Phosphorothioates를 사용 하 여 RNA에서 사이트 바인딩 규제 단백질의 소설 포화 Mutagenesis 접근: 단일 단계 특성

Genetics

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Summary

특정 RNA 순서 묶는 단백질 유전자 발현에 중요 한 역할을 재생 합니다. 이러한 바인딩 사이트의 상세한 특성은 유전자 규칙의 우리의 이해를 위해 중요 합니다. 여기, RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 포화 mutagenesis에 대 한 단일-단계 접근 방식을 설명 합니다. 이 방법은 모든 단백질 바인딩 사이트 RNA에 대 한 관련입니다.

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Singh, R. A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates. J. Vis. Exp. (138), e57816, doi:10.3791/57816 (2018).

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Abstract

유전자 규칙 개발에 중요 한 역할을 한다. 수많은 DNA과 RNA 의무적인 단백질 높은 특이성 유전자 발현 제어를 가진 그들의 대상 시퀀스를 바인딩합니다. 이러한 규제 단백질 유전자 발현 DNA (전사)의 수준에서 또는 RNA (이전 mRNA 접합, polyadenylation, mRNA 전송, 부패, 및 번역)의 수준에서 제어합니다. 식별 규제 시퀀스의 유전자가 켜거나 전환 뿐만 아니라 또한 어떤 다운스트림 유전자 규정 하는 특정 단백질에 의해 통제 된다 이해 하는 데 도움이 됩니다. 여기, RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 포화 mutagenesis 있도록 단계 접근 방식을 설명 합니다. 그것은 사이트 내에서 바인딩, 각 phosphorothioate 뉴클레오티드와 별도 RNAs의 합성 및 단백질 외피 다음 바인딩된 분수의 절연 야생-타입 뉴클레오티드와 DNA 템플렛을도 핑 포함. 야생-타입 뉴클레오티드에서 간섭 결과 단백질 바인딩 부분에서 그들의 특혜 배제. 이 다음의 phosphodiester phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis 또는 PTM)를 포함 하는 요오드와 선택적 화학 분열 하는 젤 전기 이동 법에 의해 모니터링 됩니다. 이 단일 단계 포화 mutagenesis 접근 RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 특성에 적용 됩니다.

Introduction

유전자 규칙 생물학에 있는 중요 한 역할을 한다. 유전자의 전사 사전 mRNA 접합, 3' 끝, RNA 수출, 번역, mRNA 지 방화, 붕괴, 포스트 번역 상 수정/안정성, 모두 DNA과 RNA 의무적인 단백질 유전자에 핵심 역할 수준에서 통제 될 수 있다 규칙입니다. 수많은 규제 단백질 식별 분자 유전 분석, 하는 동안 그들의 작은 하위 집합만 그들의 세포질 기능 또는 바인딩 사이트 비보완전히 특징 되어 있다. 계통 발생 시퀀스 분석과 mutagenesis DNA 또는 RNA 단백질 상호 작용의 특성을 상호 보완적인 접근을 제공 합니다.

RNA-바인딩 단백질은 성적인 감 별 법을 포함 하 여 개발 프로세스에서 중요 한. 섹스-치명적인 (SXL) 초파리 단백질 또는 마스터 섹스-스위치 단백질은 결 석 남성, 여성에서 현재에. Uridine-풍부한 시퀀스 또는 pyrimidine 책자 다운스트림 사전 mRNA 목표 (변압기, 치명적이 지 섹스, 남성 전용 lethal2) 체세포1,2에서에서 특정 스플라이스 사이트에 인접 한 인식 ,,34. 또한, 그것은 기초의 증강 (e(r)) 사본5,6uridine 풍부한 polyadenylation 증강 시퀀스에 바인딩하여 스위칭 polyadenylation 사이트 조절. SXL 가능성이 조절 되도록 남아 있는 여성 생식에 추가 대상 확인1,7,,89,,1011, 12 , 13.

