Biochemistry

अलग और Diatom Cyclotella Meneghiniana से Thylakoid लिपिड के साथ Liposomes में प्रकाश संचयन एंटेना शामिल

Published: August 28, 2018 doi: 10.3791/58017

Kerstin Pieper¹, Kathi Gundermann¹, Lars Dietzel¹

¹Institute for Molecular Biosciences, Goethe University

Summary

यहां, हम diatoms से fucoxanthin क्लोरोफिल एक/सी बाध्यकारी प्रोटीन (FCP) को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद है और उंहें प्राकृतिक लिपिड रचनाओं के साथ liposomes में शामिल करने के लिए आयन संरचना परिवर्तन पर उत्तेजना ऊर्जा हस्तांतरण का अध्ययन ।

Abstract

पौधों, शैवाल और diatoms के संश्लेषक प्रदर्शन दृढ़ता से chloroplasts की thylakoid झिल्ली में प्रकाश संचयन और ऊर्जा हस्तांतरण प्रक्रियाओं के तेज और कुशल विनियमन पर निर्भर करता है । diatoms के प्रकाश संचयन एंटीना, तथाकथित fucoxanthin क्लोरोफिल एक/सी बाध्यकारी प्रोटीन (FCP), प्रकाश अवशोषण और संश्लेषक प्रतिक्रिया केंद्रों के लिए कुशल हस्तांतरण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से फोटो के लिए अत्यधिक प्रकाश से सुरक्षा के लिए आवश्यक हैं । इन दो कार्यों के बीच स्विच अनुसंधान के एक लंबे समय से खड़ा है । इनमें से कई अध्ययनों को डिटर्जेंट micelles में FCP के साथ किया गया है । संपर्क अध्ययन के लिए, डिटर्जेंट हटा दिया गया है, जो FCP परिसरों के एक विशिष्ट एकत्रीकरण के लिए नेतृत्व किया । इस दृष्टिकोण में, यह कलाकृतियों और शारीरिक रूप से प्रासंगिक डेटा के बीच भेदभाव करने के लिए कठिन है । इसलिए, FCP और अन्य झिल्ली के बारे में अधिक मूल्यवान जानकारी प्रकाश संचयन परिसरों में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन, ऊर्जा अंतरण और अन्य स्पेक्ट्रोस्कोपी सुविधाओं का अध्ययन करके प्राप्त किया जा सकता है यदि वे अपने देशी लिपिड वातावरण में एम्बेडेड हैं. मुख्य लाभ यह है कि liposomes एक परिभाषित आकार और एक परिभाषित लिपिड/FCP clustering की हद तक नियंत्रित किया जाता है जिसके द्वारा । इसके अलावा, पीएच और आयन संरचना में परिवर्तन है कि vivo में प्रकाश संचयन को विनियमित आसानी से नकली जा सकता है । thylakoid झिल्ली की तुलना में, liposomes अधिक समरूप और कम जटिल हैं, जो इसे प्राप्त करने और स्पेक्ट्रोस्कोपी डेटा को समझने के लिए आसान बनाता है । प्रोटोकॉल FCP अलगाव और शुद्धि, liposome तैयारी की प्रक्रिया का वर्णन है, और प्राकृतिक लिपिड संरचना के साथ liposomes में FCP का निगमन । एक ठेठ आवेदन से परिणाम दिया और चर्चा कर रहे हैं ।

Introduction

ऐसे diatoms के रूप में संश्लेषक जीवों कभी बदलने प्रकाश शर्तों के साथ सामना करना चाहिए और परिष्कृत acclimation तंत्र है कि उच्च संश्लेषक क्षमता को बनाए रखने और फोटो ऑक्सीडेटिव अत्यधिक प्रकाश की वजह से नुकसान से बचाने के साथ प्रतिक्रिया । संश्लेषक eukaryotes में एक प्रमुख प्रकाश सुरक्षात्मक प्रक्रिया उच्च ऊर्जा शमन (क्यू_ई) अवशोषित प्रकाश कि गैर करने के लिए मुख्य योगदान के रूप में होता है photochemical शमन (NPQ) प्रकाश तनाव की स्थिति के तहत¹^,² ^,³. लाइट हार्वेस्टिंग एंटीना परिसरों (LHC) उत्तेजना ऊर्जा हस्तांतरण रास्ते के विनियमन में शामिल हैं । chloroplast लुमेन में उच्च प्रकाश प्रेरित कम पीएच के जवाब में, एंटीना प्रणाली प्रकाश संचयन राज्य से शमन राज्य के लिए स्विच करता है. इस ऊर्जा अपव्यय राज्य photosystems (पुनश्च) और फोटो-ऑक्सीकरण से thylakoid झिल्ली में अन्य परिसरों की रक्षा करता है । संश्लेषक eukaryotes में, q_E आमतौर पर दो कारकों¹^,²^,³द्वारा प्रेरित है । एक कारक विशेष प्रकाश संचयन प्रोटीन है कि कम पीएचको जवाब है । PsbS प्रोटीन उच्च संयंत्रों में क्यू_ई लाती⁴। LhcSRs⁵, PsbS गतिविधि द्वारा संग्राहक, हरी शैवाल⁶में क्यू_ईप्रेरित । Diatoms Lhcx-प्रोटीन की तरह है जो संरचनात्मक LHCSRs⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰से संबंधित अधिकारी ।

q_E का दूसरा कारक xanthophyll चक्र है जहां एंटीना के carotenoids को डी-epoxidation द्वारा फोटो-सुरक्षात्मक रूप में परिवर्तित किया जाता है और epoxidation द्वारा वापस किया जाता है । पौधों और हरित शैवाल में violaxanthin को zeaxanthin में परिवर्तित किया जाता है । diatoms में, diadinoxanthin diatoxanthin में कनवर्ट किया जाता है, जो NPQ¹¹की सीमा के साथ फिर से संबद्ध है । यह संयंत्र और मनोरथ LHCs से संबंधित विकासवादी है, हालांकि diatom प्रकाश संचयन एंटीना कुछ ख़ासियत के पास । फोटो संरक्षण के लिए प्रकाश संचयन से स्विच अत्यधिक तेजी से है और NPQ क्षमता पौधों की तुलना में अधिक है¹²। यह एक कारण है कि diatoms अलग पारिस्थितिकी niches में एक तरीका है कि वे ओशियानिक शुद्ध प्राथमिक उत्पादन¹³के ४५% तक के लिए जिंमेदार है में बहुत सफल रहे है हो सकता है । इसलिए, diatom लाइट हार्वेस्टिंग सिस्टम प्रकाश संश्लेषण की एक दिलचस्प वस्तु अनुसंधान कर रहे हैं ।

Diatoms, केंद्रित प्रजातियों Cyclotella meneghiniana की तरह, thylakoid आंतरिक प्रकाश संचयन प्रणालियों के नाम pigments वे बांध के बाद-fucoxanthin, क्लोरोफिल (chl) ए और सी, इसलिए FCP । लाइट हार्वेस्टिंग प्रोटीन, जैसे FCPs, कई झिल्ली परतों शामिल thylakoid झिल्ली प्रणाली में एंबेडेड । तीन thylakoids के Diatoms फार्म बैंड । इस जटिल स्थिति से उन्हें thylakoid झिल्ली में आणविक स्तर पर अध्ययन करना मुश्किल हो जाता है. इसके अलावा, कई घटक प्रकाश संचयन के विनियमन में योगदान (ऊपर देखें) । इसलिए, कई तरीकों में, परिसरों में हल्के डिटर्जेंट का उपयोग कर झिल्ली से अलग-थलग थे, जैसे n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (β-डीडीएम), जो झिल्ली solubilize लेकिन FCP परिसरों बरकरार रखें । intramolecular ऊर्जा अंतरण¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷की जांच के लिए solubilized FCP का प्रयोग करते हुए कई स्पेक्ट्रोस्कोपी अध्ययनों का प्रदर्शन किया गया । हालांकि, यह पूर्व दृष्टिकोण ऊर्जा हस्तांतरण के विनियमन के बाद से सीमित था अंय एंटीना परिसरों या photosystems के साथ excitonic बातचीत की जरूरत है । इसलिए, अध्ययनों के इन प्रकार के बाहर solubilized परिसरों के साथ नहीं किया जा सकता है क्योंकि परिसरों के बीच बातचीत खो दिया है ।

