ayrı transkripsiyon reaksiyonlar yapılır. Böylece, her reaksiyon katkılı pozisyonlarda belirli bir nükleotit izler.

Parazit nedeniyle bölümleme prensibi:

Mutagenesis yaklaşım, burada sunulan RNA'ların bir ortalama molekül başına daha az bir phosphorothioate kalıntı vardır. Bağlama, RNA molekülleri bölüm arasında protein bağlı kesir ve ilişkisiz kesir işlemi sırasında. Belirli bir nükleotit bir phosphorothioate bağlantı bağlı olduğu phosphorothioate omurga bağlantı bölünme o konumdaki belirli bir nükleotit varlığı bir okuma. Verilen herhangi bir konumundaki bir nükleotit değiştiğinde bağlama üzerinde bir etkisi de olabilir veya bağlama, kısmen veya tamamen inhibe ki bekleniyor. Belirli bir nükleotit varlığı bağlama üzerinde bir etkisi yoktur, aynı derecede protein ilişkili ve ilişkisiz kesirler bölümü. Ancak, belirli bir konumdaki belirli bir nükleotit protein bağlama ile müdahale Eğer protein bağlı kesir tercihen dışlanır. Girişim derecesini kantitatif her biri de aynı tepkiyi jel elektroforez aşağıdaki konumlarda için takip edilebilir. Bu kavram bir şematik (Şekil 3) gösterilmektedir. Toplam RNA kesir (lane T), Grup yoğunluğu tüm katkılı pozisyonlar (Grup 1, 3 – 7) için yaklaşık olarak eşittir. Protein bağımlı RNA kesir (lane B), pozisyonlarda 1, 4 ve 7, nükleotit bağlama üzerinde bir etkisi vardır. Ancak, pozisyonlarda 3 ve 6, bağlama ile uğratır ve böylece ilişkili kesir söz konusu değildir. 5 konumda girişim kısmi. Böylece, dört eşleştirilmiş yolları, T ve B her nükleotit için karşılaştırmalar tüm dört nükleotit analiz için izin verir. Olması gerektiği için varsa kükürt RNA omurgasında protein bağlayıcı üzerinde etkisi, belirli bir konumu yansıtır bu vahşi tipi nükleotit kaydetti.

Eşlik eden autoradiograph (Şekil 4) iki çift (α-thio A ve α-thio U) üzerinden denaturing bir jel (T toplam havuzu için) ve ilişkili kesir için B şerit gösterir. Birkaç gözlemler yoğunluklarda gruplarından her pozisyonda şerit (T ve B) her çifti arasında karşılaştırma tarafından yapılabilir. İlki, sinyal çoğunluğu bu jel, Yani, uncleaved ürün için her iki α-thio üstündeki lane ve α-thio U lane. İkinci olarak, α-thio A çift şerit için birkaç grup (iyot bölünme ürünleri) bağlı ve toplam RNA kesirler 1 Yukarıdaki örneğin, bantları arasında aynıdır; α-thio bir lane için bağlama sitedeki ilgili grup başvurusu için numara verilir. Üçüncü olarak, jel altındaki bantları daha yakından aralıklı (Örneğin, bantları 6 altında) bir sıralama jel için her zamankinden daha. Dördüncü olarak, çeşitli grupların toplam RNA kesir mevcut ama yok ya da önemli ölçüde azaltılmış bağımlı RNA kesir (Örneğin, Grup 1, 2, 3 ve 5). Çoğu grup toplam ve ilişkili yolları arasında karşılaştırılabilir beşinci olarak, α-thio U lane çifti için bazı Grup ilişkili kesir (Örneğin, bantları 7 ve 8) nispeten daha az yoğun iken.