일반적으로, 바인딩 사이트의 특성을 포함 한다 mutagenesis를, 예를 들어 삭제 또는 단일 또는 여러 개의 뉴클레오티드의 대체. 야생-타입 RNA 순서를 기준으로 각 돌연변이 바인딩 사이트 다음 바인딩 선호도 결정 하기 위해 일련의 단백질 농도 사용 하 여 분석 (Kd 또는 평형 분리 상수); 관심사의 단백질에 대 한 Kd 50 %RNA 바인딩을 얻을 하는 데 필요한 단백질 농도 이다. 자세한 mutagenesis의이 노동 집약적인 과정 포함 세대 및 수많은 돌연변이의 분석-3 야생 타입 뉴클레오티드 바인딩 사이트에 있는 각 위치에 대 한. 따라서, RNA에 단백질 의무 사이트의 빠르고, 쉽고, 저렴 한 포화 mutagenesis에 대 한 다른 접근 방법에 대 한 필요가 있다.

여기, RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 포화 mutagenesis 있도록 단계 접근 방식을 설명 합니다. 그것은 사이트 내에서 바인딩, 각 phosphorothioate 뉴클레오티드와 별도 RNAs의 합성 및 단백질 외피 다음 바인딩된 분수의 절연 야생-타입 뉴클레오티드와 DNA 템플렛을도 핑 포함. 야생-타입 뉴클레오티드에서 간섭 결과 단백질 바인딩 부분에서 그들의 특혜 배제. 이 다음의 phosphodiester phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis 또는 PTM)를 포함 하는 요오드와 선택적 화학 분열 하는 젤 전기 이동 법에 의해 모니터링 됩니다. 이 단일 단계 포화 mutagenesis 접근 RNA에서 단백질 바인딩 사이트의 특성에 적용 됩니다.

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Protocol

참고: 그림 1 phosphorothioate mutagenesis에 대 한 개요를 제공 하 고 프로세스의 주요 단계를 요약.

1. 돌연변이 체의 도서관의 세대-야생 타입 뉴클레오티드와 DNA 템플렛을도 핑

  1. T7 뇌관 종합 (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') 화학 합성 DNA 합성기에 의해.
  2. 화학 합성 단백질 바인딩 사이트에 해당 하는 DNA 합성기에 의해도 핑된 oligonucleotide (보완 가닥) 음성 합성. 야생 타입 뉴클레오티드 (참조 대 한 자세한 내용은이 비율에 대표적인 결과)로 10 %T 90 %A 야생-타입 뉴클레오티드의 비율로 핑 X (아래)의 각 사이트에 대 한 화학 합성 하는 동안 phosphoramidites의 적절 한 혼합을 사용 합니다.
    참고: 여기,도 핑된 oligonucleotide의 순서는 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTG참조CTATAGTGAGTCGTATTAC-3 '. 밑줄이 그어진된 순서는 SXL 단백질 바인딩 사이트, 플러스 로드 컨트롤 되 고 뿐만 아니라, RNA에 모든 변경 영향을 확인 하는 유용한 컨트롤을 제공 하는 바인딩 사이트 밖에 서 추가 뉴클레오티드의 역방향 보완 비교 그리고 뉴클레오티드 바인딩 사이트 내에서 정상화. SXL 바인딩 사이트 시퀀스에에서 존재 하는 변압기 중 mRNA14,15,,1617, UUUUUGUUGUUUUUUUU 제안 된 방법론을 고안 하 사용 되었다. 기울임꼴로 시퀀스 T7 뇌관 순서에 무료 이며 생체 외에서 전사의 T7 발기인.