एंटीना विनियमन में एक महत्वपूर्ण विशेषता "thylakoid झिल्ली¹⁸में एंटीना और photosystems की आणविक भीड़" है । पूर्व में, एक साधारण दृष्टिकोण बाहर किया गया था इन विट्रो में इस आशय का अनुकरण । डिटर्जेंट हटा दिया गया था, जो एंटीना परिसरों के यादृच्छिक एकत्रीकरण की ओर जाता है । हालांकि कुछ उचित डेटा इस दृष्टिकोण¹⁷^,¹⁹द्वारा प्राप्त किया गया था, डिटर्जेंट हटाने की स्थिति vivo में प्रतिबिंबित नहीं करता है और कुछ सीमाएं हैं क्योंकि परिसरों में उनके नियमित तृतीयक में बातचीत नहीं कर रहे हैं संरचना.

liposomes का उपयोग पूर्व सीमाओं के कई पर काबू । तृतीयक संरचना अभी भी पूरी तरह बरकरार है । liposome झिल्ली एंटीना परिसरों के लिए एक अर्ध-देशी वातावरण प्रदान करता है । झिल्ली बाहर के वातावरण से liposome के अंदर अलग होती है. इन साधनों के द्वारा, liposomes आयन और पीएच ढाल के रूप में अच्छी तरह से परिवहन प्रक्रियाओं के लिए अध्ययन के लिए दो प्रतिक्रिया डिब्बों प्रदान करते हैं । इसके अलावा, प्रायोगिक प्रणाली के मापदंडों thylakoid झिल्ली में अध्ययन के लिए और अधिक आसानी से नियंत्रित किया जा सकता है । Liposomes पहले से ही संश्लेषक परिसरों का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण होने के लिए दिखाए गए थे । अतीत में एक प्रमुख ध्यान संयंत्र LHC पर था, जहां बदल लिपिड संरचना के प्रभाव LHC द्वितीय²⁰पर परीक्षण किया गया था । अंय दृष्टिकोणों में, विभिंन LHC द्वितीय के बीच प्रोटीन प्रोटीन संपर्क²¹जांच की गई । इसके अलावा, हरी शैवाल में कुछ अध्ययनों से बाहर किया गया है कि LHC²²के बीच सहज clustering का वर्णन । जलीय पारिस्थितिकी प्रणालियों के लिए diatoms के महत्व को ध्यान में रखते हुए, अपेक्षाकृत कुछ अध्ययनों diatoms के एंटीना परिसरों के साथ प्रदर्शन किया गया । दो अध्ययनों से केंद्रित Cyclotella meneghiniana के एंटीना परिसरों की जांच की, जहां clustering के FCP एंटीना²³ और FCP की जवाबदेही विद्युत ढाल²⁴ के लिए दिखाया गया । इस प्रकार, liposomes एक उत्कृष्ट उपकरण के लिए diatom एंटेना और उनके संपर्क और लगभग देशी परिस्थितियों में विनियमन अध्ययन कर रहे हैं । liposomes लिपिड संरचना, liposome आकार, प्रोटीन घनत्व और आसपास जलीय चरण के रूप में कई शर्तों के बाद से बहुमुखी है नियंत्रित किया जा सकता है । इसके अलावा, विधि नमूनों की कम मात्रा की आवश्यकता है । प्रायोगिक प्रणाली मजबूत और अत्यधिक reproducible है । liposomes के compartmentalization पीएच और आयन ढाल, जो एंटीना परिसरों के विनियमन में महत्वपूर्ण कारक है अध्ययन के लिए अनुमति देता है ।

यहां, हम meneghiniana और प्राकृतिक thylakoid लिपिड संरचना के साथ liposomes में उनके शामिल होने से FCP एंटीना परिसरों के अलगाव का वर्णन । इसके अलावा, हम solubilized FCP के स्पेक्ट्रोस्कोपी लक्षण वर्णन के लिए अनुकरणीय डेटा प्रदान करते है और उंहें liposomes में FCP के साथ तुलना करें । विधि ज्ञान और मानकीकृत Gundermann और Büchel २०१२²³, नाताली एट अल २०१६²², और अहमद और Dietzel २०१७²⁴के सुधार से प्राप्त प्रोटोकॉल संक्षेप ।

चित्र 1: कार्यप्रवाह का योजनाबद्ध प्रस्तुतिकरण । (1) पैरा 1 को संदर्भित करता है जो सुक्रोज घनत्व ढाल पर निंनलिखित FCP जुदाई के साथ सेल विकास, व्यवधान और thylakoid अलगाव का वर्णन; सी. एम. -Cyclotella meneghiniana कोशिकाओं. (२) पैरा २ में वर्णित प्राकृतिक thylakoid लिपिड मिश्रण (MGDG, DGDG और SQDG) की तैयारी और लिपिड-डिटर्जेंट micelles के साथ octylglycoside (ओग) का निर्माण. एक परिभाषित लिपिड-micelle आकार बाहर निकालना द्वारा एक निर्धारित ताकना व्यास की झिल्ली का उपयोग करके हासिल की है । FCP और लिपिड-micelles एक पूर्वनिर्धारित लिपिड में एकीकृत कर रहे हैं: प्रोटीन अनुपात और डिटर्जेंट ओग और β-डीडीएम नियंत्रित डायलिसिस के गठन FCP proteoliposomes के माध्यम से हटा रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Protocol

नोट: संश्लेषक परिसरों जैसे FCPs अत्यधिक प्रकाश और गर्मी की चपेट में हैं । हमेशा बर्फ पर और एक बहुत ही मंद प्रकाश के तहत काम करते हैं ।

