酵母4 チオウラシルの定量化とラベリング代謝新しく合成された mRNA RNA ポリメラーゼ II の活性のためのプロキシとして

Genetics

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Summary

ここで説明されているプロトコルは、4-チオウラシルが付いた酵母から精製した新しく合成された mRNA のゲノムワイドな定量化に基づいています。このメソッドは、mrna から非 mRNA 合成を測定することができ、したがって、RNA のポリメラーゼ II のトランスクリプションの正確な測定を提供します。

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Baptista, T., Devys, D. Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity. J. Vis. Exp. (140), e57982, doi:10.3791/57982 (2018).

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Abstract

RNA ポリメラーゼ II の転写で世界的な欠陥は、トランスクリプトーム研究は、定常状態の RNA を分析によって見落されるかもしれない。確かに、mRNA 合成の世界的な減少は通常定常状態レベルを復元する mRNA 分解の同時減少で補償されるように示されています。したがって、mrna から独立して、mRNA が合成のゲノムワイドな定量化は RNA ポリメラーゼ II の転写活性の最高の直接の反射です。ここでは、酵母(出芽酵母) における初期の rna 代謝ラベリングの非摂動法について述べる。具体的には、ウラシル、アナログ 4-チオウラシルと 6 分のため培養されるセルとラベル新しく転写された Rna の精製しすべての個々 の mRNA の合成レートを決定する定量化します。さらに、内部標準により異なる酵母mRNA 合成の比較として分裂酵母細胞のラベルを使用して系統。このプロトコルを使用して、継ぎ手の動的な運動モデルとデータは、対応する mRNA の腐食率を決定できます。

Introduction

セルは、内因性と外因性手がかり、その遺伝子発現プログラムの動的変化に対応します。近年、ゲノム手法の途方もない開発は、さまざまな条件でトランスクリプトーム変更に関する正確な包括的な記述をことができます。ほとんどのトランスクリプトーム研究でマイクロ アレイ交配または高スループット シーケンスは合計定常 RNA 画分からの RNA レベルの定量化に使用されます。転写の変更特定の摂動の下では、特定の遺伝子の表現の変更やアップまたはダウンレギュ レート遺伝子の大きいスペクトルの可能な結果の広い範囲を表示できます。遺伝子発現調整の平衡の結果である- または定常状態-RNA ポリメラーゼが RNA 合成と RNA のレベルに影響を与える他のプロセスの間。Rna ポリメラーゼ II の転写は高度および複雑な mRNA や劣化、翻訳、細胞質のエクスポート処理に関連付けられているが (開始、延長および終了) の 3 つの段階を含みます。

いくつかの最近の研究は Mrna 合成と崩壊結合メカニズムが、とき定常状態の総 RNA 転写効果突然変異または刺激を見落とすことができる示した。まず、常に mRNA の定常状態レベルの分析を通して転写変化の検出は、Mrna の半減期に依存します。摂動を導入すると、短い半減期を持つ Mrna のそれらより長い半減期を持つ Mrna の定常状態レベルにはるかに少ない影響します。したがって、RNA 合成の変化の検出能転写率のダイナミックな変化を明らかにする長寿命の mRNA 種の解析が失敗する中短時間の成績証明書を支持してバイアス強くされています。第二に、いくつかのレポートは、酵母や哺乳類の両方で、転写でグローバルな変更は見落されるかもしれない mRNA の定常状態レベルを解析するとき示されています。これは mRNA 合成と分解の mRNA のバッファリングの結果をリンク機構による可能性が高いです。これは新たに転写された mRNA の解析による劣化から非 mRNA 合成を定量化する新しいプロトコルの開発を促した。近年、グローバル実行シーケンス (GRO seq)1、配列 (NET seq)2,3ネイティブ伸長トラン スクリプトなど、いくつかの選択肢が提示されています。ここで、当初哺乳類セル4,5,6で開発され、酵母7,8,9,10に適応し、プロトコルを紹介して 11, RNA のチオール ヌクレオシドまたは基本アナログで分類に基づく 4-thiouridine (4sU) または 4-チオウラシル (4tU)、それぞれ。

このメソッド具体的には浄化する RNA の細胞から新しく転写 RNA が細胞の恒常性の干渉のほとんどない、4sU 付けパルス。したがって、セルは、4sU にさらされれば、一度、分子は急速に有った、4sU 三リン酸にリン酸化し、転写される Rna に組み込まれているです。(RNA の定常状態レベルに対応する)、総細胞 RNA を抽出することが可能だし、その後、4sU 標識 RNA の一部分はチオール具体的に、パルス標識を変更した後、ビオチン間のジスルフィド結合の形成につながると新しく転写 RNA4,5。ただし、4sU は人間の平衡ヌクレオシド輸送体 (hENT1)、出芽か分裂酵母で、すぐに使用を防止するよう、ヌクレオシド輸送体の発現している細胞によって取り込まれたをできるだけです。酵母は、ヌクレオシドの運送者10,の式を必要とせず、4tU を取ることができるので変更された基本 4tU を使用してより簡単なアプローチを実現できますs.pombe出芽酵母hENT1 で表現できる 1 つ間11,12,13。 実際には、4tU の代謝は酵素ウラシル phosphoribosyltransferase (UPRT) の活動を必要とします。酵母がない哺乳類を含むいくつかの生物では、UPRT はウリジル酸にウラシルをリサイクル ピリミジンの海難救助の細道に不可欠です。

