Saccharomyces cerevisiae Métabolique marquage avec 4-thio-uracile et la Quantification des nouvellement synthétisé ARNm comme un Proxy pour l’activité de l’ARN polymérase II

Genetics

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Summary

Le protocole décrit ici est basé sur la quantification de Génome-large d’ARNm nouvellement synthétisées purifiée à partir de cellules de levure marquées avec 4-thio-uracile. Cette méthode permet de mesurer la synthèse d’ARNm dételée de désintégration de l’ARNm et, par conséquent, donne une mesure précise de la transcription de l’ARN polymérase II.

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Baptista, T., Devys, D. Saccharomyces cerevisiae Metabolic Labeling with 4-thiouracil and the Quantification of Newly Synthesized mRNA As a Proxy for RNA Polymerase II Activity. J. Vis. Exp. (140), e57982, doi:10.3791/57982 (2018).

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Abstract

Globales défauts de transcription de l’ARN polymérase II pourraient être négligées par transcriptomique études analysant stationnaire RNA. En effet, la diminution globale de synthèse de l’ARNm s’est avérée être compensée par une baisse simultanée de la dégradation de l’ARNm pour rétablir l’équilibre des niveaux normaux. Par conséquent, la quantification du génome entier de la synthèse de l’ARNm, indépendamment de la désintégration de l’ARNm, est le meilleur reflet direct de l’activité transcriptionnelle de RNA polymérase II. Ici, nous discutons d’une méthode à l’aide de marquage métabolique non perturbant d’ARN naissante chez Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). En particulier, les cellules sont cultivées pendant 6 min avec un uracile analogiques, 4 thio-uracile et le RNAs nouvellement transcrit étiqueté sont purifié et quantifié pour déterminer le taux de synthèse de l’ARNm individuels tous les. En outre, à l’aide d’étiqueté Schizosaccharomyces pombe cellules comme étalon interne permet de comparer la synthèse de l’ARNm dans différentes S. cerevisiae souches. Utilisant ce protocole et ajustement des données avec un modèle cinétique dynamique, les taux de décroissance ARNm correspondants peuvent être déterminées.

Introduction

Les cellules répondent aux signaux endogènes et exogènes, par le biais de la modification dynamique de leur programme d’expression de gène. Ces dernières années, un formidable développement de méthodologies de Génome-large permet la description précise et complète du transcriptome changements dans différentes conditions. Dans la plupart des études de transcriptomique, microarray hybridation ou haut débit séquençage sont utilisés pour quantifier les niveaux d’ARN d’une fraction de RNA totale stationnaire. Transcriptionnelles modifications sous une perturbation spécifique peuvent afficher un large éventail de résultats possibles, avec les modifications de l’expression génique spécifique ou un large spectre de gènes étant up - ou réprimés. L’expression des gènes est le résultat d’un équilibre finement élaboré — ou stationnaire — entre la synthèse de l’ARN par des ARN polymérases et autres processus influant sur les niveaux d’ARN. Transcription de l’ARN polymérase II, y compris ses trois phases distinctes (initiation, élongation et résiliation), sont hautement et intimement associé à traitement ARNm, exportation cytoplasmique, traduction et de dégradation.

Plusieurs études récentes ont démontré que la décomposition et la synthèse de l’ARNm sont des mécanismes couplés et a montré que transcriptionnelles effets sur mutation ou sous des stimuli peuvent être négligés lors de la quantification de l’ARN total stationnaire. Tout d’abord, la détection de changements transcriptionnelles par le biais de l’analyse de l’équilibre des niveaux d’ARNm toujours dépend de l’ARNm Half-Life. Dès que la perturbation est introduite, les niveaux d’équilibre des ARNm ayant une demi-vie longue seront beaucoup moins affectées que celles des ARNm ayant une demi-vie courte. Par conséquent, la détectabilité des changements dans la synthèse d’ARN fortement biaisée en faveur des transcriptions de courte durée, alors que l’analyse des vécus ARNm espèces risquent de ne pas révéler l’évolution dynamique du taux de transcription. Deuxièmement, plusieurs rapports ont montré que, tant chez les levures et les mammifères, les changements globaux dans la transcription pourraient être négligées lorsqu’on analyse les niveaux d’équilibre de l’ARNm. C’est probablement due à des mécanismes qui lient la synthèse de l’ARNm et dégradation aboutissant à la mise en mémoire tampon des ARNm. Cela a incité le développement de nouveaux protocoles pour quantifier la synthèse d’ARNm dételée de dégradation, par le biais de l’analyse de l’ARNm nouvellement transcrites. Ces dernières années, plusieurs alternatives ont été présentées, dont le séquençage exécuter-sur global (GRO-seq)1et transcription élongation native séquençage (NET-seq)2,3. Ici, nous vous présentons un protocole initialement développé dans les cellules de mammifères4,5,6 et ensuite adapté à levure7,8,9,10, 11, qui est basé sur RNA marquage avec un nucléoside THIOLÉS ou base analogique, 4-thiouridine (4sU) ou 4-thio-uracile (4tU), respectivement.

Cette méthode spécifiquement purifie ARN nouvellement transcrite les cellules dans les ARN sont marqués au pouls avec 4sU avec pratiquement aucune interférence dans l’homéostasie cellulaire. Par conséquent, une fois que les cellules sont exposées à 4sU, la molécule est rapidement absorbée, phosphorylé en triphosphate-4sU et incorporé dans l’ARN étant transcrite. Une fois marqué impulsion, il est possible d’extraire l’ARN cellulaire total (correspondant aux niveaux d’équilibre de l’ARN), et, par la suite, la fraction d’ARN marqué 4sU est thiol-spécifiquement modifié, conduisant à la formation d’un pont disulfure entre la biotine et la nouvellement transcrites RNA4,5. Cependant, 4sU ne peut être absorbée par les cellules exprimant un transporteur de nucléosides, comme le transporteur de nucléosides équilibrant humaine (hENT1), empêchant son utilisation immédiate chez les levures bourgeonnantes ou fission. Alors qu’on pourrait exprimer hENT1 dans S. pombe ou S. cerevisiae, une approche plus facile peut être réalisée à l’aide de la 4tU base modifiée, car les cellules de levure peuvent faire 4tU, sans avoir besoin d’expression d’un nucléoside transporteur10, 11 , 12 , 13. en effet, le métabolisme du 4tU requiert l’activité de l’enzyme uracile phosphoribosyltransférase (UPRT). Plusieurs organismes, y compris les levures mais pas de mammifères, UPRT est essentiel pour une voie de récupération des pyrimidines, recyclage uracile à l’uridine monophosphate.