2입니다. RNA의 합성

  1. 앞에서 설명한18으로 20 µ L 녹음 방송 반응에서 RNA를 음성 합성.
    1. 믹스 T7 전사 버퍼와 1 µ M T7 oligonucleotide, 1 µ M 실수로 oligonucleotide, 10 m m dithiothreitol (DTT) 2mm GTP, 1 mM 각 ATP, CTP, UTP (guanosine, 아데노신, cytidine, 및 uridine 3 인산 염), 그리고 2 U / µ L T7 RNA 중 합 효소.
    2. 추가, 두 개의 별도 microcentrifuge 튜브 0.167 m m α-thio ATP 또는 0.05 m m α-thio UTP RNAs에 phosphorothioates (회로도 그림2에서 참조)을 통합 하.
      참고: 다른 프로토콜에 대 한도 핑된 oligonucleotide 뉴클레오티드 대체 남은 두 테스트를 포함 하는 적절 한 녹음 방송 반응에 0.2 m m α-thio CTP 또는 0.2 m m α-thio GTP를 추가 합니다.
    3. 2 h 37 ° c.에 대 한 RNA 합성 반응 혼합물을 품 어
  2. RNA 샘플을 2.5 µ L 열 정한 알칼리 성 인산 가수분해 효소와 2.5 µ L 10xphosphatase 버퍼를 추가 합니다. 5' 인산 염 제거를 37 ° C에서 10-30 분이 25 µ L 반응을 품 어.
  3. 2-5 분 동안 80 ° C에 난방에 의해 알칼리 성 인산 가수분해 효소 효소 비활성화.
  4. Dephosphorylated RNA의 5' 끝 radiolabel (5 pmole) 1 µ L T4 polynucleotide 키 니 아 제 1 µ L γ-32P ATP 10 µ L 반응 볼륨에서을 사용 하 여. 37 ° c.에 30-60 분에 대 한 반응 혼합을 품 어
  5. 20-30 분 동안 65 ° C에서 난방에 의해 T4 polynucleotide 키 니 아 제 효소 비활성화.
  6. 젤 전기 이동 법 polyacrylamide 젤을 변성 시키기 10%에 의해 RNA를 정화. Autoradiography 하 여 젤에 RNA를 찾습니다. 소비 세 포함 된 방사선된 RNA 젤 슬라이스, 피 펫 팁, 벽에 눌러 microcentrifuge 튜브에 크 러시와 가수분해 K (PK) 버퍼 (100 mM Tris, pH 7.5, 12.5 m m EDTA, 150 mM NaCl, 1% 나트륨 라우릴 황산 염)에 담근 다. 하룻밤에 2 h에서 실내 온도에 튜브를 회전 합니다.
  7. 원심 젤 슬러리, 젤 삭제 및 버퍼 솔루션을 수집 합니다.
  8. 페 놀-클로 프롬의 같은 볼륨으로 두 번 그리고 한 번 클로 프롬 솔루션을 추출 하 고 수성 단계를 수집 합니다.
  9. 아세트산 나트륨, pH 5.2, 캐리어 3 M의 수성 단계 0.1 볼륨에 추가 tRNA 또는 glycogen, 그리고 에탄올의 2.5 볼륨. 1 h-80 ° C에서 샘플을 유지.
  10. 16,873 x g에서 고속 microcentrifuge에서 5-10 분 샘플 원심 RNA 펠 렛을 방해 하지 않고 버퍼/에탄올 솔루션을 신중 하 게 제거 합니다.
  11. 70% 에탄올과 펠 릿을 세척 하 고 신중 하 게 2-5 분 제거 에탄올에 대 한 원심. 건조 한 공기에 있는 펠 릿.
  12. 20-50 µ L diethyl pyrocarbonate (DEPC)에서 펠 릿 resuspend-물 처리. -20 ° C에서 사용까지 저장 합니다.
    참고: 방사선된 RNA 방사능 으로부터 보호 하기 위해 적절 한 예방 조치 및 플 렉 시 유리 방패를 사용 하 여 모든 단계를 수행 합니다. 현재, 스핀 열 RNA의 젤 정화 대 안으로 비법 인된 방사능, 더 일반적으로 사용 되 고 더 편리 하 게 제거 하는.