並行分析の異なるサンプル間の正規化でトランスクリプトーム研究に重要なバイアスを導入できます。確かに、多くの逸脱要因を及ぼします変異体と野生型株のトランスクリプトームの比較分析: セル換散の効率の抽出と RNA およびマイクロ アレイ解析用スキャナーの調整で差異の回復の違い、他の中で。前述したように、RNA ポリメラーゼ II の転写で世界的な効果が期待されるときそのような変化は特に誤解を招くできます。異なるサンプル間の mRNA 合成率を正確に比較するエレガントな意味は、内部標準として遠縁分裂酵母分裂酵母を使用してによって設計されました。そのため一定数のラベル, 分裂酵母出芽酵母のサンプルは、野生型や突然変異細胞、セル換散および RNA 抽出10前にセルが追加されます。その後、 , 分裂酵母酵母から定常状態と新たに合成された Rna は RT qPCR または経由でマイクロ アレイ チップまたは高スループット シーケンス10の使用によって明らかにした.速度論的モデリングとこれらのデータを組み合わせて、mRNA 合成と出芽酵母における崩壊の絶対速度を測定できます。

この原稿のフレームワークでどの新たに転写された RNA の解析は新進の RNA ポリメラーゼ II の転写のコアクチベーター複合体佐賀と (ディスインテグリン) 酵母14,15のためにグローバル ロールを明らかにするため許可されて表示されます。 16。重要なは、過去の研究は出芽酵母の定常状態の mRNA のレベルを定量化し、佐賀が佐賀で突然変異によって強く影響を受けるが (ディスインテグリン) に比較的耐性酵母遺伝子の限定セットに支配的な機能を果たしていることが示唆されました。突然変異17,18,19。驚いたことに、佐賀酵素は RNA ポリメラーゼ II の転写でこの co 活性剤のより広範な役割を示唆して、全く転写ゲノムに関する法律に示されていた。減少で最も発現遺伝子の RNA ポリメラーゼ II 新卒を募集していた佐賀またはこれらし、コアクチベーターがほとんど遺伝子で一緒に仕事することを示唆している (ディスインテグリン) の不活化に.したがって、新たに転写された mRNA の定量化は、佐賀と (ディスインテグリン) が RNA ポリメラーゼ II14,15,16でほぼすべての遺伝子の転写に必要なことを明らかにしました。代償機構の実装は、細胞 mRNA 分解同時グローバル減少によってバッファリングは mRNA 合成の世界的な減少に対処するための方法として現れます。転写因子 tfiih が不安定21,22 一般、調停コアクチベーター複合20RNA ポリメラーゼ II の転写、RNA Pol II サブユニット10など全体に影響を及ぼす因子のリストに追加します佐賀と間接的に、mRNA 分解機械9,10,23の要素。そのような代償的なイベントは佐賀変異体の mRNA 合成14のグローバルかつ深刻な減少にもかかわらず定常状態の mRNA のレベルのささやかな、限られた変更を会計で普遍的に観察されました。同様の分析は、ヒストン H2B のユビキチン化の完全な損失の結果BRE1の削除のひずみで行われました。酵母の新規転写された RNA の代謝ラベリングすることができます検出し、mRNA の変化の広い範囲を定量化することを示す、Bre1 の不在で、穏やかな、一貫したグローバルに大きな影響 RNA ポリメラーゼ II の転写を検出できる興味深いことに、合成料金です。

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Protocol

1. 細胞培養と佐賀のサブユニットのラパマイシン枯渇

  1. 酵母ひずみと複製は、野生型を含むまたは制御系統は ypd 培地 (2% ペプトン、1% 酵母エキス、グルコース 2%) 5 mL に新鮮なプレートから単一コロニーを接種します。
  2. 定数撹拌 (150 rpm) 30 ° C で一晩出芽酵母細胞を成長します。
  3. 600 の光学濃度を測定 nm (外径600) ypd 培地約 0.1 で 100 mL の OD600文化を希薄化し、OD600が約 0.8 まで育てましょう。
  4. 並行して、50 mL [はい] 媒体の上に新鮮なプレートから, 分裂酵母細胞の単一コロニーを接種する (0.5% 酵母エキス; 250 mg/L アデニン、ヒスチジン、ウラシル、ロイシン、リジン; 3% グルコース) と定数撹拌 (150 32 ° C で一晩細胞を成長rpm)。
  5. S.pombe一晩文化の外径600を測定し、[はい] 媒体の約 0.1 で 500 mL の OD600文化を希釈、外径600は約まで育てましょう 0.8。
  6. それぞれの酵母アンカー距離歪みおよび複製、制御系統、または野生型を含む ypd 培地 (2% ペプトン、1% 酵母エキス、グルコース 2%) 5 mL に新鮮なプレートから単一コロニーを接種します。
  7. セル定数撹拌 (150 rpm) 30 ° C で一晩を育てなさい。
  8. 次の朝、外径600を測定、ypd 培地約 0.1 で 100 mL の OD600文化を希釈し、OD600≈ 0.8 まで育てましょう。
  9. 1 mg/mL (1 μ g/mL の濃度最終ラパマイシン) の原液から文化に rapamycin の 100 μ L を追加し、30 ° C 核 (から条件付きで枯渇する興味の蛋白質のために必要な時間の定数撹拌インキュベート細胞通常、30 分は十分) です。コントロールのようなイースト文化を使用、ラパマイシンを追加するには、代わりにジメチルスルホキシド (DMSO) の同等のボリュームを追加します。

2. 4tU としてスパイク (カウント) s.pombeのラベリング

  1. 2 M 4-チオウラシルの新鮮なソリューションを準備します。準備が整うと、部屋の温度、光から離れてそれを保ちます。
    1. 正確に出芽酵母カルチャごとに 4 チオウラシル 64.1 mg の重量を量る、ジメチルホルムアミド (DMF) の 250 μ L または DMSO の 250 μ L に溶解します。
    2. スパイクとして使用するs.pombe文化 4-チオウラシル 320.5 mg の重量を量るし、DMSO の 1,250 μ L に溶解します。
  2. 最終濃度 5 mM の出芽酵母 s.pombe文化 4-チオウラシル ソリューションを追加し、それぞれ 30 ° C、32 ° C で一定の攪拌と 6 分のためそれらを孵化させなさい。
  3. 6 分後に、各文化のセルをカウントするための小さい因数を削除します。セルの自動カウンターまたはノイバウアー チャンバーを使用してセルをカウントします。
  4. 4 ° C で 5 分間遠心分離 (2,500 x g) からのセルを収集します。
  5. (2,500 x g、4 ° C、5 分) 冷たい 1 × PBS と遠心分離機を再び細胞を洗い、上澄みを廃棄します。
  6. 出芽酵母分裂酵母米のサンプルのそれぞれのセルの合計数を計算します。
  7. 5 mL の冷たい 1x PBS で細胞を再懸濁し、酵母を混ぜて, 分裂酵母細胞比率は 3:1。
  8. 遠心分離機の細胞 ( g、4 ° C、5 分 x 2,500)、PBS、フラッシュ凍結細胞を液体 N2、取り出して保管-80 ° c サンプルまでさらに使用します。