1. कोशिकाओं से FCP का अलगाव

C. meneghiniana कोशिकाओं से Thylakoid अलगाव
1. बढ़ती सी. meneghiniana में ५ ५०० एमएल की कुप्पी प्रत्येक भर में ३०० मिलीलीटर की ASP-मीडियम²³^,²⁵ और ५०,०००,००० कोशिकाओं से भरी हुई है । एक कपास डाट के साथ कुप्पी प्लग और कोशिकाओं के लिए घातीय वृद्धि चरण के लिए एक शेखर पर लगभग एक 16 एच प्रकाश और 8 ज अंधेरे चरण ४० µmol फोटॉनों/(m ² s) सफेद प्रकाश और 15-18 डिग्री सेल्सियस के बीच एक तापमान के साथ १२० rpm पर बढ़ने की अनुमति । जांच करें कि सेल नंबर एक सेल काउंटर चैंबर के साथ 1.5-2 मिलियन कोशिकाओं/एमएल के बीच है ।
2. एक उच्च गति के केंद्रापसारक में 15 मिनट के लिए ५०० मिलीलीटर केंद्रापसारक शीशियों (4 डिग्री सेल्सियस) के साथ एक शानदार रोटर में ४,००० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक । pipetting द्वारा homogenization बफर (एचबी, टेबल 1) के 12 मिलीलीटर में सेल छर्रों पुनः निलंबित ।
  1. निलंबन एक एकल ५० एमएल प्लास्टिक ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण । -८० डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान या 1.1.3 कदम आगे बढ़ना ।
3. मनका मिल और उपकरणों के पूर्व शांत । मनका मिल के ५० मिलीलीटर चोंच एक गिलास मनका मिश्रण के साथ ७५% को भरें और सेल निलंबन जोड़ें । सेल व्यवधान के लिए, प्रत्येक पल्स के बीच ठंडा करने के 30 एस के साथ पूरी गति से 7 x ४५ s दालों का उपयोग करें । कदम 1.1.6 में गुणवत्ता की जांच के लिए बाधित कोशिकाओं के 20 µ एल ले लो ।
4. एक गिलास फिल्टर कीप पर बाधित कोशिकाओं को फ़िल्टर और वे स्पष्ट दिखाई देते हैं जब तक गिलास मोतियों पर एचबी डालने से धो. पूल छानने के साथ धो अंश । अंतिम वॉल्यूम को १५० मिलीलीटर से कम रखें ।
5. १४० में 15 मिनट के लिए नमूना केंद्रापसारक एक्स जी ३ ५० मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूबों का उपयोग करने के लिए सेल मलबे गोली । ध्यान से 20 मिलीलीटर supernatant पाली कार्बोनेट ultracentrifugation शीशियों को स्थानांतरित और गोली त्यागें ।
  1. एचबी के साथ शीशियों भरें, वजन equilibrate, और 1 घंटे के लिए एक उपयुक्त रोटर में ३००,००० x g और 4 डिग्री सेल्सियस thylakoid झिल्ली गोली करने के लिए केंद्रापसारक ।
6. केंद्रापसारक समय का उपयोग करने के लिए माइक्रोस्कोपी द्वारा 400X आवर्धन पर 20 µ l 1.1.3 में ले लिया नमूना के साथ सूक्ष्मता से बाधित कोशिकाओं के अनुपात की जांच करें । frustules (सिलिका गोले) युक्त chloroplast मुक्त और chloroplast के बीच अनुपात की गणना ।
  नोट: Diatom कोशिका की दीवारें सिलिका की बनी होती हैं, जो माइक्रोस्कोप में अत्यधिक diffracting पदार्थ के रूप में दिखाई देती हैं । Chloroplasts के रूप में होने वाली हरी डॉट्स कोशिकाओं से जारी किया गया है चाहिए अगर सेल व्यवधान काम किया ।
7. झिल्ली गोली के रूप में संभव के रूप में थोड़ा धोने बफर के रूप में पुनः निलंबित (0.5-1 मिलीलीटर) एक छोटी सी चित्रकार ब्रश का उपयोग कर । (टेबल 1) धोने बफर के साथ पाली कार्बोनेट ultracentrifugation शीशियों भरें, अपने वजन equilibrate और २००,००० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
  1. एक चित्रकार ब्रश के साथ धोया झिल्ली को पुनः निलंबित । केवल यदि संभव हो उच्च के रूप में thylakoid एकाग्रता रखने के लिए आवश्यक धोने बफर जोड़ें । एक नमूना शीशी (15 मिलीलीटर) में सभी thylakoids पूल ।
8. पूर्व-१००% एसीटोन के ९० µ l के साथ नमूने के 10 µ l का उपयोग कर नमूनों को पतला करना. यह १२,००० में 5 मिनट के लिए एक्स जी के लिए छर्रों प्रोटीन उपजी । की 10 µ l को ले लीजिये और इसे ९०% एसीटोन के ९९० µ l के साथ मिला दीजिये ।
  1. ६६४ एनएम और ९०% एसीटोन में ६३० एनएम पर क्लोरोफिल ए और सी के अवशोषक (ABS) को मापने । दोनों मूल्यों से ABS_750nm घटाना । निम्न सूत्र का उपयोग करके कुल क्लोरोफिल सामग्री का निर्धारण:^२४
    1
    2
9. Aliquot thylakoids के अंश में कुल क्लोरोफिल के ०.५ मिलीग्राम एक १.५ मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूबों में, उंहें तरल नाइट्रोजन में स्थिर और उंहें दुकान पर-८० और अधिक उपयोग जब तक डिग्री सेल्सियस ।
जुदाई और FCP परिसरों की एकाग्रता
1. एक सुक्रोज ढाल समाधान तैयार है और ऊपर से लोड हो रहा है खंड (३००-५०० µ एल) शूंय तक ultracentrifuge ट्यूबों भरें । पर ट्यूबों फ्रीज-20 ° c जब तक वे पूरी तरह से जमे हुए हैं । ट्यूबों गल करने के लिए 4 ° c, जो एक 17 मिलीलीटर ट्यूब के लिए 3-4 ज लेता है पर अनुमति देते हैं ।
  1. बेहतर रिज़ॉल्यूशन के लिए ग्रेडिएंट को परिशोधित करने के लिए फ़्रीज़-गल सायकल को दो बार दोहराएँ.
2. ०.५ क्लोरोफिल के मिलीग्राम के लिए इसी 1.1.9 में प्राप्त नमूनों का प्रयोग करें और 2 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा बफर B1 (तालिका 1) के साथ समायोजित । solubilization के लिए, n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (b-डीडीएम) 20 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ें ।
  1. ट्यूब 3 बार उलटा और यह फोम से बचने के लिए कोमल मिलाते के साथ 20 मिनट के लिए बर्फ पर जगह है । 5 मिनट के लिए, एक पूर्व में १२,००० x g पर 4 डिग्री सेल्सियस पर तालिका शीर्ष केंद्रापसारक ठंडा करने के लिए केंद्रापसारक ।
3. ग्रैडिएंट पर supernatant लोड । 17 मिलीलीटर शीशियों का उपयोग किया जाता है, तो प्रति ढाल कुल क्लोरोफिल के १२५ से अधिक µ जी लोड मत करो । १००,००० x जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर 22 एच के लिए केंद्रापसारक ।
  1. एक सिरिंज (चित्रा 2a) का उपयोग कर ढाल से वांछित ब्राउन FCP भिन्न पुनर्प्राप्त. एक 5 µ l aliquot लें और इसे B1a के ९९५ µ l के साथ पतला करें ।
4. एक यूवी विज़-spectrophotometer में ३७०-७५० एनएम के बीच अवशोषक (ABS) स्पेक्ट्रम को मापने । अर्द्ध माइक्रो ऑप्टिकल ग्लास cuvettes का प्रयोग करें ।
  1. स्पेक्ट्रा प्रबंधक सॉफ्टवेयर खोलें, स्पेक्ट्रम मोड में जाओ और नमूना माप के बाद ३७० से ७५० एनएम के लिए एक आधार रेखा रिकॉर्ड । निम्न सेटिंग्स का उपयोग करें: स्कैन गति, २०० एनएम/ डेटा पिच, ०.५ एनएम; प्रतिक्रिया, मध्यम ।
5. एक micropipette के साथ बरामद नमूने की मात्रा को मापने । B1 बफ़र (तालिका 1) के साथ दो बार पुनर्प्राप्त की गई मात्रा जोड़कर FCP परिसरों को धोएं । १,००० x g पर 30 केडीए कटऑफ और + 4 डिग्री सेल्सियस के साथ एक झिल्ली संकेंद्रण में ध्यान केंद्रित करने के लिए कम से 20 की एक ABS_672nm .
  नोट: बी-डीडीएम एकाग्रता नमूना डिब्बे में micelle संवर्धन के कारण वृद्धि हो सकती है । इस FCP परिसरों के आगे solubilization के लिए नेतृत्व कर सकते हैं! डिटर्जेंट मुक्त बफर B1 जोड़ने से अधिक solubilization से बचें अगर आगे धोने के कदम अवशिष्ट सुक्रोज को दूर करने के लिए आवश्यक हैं ।
6. नियंत्रणों के लिए एक 20 µ l aliquot लें । सदमे तरल नाइट्रोजन में नमूनों फ्रीज और उन्हें-८० डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।