Un biais important dans les études de transcriptomique peuvent être introduit par la normalisation entre les différents échantillons analysés en parallèle. En effet, de nombreux facteurs qui DÉVIES peuvent affecter l’analyse du transcriptome de mutant et de souches sauvages : l’efficacité de la lyse cellulaire, les différences dans l’extraction et la récupération de l’ARN et les écarts dans l’étalonnage du scanner pour les analyses de microarray , entre autres. Comme indiqué plus haut, ces variations peuvent être particulièrement trompeuses lorsque les effets globaux sur la transcription de l’ARN polymérase II sont supposés. Un élégant moyen de comparer avec précision les taux de synthèse d’ADN messagère entre différents échantillons a été conçu à l’aide de la levure de fission lointainement connexe Schizosaccharomyces pombe comme étalon interne. Pour cela, un nombre fixe de marquées S. pombe cellules est ajouté aux échantillons de S. cerevisiae , cellules sauvage ou mutants, avant la lyse cellulaire et RNA extraction10. Par la suite, RNAs stationnaire et nouvellement synthétisées de S. pombe et S. cerevisiae sont quantifiées par RT-qPCR ou via l’utilisation de copeaux de microarray ou séquençage haut-débit10. En combinant ces données avec modélisation cinétique, on peuvent mesurer les taux absolus de la synthèse de l’ARNm et la décomposition dans la levure de bière.

Dans le cadre de ce manuscrit, nous allons montrer comment l’analyse de l’ARN transcrit nouvellement autorisé à révéler un rôle global pour les complexes de coactivateur SAGA et TFIID dans RNA polymérase II transcription en bourgeonnement levure14,15, 16. Ce qui est important, des études antérieures quantifier les niveaux d’ARNm stationnaire chez S. cerevisiae et a suggéré que la SAGA joue un rôle prédominant sur un nombre limité de gènes de levure qui sont fortement touchés par des mutations dans la SAGA mais relativement résistants à TFIID les mutations17,18,19. Étonnamment, l’activité de la SAGA qui ont été montrées pour agir sur le génome entier transcrit, suggérant un rôle plus large pour cet co activateur de transcription de l’ARN polymérase II. Une diminution RNA polymérase II le recrutement à gènes exprimés plus a été observé sur l’inactivation de la SAGA ou TFIID, suggérant que ces coactivateurs collaborent à la plupart des gènes. Par conséquent, la quantification des ARNm transcrit nouvellement révélé que SAGA et TFIID sont nécessaires pour la transcription des gènes de la quasi-totalité de la RNA polymérase II14,15,16. La mise en œuvre de mécanismes compensatoires émerge comme un moyen pour les cellules faire face à une diminution globale de synthèse des ARNm qui est protégée par une baisse simultanée des mondiale dans la dégradation de l’ARNm. SAGA ajoute à la liste des facteurs qui ont un effet global sur la RNA polymérase II la transcription, comme l’ARN Pol II sous-unités10, le médiateur coactivateur complexe20, le général transcription facteur TFIIH21,22 et indirectement, les éléments de l’ARNm dégradation machines9,10,23. Tels événements compensatoires ont été universellement observés chez les mutants SAGA, tenir compte des modifications dans les niveaux d’ARNm équilibre malgré une diminution globale et sévère à l’ARNm synthèse14modestes et limitées. Des analyses similaires ont aussi été réalisées dans une souche de suppression de BRE1 , ce qui entraîne une perte complète de l’histone H2B ubiquitination. Fait intéressant, un beaucoup plus doux mais cohérent global d’effet sur la transcription de l’ARN polymérase II pourrait être détecté en l’absence de Bre1, ce qui indique que le marquage métabolique de l’ARN nouvellement transcrite dans la levure peut détecter et quantifier un large éventail de changements dans l’ARNm taux de synthèse.

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Protocol

1. cellule culture et l’appauvrissement de la rapamycine d’une sous-unité de la SAGA

  1. Pour chaque souche de S. cerevisiae et répétés, y compris de type sauvage ou les souches témoins, inoculer une seule colonie d’une plaque de frais sur 5 mL de milieu YPD (2 % Peptone, extrait de levure 1 % et 2 % de glucose).
  2. La croissance de cellules de S. cerevisiae nuit à 30 ° C sous agitation constante (150 tr/min).
  3. Mesurer la densité optique à 600 nm (OD600) et diluer la culture à une OD600 d’environ 0,1 dans 100 mL de milieu YPD et laisser pousser jusqu'à ce que l' OD600 est d’environ 0,8.
  4. En parallèle, inoculer une seule colonie de cellules de S. pombe d’une plaque de frais sur 50 mL de milieu d’Oui (0,5 % d’extrait de levure, 250 mg/L adénine, histidine, uracile, leucine, lysine ; et 3 % de glucose) et pousser les cellules durant la nuit à 32 ° C sous agitation constante (150 tr/min).
  5. Mesurer l' OD600 de la culture au jour le jour de S. pombe et diluer la culture à une OD600 d’environ 0,1 à 500 mL de milieu Oui et laisser pousser jusqu'à ce que l' OD600 est d’environ 0,8.
  6. Pour chaque souche ancre-loin de S. cerevisiae et répétés, y compris de type sauvage ou les souches témoins, inoculer une seule colonie d’une plaque de frais sur 5 mL de milieu YPD (2 % Peptone, extrait de levure 1 % et 2 % de glucose).
  7. Cultiver les cellules pendant la nuit à 30 ° C sous agitation constante (150 tr/min).
  8. Le lendemain matin, mesurer l' OD600, diluer la culture à une OD600 d’environ 0,1 dans 100 mL de milieu YPD et laisser pousser jusqu'à l’OD600≈ 0,8.
  9. Ajouter 100 µL de la rapamycine dans la culture d’une solution mère de 1 mg/mL (concentration finale rapamycine de 1 µg/mL) et laisser les cellules à incuber à 30 ° C avec agitation constante pendant le temps nécessaire pour la protéine d’intérêt à s’épuiser sous condition de la (noyau en général, 30 min est suffisante). Pour le contrôle, utilisez une culture de levure semblables, mais au lieu d’ajouter la rapamycine, ajouter le volume équivalent de diméthylsulfoxyde (DMSO).