3. RNA の抽出と DNase 処理

  1. 約 20-30 分間氷の上細胞を解凍します。
  2. 酵母 RNA 抽出キット (材料表) を使用して、いくつかの適応を持つ RNA の抽出を続行します。
  3. 各サンプルごとには、キット付属 1.5 mL スクリュー キャップ チューブに冷たいジルコニア ビーズ 750 μ L を注ぐ。各チューブあたり最大 109細胞からの RNA が効率的に抽出する注意してください。したがって、チューブ各サンプルに必要な数を準備します。たとえば、100 mL (外径600≈ 0.8) の酵母培養は約 2 × 109 3 x 10 の9セル、2.7 x 10 の合計に至るまでをレンダリングできます (後米酵母の 3 分の 1 でスパイク合計で 4 x 10 の9セルに9細胞)。この場合、各サンプル/条件/変異/複製あたり 3-4 反応チューブにアップが必要になります。
  4. 各 1 x 10 の9セルあたりキットに付属の換散バッファーの 480 μ L、10 %sds の 48 μ L とフェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール (25:24:1, v/v/v) 480 μ L を追加します。
  5. 渦のミキサーを使用してセルをミックスし、冷たいジルコニア ビーズを含むチューブに転送。
  6. ボルテックス ミキサー アダプター チューブに対応し、最大速度で渦を有効に 10 分 (4 ° c の部屋) で酵母を溶解するために打ちます。また、自動ビード ・ ビーターで細胞の換散を実行します。
  7. 室温で 5 分間 16,000 x gでチューブを遠心し、慎重に上部の段階 (RNA 含有相) を収集し、15 mL の新鮮なファルコン チューブに。通常、各管ごとリカバリ ボリューム周りは 500-600 μ L。
  8. 部分的に浄化された RNA を含む 15 mL チューブ、キットとミックス徹底的に提供される結合バッファーを追加します。それぞれ 100 μ L の RNA 溶液、1 結合バッファーの 350 μ L を追加 (すなわち、水溶液相解量が 600 μ L、2.1 mL の結合バッファーする必要があります追加する)。
  9. 前の混合物に 100% エタノールを加えて混和します。それぞれ 100 μ L の RNA 溶液、あたり 100% エタノールの 235 μ L を追加 (すなわち、水溶液相解量が 600 μ L、エタノールの 1.41 mL を追加)。
  10. 最大 700 μ L フィルター カートリッジに 3.9 のステップからの混合物のコレクション チューブで組み立てキットに付属の両方を適用します。
  11. 16,000 x gで 1 分間遠心します。遠心時間総量はフィルターを通過するための十分ではなかった、もし 30 の遠心分離を繰り返す s。
  12. 流れを破棄し、同じコレクションの管を再利用します。フィルターと 16,000 x gで再び 1 分間遠心する RNA 結合バッファー エタノール溶液のもう一つの 700 μ L を追加します。
  13. 流れを破棄し、RNA ソリューションが完了するまで 3.11 と 3.12 の手順を繰り返します。
  14. 2 フィルターを洗う洗浄ソリューション 1 700 μ L と x。1 分 16,000 × gで遠心分離を介して洗浄ソリューションを収集し、常にコレクションの管。
  15. 2 フィルターを洗う洗浄ソリューション 2 500 μ L と x。1 分 16,000 × gで遠心分離を介して洗浄ソリューションを収集し、常にコレクションの管。
  16. 16,000 x gフィルターを完全に乾燥する 1 分でもう一度チューブを遠心します。
  17. 最終的なコレクション チューブ (RNA に適したチューブ) にフィルター カートリッジを転送し、50 μ L の DEPC 処理、RNase フリーの H2O (100 ° C に予熱) で RNA を溶出します。
  18. 16,000 x gで 1 分間遠心します。
  19. 予熱した DEPC 処理 RNase フリー H2O を確認すべてのボリュームが、フィルターを通過したことの 50 μ L で再び (同じチューブ) に RNA を溶出します。それ以外の場合、長い期間の遠心分離機します。
  20. 1 つの検体を複数のチューブを使用している場合は、すべて 1 つの管のプールします。
  21. 定量化し、適切な機器を使用してサンプルの純度を確認してください。
    注: 4tU は新たに合成された RNA 内に組み込まれただけ、間マイナーな DNA の混入の可能性があります。そのため、サンプルは DNase を治療することをお勧めそれは常に私。そのため、試薬製造元の推奨事項に従う RNA 抽出キット (材料表) に付属を使用します。