चित्रा 2: FCP, स्पेक्ट्रोस्कोपी नियंत्रण और शुद्धता की जांच का शुद्धिकरण । (एक) रातोंरात केंद्रापसारक के बाद एक सुक्रोज घनत्व ढाल के ठेठ उपस्थिति । सभी भूरे रंग के बैंड FCP एफसीपीए और FCPb. pigm.-असीम pigments, पुनश्च-photosystems (बी) FCP के अवशोषक स्पेक्ट्रा से पहले (नीली लाइन) और के बाद (नारंगी डैश्ड रेखा) एकाग्रता केंद्रापसारक फ़िल्टर उपकरणों का उपयोग कर के साथ शामिल पूल होते 30 केडीए कटऑफ . विशेष रूप से, carotenoids FCP से नुकसान की संभावना है, जो 500-550 एनएम के बीच इस क्षेत्र में कम अवशोषण में परिणाम होगा । रेखांकन ~ ६७० एनएम पर क्लोरोफिल क्ष_y अधिकतम करने के लिए सामान्यीकृत हैं । (ग) क्लोरोफिल कार्यात्मक उत्तेजना ऊर्जा हस्तांतरण के परीक्षण के लिए chl सी (४६५ एनएम) के उत्तेजना के साथ एक उत्सर्जन स्पेक्ट्रा । यदि chl सी के ऊर्जा हस्तांतरण chl के लिए एक बाधा है, ~ ६४० एनएम (chl सी) पर एक अतिरिक्त प्रतिदीप्ति बैंड हो जाएगा । रेखांकन उत्सर्जन अधिकतम करने के लिए सामान्यीकृत हैं । (घ) उत्तेजना स्पेक्ट्रा ६७५ एनएम में दर्ज (chl एक प्रतिदीप्ति अधिकतम) ऊर्जा हस्तांतरण के परीक्षण के लिए chl एक सभी pigments से ३७० एनएम और ६०० एनएम के बीच अवशोषित । यदि chl के लिए ऊर्जा हस्तांतरण कम कुशल है, प्रतिदीप्ति उपज विशेष रूप से ४६५ और ५५० एनएम के बीच कमी होगी । रेखांकन ४४० एनएम के आसपास अधिकतम करने के लिए सामान्यीकृत हैं । में स्पेक्ट्रा (बी), (ग) और (घ) लगभग समान है अगर एकाग्रता अच्छी तरह से काम किया । (ङ) एक Tris-tricine जेल²⁸का उपयोग कर पृथक FCP की शुद्धता के लिए जांच करें । एफसीपीए और FCPb में 18-19 केडीए के बीच उपइकाई है । सभी दृश्यमान चांदी से सना प्रोटीन 20 से बड़ा केडीए कर रहे हैं दूषित । Thyl । -Thylakoids कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

स्पेक्ट्रोस्कोपी और जेल-आधारित नियंत्रण
1. B1a के ९९५ µ l में FCP के 5 µ l के 370-750 एनएम के बीच अवशोषक चरण 1.2.5 के बाद रिकॉर्ड है । यह कदम 1.2.4 में प्राप्त स्पेक्ट्रम के साथ तुलना करें । चरण 1.2.4 में वर्णित समान इंस्ट्रूमेंटेशन और सेटिंग्स का उपयोग करें ।
  1. *. csv और डेटा को स्प्रेडशीट में आयात करें । दोनों स्पेक्ट्रा लगभग ६७२ एनएम के क्ष_y बैंड में chl a की अधिकतम करने के लिए मानक के रूप में चित्र बीमें दर्शाया गया है ।
2. ०.०३ की वांछित abs_672nm द्वारा मापा abs_672nm विभाजित करके कदम 1.2.4 और 1.3.1 से नमूनों की कमजोर पड़ने कारक की गणना । B1a के साथ तदनुसार नमूनों को पतला करें और उंहें विशेष ग् प्रतिदीप्ति cuvettes में स्थानांतरित करें ।
3. रिकार्ड chl एक spectrofluorometer के साथ एक प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रम chl सी से chl एक (चित्रा 2c) को बरकरार प्रकाश ऊर्जा हस्तांतरण प्रकट करने के लिए ।
  1. स्पेक्ट्रोमीटर सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें और निंनलिखित सेटिंग्स के साथ स्पेक्ट्रम माप मोड में जाना: मोड, उत्सर्जन; भट्ठा चौड़ाई उत्तेजना और उत्सर्जन, 3 एनएम; संवेदनशीलता, माध्यम; स्कैन स्पीड, १०० एनएम/ डेटा पिच, ०.५ एनएम; उत्तेजना तरंग दैर्ध्य, ४६५ एनएम; उत्सर्जन, 600-800 एनएम । शूंय और माप प्रदर्शन ।
4. एक ही नमूना और उपकरणों के साथ रिकार्ड उत्तेजना स्पेक्ट्रा सभी pigments से बरकरार ऊर्जा हस्तांतरण प्रकट करने के लिए chl एक (चित्रा 2d) । सेटिंग्स को इसमें बदलें: मोड, उत्तेजना; उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य, ६७५ एनएम; उत्तेजना, 370-600 एनएम । स्पेक्ट्रा रिकॉर्ड ।
  1. दीपक के वर्णक्रमीय गुण के लिए एक ही रेंज में एक rhodamine स्पेक्ट्रम के साथ सही- cf। उपयोगकर्ता के मैनुअल में निर्देश ।
5. मिश्रण FCP नमूने इसी 1 µ जी के chl a के साथ 10 µ l के एसडीएस-लोडिंग बफर. 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मशीन । एक मेज शीर्ष केंद्रापसारक में १२००० x जी में 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
  1. एक Tris-tricine जेल²⁸पर supernatant लोड । यह १५० वी और चांदी में 2 एच के लिए अलग-यह जुदाई^४०के बाद दाग ।
    नोट: FCP उपइकाईयों 18-19 केडीए, जो एफसीपीए और FCPb²⁹ (चित्रा 2E) के घटक हैं के बीच दो प्रमुख प्रोटीन बैंड में अलग.