3. 단백질 바인딩 반응 및 바인딩된 RNA의 분리

  1. 에 있는 재조합 형 단백질을 표현 하 고 대장균에서 정화.
  2. 분 광 광도 법에 의해 또는 알려진된 단백질 기준, 둔감 한 혈 청 알 부 민 (BSA) 옆 SDS polyacrylamide 젤에서 분리 하 여 재조합 단백질 농도 견적 한다. 얼룩이 Coomassie 화려한 블루 R-250와 젤 여 관심과 표준 BSA의 단백질을 시각화. 알려진된 양의 BSA 희석 동일한 젤에 비해 단백질 quantitate
    참고: 저장에서-80 ° C까지 사용 하 고 20 m m 4-(2-Hydroxyethyl) 희석 piperazine-1-ethanesulfonic 산 (HEPES), pH 8.0, 1 m m dithiothreitol (DTT), 재조합 단백질 0.2 m m Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA), 0.05 %NP-40, 20% 글리세롤. 사용 0.5-1.0 m m 프로 테아 제 억제 물 phenylmethane sulfonyl 불 (PMSF)는 선택 사항입니다.
  3. 10 mM Tris HCl, pH 7.5에에서 RNA 바인딩 반응 (20-100 µ L) 수행, 0.09 µ g / µ L 소 혈 청 알 부 민, 1 mM EDTA, 0.15 µ g / µ L acetylated 1mm DTT, 50mm KCl, 0.5 단위 / µ L RNase 억제제, tRNA, 5'-끝 방사선 RNA, 그리고 적절 한 농도 (a의 6 µ L 농도는 RNA의 50%는 단백질을 바인딩합니다) 단백질의.
    참고:이 바인딩 버퍼 3 RNA-바인딩 단백질에 대 한 작동 (SXL, U2AF65, 및 PTB), 그러나 관심사의 단백질에 대 한 표준화 해야 합니다. 약 50%를 얻을 하는 데 필요한 특정된 단백질 준비에 대 한 다양 한 희석을 사용 하 여 실험적으로, 단백질 농도 추정 RNA 바인딩. 이 조건 또는 Kd RNA 바인딩 곡선의 가장 민감한 부분을 나타냅니다.
  4. 단백질 바인딩 반응 (또는 얼음) 25 ° C에서 20-30 분 동안 품 어.
  5. 두 가지 방법 중 하나를 사용 하 여 언바운드 분수에서 단백질 바인딩 RNA 분수를 구분:
    1. Nitrocellulose 필터 바인딩
      1. 실 온에서 진공 매니폴드에 연결 nitrocellulose 필터에 바인딩 반응 (20-100 µ L)를 적용 합니다.
        참고:만 RNA-단백질 복잡 한 필터에 유지 하 고 필터를 통해 RNA 흐름을 언바운드. 필터 바인딩 접근 바운드 RNA의 높은 복구 수 이며 빠르고 간단 하 게, 젤 기동성 교대 분석 실험에 비해. DEAE 막 nitrocellulose 필터 아래에 배치 하 여 언바운드 RNA 분수 수집 또는 바운드 분수와 함께 비교에 대 한 RNA를 무료 수 이기도 합니다.
      2. Nitrocellulose 필터를 포함 하는 유지의 부분 microcentrifuge 튜브에 맞게 더 작은 조각으로 방사성 RNA 필터 조각 몰입할 충분 한 PK 버퍼 (300-500 µ L 포함 10-20 µ g PK)에 담가 잘라내어 필터에서 RNA elute 2-3 h 또는 하룻밤.
      3. 페 놀-클로 프롬, 클로 프롬로 추출 하 고 수집 수성 단계. 추가 나트륨 아세테이트, 에탄올, 냉장고에 부 화 한 후 원심, 세척, 건조 하 고 resuspend DEPC 처리 한 물에 RNA. 2.10에 2.14 위의 단계에서 설명한 대로 다음이 단계를 따릅니다.
    2. 젤 기동성 교대
      1. 준비 하 고 5% 기본 polyacrylamide 젤 유해 (후 60: 1 Acrylamide:bis-아크릴) 0.5에서 필터 바인딩 방법 하는 대신 바인딩 반응 시작 하기 전에 x TBE (표준 트리 스-Borate-EDTA 버퍼).
      2. 미리 콜드 룸 (4 ° C)에서 250 V 15 분 젤을 실행 합니다.
      3. 위의 사전 실행된 젤의 별도 우물으로 각 바인딩 반응 (위)를 로드 합니다.
        참고: 단백질 저장 버퍼 샘플 로드 웰 스에 대 한 충분 한 글리세롤을 제공 한다.
      4. 단백질 바인딩 RNA 젤 전기 이동 법 특정 단백질 및 RNA 크기에 따라 1 ~ 2 h에 대 한 250 V에서 차가운 방에 구분 합니다.
      5. Autoradiography 하 여 젤에 RNA-단백질 복합체의 위치를 찾습니다. RNA-단백질 복합물을 포함 하는 젤 슬라이스 삭제하시오 젤 조각 분쇄 하 고 PK 버퍼에 몸을 담글 하 여 젤 조각에서 RNA을 elute.
      6. 페 놀-클로 프롬, 클로 프롬로 추출 하 고 수집 수성 단계. 나트륨 아세테이트, 에탄올, 냉장고에 부 화 한 후 원심, 세척, 건조, 공기 더하고 DEPC 처리 한 물에 RNA를 resuspend. 2.10에 2.14 위의 단계에서 설명한 대로 다음이 단계를 따릅니다.