2. 4tU marquage avec S. pombe comme Spike-in (comptage)

  1. Préparer une nouvelle solution de 2 M 4-thio-uracile. Une fois préparée, gardez-le à température ambiante et à l’abri de la lumière.
    1. Peser 64,1 mg de 4-thio-uracile pour chaque culture de S. cerevisiae et dissolvez-le dans 250 µL de diméthylformamide (DMF) ou 250 µL de DMSO.
    2. Pour la culture de S. pombe à être utilisés comme spike, peser 320,5 mg de 4-thio-uracile et dissoudre dans 1 250 µL de DMSO.
  2. Ajoutez la solution de 4-thio-uracile à S. cerevisiae et S. pombe cultures pour une concentration finale de 5 mM et les incuber pendant 6 min avec une agitation constante à 30 ° C et 32 ° C, respectivement.
  3. Après 6 min, enlever une petite aliquote de chaque culture pour le comptage des cellules. Compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellule automatique ou d’une chambre de Neubauer.
  4. Recueillir les cellules par centrifugation (2 500 x g) pendant 5 min à 4 ° C.
  5. Jeter le surnageant, laver les cellules avec glacee 1 x PBS et centrifuger à nouveau (2 500 x g, 4 ° C, 5 min).
  6. Calculer le nombre total de cellules dans chacun des échantillons S. cerevisiae et S. pombe .
  7. Remettre en suspension les cellules dans 5 mL de PBS glacée 1 x et S. cerevisiae se mêlent des cellules de S. pombe avec un ratio de 3:1.
  8. Centrifuger les cellules (2 500 x g, 4 ° C, 5 min), retirer le PBS, flash-gel les cellules de la liquide N2et conserver l’échantillon à-80 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.

3. RNA Extraction et traitement de DNase

  1. Décongeler les cellules sur la glace pendant environ 20 à 30 min.
  2. Procéder à l’extraction de l’ARN à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN-levure (Table des matières) avec quelques adaptations.
  3. Par chaque échantillon, verser 750 µL de perles glacées de zircone dans un tube avec bouchon à vis 1,5 mL fourni avec le kit. Gardez à l’esprit que par chaque tube, ARN jusqu'à 109 cellules peut être efficacement extrait. Par conséquent, préparer le nombre de tubes nécessaires pour chaque échantillon. Par exemple, une culture de S. cerevisiae de 100 mL (OD600≈ 0,8) peut rendre autour de 2 x 109 3 x 109 cellules, menant à un total de 2,7 x 109 à 4 x 109 cellules au total (après le pic-in avec un tiers de la de S. pombe cellules). Dans ce cas, jusqu'à 3-4 tubes de réaction par chaque échantillon/condition/mutant/répétition serait nécessaire.
  4. Par les cellules de chaque 1 x 10-9 , ajouter 480 µL de la mémoire tampon de lyse fournie avec le kit, 48 µL du SDS de 10 % et 480 µL de phénol : chloroforme : isoamylique alcool (25:24:1, v/v/v).
  5. Mélanger les cellules à l’aide d’un agitateur Vortex et transférez-les sur les tubes contenant les billes de zircone glacées.
  6. Accueillir les tubes sur un adaptateur de mélangeur vortex, tournez le vortex à vitesse maximale et battre pendant 10 min à lyser les cellules de levure (en chambre à 4 ° C). Sinon, effectuer la lyse des cellules dans un perle-batteur automatique.
  7. Centrifuger les tubes à 16 000 x g pendant 5 min à température ambiante et recueillir soigneusement la phase supérieure (phase contenant du RNA) à un tube de faucon de frais 15 mL. En général, le volume récupéré par chaque tube est d’environ 500 à 600 µL.
  8. Pour les tubes de 15 mL contenant l’ARN partiellement purifié, ajouter le tampon de liaison fourni avec le kit et mélanger soigneusement. Par chaque 100 µL de solution de RNA, ajouter 350 µL de tampon de liaison (c'est-à-dire, lorsque le volume de la solution de la phase aqueuse est 600 µL, 2,1 mL de tampon de la liaison doit être ajoutée).
  9. Au mélange précédent, ajouter de l’éthanol à 100 % et bien mélanger. Par chaque 100 µL de solution de RNA, addition de 235 µL d’éthanol à 100 % (c'est-à-dire, lorsque le volume de la solution de la phase aqueuse est 600 µL, ajouter 1,41 mL d’éthanol).
  10. Appliquer jusqu'à 700 µL du mélange de l’étape 3.9 pour une cartouche de filtre assemblé dans un tube de prélèvement, tous deux fournis avec le kit.
  11. Centrifuger pendant 1 min à 16 000 x g. Si la durée de centrifugation n’était pas suffisant pour le volume total de passer par le filtre, répétez la centrifugation pendant 30 s.
  12. Jeter le cheminement et réutiliser le même tube de prélèvement. Ajouter un autre 700 µL de solution tampon-éthanol liaison à l’ARN pour la filtrer et centrifuger à nouveau à 16 000 x g pendant 1 min.
  13. Jeter le cheminement et répétez les étapes 3.11 et 3.12 jusqu'à ce que la solution RNA est terminée.
  14. Laver le filtre 2 x 700 µl de la solution 1 de lavage. Recueillir la lavage solution par centrifugation à 16 000 x g pendant 1 min et gardez toujours le tube de prélèvement.
  15. Laver le filtre 2 x 500 µl de la solution 2 de lavage. Recueillir la lavage solution par centrifugation à 16 000 x g pendant 1 min et gardez toujours le tube de prélèvement.
  16. Centrifuger les tubes une fois de plus à 16 000 x g pendant 1 min sécher complètement le filtre.
  17. Transférer la cartouche du filtre à la collection finale (tube de RNA adaptées) et éluer l’ARN avec 50 µL de traitée DEPC, exempte de RNase H2O (préchauffé à 100 ° C).
  18. Centrifuger pendant 1 min à 16 000 x g.
  19. Éluer l’ARN nouveau (pour le même tube) avec 50 µL de préchauffé traitée DEPC, exempte de RNase H2O. Assurez-vous que tout le volume est passé par le filtre ; dans le cas contraire, centrifuger pendant de longues périodes.
  20. Si les tubes multiples pour un seul échantillon sont utilisés, leur piscine tous dans un seul tube.
  21. Quantifier et vérifier la pureté de l’échantillon à l’aide de l’équipement approprié.
    Remarque : Alors que 4tU est seulement constituée au sein de l’ARN nouvellement synthétisé, il y a un risque de contamination mineure avec l’ADN. Pour cette raison, il est toujours conseillé de traiter les échantillons à la DNase I. Pour cela, utilisez les réactifs fournis avec le kit d’extraction de l’ARN (Table des matières) suite aux recommandations du fabricant.