2. FCP के Liposomes और निगमन की तैयारी

लिपिड मिश्रण और लिपिड डिटर्जेंट micelles की तैयारी
नोट: लिपिड गर्म तापमान ऑक्सीडेटिव शर्तों के साथ संयुक्त करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं । लिपिड ठंडा रखने के लिए और एक N₂ वातावरण के तहत की कोशिश करो ।
1. Vieler एट अल. २००७³⁰के अनुसार सी. meneghiniana के लिए वांछित thylakoid लिपिड अनुपात की गणना । पूरक तालिका 1में दिए गए उदाहरण का संदर्भ लें । एक विलायक सबूत कंटेनर में निर्माता द्वारा सिफारिश की लिपिड स्टॉक समाधान तैयार करें ।
2. एक 2 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में लिपिड की वांछित राशि पिपेट और एक कोमल नाइट्रोजन प्रवाह का उपयोग कर क्लोरोफॉर्म लुप्त हो जाना और ट्यूब आधार के पूरे क्षेत्र में लिपिड फैलाने के लिए प्रयास करें । N₂ प्रवाह चलो जब तक सभी विलायक काफूर है ।
3. Solubilize के 29 µ l में लिपिड मिश्रण-octyl β-D-glucopyranoside समाधान (ओग) 4 के लिए ° c 4 एच. के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए लिपिड मिश्रण की मशीन । 3 x 3 मिनट के लिए एक sonicator स्नान में लिपिड की मशीन 25 डिग्री सेल्सियस से बाधित बर्फ पर 30 एस ।
  1. जोड़ें २२१ µ एल के tricine बफर और २५० 4x डायलिसिस बफर के µ एल ।
4. 50-70 एनएम के एक परिभाषित liposome व्यास के लिए ०.१ µm पाली कार्बोनेट झिल्ली के साथ एक बाहर निकालना का उपयोग करें । झिल्ली और फिल्टर समर्थन के साथ बाहर निकालना को इकट्ठा । हवा के बुलबुले से बचें और अच्छी तरह से विधानसभा कस ।
5. कोई बुलबुले दूसरी सिरिंज में देखा जा सकता है जब तक 4x डायलिसिस बफर और पूर्व गीला बाहर निकालना मशीन के साथ एक सिरिंज भरें.
6. लागू करें लिपिड-डिटर्जेंट-micelles बाहर निकालना करने के लिए और एक सिरिंज से दूसरे आगे और पीछे करने के लिए समाधान दबाएँ. यह चरण 5 बार दोहराएँ जब तक कि समाधान समरूप प्रकट होता है ।
  नोट: यह समाधान कई दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है । फ्रीज मत करो!
FCP परिसरों और डिटर्जेंट और समुच्चय को हटाने का निगमन
नोट: इस उदाहरण में हम एक लिपिड का उपयोग करें/chl का अनुपात 12:1, जो लगभग 100:1 के एक लिपिड/
1. जोड़ें FCP के बराबर 20 µ के g chl a की कुल मात्रा में ५०० µ एल के B1a बफर के २५० μएल के लिए बाहर की गई लिपिड micelles और 4x डायलिसिस बफर के २५० µ एल. १,५०० में एक thermomixer में 25 डिग्री सेल्सियस से कम 3 x 3 मिनट के लिए नमूनों की मशीन-३,००० rpm बर्फ पर एक 30 एस थामने से बाधित ।
2. अभी भी ढक्कन पर फिट बैठता है जो एक अंगूठी देने के शीर्ष के तहत चार १.५ मिलीलीटर रिएक्शन ट्यूब के ढक्कन में कटौती । डायलिसिस झिल्ली के १.५ cm x १.५ cm के टुकड़े तैयार करें और उन्हें 1x डायलिसिस बफर के 20 मिलीलीटर में धो लें
3. प्रत्येक ढक्कन के लिए नमूने के २५० µ एल भरें । ध्यान से, ढक्कन पर झिल्ली रखना ताकि डिब्बे पूरी तरह से नमूना के साथ भरा हुआ है और कोई हवाई बुलबुले होते हैं । विधानसभा पर प्रतिक्रिया ट्यूब अंगूठी कस क्रम में एक बंद डिब्बे है ।
4. Dialyze एक tumbling शेखर पर बर्फ पर रात भर 1x डायलिसिस बफर (12-16 एच) के ५० मिलीलीटर में नमूनों की जांच की । नए सिरे से एक के साथ इस्तेमाल किया डायलिसिस बफर बदलें और adsorbent मोतियों की 7 मिलीग्राम जोड़ने के लिए शेष डिटर्जेंट कम से 6 ज को दूर करने के लिए ।
5. डायलिसिस बफर फिर से बदलें और एक और 12 घंटे के लिए dialyze एक २०० µ l micropipette टिप के साथ डायलिसिस झिल्ली भेदी द्वारा liposomes पुनर्प्राप्त और प्रतिक्रिया ट्यूब ढक्कन से सभी महाप्राण liposomes ।
6. वैकल्पिक चरण: यदि उच्च शुद्धता (> 95%) की जरूरत है । 17 मिलीलीटर ultracentrifugation शीशियों में 6%, 10%, 15% और डायलिसिस बफर में 20% सुक्रोज epichlorhydrin copolymer युक्त कदम के साथ एक सतत घनत्व ढाल तैयार करते हैं । शीर्ष पर liposomes लोड और १००,००० x g पर ultracentrifuge 4 ज के लिए एक झूलते बाल्टी रोटर में ।
  1. एक सिरिंज के साथ ऊपरी भूरे रंग के बैंड ठीक, डीपी के साथ नमूना 1:5 पतला और अगले कदम के लिए आगे बढ़ें ।
7. १००,००० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर १.५ ज के लिए 1x डायलिसिस बफर के कम से कम 2 मिलीलीटर में FCP liposomes केंद्रापसारक । ४५ ° के कोण पर केंद्रापसारक ट्यूब मोड़ द्वारा liposomes पुनर्प्राप्त करें । 1 मिनट (चित्र 3ए) के लिए नीचे जाने के लिए liposomes की अनुमति दें ।
8. 25-50 µ एल के एक अंतिम मात्रा में FCP liposomes पुनर्प्राप्त करें. हाला को परेशान करने से बचें ।
नियंत्रण 1: अवशोषक, प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी
1. एक 3 µ एल aliquot के FCP-liposomes 1x डायलिसिस बफर की एक 1 मिलीलीटर अंतिम मात्रा में जोड़ें और 5 मिनट के लिए १२,००० x g पर केंद्रापसारक
  1. 1.2.4 में वर्णित के रूप में एक ही उपकरण के साथ FCP-liposomes के ३७० और ७५० एनएम के बीच अवशोषक रिकॉर्ड । chl a (670-680 एनएम) के क्ष_y क्षेत्र में अधिकतम करने के लिए स्पेक्ट्रम को सामान्य और solubilized FCP (चित्रा 3सी) के सामान्यीकृत स्पेक्ट्रम के लिए यह तुलना.
2. 670-680 एनएम के बीच अधिकतम के संबंध में एक अवशोषक (ABS) = 0.03 के साथ डीपी के 1 मिलीलीटर में FCP-liposomes तैयार करें । B1a के साथ एक ही ABS कमजोर करने के लिए कदम 1.2.6 से डिटर्जेंट में solubilized FCP को समायोजित करें ।
3. 1.2.4 में वर्णित के रूप में दोनों नमूनों की रिकॉर्ड अवशोषक स्पेक्ट्रा । रिकॉर्ड chl दोनों नमूनों की एक प्रतिदीप्ति उत्सर्जन स्पेक्ट्रम 1.3.3 में वर्णित के रूप में ।
  नोट: प्रतिदीप्ति उपज FCP-liposome नमूना (चित्रा 3 डी और cf. चर्चा) में कमी आई है ।

चित्रा 3: FCP proteoliposomes के अलगाव स्पेक्ट्रोस्कोपी नियंत्रण और फोकल इमेजिंग द्वारा पीछा किया । (क) FCP liposomes की वसूली के बाद केंद्रापसारक । ४५ ° करने के लिए केंद्रापसारक ट्यूब बारी और लगभग 1 मिनट प्रतीक्षा-liposomes FCP समुच्चय जो liposomes में शामिल नहीं कर रहे हैं, जबकि नीचे कदम होगा ट्यूब दीवार के लिए छड़ी । (ख) solubilized FCP के अवशोषक स्पेक्ट्रा की तुलना डिटर्जेंट (नीला) में और FCP में liposomes (नारंगी) (ग) में (ख) के रूप में एक ही स्पेक्ट्रा को chl लाल क्षेत्र में एक अधिकतम (~ ६७० एनएम-Qy पीक) के लिए सामान्यीकृत; solubilized FCP में डिटर्जेंट (नीला) और FCP में liposomes (नारंगी). संभावित, वहां मुख्य रूप से 500-550 एनएम क्षेत्र में दिखाई carotenoids के एक वर्णक हानि हो सकती है । liposomes में FCP के clustering एक शिखर का विस्तार करने के लिए नेतृत्व कर सकते है और लाल chl एक अधिकतम (~ ६७० एनएम) के एक मामूली बदलाव । (घ) liposome में डिटर्जेंट और FCP में solubilized FCP का उत्सर्जन स्पेक्ट्रा. liposome में FCP की clustering FCP परिसरों के ऊर्जावान बातचीत जो प्रतिदीप्ति उपज (नारंगी वक्र) कम करती है और उत्सर्जन maxima थोड़ा लाल करने के लिए पाली बढ़ाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Representative Results