4 新たに合成された RNA のチオール固有ビオチン化

  1. 2 mg/mL にプロトコルのセクション 3 で得られた RNA 濃度を調整します。総 RNA の 200 μ g 因数は 60 ° C で 10 分間加熱し、2 分間氷の上それをすぐに冷やします。
  2. RNA 因数を次の順序で下記試薬を追加: DEPC 処理、RNase フリー H2O、100 μ L (100 mM トリス-HCl 【 ペーハー 7.5 と 10 mM EDTA、DEPC 処理、RNase フリー H2O) ビオチン化バッファーの 600 μ L、200 μ L1 mg/mL ビオチン-HPDP DMSO の DMF のストックからビオチン HPDP。
    1. いくつかの状況でビオチン HPDP ソリューションは、可能性が高い水に難溶のため、沈殿する傾向があります。このような状況では、DMSO/DMF の音量を上げる反応量の 40% まで (RNA サンプルを 400 μ L の DEPC 処理 H2O、ビオチン化バッファーの 100 μ L とビオチン HPDP の 400 μ L から追加 0.5 mg/mL 在庫)。
  3. 室温でサンプルをインキュベートし、穏やかな動揺と、3 h の光から保護します。
  4. インキュベーション後、チューブにクロロホルムのほぼ等しい量を追加し、精力的にミックスします。
  5. 4 ° C で 5 分間 13,000 x gでサンプルをスピンします。この手順は、ない biotinylate RNA をしなかった余分なビオチンを削除できます。また、位相ロック チューブ (重い) を使用してこの手順を実行します。そのため、13,000 × gで 1 分の位相ロック チューブ スピンダウン、積極的にそれらをミックスし、4 ° C で 5 分間 13,000 × gで遠心分離機に RNA の混合物、クロロホルムの等しい量を追加
  6. 慎重に上部の段階を新しい 2 mL チューブに転送します。
  7. 5 M の NaCl の量の 10 分の 1 を追加し、サンプルを混ぜます。
  8. イソプロパノールの等しい量を追加、サンプルを混和、4 ° C で少なくとも 30 分、13,000 x gでスピン
  9. 慎重に上澄みを除去し、冷えた 75% エタノール 1 mL を加えます。
  10. 4 ° C で 10 分間 13,000 x gでスピンします。
  11. 慎重に上清、クイック スピン チューブを外し、残りのエタノール溶液。RNA の餌が乾燥しないことを確認します。
  12. DEPC 処理、RNase フリー H2o. の 100 μ L の RNA を中断します。

5. 新生画分ストレプトアビジン コートした磁気ビーズを使用して合計とラベルの RNA の浄化

  1. 65 ° C で 10 分間のビオチン標識 RNA を加熱し、5 分間氷の上のサンプルでリラックスします。
  2. (200 μ L の最終巻) にビオチン標識 RNA にストレプトアビジン コートした磁気ビーズの 100 μ L を追加します。具体的より一貫性のある、信頼性の高いにこれらに見えた他の研究所との会話後以来、材料表に示されているビーズを使用することをお勧めします。
  3. 90 分間、室温のわずかな揺れでサンプルをインキュベートします。
  4. マグネット スタンドでキットレンズ (材料表) 提供される列を配置します。
  5. 常温洗浄バッファーの 900 μ L を追加 (100 mM トリス-HCl 【 ペーハー 7.5、10 ミリメートルの EDTA、1 M NaCl と 0.1% Tween 20 DEPC 処理、RNase フリー H2O) (事前実行および平衡) の列に。
  6. ビーズ/RNA の混合物 (200 μ L) を列に適用されます。
  7. 1.5 mL チューブの流れを収集し、同じ磁気列に再び適用すること。必要に応じて、ラベルの RNA の一部分を表すのでこの流れを維持します。
  8. 5 列を洗う洗浄液の増加に伴い x (600、700、800、900、および 1,000 μ L)。
  9. 0.1 M の DTT の 200 μ L で新たに合成された RNA を溶出します。
  10. 0.1 M の DTT の等量を第 2 溶出、3 分後を実行します。
  11. RNA を溶出後 0.1 量 3 M NaOAc (pH が 5.2)、冷えた 100% エタノールの 3 つの容積および 20 mg/mL グリコーゲン (RNA グレード) の 2 μ L を追加し、-20 ° C で、RNA の沈殿物一晩
  12. 遠心分離 (13,000 x gで 4 ° C, 10 分間) によって RNA を回復し、15 μ L の DEPC 処理、RNase フリーの H20 でそれを再懸濁します。ラベル ・総 RNA の割合は約 2%-4% (通常以上最下部)、新たに合成された RNA の約 2.0 μ g をレンダリングをする予定です。この量は、マイクロ アレイ/シーケンス解析だけでなく、いくつかの qPCR 実験を行うのに十分です。

6. RT qPCR の異なる画分の検証

  1. 製造元の指示 (材料表) に従って総 RNA の 2 μ g またはランダムな hexamers と選択、逆転写酵素を使用してラベル付けされた RNA の 10 μ L から cDNA を合成します。
  2. 標準的なプロトコル (資材表) を使用してリアルタイムの qPCR による cDNA を増幅します。
    注: すべてのサンプルは、2 つの生物学的複製の最小値から 3 通実行する必要があります。S.pombeチューブリンの式のすべての raw 値を修正します。

7. マイクロ アレイの交配

  1. 製造元の指示に従って最寄りのマイクロ アレイ チップに RNA サンプルを交配させなさい (この特定のプロトコルでは、材料の表を参照してください)。簡潔の準備ビオチン標識 cRNA 目標 150 から製造元の指示に従ってプレミアの RNA 増幅キット (資材表) を利用した RNA の ng。16 h 45 ° c およびマイクロ アレイ チップ 60 rpm の断片化の cRNAs の 4 mg を交配させます。
  2. 洗浄、染色、および指定された駅と (材料表) のスキャナーを使用してチップをスキャンします。コマンド コンソール (AGCC、バージョン 4.1.2) を使用してスキャンした画像から生データ (セル強度ファイル) を抽出します。
  3. 式コンソールのソフトウェア バージョン 1.4.1 プローブ セット地球スケールの正規化方法として既定の設定と統計情報を用いたアルゴリズム MAS 5.0 を使用して信号強度を計算すると CEL ファイルをさらに処理します。
    注: 各チップのトリム平均ターゲット強さは任意に 100 に設定。少なくとも 2 つの独立した生物学的複製を使用してすべての実験を実行します。S.pombe信号に raw データを正規化し、合計と新たに合成された RNA レベルでのフォールドの変更を計算します。