4. thiol-spécifique Biotinylation des ARN nouvellement synthétisé

  1. Ajuster la concentration de l’ARN obtenu à l’article 3 du protocole à 2 mg/mL. Aliquote 200 µg d’ARN total, chauffer pendant 10 min à 60 ° C et le refroidir immédiatement sur la glace pendant 2 min.
  2. La partie aliquote de RNA, ajouter les réactifs mentionnés ci-dessous dans l’ordre suivant : 600 µL de traitée DEPC, exempte de RNase H2O, 100 µL de tampon de biotinylation (100 mM Tris-HCl [pH 7.5] et 10 mM EDTA, traitée DEPC, exempte de RNase H2O) et 200 µL de biotine-HPDP d’un stock de 1 mg/mL biotine-HPDP dans le DMSO ou DMF.
    1. Dans certaines situations, la solution de biotine-HPDP a tendance à précipiter, probablement en raison de sa faible solubilité dans l’eau. Dans ce cas, augmenter le volume du DMSO/DMF jusqu'à 40 % du volume de réaction (à l’exemple de RNA, ajouter 400 µL de traitée DEPC H2O, 100 µL de tampon de biotinylation et 400 µL de biotine-HPDP d’un stock de 0,5 mg/mL).
  3. Incuber les échantillons à la température ambiante et l’abri de la lumière pendant 3 h, avec agitation douce.
  4. Après incubation, ajouter un volume égal environ du chloroforme pour les tubes et mélanger vigoureusement.
  5. Faire tourner l’échantillon à 13 000 x g pendant 5 min, à 4 ° C. Cette étape permet l’élimination des excès biotine qui n’a pas biotinylater l’ARN. Vous pouvez également effectuer cette étape en utilisant des tubes de phase-lock (lourds). Pour cela, tournez en bas des tubes de phase-serrure pendant 1 min à 13 000 x g, ajouter le mélange de RNA et une quantité égale de chloroforme, mélangez-les vigoureusement et les centrifuger à 13 000 x g pendant 5 min, à 4 ° C.
  6. Transvaser avec soin la phase supérieure dans nouveaux tubes de 2 mL.
  7. Ajouter un dixième du volume de 5 M de NaCl et mélanger l’échantillon.
  8. Ajouter un volume égal d’isopropanol, bien mélanger l’échantillon et le tourner à 13 000 x g pendant au moins 30 min, à 4 ° C.
  9. Avec précaution, retirez le surnageant et ajouter 1 mL d’éthanol glacé de 75 %.
  10. Tourner à 13 000 x g pendant 10 min, à 4 ° C.
  11. Soigneusement retirer le surnageant, rapide-spin le tube et supprimer le reste de la solution d’éthanol. Veillez à ce que le culot de RNA ne sèche pas.
  12. Suspendre l’ARN dans 100 µL de traitée DEPC, exempte de RNase H2O.

5. purification de la Fraction nouvellement synthétisée de l’ARN Total et non étiqueté à l’aide de streptavidine des billes magnétiques

  1. Faire chauffer le biotinylé RNA pendant 10 min à 65 ° C et ensuite refroidir les échantillons sur la glace pendant 5 min.
  2. Ajouter 100 µL de streptavidine des billes magnétiques pour le biotinylé RNA (à un volume final de 200 µL). Plus précisément, il est recommandé d’utiliser les perles indiquées dans la Table des matières, puisque, après des conversations avec d’autres laboratoires, ces semblait être la plus cohérente et la plus fiable.
  3. Incuber l’échantillon avec la légère secousse pendant 90 minutes, à température ambiante.
  4. Placer les colonnes fournies avec le kit (Table des matières) dans le support magnétique.
  5. Ajouter 900 µL de tampon de lavage à température ambiante (100 mM Tris-HCl [pH 7.5], 10 mM EDTA, 1 M NaCl et 0,1 % de Tween 20, dans traitée DEPC, exempte de RNase H2O) aux colonnes (testé et équilibrer).
  6. Appliquer perles/ARN mélange (200 µL) sur les colonnes.
  7. Recueillir le cheminement dans des tubes de 1,5 mL et appliquez-le à nouveau à la même colonne magnétique. Si nécessaire, garder ce cheminement car il représente la fraction d’ARN non étiquetée.
  8. Laver les colonnes 5 x avec augmentation du volume de tampon de lavage (600, 700, 800, 900 et 1 000 µL).
  9. Éluer l’ARN nouvellement synthétisé avec 200 µL de 0,1 M TNT.
  10. Effectuer une deuxième d’élution, 3 min plus tard, avec un volume égal de 0,1 M TNT.
  11. Après élution de l’ARN, ajouter 0,1 volumes de 3 M AcONa (pH 5,2), 3 volumes d’éthanol glacé de 100 % et 2 µL de glycogène de 20 mg/mL (RNA-grade) et laisser la nuit précipitée de RNA, à-20 ° C.
  12. Récupérer l’ARN par centrifugation (13 000 x g pendant 10 min, à 4 ° C) et il resuspendre dans 15 µL de traitée DEPC, exempte de RNase H20. La proportion d’ARN marqué-à-total devrait être d’environ 2 % à 4 % (généralement plus vers l’extrémité inférieure), rendre d’environ 2,0 µg d’ARN nouvellement synthétisée. Cette quantité est suffisante pour faire plusieurs expériences de qPCR, ainsi que pour les analyses de microarray/séquençage.

6. RT-qPCR Validation des différentes Fractions

  1. Synthèse de cDNA de 2 µg d’ARN total ou 10 µL d’ARN marqué à l’aide des hexamères aléatoire et la transcriptase inverse de choix, selon les instructions du fabricant (Table des matières).
  2. Amplifier l’ADNc par qPCR en temps réel en utilisant un protocole standard (Table des matières).
    Remarque : Tous les échantillons doivent être exécutés en trois exemplaires d’un minimum de deux réplicats biologiques. Corrigez toutes les valeurs brutes pour l’expression de S. pombe tubuline.

7. l’hybridation « microarray »

  1. Hybrider les échantillons d’ARN sur puces de microarray préféré selon les instructions du fabricant (pour ce protocole spécifique, consultez la Table des matières). En bref, préparer biotinylé cRNA cibles de 150 ng d’ARN en utilisant le Premier Kit d’Amplification d’ARN (Table des matières), selon les instructions du fabricant. Hybrider 4 mg de Crna fragmentés pendant 16 h à 45 ° C et 60 tr/min sur les puces de microarray.
  2. Laver, tache et balayer les puces à l’aide de la station indiquée et le scanner (Table des matières). Extraire les données brutes (fichiers CEL intensité) à partir des images numérisées à l’aide de la console de commande (AGCC, version 4.1.2).
  3. Encore traiter les fichiers CEL avec la version du logiciel Console Expression 1.4.1 pour calculer la sonde définie les intensités du signal et en utilisant les algorithmes statistiques MAS 5.0 avec les paramètres par défaut et la mise à l’échelle mondiale comme méthode de normalisation.
    Remarque : L’intensité cible moyenne ajustée de chaque puce a été fixée arbitrairement à 100. Effectuer toutes les expériences à l’aide d’au moins deux réplicats biologiques indépendants. Normaliser les données brutes pour le signal de S. pombe et calculer le pli des changements dans les niveaux d’ARN totales et nouvellement synthétisées.

8. analyse à l’aide d’un tuyau existant de R

  1. Calculer la synthèse et de la décomposition des taux à l’aide d’un pipeline et les R/Bioconductor paquet accessible au public, comme décrit précédemment8,,10.