प्रोटोकॉल देशी लिपिड संरचना के साथ liposomes में Cyclotella meneghiniana और निगमन से कुल FCP अंश के अलगाव का वर्णन । thylakoid अलगाव अत्यधिक reproducible है, लेकिन thylakoid उपज बदल सकता है । परिणाम अगर सभी pigments के ५०% से अधिक कदम 1.1.4 में बरामद कर रहे है स्वीकार्य है । से अधिक ८०% इष्टतम है ।

thylakoids का solubilization अहम कदम है । अच्छी तरह से solubilized झिल्ली प्राप्त कर रहे हैं अगर supernatant चरण 1.2.2 के बाद pigments के सबसे शामिल हैं. photosystems से FCP की जुदाई अगर एक स्पष्ट भूरे रंग (FCP) और एक हरे (पी एस) बैंड अलग है (चित्रा 2a) अच्छा है । ढाल के शीर्ष पर एक प्रमुख पीले अंश वर्णक हानि के लिए एक संकेत के कारण अधिक solubilization है । वर्णक हानि हर तैयारी में होता है. यह एक निश्चित डिग्री करने के लिए स्वीकार्य है जब तक ऊर्जा हस्तांतरण की कार्यक्षमता chl एक प्रभावित नहीं है (चित्रा 2c2d) । इसके अलावा, FCP संवर्धन कदम (1.2.4) आगे solubilization और वर्णक कमी सहवर्ती डिटर्जेंट संवर्धन के कारण पैदा हो सकती है । सामान्यीकृत अवशोषित स्पेक्ट्रा में अंतर वर्णक हानि (चित्रा बी), जो अक्सर 500-550 एनएम के बीच वर्णक्रमीय क्षेत्र में होता है जहां carotenoids अवशोषित के लिए एक संकेत कर रहे हैं । वर्णक हानि स्वीकार्य अगर परिसरों अभी भी कार्यात्मक हैं । इसका मतलब यह है कि कोई बड़ा अंतर उत्सर्जन स्पेक्ट्रा और उत्तेजना स्पेक्ट्रा (चित्रा 2c2 डी) में होते हैं । उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के लिए, chl सी तरजीह ४६५ एनएम पर उत्तेजित है और सभी उत्तेजना ऊर्जा स्थानांतरण chl एक है, जो ~ ६७५ एनएम पर उत्सर्जन करता है । यदि chl सी एक ऊर्जा हस्तांतरण chl के लिए परेशान है, chl सी ~ ६४० एनएम पर उत्सर्जन करता है । उत्तेजना स्पेक्ट्रा में, chl करने के लिए ऊर्जा हस्तांतरण ३७०-६०० एनएम से उत्तेजना तरंग दैर्ध्य बदलकर निगरानी की है । ३७०-४४० एनएम से वर्णक्रमीय सीमा में मुख्य रूप से chl एक उत्साहित है । उत्तेजना के आसपास ४६५ एनएम एहसान chl सी । रेंज में > ५०० एनएम carotenoids, मुख्य रूप से fucoxanthins, उत्साहित हैं । ऊर्जा संचरण प्रभावित है, अगर chl सी और carotenoids कम योगदान करने के लिए एक प्रतिदीप्ति chl । इसलिए, प्रतिदीप्ति उपज 370-440 एनएम के बीच एक उत्तेजना chl के संबंध में इन वर्णक्रमीय क्षेत्रों में कम हो जाती है ।

नमूने की वांछित शुद्धता अध्ययन के उद्देश्य से निर्भर करता है । उदाहरण के लिए, यह स्पेक्ट्रोस्कोपी माप के लिए FCP से अलग photosystems आवश्यक है, जबकि गैर pigmented प्रोटीन माप के साथ कम हस्तक्षेप. यहाँ, ९५% की शुद्धता पर्याप्त रूप से उच्च (चित्रा 2E) है । जन spectrometric दृष्टिकोण विशेष रूप से, FCP उपइकाइयों के लिए एक चांदी से सना हुआ जेल पर दिखाई जानी चाहिए ।

liposome तैयारी की गुणवत्ता नियंत्रण पर नजर रखने के लिए मुश्किल है और केवल प्रोटोकॉल के अंत में देखा जा सकता है (2.2.5, 3 ए आंकड़ा) । यदि उनका रंग भूरे से जैतून का हरा हो जाता है तो FCP परिसर नष्ट हो जाते हैं । एक अच्छा परिणाम है अगर एक भूरे रंग liposome अंश एकत्र की है । liposomes के प्रतिशत से बरामद गोली बनाम एकत्र की अधिकतम > 70% है । liposomes में FCP का निगमन फिर से मामूली वर्णक हानि के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । सामान्यीकृत अवशोषक स्पेक्ट्रा की तुलना से पहले और इसके बाद शामिल है अगर pigments खो गए थे देखा है (चित्र बी3सी) । FCP के कुछ अवशोषक चोटियों-liposomes व्यापक दिखाई देते हैं और लाल वर्णक्रमीय क्षेत्र में अवशोषण (~ ६७० एनएम-तथाकथित क्यू_वाई बैंड) chl के एक थोड़ा लाल हो सकता है स्थानांतरित कर दिया । यह liposome में FCP के clustering के कारण होता है । chl एक प्रतिदीप्ति liposomes में FCP से उत्पंन होने वाली उपज काफी हद तक excitonic समूहों (चित्रा 3 डी, cf. चर्चा) में FCP बातचीत के कारण कम है ।

liposomes के साथ एक ठेठ प्रयोग liposome के दो प्रतिक्रिया एक लिपिड bilayer कि पीएच या विद्युत ढाल की अनुमति देता है द्वारा अलग डिब्बों का उपयोग करता है । एक उदाहरण में, FCP प्रतिदीप्ति उपज पर पोटेशियम आयन ढाल के प्रभाव का परीक्षण किया गया था (चित्रा 4a). प्रतिदीप्ति उपज मानक बफ़र की उपस्थिति में मापा गया था । प्रतिदीप्ति 30% से गिरता है अगर KCl जोड़ा गया था । K⁺ ढाल पोटेशियम विशिष्ट ionophore valinomycin द्वारा जारी किया गया था, जो FCP प्रतिदीप्ति प्रारंभिक स्तर (चित्रा 4B) को पुनर्स्थापित करता है. प्रतिदीप्ति में ये बदलाव पुष्ट की परिकल्पना है कि FCP परिसरों में पोटेशियम आयन एकाग्रता ढाल²⁴ vivo मेंप्रतिक्रिया करते हैं ।

चित्रा 4: FCP liposomes के साथ ठेठ प्रयोग एक विद्युत KCl द्वारा प्रेरित ढाल के जवाब में FCP प्रतिदीप्ति के परिवर्तन दिखा । (क) प्रायोगिक योजना: 1. डायलिसिस बफर में FCP chl प्रतिदीप्ति । 2. एक विद्युत ढाल उत्प्रेरण KCl 20 मिमी के अलावा । 3. K⁺ चयनात्मक ionophore valinomycin (4 µ एम) द्वारा ढाल की छूट । (ख) FCP प्रतिदीप्ति के ड्रॉप (६७५ एनएम) के जवाब में एक K⁺ ढाल (नीला) और ढाल (ग्रे) की छूट से पहले के रूप में एक ही प्रतिदीप्ति उपज की बहाली (नारंगी) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

	बफ़र्स/	संरचना
सेल विकास और	कृत्रिम समुद्री जल के अनुसार	८६ मिमी NaCl
thylakoid तयारी	Provasoli, १९५७ (ASP)²⁵	21 एमएम KCl
		4 मिमी Tris
		८.१ मिमी MgSO₄
		११.८ मिमी नैनो₃
		०.५८ मिमी K₃HPO₄
		०.१६ मिमी एच₃बो₃
		2 मिमी सिलिका
		पीएच ७.७ (एच₂तो₄)
		आटोक्लेव
		बाँझ जोड़ें: २.७२ mM CaCl₂
		बाँझ जोड़ें: ०.०१२ mM FeCl₃
		बाँझ जोड़ें: ०.०९२ mM EDTA
		बाँझ जोड़ें: ०.०२ mM MnCl₂
		बाँझ जोड़ें: ०.००२ mM ZnCl₂
		जोड़ बाँझ: ५० pM CoCl₂
		जोड़ बाँझ: 25 बजे ना₂मू₄
		जोड़ बाँझ: २२.५ pM CuCl₂
	homogenisation बफर	10 मिमी एमईएस
		2 मिमी KCl
		5 मिमी EDTA
		१ मी सोर्बिटोल
		पीएच ६.५ (कोह)
	वाशिंग बफर	10 मिमी एमईएस
		2 मिमी KCl
		5 मिमी EDTA
		पीएच ६.५ (कोह)
	ग्लास मनका मिश्रण	७५% 1 मिमी मोती
		25% ०.४ mm मोती
	एसीटोन	९०% (वी/वी) के साथ एच₂ओ
	तरल नाइट्रोजन
FCP शुद्धिकरण	n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside	एच₂ओ में 10% (डब्ल्यू/वी)
	बफर B1	25 एमएम Tris
		2 मिमी KCl
		पीएच ७.४ (एचसीएल)
	बफ़र B1a = B1 + b-डीडीएम	०.०३% (डब्ल्यू वी) अंतिम
	सुक्रोज ग्रैडिएंट समाधान	B1a में 19% सुक्रोज (w/
liposome तयारी	लिपिड देखें पूरक तालिका 1
	एन₂ गैस
	n-octyl β-D-glucopyranoside (ओग)	B1a में 10% (w/
	tricine बफर	20 मिमी पीएच ७.५
	4x डायलिसिस बफर (DB)	८० मिमी tricine पीएच 7.5
		20 मिमी MgCl₂
		०.०४% (w/v) नण य₃