8 既存の R パイプラインを用いた解析

  1. 合成を計算し、崩壊率前述8,10としてパイプラインと R/Bioconductor パッケージの公開を使用してください。

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Representative Results

制御する必要があるいくつかの側面、新たに転写された RNA の代謝ラベル付けを実行するとき: 時間とラベリング、スパイクの割合、抽出のプロトコル、ビオチン化効果 (含む信号対雑音比) の効率他の中。これらの条件広範囲、組織的が示されている他の人が7,10,11。ここで我々 は主に解釈とサンプルが処理されて、RT qPCR、マイクロ アレイ、またはシーケンスで実行できる即時解析に焦点を当てます。別の変異株の解析が佐賀変異酵母の場合、mRNA 合成だけでなく劇的な世界的な減少を検出するメソッドの力を発揮株だけでなく、非常に穏やかな時に RNA ポリメラーゼ II の活性化monoubiquitination ヒストン H2B の抑制。

佐賀酵素活性の分析は、クロマチン15佐賀突然変異系統の定常状態の mRNA のレベルの分析によって明らかにされなかったへの広範な採用を提案しました。RNA ポリメラーゼ II 募集は佐賀の不活性化によって損なわれたと mRNA 合成率が世界的に影響を受けるかどうかを分析しました。それ故に、野生型と変異酵母株が新たに転写された Rna のラベルの 6 分間 4tU にさらされました。スパイクでラベル付きセル (s.pombe) 3:1 の割合で混ぜ合わせて、総 RNA の抽出と新たに合成された RNA のビオチン化され chronogram を図 1に示すように、ここで提示されたプロトコルに従って精製します。ラベル付けされた Rna は rna の精製されたプロダクトの量になるは任意のダウン ストリーム アプリケーションのための十分な確保 200 μ g の合計から精製しました。任意のゲノム解析の前に体系的な初期手順として新たに合成された RNA の浄化は RT qPCR で検証されました。遺伝子は、式、規制経路と異なる RNA ポリメラーゼへの依存のレベルなど、さまざまなパラメーターに従って選ばれました。

このプロトコルは、特に標識 RNA を浄化しを確認するため、4tU の有無を培養した野生型細胞から精製した分数の転写物のレベルを定量化しました。4tU に晒されていないセルから分析された Rna のほとんどのバック グラウンド レベルが検出された (図 2A)。新しく転写の RNA の浄化は、イントロンを含むACT1 mRNA (データは示されていない) の観測強化によってさらに検証されました。我々 はテスト サンプルの質の検証後、mRNA 合成SPT20佐賀の複雑なアセンブリを混乱させる知られているの削除に影響を受けるかどうか。他の報告、mRNA 定量spt20Δ ひずみからの総 (定常) RNA 上で実行はテスト遺伝子 (図 2B) ほとんど横這い軽度減少レベルを明らかにしました。同様の結果得られた系統のBRE1 (図 2B) を削除します。対照的に、 spt20Δ 株から新たに転写された RNA の解析は、3 で mRNA 合成の劇的な減少を明らかにした-すべてのために 5 倍テスト遺伝子 (図 2C)。Bre1 の損失は、研究の遺伝子 (図 2C) を新たに合成された mRNA のレベルでより目立たないがまだ目に見える減少につながった。式が佐賀と Bre1 の RNA のポリメラーゼ II のトランスクリプションの役割を持つ良い契約では Spt20 または Bre1 のいずれかの損失に影響しなかったRDN25またはsnR6遺伝子の転写 RNA ポリメラーゼによって私と RNA ポリメラーゼ III、それぞれ (図 2C)。

ただし、系統佐賀SPT7またはSPT20のような複雑な構造のサブユニットの削除は観察された転写変化を占める可能性があります重度の低成長の表現型を表示します。我々 は条件付きで核から Spt7 を枯渇望ましくない二次的影響を排除、14,24を系統アンカー距離S の酵母を使用します。4tU とパルス ラベリング前に、ラパマイシン標的治療の 60 分に (概略の図 1を参照)、削除ずみ (図 2 D2E に見られたと同様の範囲に新たに転写された mRNA のレベルが減った).この分析は、したがって、私たちの元の結果を確認した、この誘導枯渇システムのプロトコルを検証します。時間コース分析、ラパマイシンを 240 分の 0 から時間のスパンのために公開していた細胞の発現低下は薬剤への露出の 15 分後にすぐに証明されました。さらに興味深いは、定常状態の mRNA のレベル最初減少する傾向があったが、60 分、代償機構行われる一方で (図 2E) であることを示す後に通常のレベルに戻った。

完全に、ラベリングと新たに合成された RNA の定量は許可佐賀複雑な新しい規制の役割を明らかに。記述されていたプロトコル RNA ポリメラーゼ II の活性に及ぼす緩和効果を明らかにすることもされ、正常に適用される条件付き枯渇酵母。