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Representative Results

Lorsque vous effectuez un marquage métabolique de l’ARN transcrit nouvellement, plusieurs aspects doivent être contrôlés : le temps et l’efficacité de l’étiquetage, l’épi-en proportion, le protocole d’extraction et l’efficacité de la biotinylation (y compris signal-to-noise ratio), Parmi d’autres. Ces conditions ont été longuement et méthodiquement illustrées par d’autres7,10,11. Ici, nous nous concentrons principalement sur l’interprétation et l’analyse immédiate qui peut être effectuées une fois que les échantillons ont été traités, soit par RT-qPCR, microarray ou séquençage. Les analyses des différentes souches mutantes de démontrer la puissance de la méthode pour détecter non seulement une baisse spectaculaire de globale dans la synthèse de l’ARNm, comme dans le cas de mutant SAGA S. cerevisiae souches, mais aussi une réduction très douce de l’activité de la RNA polymérase II sur suppression de la monoubiquitination de l’histone H2B.

Nos analyses des activités enzymatiques SAGA a suggéré un recrutement large à la chromatine15, qui n’est pas révélée par l’analyse des niveaux d’ARNm stationnaire chez les souches mutantes de SAGA. Recrutement de RNA polymérase II a été réduite à l’inactivation de la SAGA, nous avons décidé d’analyser si le taux de synthèse d’ARNm seraient touchés dans le monde. Par conséquent, sauvage ou mutant des souches de S. cerevisiae ont été exposés à 4tU pendant 6 min, d’étiqueter les ARN nouvellement transcrites. Après avoir mélangé avec l’épi-en cellules marquées (S. pombe) dans une proportion de 3:1, l’ARN total a été extrait et ARN nouvellement synthétisé est biotinylé et purifiée selon le protocole présenté ici, comme dans le chronogramme illustré à la Figure 1. RNAs marqués ont été purifiées sur un total de 200 µg d’ARN, en veillant à ce que la quantité de produit purifié ne suffire pas pour n’importe quelle application en aval. Comme une étape initiale et systématique avant toute analyse du génome, purification de RNA nouvellement synthétisée a été validée par la RT-qPCR. Gènes ont été sélectionnés selon plusieurs critères, y compris un niveau d’expression, voies réglementaires et une dépendance sur les différents ARN polymérases.

Pour confirmer que ce protocole purifie spécifiquement étiqueté RNA, nous avons mesuré les niveaux de transcription dans les fractions purifiées à partir des cellules de type sauvage qui ont été cultivées avec ou sans 4tU. Un niveau négligeable de RNAs analysé ont été détecté des cellules qui n’étaient pas exposés à 4tU (Figure 2A). Purification de RNA nouvellement transcrite était encore validée par l’enrichissement observé de l’intron contenant ACT1 ARN pré-messager (données non présentées). Après validation de la qualité des échantillons, nous avons vérifié si la synthèse de l’ARNm serait affectée à la suppression de SPT20, qui est connu pour perturber l’assemblage complexe de SAGA. Tel que rapporté par d’autres, quantification de mRNA effectuée sur l’ARN total (état d’équilibre) de la souche Δ de spt20a révélé principalement des niveaux stables ou légèrement réduites pour les gènes testés (Figure 2B). Résultats semblables sont obtenus pour les souches supprimés pour BRE1 (Figure 2B). En revanche, l’analyse de l’ARN transcrit nouvellement de la souche Δ de spt20a révélé une baisse dramatique dans la synthèse de l’ARNm par trois-testé à cinq fois pour tous les gènes (Figure 2C). La perte de Bre1 conduit à une diminution plus discrète mais toujours visible dans les niveaux d’ARNm nouvellement synthétisé pour les gènes étudiés (Figure 2C). Bon d’accord avec un rôle de SAGA et Bre1 dans la transcription de l’ARN polymérase II, la perte de Spt20 ou de Bre1 n’a pas affecté l’expression des gènes RDN25 ou snR6 , transcrits par l’ARN polymérase I et l’ARN polymérase III, respectivement ( Figure 2C).

Cependant, souches supprimés des sous-unités structurales de la SAGA complexe, comme SPT7 ou SPT20, affichent graves phénotypes de croissance lente qui peuvent expliquer les altérations observées transcriptionnelles. Pour exclure des effets secondaires indésirables, que nous appauvri conditionnellement Spt7 du noyau, à l’aide d’ancrage-away s. cerevisiae souches14,24. Après 60 min de traitement de la rapamycine, avant l’impulsion-marquage avec 4tU (voir la Figure 1 pour une représentation schématique), nouvellement transcrites de l’ARNm ont été réduites de manière similaire que celle observée chez la souche de suppression (2EFigure 2D et ). Cette analyse, ainsi, a confirmé nos résultats anciens et validé le protocole pour ce système d’épuisement inductible. Dans une analyse temporelle, où les cellules sont exposées à la rapamycine pour un temps allant de 0 à 240 min, expression réduite témoignent immédiatement après 15 min d’exposition à la drogue. Plus intéressant encore, les niveaux d’ARNm stationnaire ont eu tendance à diminuer au départ mais retournés à des niveaux normaux après 60 min, une indication qu’un mécanisme de compensation a lieu dans l’intervalle (Figure 2E).

Au total, l’étiquetage et à la quantification de l’ARN nouvellement synthétisé permis révélant de nouveaux rôles réglementaires relatifs à l’ensemble de la SAGA. Le protocole décrit pourrait également révéler des effets modérés sur l’activité RNA polymérase II et a été appliquée avec succès à condition d’épuisement souches de levures.

Une des applications en aval pour l’ARN nouvellement synthétisé purifiée est une quantification du génome des transcriptions par microarray hybridation ou séquençage (4tU-seq). Alors que le séquençage haut-débit est plus quantitative, sensible et informatifs, microarray hybridation peut être très utile pour déterminer si les niveaux de mRNA global sont altérées. Dans ce contexte où la normalisation est essentielle, nous avons ajouté un épi-dans l’organisme à l’échantillon que nous avons cherché à analyser. Plus précisément, nous avons mélangé les cellules de S. cerevisiae de S. pombe dans un ratio de 3:1, les deux étant préalablement exposées à 4tU. Quand l’ARN purifié, étiquetées est soumis au séquençage haut-débit, n’importe quel protocole de préparation de bibliothèque standard peut être utilisé, le plus souvent suite à l’appauvrissement de l’ARN ribosomique. Normalisation entre 4tU-seq données provenant de différents échantillons a été réalisée en ajoutant soit étiqueté RNA de différentes espèces (p. ex., mélange s. cerevisiae et s. pombe cellules comme ci-dessus)22 ou in vitro- transcription de l’acte, THIOLÉS spike-dans RNA12,25,26,27. Copeaux de microarray disponibles dans le commerce contiennent des sondes pour le transcriptome entier de levure en herbe et la fission, ce qui permet la quantification d’ADN messagère de ces deux organismes dans une expérience unique. Microarray hybridations ont été réalisées avec de l’ARN total et nouvellement synthétisée validé par RT-qPCR comme indiqué ci-dessus (sauvage, spt20Δ et bre1Δ). En outre, nous avons inclus une souche qui ne supporte pas les monoubiquitination de l’histone H2B, par le biais de mutation ponctuelle du résidu ubiquitinable (K123R). Parce que la même proportion exacte des cellules de s. pombe ont été utilisés dans les différents échantillons et les répétitions, il est possible de redimensionner linéairement des tableaux intensités afin que le total et étiquetés S. pombe sondes ont la même intensité médiane. Cette normalisation, ou mise à l’échelle, peut être effectuée à l’aide d’un paquet de Bioconductor mis au point par le laboratoire de Patrick Cramer et est utilisé en parallèle dans tous les échantillons analysés, totales et étiqueté fractions et sauvage et des mutants de souches8. En bref, l’entrée de ce pipeline est un fichier Excel contenant les sondes et leur intensité (MAS5 ou RMA) pour tous les échantillons et les fractions. Après exclusion des sondes qui sont hors du champ de détection, l’intensité du signal est recalibrée, prenant en compte les valeurs d’intensité des sondes S. pombe . Enfin, vous pouvez mapper les sondes sur le bourgeonnement et des génomes de levures de fission, se terminant par une matrice contenant les valeurs de l’expression normalisées pour que la pointe. Ces valeurs peuvent être traitées (voir section suivante) ou utilisé tel quel. Dans l’exemple suivant, nous avons déterminé que le pli change de chaque relevé de notes entre le mutant et la souche sauvage.

Les analyses ont été effectuées pour les deux stationnaire ou nouvellement synthétisé les niveaux d’ARN et comploté contre leur signification statistique (p-value) (Figure 3). En accord avec d’autres études, analyse des niveaux d’ARN totales, seulement quelques gènes avaient leur expression altérée, soit vers le haut - soit diminuée (Figure 3 a-3 C). Cependant, l’analyse de l’ARN transcrit nouvellement conduit à des conclusions très différentes. Les taux d’ARNm nouvellement transcrites de plus de 4 000 gènes ont été significativement réduites d’au moins deux fois à la suppression de SPT20, suggérant un effet global positif de SAGA sur la RNA polymérase II transcription dans les levures bourgeonnantes (Figure 3D ). En outre, dans les bre1Δ et K123R des mutants, les résultats ont été plus discrets : la majorité des gènes semblent avoir leur expression réduite, mais l’importance de la régulation à la baisse et le nombre de gènes significativement affectés (≈ 300-500) est en effet plus Limited (Figure 3E et 3F).

Comme précédemment mentionnés, stationnaire ou totales des niveaux d’ARNm sont dictées par l’équilibre serré entre la synthèse et la dégradation (Figure 4A). Lorsque la transcription de l’ARN polymérase II est globalement médiocres, deux scénarios peuvent être sur la photo : niveaux (i) soit l’ARNm total diminuent dans le monde, en réponse à la synthèse réduite mais décroissance constante, ou dégradation de l’ARNm (ii) est diminuée dans la même mesure, résultant dans plupart du temps inchangé l’ARNm stationnaire. Le deuxième scénario a été signalé à plusieurs conditions, notamment dans le cadre de la SAGA ou TFIID perturbation9,10,14,16,22. Une procédure appelée analyse comparative dynamique transcriptome (CFDC) basé sur 4tU étiquetage et modélisation cinétique dynamique permet de déterminer la synthèse de l’ARNm et en déduire le taux de décomposition pour chaque transcription8,10. Une fois de plus, nous avons profité des données recueillies pour les souches mentionnées précédemment (sauvage, spt20Δ, bre1Δ et K123R). Comme prévu, à la suppression de SPT20, nous avons observé une baisse simultanée des ARNm des taux de synthèse et de dégradation par rapport à la souche sauvage. Dans cette souche mutante, l’indemnité était presque optimale, avec une moyenne diminution de synthèse de 3,8 et une moyenne diminuent en décomposition de 4.1-fold (Figure 4B), corroborer, pourquoi seulement des changements limités transcriptionnelles pourraient être détectés sur les niveaux d’ARNm total (Figure 3A). Dans les deux autres souches mutantes (bre1Δ et K123R), des modifications concomitantes dans la synthèse de l’ARNm et la décomposition ont aussi été observées, mais les changements étaient sur une échelle beaucoup plus petite et plus dispersée (Figure 4 et 4D).

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique de l’étiquetage métabolique de l’ARN à l’aide de 4tU. 4tU fraîchement préparé est ajouté au milieu de culture et cellules sont marquées pendant 6 min. étiquetées S. cerevisiae et S. pombe cellules sont mélangés dans un ratio de 3:1 et l’ARN total est extrait. Par la suite, les ARN nouvellement synthétisé est biotinylé et peut être purifié à l’aide de billes magnétiques streptavidine. Enfin, total RNA (stationnaire) et étiqueté nouvellement synthétisées RNA peut être utilisé dans une variété d’applications en aval, y compris l’hybridation RT-qPCR et microarray ou séquençage. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Analyse représentant les changements transcriptionnels dans les deux stationnaire et nouvellement transcrites RNA déterminé par RT-qPCR. (A) RNA niveaux de cinq gènes différents ont été quantifiés de la fraction d’ARN marquée purifiée à partir de cellules de type sauvage qui ont été exposés soit ou non à 4tU. Les deux panneaux montrent (B) total et (C) nouvellement synthétisés quantification de RNA par RT-qPCR de type sauvage (WT), spt20Δ et bre1des cellules de levure Δ. Souches d’anchor-loin de Spt7, non traitées ou traitées avec la rapamycine pendant 60 min, ont été marquées avec 4tU et total (D) ou (E) nouvellement transcrites RNA a été quantifié par RT-qPCR. (F), ce panneau indique l’analyse temporelle des changements dans l’équilibre et nouvellement synthétisé ARNm sur l’appauvrissement de la couche nucléaire Spt7. Pour tous les échantillons, les niveaux d’ARNm cinq gènes d’ARN polymérase II ont été quantifiés par RT-qPCR. L’ARN polymérase I et gènes d’ARN polymérase III (RDN25 et snR6, respectivement) ont été utilisés comme contrôle. Valeurs de l’expression (moyenne ± écart-type de trois expériences indépendantes) ont été normalisées pour les dopés-dans S. pombe du signal et la valeur 1 dans l’échantillon de contrôle. Panneaux D-F ont été modifiés de Baptista et al. 14. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Analyses de Génome-large d’ARNm en utilisant des fractions de RNA totales ou étiquetées. Ces panneaux montrent volcan parcelles montrant pli changements dans les niveaux d’ARNm stationnaire (A-C) ou (D-F) nouvellement synthétisé de l’ARNm par rapport à leur importance (p-value). Les changements de pli (FC) ont été calculées comme la log2 du ratio de la valeur de l’expression de chaque gène après normalisation du signal de S. pombe dans le Δ de spt20(A et D), Δ de bre1(B et E), ou () C et F) K123R de la souche par rapport à la valeur de l’expression du gène même dans sauvage S. cerevisiae. Un total de 5 385 gènes ont été analysés, et changent de seuils de double (point bleu : plus qu’un double diminuer ; jaune points : plus de deux fois plus) et 0,05 p-valeurs ont été considérées. Panneaux A et D ont été modifiés de Baptista et al. 14. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Parallèle des changements dans la synthèse de l’ARNm et des résultats de désintégration ARNm en ARNm mise en mémoire tampon. (A), ce tableau montre une représentation schématique du résultat d’une perturbation de la synthèse de RNA sur les niveaux d’ARN stationnaire. (B-D) Ces panneaux montrent le calcul de la synthèse de l’ARNm et le taux de décomposition des analyses de l’ARN total et nouvellement synthétisée. Les taux de synthèse et de dégradation ont été déterminés pour chaque transcription de S. cerevisiae (B) spt20Δ, Δ bre1(C) et (D) K123R. (Calculés selon le log2 du rapport entre le mutant et sauvage) des changements dans les taux de synthèse ont été tracées contre les fluctuations des taux de désintégration. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Alors que le génome des outils pour analyser les changements dans la transcription sont améliorent encore, la seule analyse du transcriptome par le biais de la quantification des niveaux d’équilibre de l’ARN pourrait reflètent pas exactement les changements dans l’activité d’ARN polymérase II. En effet, les niveaux d’ARNm sont réglementés non seulement par la synthèse de l’ARN, mais aussi par leur maturation et leur dégradation. Pour mesurer la synthèse d’ARNm dételée de dégradation de l’ARNm, protocoles distincts ont été élaborés ces dernières années pour l’analyse de la transcription naissante chez les levures et les mammifères.

Un des protocoles plus largement utilisés pour la quantification de la transcription naissante est GRO-seq1. Alors que le principal avantage de GRO-seq est sa capacité à dévoiler une polymérase transcriptionnellement active et engagée à haute résolution et faible bruit de fond, il a deux points distincts qui diminuent son attractivité : (i) il est techniquement difficile et nécessite la isolement des noyaux et des manipulations de noyaux (ii) introduire quelques perturbations au système28. Une autre alternative est NET-seq, qui repose sur le séquençage de l’extrémité 3' des relevés de notes obtenus lors de l’immunoprécipitation du complexe ternaire extrêmement stable formé entre ARN naissante, modèle ADN et l’ARN polymérase II. Cette approche permet la caractérisation des ARN naissante à une résolution de paires de bases et peuvent explorer les événements de traitement ARNm par immunoprécipitation de la mis à jour le RNA polymérase II (phosphorylation de sérine-5, par exemple)2,3 , 29. Néanmoins, il présente quelques obstacles, d'où nous mettons en évidence trois. Tout d’abord, tandis que les anticorps ciblant l’ARN polymérase II sont généralement très précis, ça dépend sur l’efficacité de l’anticorps. Deuxièmement, RNA peut-être être enclin à dégradation durant les périodes d’incubation, ainsi nous conduire au point précédent (anticorps moins efficaces peuvent nécessiter une incubation plus longue fois, laissant l’ARN plus sensibles à la dégradation)29. Tiers et notamment en mammifères, la digestion MNase et la sélection de la taille pourraient exclure les séquence unique alignement29,30.

Ici, nous avons présenté un protocole détaillé pour le marquage métabolique de l’ARN nouvellement synthétisé à l’aide de 4tU chez S. cerevisiae qui a différents avantages par rapport aux autres approches disponibles. Parce que la transcription est très sensible aux perturbations, les cellules doivent être maintenues dans les conditions physiologiques plus. Par exemple, GRO-seq implique l’arrestation de transcriptionally engagé ARN polymérase II par l’exposition des cellules/noyaux à sarkosyl. Cependant, traitement sarkosyl a été décrit comme inhibiteur de plusieurs processus cellulaires11. Dans ce cas, un marquage métabolique avec 4tU ou 4sU à la concentration décrite est non perturbant et n’affecte pas visiblement l’homéostasie cellulaire, surtout pour de courtes périodes d’exposition. Contrairement à d’autres méthodes utilisant inhibition de la transcription pour mesurer les ARNm demi-vies, cDTA ou 4tU-seq et raccord avec la modélisation dynamique détermine les taux de dégradation de chaque seul ARNm dans les cellules non perturbés. Par conséquent, une seule méthode peut adresser simultanément tant la synthèse et le taux de décomposition du transcriptome entière sur un type spécifique de cellules. Puisque le cDTA ou 4tU-seq tire profit des méthodes de normalisation très fiable, à savoir par le biais de l’utilisation de l’épi, différents ensembles de données pouvant être analysés ensemble et directement comparée. Enfin, marquage métabolique et la quantification de l’ARN nouvellement synthétisé est une technique qui peut être facilement implémentée dans n’importe quel laboratoire de biologie moléculaire comme il ne nécessite aucun équipement spécifique. Ceci explique probablement la diffusion assez importante de cette technique, qui a tendance à utiliser plus systématiquement pour étudier la production d’ARN et de la dégradation dans les levures, ainsi que chez les eucaryotes supérieurs.

RNA peut être étiquetée dans les cellules vivantes à l’aide d’autres analogues nucléosidiques, à savoir 5-bromouridine (BrU)31,32 ou 5-ethynyluridine (EU)33,34. L’isolement de BrU RNA marqués au pouls s’appuie sur la purification d’anticorps anti-BrdU qui peut-être avoir différentes efficacités entre les expériences. RNA EU marqués peut être conjugué par liaison covalente à la biotine utilisant la chimie de clic menant à une conjugaison irréversible contrairement à modification de thiol, qui peut être inversée avec les agents réducteurs. BrU et EU marquage ont été utilisés dans les cellules de mammifères pour déterminer tout le génome RNA decay tarifs31,32 ou pour évaluer la naissante RNA synthèse34,35. Toutefois, le BrU ou UE étiquetage n'a pas été décrite chez S. cerevisiae. En effet, l’absorption d’analogues nucléosidiques nécessite l’expression du transporteur de nucléosides et, ainsi, ces méthodes apparaissent moins flexibles dans la levure de bière que marquage avec 4tU.

La durée de l’étiquetage 4tU adaptable et varie en fonction de la question. Lors de l’évaluation des ARNm synthèse chez S. cerevisiae, une courte impulsion étiquetage 6 min veille à ce que les taux d’ARNm nouvellement transcrites sont minimalement touchés par la dégradation de l’ARN. Considérant que le temps de latence avant que le nucléotide modifié peut être incorporé dans l’ARN naissante est inférieure à 1 min, cette durée de 6 min étiquetage garantit qu’une quantité raisonnable de l’ARN nouvellement synthétisé peut être épurée. Ces protocoles, tel que défini par Miller et al. 11, a été utilisé dans différents S. cerevisiae mutants pour révéler les changements globaux dans la synthèse de l’ARNm et l’ARN désintègrent9,10,22,26,27, 36. une étiquetage plus durée (3 h) a été utilisée dans un pulse-chase métabolique marquage avec 4tU pour déterminer la vitesse de décomposition de tous les ARNm dans S. cerevisiae12. Enfin, extrêmement court (à partir de 1,5 min) 4tU étiquetage a été utilisé pour étudier la cinétique de traitement RNA en herbe et fission levure13,25,37.

Néanmoins, cette méthode a quelques limitations, comme le rendement relativement faible d’ARN marqué récupéré à la fin du protocole entier. Alors que chez la levure, il n’y a pas de limitation dans le matériel de départ, et cela peut être un problème lors de l’analyse des cellules de métazoaires, notamment si ce protocole est être utilisés in vivo. Une des étapes limitantes du protocole est biotinylation de la piscine de RNA marquée, dont l’efficacité est loin d’être achevée et a été estimée à modifier une personne sur trois 4sU résidus étiquetées RNA5. Il a récemment montré que l’utilisation de méthanethiosulfonate (MTS)-biotine, au lieu de biotine-HPDP, augmente le rendement de récupération RNA38. Toutefois, selon des résultats non publiés de ce groupe de recherche et résultats de Rutkowski et Dölken, MTS-biotine n’est pas totalement spécifique thiol, conduisant à la purification d’ARN sans étiquette, qui est particulièrement problématiques lorsque de faibles quantités d’ARN marqué sont purifiée39. Une autre limitation de l’étiquetage métabolique à l’aide de 4tU/4sU est la vitesse intrinsèque à laquelle RNA polymérase s’allonge. La vitesse moyenne de l’ARN polymérase II a été estimée à environ 3,5 Ko/min40,41,42. Par conséquent, par un marquage de 6 min, la polymérase aura la capacité pour transcrire les 15 à 20 Ko. Ainsi, dans une expérience avec une courte impulsion-marquage avec 4tU/4sU, seulement les 3' fin partie de l’ARN transcrit nouvellement est appelée, tandis que les régions d’extrémité 5' étaient déjà avant l’ajout de 4tU/4sU. Ainsi, la purification d’ARN marqué enrichit également préexistant extrémités 5' de relevés de notes, notamment des transcriptions longues comme dans les cellules de mammifères. Afin de surmonter cette partialité, dans un protocole raffiné appelé TT-seq, l’extrait intitulé RNA est fragmenté par sonication avant la purification des espèces nouvellement synthétisées43.

Au total, 4tU-seq est un excellent moyen de transcriptional changement d’adresse dans un contexte donné. Néanmoins, et alors que le protocole est assez simple, il se compose de plusieurs étapes différentes, étant finalement assez riche. Tout d’abord, étant donné que ce protocole gère RNA de bout en bout, il est obligatoire que toutes les exigences nécessaires pour obtenir un exemple propre et exempte de dégradation sont remplies. Par conséquent, tous les réactifs doivent être exempte de RNase, et tous les matériaux doivent être dédiés à la manipulation des ARN, tout nettoyer soigneusement et régulièrement avec la solution de décontamination de RNase. Deuxièmement, alors que la réaction de biotine est hautement spécifique, l’excès de biotine-HPDP qui n’ont pas réagi devrait être retiré de l’échantillon (pour éviter la saturation des perles streptavidine avec de la biotine qui n'est pas lié par covalence à l’ARN, par exemple). Tiers, tel que décrit dans le protocole, l’utilisation de billes magnétiques-streptavidine indiquées est fortement recommandée, puisque le plusieurs recherche groupes nous avons parlé d’avoir tous a indiqué que ces perles pour abaisser des niveaux de fond. Qualité Quatrièmement, appropriée et le contrôle expérimental doit être utilisé. Inclure des échantillons provenant de cellules qui n’étaient pas exposés à 4tU/4sU. Ces échantillons seront très utiles pour lutter contre les niveaux de fond et pour s’assurer que, pendant l’expérience, une contamination avec de l’ARN non marqué ne se produit pas. En outre, une autre excellente alternative pour tester si l’échantillon est enrichi pour ARN nouvellement synthétisé est d’effectuer un RT-qPCR en utilisant des amorces contre un gène contenant de l’intro. Les amorces devraient être complémentaires à l’extrémité 3' et 5' fin de deux consécutifs exon et intron ou vice versa. Enfin, avant le séquençage de l’hybridation de microarray, valider les échantillons par RT-qPCR. Pour ce faire, différents gènes avec différents niveaux d’expression et la régulation doivent être sélectionnés et analysés. Idéalement, cela doit être exécutée pour les deux différentes fractions de l’ARN (ARN stationnaire et nouvellement synthétisée).

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions Laszlo Tora pour son soutien et V. Fisher, K. Schumacher et F. El Saafin pour leurs discussions. C.T. a été soutenue par une bourse Marie Curie-ITN (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) et l’ARC de la Fondation. Ce travail a été soutenu par des fonds de l’Agence Nationale de la Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2). Cette étude a été soutenue également par l’ANR-10-LABX-0030-INRT, un fonds de l’État Français géré par l’Agence Nationale de la Recherche dans le cadre programme Investissements d’avenir ANR-10-IDEX-0002-02.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Thiouracil Sigma-Aldrich Cat# 440736
Rapamycin Euromedex Cat# SYN-1185
Countess II FL Automated Cell Counter ThermoFisher N/A
RiboPure RNA Purification kit, yeast ThermoFisher Cat# AM1926
NanoDrop 2000 Spectrophotometer ThermoFisher ND-2000
TURBO DNA-free Kit ThermoFisher AM1907
EZ-Link HPDP Biotin ThermoFisher Cat# 21341
Thiolutin Abcam ab143556
µMACS Streptavidin kit Miltenyi Biotec Cat# 130-074-101
Transcriptor Reverse Transcriptase Roche 03 531 295 001
SYBR Green I Master Roche 4707516001
GeneChip Yeast Genome 2.0 ThermoFisher 900555
GeneChip Fluidics Station 450 ThermoFisher 00-0079
GeneChip Scanner 3000 7G ThermoFisher 00-0210

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