तालिका 1: FCP तैयारी और liposomes में शामिल करने के लिए बफ़र्स, स्टॉक समाधान और मिश्रण की सूची ।

पूरक तालिका 1: उदाहरण के लिए लिपिड और chl अनुपात परिकलन । एक लिपिड/chl 12 का अनुपात चित्रा 1 और चित्रा 3में दिए गए उदाहरण में प्रयोग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

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Discussion

FCP liposomes प्राकृतिक लिपिड संरचना के साथ एक आसान, सरल और reproducible के लिए इन विट्रो में स्पेक्ट्रोस्कोपी गुणों की जांच उपकरण प्रदान करते हैं । FCP liposomes में लिपिड वातावरण thylakoid झिल्ली के भीतर की स्थिति जैसा दिखता है, प्रयोगात्मक परिणाम है कि प्राकृतिक परिस्थितियों के करीब है को जंम दे रही है ।

FCP एंटीना के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में सी. meneghiniana का उपयोग करने के कई फायदे हैं. यह अपेक्षाकृत तेजी से बढ़ता है और अन्य diatom मॉडल प्रजातियों की तुलना में अधिक मजबूत है, जैसे, Thalassiosira pseudonana. कोशिकाओं को तोड़ने के मनका मिल में अपेक्षाकृत आसान है, जो बरकरार thylakoid परिसरों की एक उच्च उपज के लिए अनुमति देता है । C. meneghiniana के लिए प्रमुख बिंदु जैव रासायनिक और स्पेक्ट्रोस्कोपी डेटा का खजाना है जो पिछले वर्षों में प्राप्त¹⁶^,¹⁷^,²³,²⁷^,²⁹,³¹ ^,^३२^,^३३^,^३४. केवल नुकसान यह है कि एक व्याख्या जीनोम उपलब्ध है, हालांकि आनुवंशिक जोड़तोड़^३५संभव नहीं है अभी तक नहीं है ।

FCPs इष्टतम परिस्थितियों में उगाई गई संस्कृतियों से तैयार किए गए थे । इसलिए, उपज, उपइकाई संरचना और FCP परिसरों की रंजकता अगर वे तनाव की स्थिति, जैसे, उच्च प्रकाश²⁷ या पोषक तत्वों की सीमा से तैयार कर रहे है बदल सकते हैं । मनका मिल (1.1.3) में सेल व्यवधान FCP उपज के लिए महत्वपूर्ण है और एक खुर्दबीन द्वारा विकास की स्थिति के हर परिवर्तन के बाद निगरानी की जानी चाहिए । plastids कोशिकाओं से जारी किया जाना चाहिए था ताकि खाली frustules (सिलिका के गोले) प्रबल हो । अगला अहम कदम है thylakoid solubilization । झिल्ली solubilization की दक्षता कुछ तनाव की स्थिति^३६के तहत जमा है कि भंडारण लिपिड की राशि के साथ हस्तक्षेप । इसलिए, डिटर्जेंट की मात्रा से अधिक solubilization से बचने के लिए तनाव की स्थिति के तहत प्राप्त नमूनों प्रसंस्करण से पहले समायोजित किया जाना चाहिए । यह समस्या ~ ६४० एनएम में वृद्धि हुई chl c प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के रूप में प्रकट होता है । इसके अलावा, carotenoids (500-550 एनएम) से chl एक को ऊर्जा हस्तांतरण कम हो गया है । यह उत्तेजना स्पेक्ट्रम (फिगर 2c2d) में देखा जा सकता है । कुछ दृष्टिकोण एफसीपीए FCPb एंटीना परिसरों से आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी²⁷से अलग करने के लिए उपयोगी हो सकता है.

liposomes में FCP का स्थानांतरण अगला महत्वपूर्ण कदम है । हस्तांतरण दक्षता, liposome एकरूपता और अक्षुण्णता कई मापदंडों पर निर्भर करती है । लिपिड micelle-तैयारी और बाहर निकालना homogenously आकार liposome पुरोगामी प्रदान करता है । इस उदाहरण में (2.1.3-2.1.4), १०० एनएम ताकना आकार का एक पाली कार्बोनेट झिल्ली ~ ५० एनएम के एक proteo-liposome आकार प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । FCP की मात्रा लिपिड-डिटर्जेंट micelles में जोड़ा प्रोटीन: लिपिड अनुपात liposome में परिभाषित करता है । इसलिए, प्रति liposome FCP की एक निर्धारित संख्या प्राप्त की है । एक ऐसे ही दृष्टिकोण संयंत्र और हरे मनोरथ LHC परिसर संकुल सहज में । इस तथ्य को समय से पता चला-हल प्रतिदीप्ति और एकल-अणु स्पेक्ट्रोस्कोपी²² और आगे के प्रयोगों के लिए एक ध्वनि आधार प्रदान करता है.

नियंत्रित डायलिसिस liposomes में FCP के शामिल करने के लिए भी महत्वपूर्ण है । हालांकि hydrophobic FCP परिसर के शामिल ऊर्जावान इष्ट है, प्रविष्टि के कैनेटीक्स एकत्रीकरण के कैनेटीक्स के साथ प्रतिस्पर्धा हो सकती है । इस तथ्य को और अधिक hydrophobic और बड़े परिसरों प्रमुख हो जाता है । इस उदाहरण में छोटे एफसीपीए ट्रिमर बड़ा FCPb nonamer की तुलना में तेजी से एंबेडेड है । उचित FCP निगमन की आवश्यकता है कि लिपिड micelles अच्छी तरह से डायलिसिस के माध्यम से डिटर्जेंट हटाने से पहले solubilized FCP परिसरों के साथ मिश्रित कर रहे हैं । यहां, 2.2.1 में मिश्रण समय विविध किया जा सकता है । यह मिश्रण तापमान वृद्धि करने के लिए अनुशंसित नहीं है क्योंकि यह FCP विघटन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसके अलावा, डिटर्जेंट हटाने की ' गति ' महत्वपूर्ण है और adsorbent (2.2.4) की राशि से समायोजित किया जा सकता है । liposomes का अंतिम आकार भिंन हो सकता है । गतिशील प्रकाश कैटरिंग, विश्लेषणात्मक ultracentrifugation और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी liposome आकार रेंज^३७^,^३८निर्धारित करने के लिए उपयुक्त तरीके हैं । प्राकृतिक thylakoid लिपिड संरचना और लिपिड micelle बाहर निकालना के साथ इस प्रोटोकॉल के लिए, हम ५०-८० एनएम के aforementioned व्यास और आकार की तरह एक लगभग क्षेत्र क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा पता चला की उम्मीद है । इन परिणामों को बहुत ही विधि के साथ प्राप्त किया गया हरे मनोरथ LHC²²शामिल हैं । ऐसे छोटे व्यास के Liposomes एक मजबूत सतह वक्रता है ~ 10 ° प्रति 5 एनएम जो बड़ा एंटीना परिसरों मोड़ और उंहें monomerize करने के लिए मजबूर कर सकते हैं । इस स्थिति के शैवाल और पौधों के grana मार्जिन में प्राकृतिक वक्रता²²नकल । grana मार्जिन की तुलना में, thylakoid का प्रमुख हिस्सा बल्कि सपाट दिखाई देता है । इसलिए, अगर photosystems जैसे बड़े परिसरों का अध्ययन किया जाएगा यह एक बड़ा व्यास के liposomes का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है । एक और सवाल है जो उठता है: परिसरों के उंमुखीकरण क्या है? एफसीपीए के मामले में, हम कम पीएच²⁴ के जवाब में माप से निष्कर्ष निकालना है कि अभिविंयास के बारे में ५०% दाईं ओर बाहर और ५०% बाहर अंदर है । भविष्य में, विधियों एक दिशा में परिसरों को मजबूर करने के लिए आवश्यक हैं । bacteriorhodopsin समाप्ति पंप के साथ अंय अध्ययनों में, लगभग सभी प्रोटीन सहज उसी तरह (दाईं ओर बाहर)^३९में उंमुख हैं ।