浄化された新たに合成された RNA のダウン ストリーム アプリケーションの 1 つは、マイクロ アレイの交配を使用してまたはシーケンス (seq-4tU) の成績証明書のゲノムワイド定量化です。高スループット シーケンスはより定量的な敏感な有益なマイクロ アレイの交配はグローバルの mRNA のレベルを変更するかどうかを判断する非常に有用することができます。正規化が極めて重要なこの文脈で分析するサンプルをスパイクで生物を追加しました。具体的には、酵母細胞の比 3:1、両方以前にさらされて 4tU で, 分裂酵母細胞へをミックスしました。精製、標識 Rna が高スループット シーケンスのとき、任意の標準ライブラリの準備のプロトコル使用できます、最も頻繁に次のリボソーム RNA の枯渇。どちらか種 (すなわち、混合米酵母酵母の米としての上のセル)22または体外から RNA をラベルを追加して実行されたさまざまなサンプルから 4tU seq データ間の正規化転写、RNA12,25,26,27スパイクのチオール。市販のマイクロ アレイ チップには、両方の生物から mRNA の定量化を許可し、1 つの単一の実験で、出芽や分裂酵母の全トランスクリプトームのプローブが含まれています。マイクロ アレイの交配を合計と新たに合成された RNA (野生型、 spt20Δ、 bre1Δ) を上記のように RT qPCR による検証を行った。また、ヒストン H2B、ubiquitinable 残基 (K123R) の点突然変異によっての monoubiquitination をサポートしないひずみを含まれています。S の酵母細胞の正確な同じ比率は、さまざまなサンプルと複製で使用された、線形配列の尺度を変更することが可能だ強度s.pombeの合計とラベル プローブ、同じ中央の強度があります。この正規化、または再スケーリング、パトリック ・ クレイマーの研究所によって開発されたBioconductorパッケージを使用して実行することができます合計すべての分析サンプルの並行使用し、分数、野生タイプおよび突然変異体系統8のラベルします。簡単に言えば、このパイプラインの入力は、すべてのサンプルと分数のプローブとその強度 (MAS5 または RMA) を含む Excel ファイルです。検出の範囲外にあるプローブを除く、信号強度は再スケーリング、 s.pombeプローブの明度値を考慮しています。最後に、スパイクでの正規化された式の値を含む行列で終わる出芽や分裂酵母のゲノムにプローブをマップできます。これらの値は、さらにすることができます (次のセクションを参照してください) を処理またはそのまま使用します。次の例では、我々 は倍の突然変異体と野生型株の間すべてのトラン スクリプトの変更を決定しました。

分析両方の定常状態を行ったまたは新しく合成された RNA のレベルと、統計的有意性に対してプロット (p-値) (図 3)。総 RNA レベルが分析されると、のみに少数の遺伝子を持っていた彼らの表現を変更すると、他の研究に一致して、アップまたはダウンレギュ レート (図 3 a-3 C)。しかし、新たに転写された RNA の解析は著しく異なる結論につながった。4,000 以上の遺伝子の新たに転写された mRNA のレベルの少なくとも低減により大幅削除SPT20、出芽酵母 (図 3D における RNA ポリメラーゼ II の転写に佐賀の世界的なプラスの効果を示唆しているに二重).さらに、 bre1Δ とK123R変異体では、結果がより控えめな: ほとんどの遺伝子が減少、その表現に見えたが、ダウンレギュレーションと大きく影響を受けた遺伝子 (≈ 300-500) の数の範囲は確かよりリミテッド (図 3 e3 f) します。

以前述べられた、定常状態または合計レベル mRNA の合成と齲蝕 (図 4A) のタイトな平衡によって口述された場合します。2 つのシナリオを描写できます RNA ポリメラーゼ II の転写がグローバルに障害、: (i) いずれか合計 mRNA レベル減少グローバル合成低下ですが一定減衰への応答として、または (ii) mRNA 分解は同じ程度に減少した結果定常状態の mRNA のレベルをほとんど変更されていません。2 番目のシナリオは、佐賀か (ディスインテグリン) 混乱9,10,14,16,22のコンテキストでを含むいくつかの条件に対して報告されています。比較の動的なトランスクリプトーム解析 (cDTA) と呼ばれるプロシージャが 4tU ラベルに基づいて、動的運動モデリング mRNA 合成を決定し、トラン スクリプト8,10減衰率を推測することができます。もう一度、前述の系統 (野生型、 spt20Δ、 bre1Δ、 K123R) で収集されたデータの利用をしました。SPT20の削除時に、期待と合成と分解の率野生型株と比較して mRNA の同時減少我々 観察。この変異株で報酬はほぼ最適な平均で 3.8-fold の合成の減少、平均はなぜ限られた転写変更ことができる 4.1-fold (図 4B) 裏付けの崩壊の減少合計 mRNA のレベル (図 3A) で検出されました。2 他変異株 (bre1Δ とK123R)、mRNA 合成と減衰の変化も認め、しかし、はるかに小さい規模に変更があったより分散 (図 4および4 D)。

Figure 1
図 1: 4tU を使用して RNA の代謝標識の略図。培に作りたての 4tU が追加されますと 6 分ラベル付き酵母細胞が付きますと, 分裂酵母細胞が 3:1 の比率で混合される、総 RNA が抽出されます。その後、新しく合成された RNA ビオチン、ストレプトアビジン コートした磁気ビーズを使用して浄化することができます。最後に、(定常) RNA を合計し、ラベル新たに合成された RNA は下流のアプリケーション、含む Rt-qpcr およびマイクロ アレイ交配またはシーケンスの様々 なで使用できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 分析両方の定常状態および新しく転写で変更を描いた転写 RNA Rt-qpcr によって決まります。5 つの異なる遺伝子の RNA (A) レベルか 4tU かは公開されていた野生型細胞から精製した標識 RNA 画分から定量を行った。次の 2 つのパネルは、合計 (B) を表示、(C) を合成した野生型 (WT)、 spt20Δ、 bre1Δ 酵母に RT qPCR による RNA の定量化。Spt7 アンカー離れた系統、未治療または 60 分、ラパマイシンと扱われる 4tU でラベル付けされた、RNA が新しく転写 (E) または (D) 合計 RT qPCR による定量化を行った。(F) このパネルは、定常状態では、新しく変化の経時的解析 Spt7 核枯渇時に mRNA の合成を示しています。すべてのサンプルに対して 5 つの RNA ポリメラーゼ II 遺伝子の mRNA レベルが RT qPCR による定量化しました。Rna ポリメラーゼ私と RNA ポリメラーゼ III 遺伝子 (RDN25snR6、それぞれ) コントロールとして使用されました。式の値 (平均 ± SD を 3 つの独立実験) s.pombeのスパイクに正規化された信号およびコントロール サンプルでは 1 に設定。パネルD Fバプティスタから変更されています。14.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 合計または標識 RNA 画分を使用しての mRNA のレベルのゲノムワイドな解析します。これらのパネルを示す火山プロット表示フォールドの変更 (A ~ C) 定常状態の mRNA のレベルでまたは (D F) は新しくその意義を基準にして mrna を合成 (p-値)。フォールドの変更 (FC) (AD) spt20Δ でs.pombe信号の正規化後 log2 の各遺伝子の式の値の比率として算出した (BおよびE) のbre1Δ または (CF) K123R は野生型酵母のひずみ同じ遺伝子の式の値。5,385 の遺伝子の合計を分析し、2 つのしきい値を変更 (青いドット: 二重以上減少; 黄色のドット: よりも二倍の増加)、0.05 p-値と考えられていた。パネルADは、バプティスタから変更されています。14.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 並列 mRNA 合成の変化と mRNA 崩壊結果 mRNA バッファリングします。(A) このパネル RNA 濃度が定常状態の RNA 合成の摂動の結果の概略を示しています。(B D)これらのパネルは、mRNA 合成と合計と新たに合成された RNA の解析から減衰率の計算を示します。(D) K123R (C) bre1Δ、(B) spt20Δ 各酵母議事録の合成と減衰率を求めた。合成率の変化 (log2 変異体と野生型との比として算出) を減衰率の変化に対してプロットしました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