4. 돌연변이 뉴클레오티드 위치 검출을 위한 요오드 죽 습 Phosphorothioate 제품의 분석

  1. 20 µ L DEPC 처리 물 포함 최대 10 µ g 캐리어에에서 1mm 요오드를 추가 RNAs (바운드 및 총 RNAs) phosphorothioate 관의 사이트에서 다니엘에 tRNA. 5 분 동안 실 온에서 품 어.
    참고: 요오드 분열 약간 다른 조건에 세부 사항 더-7% (v/v) iodoethanol, 3 분 동안 95 ° C에서 난방-Gish & 엑스 타인과 198819에서 찾을 수 있습니다.
  2. 위에서 설명한 대로 추가 나트륨 아세테이트/에탄올, 쪼개진된 RNA 침전. 젤을 변성 시키기 위한 로드 염료에 resuspend. 열 및 RNA 조각에 15-20% 변성 polyacrylamide 젤 전기 이동 법으로 분리 하는 샘플을 로드 합니다.
  3. 노출 x-선 필름 polyacrylamide 젤.
  4. 총 풀 autoradiography를 사용 하 여 대 바인딩된 분수 밴드를 감지 합니다.
    참고: 배기 후드에 요오드와 모든 단계를 수행 합니다. 여기에 표시 된 RNA 분리,이 젤의 하단에 추가 인치 긴 스페이서를 삽입 하 여 젤 접시의 하단에 두 스페이서의 두께 두 배로 얻을 수 있다 쐐기 모양의 젤 채택 된다. 이 모양은 짧은 RNA 파편 사이 더 균일 한 또는 더 가깝게 간격을 허용 한다. 또는, 검색 및 방사능의 정량에 대 한 x 선 필름 보다는 phosphorimager는 사용할 수 있습니다.

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Representative Results

도 핑을 사용 하 여 포화 mutagenesis의 원리:

야생-타입 및 다른 뉴클레오티드의 적절 한 어 금 니 비율을 분석 하는 것입니다 한 위치 하는 경우에 모든 4 개의 뉴클레오티드의 동등한 혼합물을 사용 합니다. 그러나, 그러므로 동시에 여러 위치를 분석 비율의 비-야생 타입 야생-타입 뉴클레오티드를 조정 해야 합니다, 즉, 감소. 그렇지 않으면,이 하나의 대체 뿐만 아니라 있을 것입니다 또한 단일 뉴클레오티드 대체의 효과의 분석을 제외 하는 분자에 여러 야생 타입 뉴클레오티드와 함께 서식 파일. 따라서, 엄지손가락의 규칙으로 사용 비율의 비-야생 타입 1/n의 야생-타입 뉴클레오티드를 여기서 n은 분석을 위치 수입니다. 여기, 우리가 분석 10 위치 동시에 야생-타입 뉴클레오티드의 90%와 10%의 DNA 템플렛을도 핑에 대 한 야생 타입 뉴클레오티드를 포함 하는 혼합물을 사용 하 고. 별도 녹음 방송 반응, 각 녹음 방송 반응 4 phosphorothioates 중 하나 수행 완료 됩니다. 따라서, 각 반응도 핑된 위치에서 특정 염기를 모니터링합니다.

간섭으로 인해 분할의 원리:

여기에 제시 된 mutagenesis 접근, RNAs 평균에 분자 당 미만 1 phosphorothioate 잔류물이 있다. 바인딩, 단백질 바인딩 분수와 언바운드 분수 사이 RNA 분자 파티션 과정 중 Phosphorothioate 백본 결합의 분열을 특정 뉴클레오티드 phosphorothioate 링크에 연결 이므로 그 자리에서 특정 염기의 존재의 판독. 지정된 된 위치에는 뉴클레오티드 변경 될 때 바인딩에 아무런 영향을 미치지도 있을 수 있습니다 그것은 또는 부분적으로 또는 완전히 바인딩을 억제 수 있습니다 예상 된다. 경우 특정 뉴클레오티드의 존재에는 아무 영향이 바인딩 단백질-바운드 및 언바운드 분수 사이 동등 하 게 분할 됩니다. 그러나, 주어진된 위치에 특정 뉴클레오티드 단백질 바인딩 방해 하는 경우 그것은 우선적으로 제외 됩니다 단백질 바인딩 부분에서. 방해의 정도 각 젤 전기 이동 법에 따라 동일한 반응에 있는 위치에 대 한 양적 모니터링할 수 있습니다. 이 개념은 도식 (그림 3)에 나와 있습니다. 총 RNA 분수 (레인 T), 밴드 강도 이며 모든도 핑된 위치 (밴드 1, 3-7)에 대 한 합니다. 위치 1, 4, 7에서 온 단백질 바인딩 RNA의 분수 (레인 B),는 뉴클레오티드에 바인딩에 영향을 주지 않습니다 합니다. 그러나, 위치 3과 6에 그것은 바인딩을 방해 하 고 따라서 바운드 분수에서 제외 됩니다. 5 위치에서 간섭 부분입니다. 따라서, 모든 4 개의 뉴클레오티드의 분석 4 짝된 레인, T와 B 각 뉴클레오티드의 비교 하실 수 있습니다. 그럴 경우, 단백질 바인딩에 RNA 등뼈에 유황의 효과를 반영 하는 주어진된 위치에 대 한 그 야생-타입 뉴클레오티드를 지적 했다.

함께 autoradiograph (그림 4) 변성 젤 (총 풀 T)와 B 바인딩된 분수에서에서 레인의 두 쌍 (α-thio A와 α-thio U)를 보여 줍니다. 레인 (T와 B)의 각 쌍 사이 각 위치에 밴드의 강도 비교 하 여 여러 가지 관측을 만들 수 있습니다. 첫째, 젤, 즉, uncleaved 제품, 모두 α-thio의 상단에 신호의 대부분은 레인과 α-thio U 레인. 둘째, α-thio A 쌍 레인, 여러 밴드 (요오드 분열 제품)는과 총 RNA 분수 1; 위의 예를 들어 밴드는 동일 α-thio는 레인에 대 한 바인딩 사이트 내 관련 밴드 참조 번호가 지정 됩니다. 셋째, 젤의 하단에 밴드는 더 밀접 하 게 간격 (예를 들어, 아래 6 밴드)을 시퀀싱 젤에 대 한 일반적인 것 보다. 넷째, 여러 밴드는 총 RNA 분수에 존재 하지만 결 석 또는 바인딩된 RNA 분수 (예: : 밴드 1, 2, 3, 및 5)에 크게 감소. 다섯째, α-thio U 레인 쌍에 대 한 있지만 대부분 밴드는 총 및 바운드 차선 사이 비교 일부 밴드 되지 않습니다 바인딩된 분수 (예: : 밴드 7, 8)에 상대적으로 덜 긴장.

이 새로운 메서드 및 다음과 같은 결론을 리드의 성공적인 개발에 대 한 증거를 제공 하는 이러한 관측: 첫째, RNA의 대부분은 쪼개진 때문에 α-thio A 쌍 차선 및 α-thio U 차선, 쌍에 대 한 제공 증거의 단지 작은 분수 RNA를 포함 수정 또는 phosphorothioate 잔류물. 이 RNA 분자 개 이상의 phosphorothioate 잔류 물질이 확인 하기 때문에 중요 하다. Α-thio A와 α-thio U 대 한 두 개의 차선 사이 바인딩 사이트 이외의 여러 밴드에 대 한 두 번째, 동일 하거나 유사한 농도 로딩은 두 차선, 차선 사이 쉬운 비교를 허용에 대 한 비교를 보여 줍니다. 셋째, 더 가깝게 간격을 둔 밴드 α-thio A와 α-thio U, 젤 (상단에 얇고 하단에 두꺼운)의 쐐기 모양으로 따라서 더 이상 시퀀스 읽기의 분석을 허용 하 고 더 높은 해상도 제공 하 고, 달성 된다. 일반적으로, 짧은 조각은 더 넓게 간격을 젤에 균일 한 두께와. 넷째, 실종 또는 바운드 분수에 특정 밴드의 감소 된 강도 야생-타입 뉴클레오티드 우선적으로 바인딩된 분수 (α-thio A)에서 제외 되었음을 나타냅니다. 바운드 레인 내 다른 밴드의 상대 농도 또한의 다른 위치에서 야생 타입 잔류물 간섭 정도 대 한 정량적 인 정보를 제공합니다. 즉, 돌연변이 또는 특정 위치에서 야생 타입 뉴클레오티드 단백질 바인딩 방해합니다. 마지막으로, 비 브리지 oxygens (α-thio U) 중 하나에서 백본 황 대체 (phosphorothioate)의 효과 테스트, 3 순위 백본 sulfurs (예를 들어, 6, 7 및 7 아래)에서 작은 효과 보여 보여 줍니다. 우리의 결합 된 결과 바인딩 사이트 내에서 여러 위치 특혜 실종을 표시 하거나 바운드 분수에 특정 밴드의 농도 감소를 보여 줍니다. 이것은 단백질 (α-thio A) 바인딩 사이트에 있는 특정 기지와 상호 작용을 나타내는 자료 보다는 백본 대체. 한편, α-thio C의 표시는 간섭 패턴 α-thio a 비교 그러나만 3-4 α-thio G 대체 표시 작은 감지 간섭 중심, 예를 들어 위치 번호 2와 3 (데이터 표시 되지 않음). 이 방법은 어떻게 접합 진압 SXL 및 일반적인 접합 계수 u 2 snRNP 보조 요소 (U2AF65) 바인딩할는 동일한 사전-mRNA 접합 신호 순서 (polypyrimidine로)15 가지 방식에서에 차이 나타내기 위해 사용 되었습니다. .