Bu gözlemler bu yeni yöntem ve aşağıdaki sonuçlara yol başarılı gelişimi için kanıt: çünkü çoğu RNA'ın uncleaved yolları, α-thio A çift şerit ve α-thio U eşleştirmek için ilk olarak, bu kanıt sadece küçük bir kısmını sağlar RNA içeren değiştirilmiş veya phosphorothioate artıkları. Bu önemli çünkü RNA molekülleri birden fazla phosphorothioate kalıntı içeren yaptýklarýylaçakýþmadýklarýndan. İkinci, aynı veya benzer yoğunluklarda için α-thio A ve α-thio U, iki şerit arasında bağlama sitesinin dışındaki çeşitli gruplar için yükleme yolları arasında kolay karşılaştırma izin her iki şerit için karşılaştırılabilir olduğunu ispat. Üçüncüsü, daha yakından aralıklı bantları, α-thio A ve böylece daha uzun sıra okuma analiz izin ve daha yüksek çözünürlük sunan α-thio U, jel (ince üst ve kalın alt), kama şeklinde tarafından elde edilir. Genellikle, daha kısa parçaları daha yaygın bir jel ile Tekdüzen kalınlığı aralıklı vardır. Dördüncü olarak, ortadan kalkması veya azaltılmış yoğunluğuna bağlı kesir belirli bantlarında vahşi tipi nükleotit tercihen ilişkili kesir (α-thio A) söz konusu değildir gösterir. İlişkili sokağın içindeki farklı grupların göreli yoğunluklarda de vahşi türü artıkları farklı yerlerde müdahalelerden ölçüde hakkında kantitatif bilgi sunar. Başka bir deyişle, mutant veya vahşi türü nükleotit belirli konumlarda protein bağlama ile engel. Son olarak, omurga kükürt ikame (phosphorothioate) etkisi olmayan köprüleme oxygens (α-thio U) birinde test, üç pozisyon omurga sulfurs (Örneğin, 6, 7 ve 7 aşağıdaki) ikincil etkilerinden show gösterir. Bizim kombine sonuçlar bağlama site içinde çeşitli kademelerde Tercihli ortadan kalkması gösterme veya ilişkili kesir belirli gruplarından yoğunluklarda azaltılmış gösterir. Bu protein etkileşimleri (α-thio A) bağlama sitesindeki belirli üsleri ile gösteren omurga yerine Bankası ikame kaynaklanmaktadır. Bu arada, α-thio C ortaklığın bir kesişim deseni α-thio A. karşılaştırılabilir gösterir Ancak, sadece 3-4 α-thio G oyuncu değişikliği küçük göstermek ama algılanabilir girişim etrafında, merkezli Örneğin, numaralandırılmış 2 ve 3 (veri gösterilmez) konumlandırır. Bu yöntem nasıl alışılageldik önleyici SXL ve genel alışılageldik faktör U2 snRNP yardımcı faktör (U2AF65) farklı şekilde15 aynı pre-mRNA alışılageldik sinyal dizisi için (polypyrimidine-yolu) bağlamak farklılıklar ortaya çıkarmak için kullanılan .

Figure 1
Şekil 1: akış şeması anahtar adımlar phosphorothioate mutagenesis (PTM). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: kimyasal olarak iyot tarafından i ciddi iki nükleotitler arasındaki bir phosphorothioate bağlantı şematik. Kükürt sigara köprüleme fosfat oxygens biri yerini alır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: parazit nedeniyle bölümleme prensibi. Varsayımsal RNA temsilcisi α-thio nükleotit bir protein bağlayıcı sitesi de dahil olmak üzere altı pozisyonlarda içerir. Protein bağlayıcı takiben, RNA iyot tarafından phosphorothioate birleşme sitelerinde i ciddi. Durum 1-7 içinde ve çevresinde bağlama site referans metin için keyfi olarak numaralandırılır. Pozisyonu 2 veya eksik grup yok phosphorothioate birleşme veya sigara katkılı nükleotit temsil eder. Lane T toplam RNA ve lane B protein bağımlı RNA. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: Phosphorothioate mutagenesis (PTM) yaklaşım sağlar doygunluk mutagenesis bir polypyrimidine-yolu/3 ' site mevcut trafo pre-mRNA splice. Lane T toplam RNA ve lane B protein bağımlı RNA. Α-thio temsil RNA α-thio ATP huzurunda sentezlenmiş ve α-thio adenosines katkılı konumlarla sıradaki tanımlar. Üç güçlü grup adenosines bu konumlarda sırayla karşılık gelir. Α-thio U α-thio UTP huzurunda sentezlenmiş RNA temsil eder ve katkılı pozisyonlarda sırası da dahil olmak üzere tüm uridines tanımlar. Sol dikey çizgi SXL bağlama sitesi işaretler. Pozisyonları 1 – 8 bağlama site içinde başvuru amacıyla ve sonuçlar bölümünde Açıklama kolaylığı için numaralandırılmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mutagenesis uzun protein bağlayıcı siteleri niteleyen kullanılmaya başlanmıştır. İlk olarak, mutantlar bir dizi inşa ve deneyleri benzeşme bağlama üzerinde onların etkilerini incelemek için bağlama içinde tek tek test. Ise standart mutagenesis yaklaşım çeşitli serileri analiz etmek için bir yol sağlar, birden çok adımı mutantlar oluşturmak ve tepkiler her mutant için bağlayıcı bir dizi performans gibi standart yaklaşım, dahil, zahmetli ve zaman alıcı ve olmayabilir özellikle uzun serileri için Doygunluk mutagenesis izin verir. İkinci olarak, bir dizi randomize ve havuzun birden fazla bağlama ve polimeraz zincir reaksiyonu devredir (PCR) amplifikasyon kullanılır. Protein bağlamak bu dizilere klonlanmış ve tanımlamak ve fikir birliği serisinden bir bağlama site doğrulamak için sıralı olacaktır. Yine de, bu yinelemeli bağlama ve güçlendirme seçenek birden çok adımdan oluşur ve bağlama site içinde önemli kalıntılar teşhis etmek için zahmetli. Ayrıca, yinelenen sıra arttırımlar PCR için doğal sırası önyargı ile tanıştırayım. Üçüncü olarak, rasgele havuzundan seçili sıraları nispeten pahalı olmasına rağmen yüksek işlem hacmi sıralama, daha hızlı bir seçeneği kullanarak sıralı. Bu nedenle, birden çok adımı, zahmetli ve/veya pahalı Yöntemler, bu sınırlamaları aşmak için biz daha hızlı bir icat, ucuz ve en önemlisi bir tek adımlı Yöntem, doygunluk mutagenesis bir bağlama sitesinin (PTM) gerçekleştirmek için burada, açıklanan.