ゲノムワイドな転写の変化を解析するツールまだ改善している間唯一 RNA の定常状態レベルの定量化によるトランスクリプトーム解析では RNA ポリメラーゼ II の活性の変更は正確に反映可能性があります。確かに、mrna は RNA 合成だけでなく、成熟し、劣化も規制されています。MRNA 分解から非 mRNA 合成を測定するには、明確なプロトコルは、酵母や哺乳類の初期転写の解析のため近年開発されています。

新生転写の定量化のための最も広く使用されているプロトコルの 1 つはグロ seq1です。GRO seq の主な利点は、能力を高解像度で低バック グラウンド発現従事とアクティブなポリメラーゼを発表、その魅力を減らす 2 つの異なる点があります: (i) それは技術的に難しく、必要です、核と、(ii) 核操作の分離は、28のシステムにいくつかの摂動をご紹介します。別の方法としてはネット-seq、初期の RNA、テンプレート DNA と RNA ポリメラーゼ II の間に形成された非常に安定した複合体の免疫沈降の時に得られる転写産物の 3' 端のシーケンスに依存しています。このアプローチは塩基対解像度で新生 Rna の特性をでき変更された RNA ポリメラーゼ II の免疫沈降による mRNA 処理イベントを探ることができます (セリン-5 リン酸化、例えば)2,3,29. それにもかかわらず、それは我々 は 3 つを強調するから、いくつかの障害を示します。まず、ターゲット RNA ポリメラーゼ II 抗体は特異性の高い、通常中に、は、抗体効率に依存します。第二に、RNA かもしれない、潜伏期間中に分解しやすい前のポイントに戻ってつながる私たち (効率抗体が分解しやすい RNA を残して時間長い潜伏あります)29。第三と特にの哺乳類、MNase 消化とサイズの選択は、一意のシーケンス配置29,30を除外できます。

ここで私たちと比較して他の使用可能なアプローチの別の利点は、出芽酵母の 4tU を使用して新たに合成された RNA の代謝分類のための詳しいプロトコルを発表しました。転写は摂動に非常に敏感、最も生理学的条件下で細胞を維持しなければなりません。例えば、GRO seq セル/核の sarkosyl への暴露を介して転写従事して RNA ポリメラーゼ II の逮捕を意味します。ただし、sarkosyl の治療はいくつかの細胞プロセス11の抑制として記載されています。この場合、4tU と記載されている濃度 4sU 代謝ラベリング非摂動、特に露出の短い期間に目に見えない細胞の恒常性を影響しません。転写抑制を使用して半減期 mRNA を測定する他の方法と対照をなして cDTA または 4tU seq と動的モデリングとフィッティングは動じないセルのすべての単一の mRNA の分解速度を決定します。したがって、1 つのメソッドは同時に特定のセルタイプに全体のトランスクリプトームの減衰率と合成をアドレス指定できます。CDTA または 4tU seq 信頼性の高い正規化手法の活用をしているので、スパイクでの使用法によってすなわち異なるデータセット解析一緒にでき直接比較します。最後に、代謝ラベリングと新たに合成された RNA の定量は、任意の特定の機器を必要としない任意の分子生物学の実験室で簡単に実装できる手法です。これは可能性がありますを使用してより体系的に RNA の生産と分解、酵母だけでなく、高等真核生物を探索する傾向があるこの技術のかなり大規模な普及をについて説明します。

RNA は他のヌクレオシド類似体、すなわち 5 bromouridine (BrU)31,32345 ethynyluridine (EU)33,を用いた生細胞内ラベルすることができます。BrU パルス標識 RNA の分離は、実験間の異なる効率あるかもしれない抗 BrdU 抗体精製に依存します。EU された RNA は、チオールの変更は、還元剤を反転させることができますとは異なり非可逆的な活用につながるクリック化学を用いたビオチンに共有活用することができます。ゲノム RNA 減衰率31,32や新生 RNA 合成34,35の評価を哺乳類細胞で BrU と EU のラベルが使用されています。ただし、BrU や EU 分類記載されていない酵母で。確かに、ヌクレオシド アナログの取り込みは、ヌクレオシド輸送体の発現を必要とし、したがって、これらのメソッドは表示 4tU ラベルよりも出芽酵母における柔軟性です。