Figure 1
그림 1: 키의 순서도 단계 phosphorothioate mutagenesis (PTM). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 요오드에 의해 화학적으로 죽 습 있을 수 있습니다 두 개의 뉴클레오티드의 phosphorothioate 연동의 도식. 황 인산 비 브리지 oxygens의 한을 대체합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 간섭 때문에 분할의 원칙. 가상 RNA 단백질 바인딩 사이트를 포함 하 여 6 개의 위치에 대표적인 α-thio 뉴클레오티드를 포함 합니다. 단백질 바인딩 다음 RNA 요오드에 의해 phosphorothioate 관의 사이트에서 죽 습 이다. 위치 1-7 및 바인딩 사이트 내에서 임의로 참조 텍스트에 대 한 번호가 지정 됩니다. 위치 2 또는 누락 된 밴드 phosphorothioate 법인 또는 마약에 취해 비 뉴클레오티드를 나타냅니다. 레인 T 총 RNA 이며 레인 B는 단백질 바인딩 RNA. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: Phosphorothioate mutagenesis (PTM) 접근 방식은 수 polypyrimidine-로/3의 포화 mutagenesis' 사이트 변압기 사전 mRNA에 결합. 레인 T 총 RNA 이며 레인 B는 단백질 바인딩 RNA. Α-thio 나타냅니다 RNA α-thio ATP의 합성 하 고 시퀀스에 α-thio adenosines와도 핑된 위치를 식별 합니다. 3 강한 밴드 그 위치에서 순서에 adenosines에 해당합니다. Α-thio U α-thio UTP의 합성 RNA를 나타냅니다 하 고 시퀀스에서도 핑된 위치를 포함 하 여 모든 uridines를 식별 합니다. 왼쪽에 세로 라인 SXL 바인딩 사이트를 표시합니다. 바인딩 사이트 내 위치 1-8 참고 목적 및 결과 섹션에서 설명의 용이성을 위해 번호가 지정 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

Mutagenesis은 긴 단백질 바인딩 사이트 특성에 사용 되었습니다. 첫째, 돌연변이의 시리즈 구성 하 고 바인딩 바인딩 선호도에 미치는 영향을 분석 하는 분석에서 개별적으로 테스트 될 수 있습니다. 기준이 mutagenesis 접근 여러 시퀀스를 분석 하는 방법을 제공 하는 동안 여러 단계 돌연변이 구성 하 고 바인딩 각 돌연변이 대 한 반응의 일련과 같은 표준 접근에, 힘들고 시간이 걸리는 이며 하지 않을 수 있습니다. 특히 긴 시퀀스에 대 한 포화 mutagenesis 허용. 둘째, 시퀀스를 무작위 수 있습니다 고 수영장 사용 여러 사이클 바인딩 및 중 합 효소 연쇄 반응의 증폭 (PCR). 이러한 시퀀스 단백질을 복제 하 고 식별 하 고 일치 시퀀스에서 바인딩 사이트 유효성을 시퀀싱 할 것 이다. 그럼에도 불구 하 고,이 반복 바인딩 및 증폭 옵션 여러 단계를 포함 하 고 확인 하는 바인딩 사이트 내에서 중요 한 잔류물에 힘 드는입니다. 또한, 반복된 시퀀스 확대 PCR에 시퀀스 바이어스를 발생할 수 있습니다. 셋째, 임의의 풀에서 선택한 시퀀스 그것은 상대적으로 저렴 하지만 높은 처리량 시퀀싱의 빠른 옵션을 사용 하 여 시퀀싱 수 있습니다. 따라서, 여러 단계, 힘 드는 또는 비싼 방법의 이러한 한계를 극복 하기 위해 고안 빠르고, 저렴 한, 그리고 가장 중요 한 것은 단일 단계 방법, 설명, 바인딩 사이트 (PTM)의 포화 mutagenesis 달성 하기 위해.

이 접근에 주요 단계 식별 또는 야생-타입 nucleotide(s)의 태그 포함 됩니다. 우리 phosphorothioate 뉴클레오티드는 인산 염에 oxygens의 어느에서 백본 유황, 바뀌는 사용 설명된 (그림 2). 장점은 요오드 화학적 다니엘 phosphorothioate 뉴클레오티드의 중추를 사용할 수 있습니다. 따라서, phosphorothioate 백본 포함 된 RNA 기판의 요오드 분열 생성 시퀀싱 형 사다리, 분열의 사이트는 프록시 또는 4의 존재에 대 한 태그 위치에 기초 합니다. 언바운드 및 총 분수의 비교 우선적으로 바인딩된 분수에서 제외 되 고 따라서 단백질 바인딩 위한 중요 한 잔류물을 식별 합니다. 대조적으로, 잔류물 바인딩을 위해 중요 하지 않은 두 분수 사이 동등 하 게 분산 유지. 이 방법은 어떤 RNA 의무적인 단백질에 대 한 바인딩 사이트 정의를 사용할 수 있습니다.

요약 하자면, 원스텝 포화 mutagenesis 이렇게도 핑, phosphorothioates, 및 요오드 분열, 결합 RNA에 바인딩 사이트의 특성에 대 한 강력한 수단을 제공 합니다. 그러나,이 방법은 바인딩 사이트 mutagenesis 전에 이미 알려진 해야 합니다. 또한, 단백질-바인딩 조건 각 단백질에 대 한 최적화 해야 합니다. 다음 주의 사항을 강조 될 필요가 있다. RNA 처리에 대 한 주의 같은 장갑, 솔루션 및 DEPC 처리 물, 압력가 마로 소독 피 펫 팁, 튜브, 버퍼의 준비를 착용 하 고 RNA에 대 한 장비를 누리고 RNAses를 피하려고만 사용 행사 해야 합니다. 마찬가지로, 방사능 방패, 방사성 방사성 물질을 사용 하 여 하는 것은 필수, 모니터링을 포함 하는 관심과 유해 화학 물질을 사용 하는 동안 배기 후드의 사용 필요 하다.

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Disclosures

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

Acknowledgments

저자는 건강의 국가 학회는 지난 자금에 대 한 감사 위한 그리고 감사 마이클 R. 그린 oligonucleotides 합성.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Uridine 5’ a-thio triphosphate NEN (Boston, Massachusetts) NLP-017
Adenosine 5’ a-thio triphosphate NEN (Boston, Massachusetts) NLP-016
Vacuum manifold Fisher Scientific XX1002500 Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter
Vacuum manifold Millipore XX2702552 1225 Sampling Vacuum Manifold
Nitrocellulose Millipore HAWP
Nitrocellulose Schleicher & Schuell PROTRAN
Dephosphorlyation Kit NEB M0508
T4 Polynucleotide Kinase NEB M0201S
Proteinase K NEB P8107S
T7 RNA polymerase NEB M0251S
RNasin Promega RNase inhibitor
Glass Plates Standard Standard
Gel Electrophoresis equipment Standard Standard
X-ray films Standard Standard
Polyacrylamide gel solutions Standard Standard

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References

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