वहां क्या प्रतिदीप्ति परिवर्तन लाती है जब कश्मीर⁺ liposomes के लिए जोड़ा जाता है का सवाल है । कई जवाब काल्पनिक हैं । यदि कश्मीर एकाग्रता अकेले जिंमेदार है, 4 चित्रा में प्रयोग प्रतिदीप्ति की एक और कमी में परिणाम अगर valinomycin KCl के बाद जोड़ा जाता है । हाल के एक अध्ययन में, हम धारणा है कि कश्मीर⁺ एकाग्रता ढाल एफसीपीए²⁴के प्रतिदीप्ति परिवर्तन के लिए जिंमेदार है के लिए समर्थन प्रदान की है । कई अंय कारकों के रूप में अच्छी तरह से प्रतिदीप्ति उपज प्रभावित हो सकता है । इन आसमाटिक या सतह प्रभारी गतिशीलता प्रभाव²⁴हो सकता है ।

योग करने के लिए, इस तरह के liposomes में FCP के रूप में प्रकाश संचयन एंटीना परिसरों की जांच करने के लिए लाभ यह है कि यह एक कार्यात्मक प्रणाली vivo स्थितियों में करीब प्रदान करता है । लेकिन घटकों की संख्या अभी भी छोटी है, जो प्रयोगात्मक परिणामों में जटिलता कम कर देता है । यह प्रकाश तनाव की स्थिति और फोटो सुरक्षा तंत्र की प्रेरण के सिमुलेशन के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा FCP परिसरों के कार्य पर कतिपय लिपिड प्रजातियों की भूमिका का अध्ययन किया जा सकता है । इस पद्धति की क्षमता क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, एकल अणु स्पेक्ट्रोस्कोपी और अन्य समय में हल की गई स्पेक्ट्रोस्कोपी विधियों में हाल ही में की गई प्रगति के साथ बढ़ जाती है. इससे रिसर्चर्स को लाइट हार्वेस्टिंग सिस्टम में एनर्जी ट्रांसफर की पढ़ाई बेहतर हो सकेगी । इन तकनीकों के साथ संयुक्त, solubilized और एकत्रित राज्य में FCP के बारे में ज्ञान FCP समारोह के लिए लिपिड पर्यावरण के योगदान के बारे में डेटा के साथ पूरित किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

FCP शुद्धिकरण में सहायता के लिए हम राणा Adeel अहमद का धन्यवाद करते हैं । प्रो क्लाउडिया Büchel उपयोगी विचार विमर्श के लिए स्वीकार किया है और पांडुलिपि पढ़ने । इस काम को जर्मन रिसर्च फाउंडेशन द्वारा एलडी (DI1956-1/1) और एलडी को फ़ेयोडोर-Lynen फेलोशिप के लिए पीरु फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया ।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
500 ml centrifuge vials
high speed centrifuge	Heraeus
Bead Mill VI 2	Edmund-Bühler (edmund-buehler.de)		newer version: Vibrogen-Zellmühle Vl 6
Silibeads S 400 µm	Sigmund-Lindner.com	5223-7
Silibeads S 1,-1,3 mm	Sigmund-Lindner.com	4504
VitraPOR filter funnel - por1	ROBU GmbH	21121
polycarbonate ultracentrifuagtion vials (30 mL) for T-865	Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de)	314348
Ultracentrifuge Discovery 90SE	Sorvall	n.a.
rotor T 865	ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)	51411
Neubauer Cell Counter Chamber (improved)	Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com)	T729.1
Zeiss Mikroskop Primostar (7)	Optik-Pro (optik-pro.de)	51428
optical glass cuvettes (6040-OG)	Hellma Analytics (hellma-analytics.com)	"6040-10-10"
V-630 UV-VIS Spectrophotometer (incl. software)	Jasco (jasco.de)	V-630
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside	ANATRACE (anatrace.com)	D310LA
Ultra-Clear tubes 17 ml for AH629	Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de)	344061
rotor AH629-17-mL	ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)	54285
Membrane concentrator_Centriprep 30 kDa cutoff	Millipore (merckmillipore.com)	4307
Biometra Minigel-Twin	Analytik Jena AG (analytik-jena.de)	846-010-100
Silver Stain Plus Kit	Bio-Rad (bio-rad.com)	1610449
libre office spread sheet	The document foundation	https://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/
special glass cuvettes for fluorescence (101-0S)	Hellma Analytics (hellma-analytics.com)	101-10-20
Spectrofluorometer FP-6500 (incl. Software)	Jasco (jasco.de)	FP-6500
SDS-loading buffer Roti-Load	ROTH (carlroth.com)	K929.1
n-octyl β-D-glucopyranoside	ANATRACE (anatrace.com)	O311
Monogalactosyl Diaclyglycerol (MGDG)	Larodan AB (larodan.com)	59-1300	make stock solution in chloroform
Digalactosyl Diacylglycerol (DGDG)	Larodan AB (larodan.com)	59-1310	make stock solution in chloroform
Sulphoquinovosyl Diacylglycerol (SQDG)	Larodan AB (larodan.com)	59-1230	make stock solution in chloroform
L-alpha-Phosphatidylglycerol (PG)	Larodan AB (larodan.com)	37-0150	make stock solution in chloroform
L-α-Phosphatidylcholine	Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)	P3782 SIGMA	make stock solution in chloroform
sonicator bath S-50TH	Sonicor (getmedonline.com	SONICOR-S-50TH
mini-Extruder	Avanti Polar Lipids (Avanti.com)	610000
Nuleopore polycarbonate membrane	Avanti Polar Lipids (Avanti.com)	610005
dialysis membrane Visking 14 kDa cutoff	ROTH (carlroth.com)	0653.1	boil in destilled water before use
Biobeads SM2 Adsorbent	Biorad (Bio-rad.com)	152-3920
sucrose epichlorhydrin copolymer - Ficoll 400	Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)	F4375
Polycarbonate ultracentrifuagtion vials (2.7 mL) for TFT 80.4	Beranek Laborgeräte (Laborgeraete-beranek.de)	252150
rotor TFT 80.4	Millipore (merckmillipore.com)	54356
*material listed in order of appearance*			For specific safety instructions please refer to material safety sheets and repective manuals. Standard lab material and substances are not listed.

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References

Eberhard, S., Finazzi, G., Wollman, F. A. The Dynamics of Photosynthesis. Annual Review of Genetics. 42, 463-515 (2008).
Li, Z. R., Wakao, S., Fischer, B. B., Niyogi, K. K. Sensing and Responding to Excess Light. Annual Review of Plant Biology. 60, 239-260 (2009).
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अलग और Diatom <em>Cyclotella Meneghiniana</em> से Thylakoid लिपिड के साथ Liposomes में प्रकाश संचयन एंटेना शामिल

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Pieper, K., Gundermann, K., Dietzel, L. Isolating and Incorporating Light-Harvesting Antennas from Diatom Cyclotella Meneghiniana in Liposomes with Thylakoid Lipids. J. Vis. Exp. (138), e58017, doi:10.3791/58017 (2018).

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