4tU ラベルの期間は適応することができ、質問によって異なります。とき酵母、6 分の短いラベルのパルスで mRNA 合成の評価により新たに転写された mrna は RNA の劣化による影響を最小限になります。新生 RNA に変更されたヌクレオチドを組み込むことができる前に遅延時間が 1 分未満の場合を考えると、この 6 分の表示期間は、新たに合成された RNA の合理的な量を精製することができますを保証します。このようなプロトコルは、ミラーによって定義されています。11、使用されている異なる酵母mRNA 合成と RNA でグローバルな変更を明らかにする突然変異体崩壊26,2722,9,1036. 代謝パルス追跡の 4tU と出芽酵母12.にすべての Mrna の分解速度を決定するための分類としてもはやラベル時間 (3 h)最後に、非常に短い (1.5 分) から 4tU のラベル付けに使用されています出芽や分裂酵母13,25,37で RNA 処理速度を調べる。

それにもかかわらず、このメソッドは、全体のプロトコルの最後で回収標識 RNA の比較的低い収穫など、いくつかの制限をあります。酵母、出発材料に制限はありませんし、後生動物の細胞を分析する際、これは問題をすることができますをこのプロトコルが場合に特には利用in vivo。プロトコルの制限の手順の 1 つは、ビオチン化標識 RNA プール、その効率は程遠いで、ラベル付けされた RNA の5の 3 つの 4sU 残基を変更すると推定されたのです。それは最近ことを示した methanethiosulfonate (MTS) の使用-ビオチン、ビオチン-HPDP の代わりに回復された RNA38の収穫量を増加します。しかし、この研究グループから未発表の結果とルトコフスキと Dölken からの結果によると MTS ビオチン固有ではない完全にチオール-、標識 RNA の低いとき特に問題となる量であるラベルの RNA の浄化につながる、精製39。4tU/4sU を使用した代謝ラベリングのもう一つの制限は、RNA のポリメラーゼの伸長固有速度です。RNA ポリメラーゼ II の平均速度は約 3.5 kb/分40,41,42と推定されました。したがって、6 分のラベル、ポリメラーゼに 15-20 kb を転写する能力があります。したがって、付け、短いパルス-4tU/4sU の実験、のみ 3' 終わり新たに転写された RNA の一部はラベルは 5' 末端地域が 4tU/4sU を追加する前に既存します。したがって、議事録、特に哺乳類細胞のように長い成績証明書の既存の 5' 末端標識 Rna の浄化も豊かにします。TT seq と呼ばれる洗練されたプロトコルでは、このバイアスを克服するためには、抽出した RNA をラベルは新たに合成された種43の精製前の超音波によって断片化されます。

完全に、4tU seq は特定のコンテキストでのアドレス転写変化に優れた方法です。それにもかかわらず、およびプロトコルはかなり単純ですが、それが最終的に比較的広範なされているいくつかの異なったステップで構成されています。第一に、このプロトコルでは、スタートからフィニッシュまで RNA を処理するので必須です、劣化ないきれいなサンプルに必要なすべての要件が満たされています。したがって、すべての試薬は、RNase フリーする必要があります、すべての材料を専用して RNA、RNase 除染液で徹底的に、定期的にすべての洗浄を操作する必要があります。第二に、ビオチン反応は特異性の高いが、反応しなかったビオチン-HPDP の過剰は (共有されていない RNA、たとえばビオチンとストレプトアビジン ビーズの飽和を避けるため) にサンプルから削除必要があります。第三に、前述のプロトコルでは、示されたストレプトアビジンをコートした磁気ビーズの使用を強くお勧めします、いくつかの研究グループは、我々 が持っているので話をすべて示されるこれらのビーズがバック グラウンド レベルを下げるに至ったという。第四に、適切な品質と実験的コントロールを使用する必要があります。4tU/4sU に晒されていない細胞由来サンプルが含まれます。これらのサンプルはアドレス バック グラウンド レベルに大きな価値があるだろうし、非標識 RNA との汚染は発生しませんを確認するが、実験中に。また、新たに合成された rna サンプルを濃縮するかどうかをテストするのには別の優秀な代わりは RT qPCR を実行、イントロを含む遺伝子に対するプライマーを使用して。プライマーは、3' 端および 2 つの連続したエクソンとイントロン、またはその逆の 5' 末端に補足する必要があります。最後に、マイクロ アレイの交配のシーケンスの前に RT qPCR による試料を検証します。このため、異なる遺伝子発現と制御のさまざまなレベルを選択し、分析する必要があります。理想的には、この RNA (定常状態と新たに合成された RNA) の 2 つの異なる画分を行わなければなりません。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

彼のサポートのためのラズロ寅と V. フィッシャー、k. シューマッハと f. エル Saafin 議論のために感謝しますマリー キュリー ITN フェローシップ (PITN-ジョージア州-2013-606806、NR ネット) に支えられ闘病を続けてと財団アーク。この作品は、アジャンス ナシオナル デ ラ抜き (ANR-15-CE11-0022 SAGA2) からの資金によって支えられました。本研究は、ANR-10-LABX-0030-INRT、フレーム プログラム Investissements d'Avenir ANR-10-アイデックス-0002-02 下のアジャンス ナシオナル デ ラ抜きの運営するフランス国家ファンドによっても支えられました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Thiouracil Sigma-Aldrich Cat# 440736
Rapamycin Euromedex Cat# SYN-1185
Countess II FL Automated Cell Counter ThermoFisher N/A
RiboPure RNA Purification kit, yeast ThermoFisher Cat# AM1926
NanoDrop 2000 Spectrophotometer ThermoFisher ND-2000
TURBO DNA-free Kit ThermoFisher AM1907
EZ-Link HPDP Biotin ThermoFisher Cat# 21341
Thiolutin Abcam ab143556
µMACS Streptavidin kit Miltenyi Biotec Cat# 130-074-101
Transcriptor Reverse Transcriptase Roche 03 531 295 001
SYBR Green I Master Roche 4707516001
GeneChip Yeast Genome 2.0 ThermoFisher 900555
GeneChip Fluidics Station 450 ThermoFisher 00-0079
GeneChip Scanner 3000 7G ThermoFisher 00-0210

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References

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