Bu yaklaşım önemli adımlar kimlik veya non-vahşi türü nucleotide(s) etiketleme içerir. Biz phosphorothioate nükleotit fosfat oxygens hangi bir omurga Kükürt ile konulur, açıklanan (Şekil 2) kullanılır. Iyot kimyasal olarak phosphorothioate nükleotit omurgası ayırmak için kullanılabilir avantajdır. Böylece, bir phosphorothioate omurga içeren RNA substrat iyot bölünme nerede site dekolte bir proxy veya etiket bir dört varlığı için o konumda üsleri bir sıralama tipi merdiven oluşturur. İlişkisiz ve toplam kesirler karşılaştırılması tercihen ilişkili kesir hariç tutulur ve protein bağlama için önemli olan artıkları tanımlar. Buna ek olarak, bağlama için önemli değildir artıkları arasında iki kesirler eşit dağıtılmış kalır. Bu yaklaşım için herhangi bir RNA-bağlayıcı protein bağlayıcı siteleri tanımlamak için kullanılabilir.

Özet olarak, bu tek adımlı doygunluk mutagenesis yaklaşım, phosphorothioates ve iyot bölünme, doping birleştirerek, RNA herhangi bir bağlama sitedeki karakterizasyonu için güçlü bir araç sunar. Ancak, bu yaklaşım bağlama site zaten mutagenesis önce bilinen gerektirir. Ayrıca, protein-bağlayıcı koşulları optimize için her protein gerekir. Aşağıdaki önlemleri vurguladı gerek. Eldivenler, çözümleri ve arabellekleri suda DEPC tedavi, ısıyla pipet ipuçları ve tüpler, hazırlanması ve ekipman için RNA ithaf sadece RNAses önlemek için kullanmak gibi önlemler RNA işleme için uygulanmalıdır. Benzer şekilde, radyoaktif kalkanlar, radyoaktif malzeme kullanılması esastır ederken izleme radyoaktif içeren bakım ve çok yormak kukuleta kullanımı tehlikeli kimyasallar kullanırken gereklidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirir.

Acknowledgments

Yazar Ulusal son finansmanı için Sağlık Enstitüleri ve teşekkür Michael R. Green oligonucleotides sentezleme için.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Uridine 5’ a-thio triphosphate NEN (Boston, Massachusetts) NLP-017
Adenosine 5’ a-thio triphosphate NEN (Boston, Massachusetts) NLP-016
Vacuum manifold Fisher Scientific XX1002500 Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter
Vacuum manifold Millipore XX2702552 1225 Sampling Vacuum Manifold
Nitrocellulose Millipore HAWP
Nitrocellulose Schleicher & Schuell PROTRAN
Dephosphorlyation Kit NEB M0508
T4 Polynucleotide Kinase NEB M0201S
Proteinase K NEB P8107S
T7 RNA polymerase NEB M0251S
RNasin Promega RNase inhibitor
Glass Plates Standard Standard
Gel Electrophoresis equipment Standard Standard
X-ray films Standard Standard
Polyacrylamide gel solutions Standard Standard

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schutt, C., Nothiger, R. Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects. Development. 127, (4), 667-677 (2000).
  2. Mahowald, A. P., Wei, G. Sex determination of germ cells in Drosophila. Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).
  3. Steinmann-Zwicky, M. How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm. Bioessays. 14, (8), 513-518 (1992).
  4. Salz, H. K. Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary. Fly (Austin). 7, (1), 3-7 (2013).
  5. Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline. Embo J. 25, (6), 1263-1272 (2006).
  6. Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins. PLoS One. 2, (6), e520 (2007).
  7. Samuels, M. E., et al. RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo. Mol. Cell. Biol. 14, (7), 4975-4990 (1994).
  8. Fujii, S., Amrein, H. Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology. EMBO J. 21, (20), 5353-5363 (2002).
  9. Kelley, R. L., et al. Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila. Cell. 81, (6), 867-877 (1995).
  10. Hager, J., Cline, T. Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination. Development. 124, (24), 5033-5048 (1997).
  11. Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B. Dev Biol. 253, (2), 214-229 (2003).
  12. Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary. Genetics. 182, (1), 121-132 (2009).
  13. Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (24), 9465-9470 (2012).
  14. Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268, (5214), 1173-1176 (1995).
  15. Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal. RNA. 6, (6), 901-911 (2000).
  16. Sakashita, E., Sakamoto, H. Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection. Nucleic Acids Res. 22, (20), 4082-4086 (1994).
  17. Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA. EMBO J. 14, (18), 4530-4539 (1995).
  18. Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).
  19. Gish, G., Eckstein, F. DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry. Science. 240, (4858), 1520-1522 (1988).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics