Endovenosa e Intra-amniotic nell'Utero trapianto nel modello murino

Developmental Biology

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Summary

Descriviamo un protocollo per l'esecuzione di un trapianto in utero (IUT) attraverso vie endovenosa e intra-amniotic di iniezione nel modello murino. Questo protocollo consente di introdurre cellule, vettori virali e altre sostanze nell'unico ambiente fetale immunitario-tollerante.

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Ahn, N. J., Stratigis, J. D., Coons, B. E., Flake, A. W., Nah-Cederquist, H. D., Peranteau, W. H. Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model. J. Vis. Exp. (140), e58047, doi:10.3791/58047 (2018).

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Abstract

Il trapianto in utero (IUT) è un modo unico e versatile di terapia che può essere utilizzato per introdurre le cellule staminali, vettori virali o altre sostanze all'inizio della gestazione. La spiegazione razionale dietro IUT a scopo terapeutico è basata sulle piccole dimensioni del feto, l'immaturità fetale immunologica, l'accessibilità e la natura proliferativa delle cellule staminali o progenitrici fetale e il potenziale di trattare una malattia o l'insorgenza di sintomi prima della nascita. Approfittando di queste proprietà inerente allo sviluppo normale del feto, la fornitura di cellule staminali ematopoietiche (HSC) tramite un IUT ha il potenziale per il trattamento di disordini congeniti ematologici quali anemia falciforme, senza la necessaria i trapianti mieloablativa o immunosoppressiva condizionata necessaria per HSC postnatale. Allo stesso modo, l'accessibilità delle cellule progenitrici in organi multipli durante lo sviluppo potenzialmente permette per un targeting più efficiente delle cellule staminali/progenitrici dopo un IUT di vettori virali per la terapia genica o editing genomico. Inoltre, IUT può essere usato per studiare i processi inerenti allo sviluppo normali tra cui, ma non limitato a, lo sviluppo di tolleranza immunologica. Il modello murino fornisce un mezzo prezioso e conveniente per comprendere le potenzialità e le limitazioni di IUT prima studi pre-clinici di animali grandi e un'eventuale applicazione clinica. Qui, descriviamo un protocollo per l'esecuzione di un IUT nel feto murino attraverso vie endovenosa e intra-amniotic. Questo protocollo è stato usato con successo per delucidare i meccanismi dietro nell'utero il trapianto di cellule staminali ematopoietiche, induzione della tolleranza e la terapia genica nell'utero e le condizioni necessarie.

Introduction

Recenti progressi nella diagnosi e lo screening prenatale hanno portato alla luce la possibilità di trattare il feto per un certo numero di disordini congeniti che non hanno opzioni di adeguato trattamento postnatale e provocare la morbosità e mortalità significative. In particolare, nell'utero il trapianto di cellule staminali ematopoietiche (IUHCT) e la modifica di gene terapia/genoma hanno il potenziale per approfittare delle proprietà inerente allo sviluppo normale del feto per trattare congenita ematologica, sistema immunitario e genetico i disordini più efficientemente postnatale trapianto di HSC e gene terapia/genoma modifica può fare1,2. In particolare, a causa delle piccole dimensioni del feto, la cellula donatrice o dose di vettore virale può essere ingrandita per il peso del destinatario. Inoltre, l'immaturità immunologica del feto consente donatore HSCs per essere iniettato senza il mieloablativa e immunosoppressiva condizionata che è necessaria in protocolli di trapianto postnatale. Allo stesso modo, vettori virali che trasportano un transgene terapeutico o la tecnologia di editing del genoma possono essere iniettati senza una risposta immunitaria limitante per il prodotto di transgene o il vettore virale. Infine, l'accessibilità e la natura proliferativa delle cellule embrionali staminali/progenitrici diano la possibilità di un più efficiente trasduzione delle cellule del progenitor di destinazione, nonché taluni modi di genoma editing (regia di omologia riparazione) che richiedono ciclismo cellule si verificano in modo efficiente. Il modello murino serve come un mezzo penetrante e conveniente per affrontare questioni importanti in biologia delle cellule staminali e immunologia prima della sperimentazione in modelli pre-clinici di animali grandi e, come tale, ha servito come il modello primario in cui IUHCT e nell'utero terapia genica sono stati esplorati1,2,3.

Anche se molte variabili svolgono un ruolo importante nel successo di IUHCT e nell'utero gene editing terapia/genomico in modelli murini e grandi animali, una variabile fondamentale è il metodo di consegna del vettore virale o HSCs. La consegna di grandi dosi di donatore HSCs con un effetto di primo passaggio che si verificano nel fegato fetale, l'organo ematopoietico al momento della IUHCT, ha dimostrata di essere determinante nel raggiungimento di livelli macrochimeric di attecchimento in mouse e modelli animali di grandi dimensioni4 ,5. Questo è stato raggiunto tramite un'iniezione di donatore cellule tramite la vena vitellina nel modello del topo e tramite un'iniezione intra-cardiaca nel modello canino. Il percorso di iniezione anche gioca un ruolo fondamentale nell'ottimizzazione del progenitor di diversi organi durante lo sviluppo. Ad esempio, un'iniezione endovenosa tramite la vena vitellina ha dimostrata in modo efficiente trasduce cardiomyocytes ed epatociti segue un fine gestazione iniezione6,7. In alternativa, un'iniezione intra-amniotic dei vettori virali permette il targeting degli organi che sono fisicamente esposti basati su pieghevole/sviluppo embrionale al momento dell' iniezione8. Questo è meglio esemplificato dal targeting di epitelio respiratorio tramite un'iniezione intra-amniotic nel tardo la gestazione per approfittare dei normali movimenti fetali "respirazione", che espone le vie respiratorie per il vettore virale nell'amniotico fluido9. Queste due modalità di IUT, per via endovenosa tramite la vena vitellina e intra-amniotic, sono state la base per esperimenti multipli passate e in corso nel nostro laboratorio. In questo protocollo, descriviamo dettagliatamente le modalità di esecuzione per via endovenosa e intra-amniotic IUT nel modello murino.

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Protocol

I protocolli sperimentali sono stati approvati dal comitato di uso presso The Children Hospital di Philadelphia e istituzionali Animal Care.

1. creazione delle pipette di iniezione

  1. Utilizzando un estrattore micropipetta verticale, tirare una pipetta di microcapillary 100 µ l (Figura 1A - 1C). Calibrare la levetta della micropipetta in modo che la parte conica è > 1 cm di lunghezza.
    Nota: Inizialmente, le impostazioni dell'estrattore devono essere regolate per una lunghezza ottima. Un'impostazione di calore superiore farà la punta più a lungo, e un'impostazione di tiro superiore farà il diametro della punta più stretta.
  2. Tagliare l'estremità conica in modo che è ≥ 1 cm di lunghezza. Assicurarsi che il diametro interno sulla punta dell'ago è tra 70 µm e 100 µm e che è inversamente proporzionale alla lunghezza dell'estremità conica.
    Nota: Il diametro interno dipende anche la calibrazione dell'estrattore della micropipetta. Vedere le istruzioni del produttore dell'estrattore della micropipetta verticale o qualsiasi tipo di estrattore micropipetta preferito.
  3. Dopo aver verificato che l'ago ha il diametro interno corretto, creare la smussatura del 15-20 gradi di affilare la punta utilizzando una Smussatrice micropipetta con un diamante Affilatura ruota (Figura 2A - 2C). Assicuratevi di appoggiare la punta delicatamente sulla ruota senza troppa pressione, a diminuire le possibilità di rottura o la punta di cracking.
    Nota: Un pennello può essere utilizzato per spazzare via i detriti che si accumula sulla punta dell'ago.
  4. Valutare la punta sotto un microscopio e assicurarsi che la punta sia rotonda senza chip o crepe. Rivalutare il diametro interno per assicurarsi che è tra 70 µm e 100 µm (Figura 2D - 2 H).
  5. Disegnare linee sul resto dell'ago per designare 5 µ l di volume tra di loro (ad esempio, gli aghi con un diametro interno di 1,3 mm dovrebbero avere linee disegnate a incrementi di 3,77 mm).
  6. Sterilizzare in autoclave il priore di aghi da usare in chirurgia e maneggiarli con guanti sterili.

2. nell'utero iniezioni

  1. Preparare i necessari strumenti in autoclave li prima del tempo. Includono strumenti essenziali come porta aghi microinjector, un driver di ago chirurgico, un paio di Adson da, un paio di forbici curve regolare del tessuto, una siringa da insulina 1 mL, un paio di applicatori con punta di cotone, una pipetta di trasferimento, una provetta conica da 50 mL e un Pack di suture polyglactin 910 4-0.
  2. Usando una tecnica sterile, inserire l'ago per il porta-aghi e collegarlo al microinjector.
    Nota: Le impostazioni dell'azoto compresso utilizzato sono come segue: iniettare 4-6 psi, equilibrio 0 psi. A seconda di ciò che è stato iniettato, in particolare, la viscosità della per iniettato, così come la dimensione della micropipetta, i tempi di iniezione variano tra 0.3 - 1.5 s.
  3. Pulire la punta dell'ago di tutti i possibili residui di elaborazione di 5-10 µ l di sterile 1x tampone fosfato salino (PBS) e quindi di sgombrare. Ripetere questo x 2-3.
  4. Preparare incinto topi femmina di 2 - 6 mesi per la chirurgia di rasatura loro addomi con un clipper. Fare attenzione a non danneggiare i capezzoli. Somministrare i farmaci di dolore orale (ad esempio, 100 µ l di 1,5 mg/mL sospensione orale di meloxicam per topo).
  5. Iniziare a riempire l'ago con il materiale desiderato (cellule/vettore/droga) al volume desiderato. Fare attenzione a non rompere la punta dell'ago durante il riempimento l'ago.
    Nota: Il volume di iniezione al feto varia in base alla specifica progettazione sperimentale. 20 µ l funziona bene per l'iniezione di un gran numero di cellule (cioè, fino a 107 cellule nella vena vitellina. Per esempio, abbiamo consegnato 1 x 107 intero midollo osseo cellule isolate da C57BL/6TgN(act-EGFP) OsbY01 ["B6 verde fluorescente Protein (GFP)"] topi tramite la vena vitellina in feti di Balb/c gestazionale giorno-14. Per preparazioni iniettabili vettore virale, una singola iniezione di 10 µ l di un vettore diluito 1:1 con PBS funziona bene.
  6. Per calibrare il tempo di iniezione, eseguire la procedura seguente.
    1. La modalità pulsante 3x su microinjector per raggiungere la schermata di calibrazione di iniezione. Regolare il tempo di iniezione con l'aggiunta di intervalli di 10 o 100 ms e spingere la modalità pulsante 2x.
    2. Premere il pulsante di equilibrio e spingere il pedale una volta. Ora premere nuovamente il pedale e valutare quanto volume viene svuotato fuori l'ago a spingere. Se non calibrata al volume desiderato di 5-20 µ l per pedale, ripetere i passaggi 2.6.1 e 2.6.2.
      Nota: In generale, è buona calibrare ogni push-to-consegnare la metà del volume totale di destinazione in un momento. Mentre è possibile iniettare più di 30 µ l o addirittura 40 µ l di volume totale, non generalmente andiamo oltre 20 µ l al feto, per via endovenosa o intra-amniotic.
  7. Riempire l'ago fino al livello desiderato.
  8. Iniziare a consegnare l'anestesia al mouse regolando il flussometro ossigeno a 1 L/min e il vaporizzatore di isoflurane al 3%.
  9. Confermare se il mouse è anestetizzato controllando per l'assenza del riflesso del pedale. Trasferire il mouse a un rilievo di riscaldamento in posizione supina.
  10. Applicare il gel lubrificante occhio per evitare disidratazione corneale. Fissare il mouse nel posto registrando gli arti superiori e inferiori al pad.
  11. Preparare l'addome con clorexidina scrub seguita dall'alcool e iniettare un anestetico locale (ad esempio, 100 µ l di bupivacaina 0,25%) per via sottocutanea (Figura 3A).
  12. Con le forbici, fare un'incisione della pelle di 1-2 cm in modo che il bordo inferiore è no più vicino di 1 cm per il introitus; la fascia sotto è molto sottile e traslucido.
  13. Identificare la linea mediana della fascia che è più trasparente rispetto all'area circostante. Fare attenzione a non danneggiare i vasi epigastrici che si trovano su entrambi i lati della linea mediana. I vasi epigastrici dovrebbero farsi male, mantiene la pressione con applicatori di punta di cotone per fermare l'emorragia.
  14. Utilizzando forcipe Adson, pizzicare la fascia senza afferrare uno qualsiasi degli organi sottostanti come l'intestino, vescica o feti. Aprire la fascia con le forbici, facendo attenzione a non danneggiare gli organi. Una volta in modo sicuro nell'addome, estendere l'incisione fascia. Renderlo non più che l'incisione cutanea.
  15. Applicatori di punta di cotone consente di spostare l'intestino nella parte superiore dell'addome, esponendo in tal modo l'utero gravido. Consegnare l'utero fuori l'incisione, identificare accuratamente le ovaie destra e sinistra per garantire che tutti i feti sono contati (Figura 3B).
  16. Posizionare l'utero sinistro indietro nell'addome in modo che solo l'utero giusto è esposto; Questo impedisce l'essiccazione dell'utero e mantiene i feti non iniettato caldo.
  17. Tenere più laterale feto/amniotico tra il pollice e il dito indice della mano non dominante dell'operatore (Figura 3C). Sempre essere gentile da non provocare alcun danno per i feti.
  18. Posizionare il microscopio di dissezione (un ingrandimento 10x è l'ideale) e regolare la messa a fuoco in modo che il feto è in vista. Regolare l'illuminazione per una migliore visualizzazione.
  19. Identificare la parte che verrà iniettata (vena vitellina, Amnios). Per iniezioni endovenose, visualizzare sia le vene vitellina e loro anastomosi. Per iniezioni intra-amniotic, orientare il feto con il lato destro in vista.
  20. Raggiungere lo spazio di destinazione con l'ago come descritto di seguito.
    1. Per un' iniezione endovenosa, procedere come segue.
      1. Ruotare l'utero in modo che la vena vitellina che è stata iniettata è parallela alla punta dell'ago; Tenete a mente che le iniezioni devono essere effettuate verso l'anastomosi di due vene.
      2. Gettare l'ago sull'utero ad un angolo di 5° e perforare la parete uterina. Ora che la punta è tra la parete uterina ed il sacco amniotico, posizionare la punta direttamente in cima la vena vitellina.
      3. Ad un angolo quasi tangenziale, scivolare l'ago sopra la vena fino a quando la smussatura trafigge e avanza nel recipiente; Questo è evidente da un lampo di sangue visto nella punta dell'ago (Figura 3D).
        Nota: L'accesso alla vena potrebbe richiedere alcuni tentativi, come l'ago non può perforare la vena con la prima planata sopra la vena.
    2. Per un' iniezione intra-amniotic, procedere come segue.
      1. Ruotare il sacco amniotico e trovare una posizione priva di vasi a trafiggere.
      2. Scegliere l'ago perpendicolare alla parete uterina e perforare l'utero, il sacco vitellino e quindi il sacco amniotico. Fare attenzione a non perforare attraverso qualsiasi tessuto fetale. Assicurarsi che l'ago è passato tra le membra come questo conferma che l'ago è nel sacco amniotico. Quindi procedere con l'iniezione.
  21. Iniettare il volume appropriato di materiale desiderato (solitamente 10-20 µ l) premendo il pedale.
    Nota: Poiché l'iniettore deve mantenere la visualizzazione della punta dell'ago attraverso il microscopio a tutte le volte, una seconda persona deve leggere le marcature sul ferro per quantificare la quantità iniettata e informare l'iniettore quanto volume resta da iniettare. Una discussione prima dell'iniezione tra l'iniettore e assistente è importante evitare qualsiasi confusione e ritardi. Questo è particolarmente importante per le iniezioni endovenose perché una ritardata rimozione dell'ago vi permetterà un riflusso di sangue venoso nell'ago e il risultato in un dosaggio errato.
  22. Una volta che il volume desiderato è consegnato, ritirare l'ago dal sito di iniezione. Come ci può essere qualche sanguinamento da nave puntura sito con iniezioni endovenose, tenere la pressione con il lato dell'ago per 10-15 s fermare l'emorragia.
  23. Procedere al feto prossimo. Continuare fino a quando tutti i feti del corno uterino di destra sono stati iniettati.
  24. Rimuovere il corno uterino sinistro dall'addome e sostituire il corno uterino destra indietro all'interno della cavità peritoneale.
    Nota: In alcuni casi, l'ago deve essere riempito con il injectant.
  25. Una volta che tutti i feti sono stati iniettati, sostituire l'utero nell'addome (Figura 3E). Assicurarsi di evitare un volvolo intestinale o uterino.
  26. Con una pipetta monouso, posto circa 2 mL di 1X PBS nell'addome per sostituire eventuali perdite insensibili.
  27. Chiudere la gronda e addome in uno strato continuo con 4-0 polyglactin 910 punti di sutura per evitare di ferire gli organi sottostanti durante la chiusura (Figura 3F - 3G).
  28. Rimuovere il nastro e trasferire il mouse a una gabbia sotto una lampada di calore. Fare attenzione a non posizionare la lampada di calore troppo vicino al mouse. Assicurarsi che la gabbia dispone di biancheria da letto, cibo e acqua.
    Nota: Una camera calda termostaticamente controllata può essere utilizzata anche. Il mouse è sveglio quando è in posizione verticale e a piedi.
  29. Osservare il mouse quotidianamente e dare antidolorifici come necessario.
    Nota: Ordinariamente diamo meloxicam giorni postoperatori 1 e 2 e a volte il giorno 3 Se il mouse Mostra segni di dolore.
  30. Se facendo un intervento di batch con lo stesso materiale di iniezione, pulire l'ago per iniezione con PBS sterile. Se l'iniezione con un materiale diverso, smaltire l'ago in un contenitore di sharps e usi un nuovo ago.
    Nota: Si consiglia di favorire i cuccioli con madri surrogate immediatamente dopo la nascita, nel caso in cui la diga monta una risposta immunitaria agli anticorpi injectant e trasferimenti per cuccioli via latte.

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Representative Results

Sopravvivenza e attecchimento sono misure importanti di successo per gli esperimenti IUHCT. A seconda degli specifici endpoint di un esperimento, i feti che ha ricevuto un IUHCT possono essere analizzati prenatally con un taglio cesareo o dopo la nascita. In media, i tassi di sopravvivenza dopo iniezioni endovenose vanno da 75-100%. I tassi di sopravvivenza dopo le iniezioni intra-amniotic tendono a Fiera meglio di iniezioni endovenose, a circa 85-100%.

Nel nostro laboratorio, il processo di formazione per conseguire la conoscenza di queste tecniche richiede circa 8-12 mesi. Per valutare l'acquisizione delle competenze necessarie per eseguire queste iniezioni in modo riproducibile, i tirocinanti sono monitorati per engraftment fetale di cellula di sopravvivenza e donatore in breve tempo punti seguendo la IUT. Lo dimostrano i seguenti esperimenti di controllo di qualità. In particolare, 1 x 107 intero midollo osseo cellule sono isolate da C57BL/6TgN(act-EGFP) OsbY01 ("GFP B6") i topi come precedentemente descritto5 e sono iniettato tramite la vena vitellina in feti di Balb/c gestazionale giorno-14. In un gruppo, IUT è stato effettuato da un istruttore esperto e in un altro gruppo da un partecipante che ha praticato la tecnica per ~ 4 mesi. Immagini di microscopia fluorescente rappresentativo dei fegati fetali raccolti 24 h dopo la IUT sono mostrati in Figura 4A. I fegati dei feti che hanno ricevuto la IUT dal tirocinante reagiscono in meno a causa di una bassa attecchimento delle cellule GFP trapiantate. Questi fegati sono stati quindi analizzati per cellule erogarici GFP+ tramite flusso cytometry per quantificare i livelli di attecchimento. La differenza nei livelli di attecchimento media tra i due iniettori correlati con le immagini viste in microscopia fluorescente (Figura 4B).

La capacità di vettori virali consegnati tramite l'itinerario intra-amniotic trasduce cellule a contatto con il liquido amniotico è esemplificata dalla trasduzione di epiteliale cellule 48 h dopo un'iniezione intra-amniotic di annuncio-GFP (un vettore di adenovirus riporto di transgene GFP10) nei feti di giorno-12.5 gestazionale (Figura 5A e 5B).

Figure 1
Figura 1 . Il processo di creazione di un ago di pipetta di vetro con la levetta della micropipetta. (A) montare la pipetta di vetro e fissarla stringendo i quadranti su entrambe le estremità dell'estrattore. (B) dopo aver fissato l'interruttore trazione attiva il calore. Le impostazioni visualizzate sono calore #1: 985 e Pull: 27. Il vetro scuro di copertura deve essere chiuso durante questo processo per la sicurezza. È stato aperto per scopi di servizio fotografico. (C) la micropipetta è separato. Scartare la parte inferiore e prendere la parte superiore della micropipetta separata per i passaggi successivi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 . Il processo di macinazione la micropipetta per modellare la punta dell'ago. (A), questo pannello mostra la configurazione generale della macinatura. Una sorgente di luce è necessaria per visualizzare il suggerimento sotto il microscopio. (B e C) montare la micropipetta in un angolo di 15-20 °. (D) una accumulo di detriti è previsto durante il processo di macinazione. Utilizzare un pennello per cancellare la punta per ottenere una migliore visualizzazione del processo di rettifica. (E), A punta d'ago ben macinato senza chip identificabili o bordi frastagliati è mostrato sotto un ingrandimento 4x. (F, Ge H) Una nuova ispezione effettuata, l'ago di terra sotto un ingrandimento 10x Mostra un ago ben macinato con una punta affilata e bordi lisci intorno alla punta. Assicuratevi di controllare l'ago in diverse angolazioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 . Trapianto di laparotomia e nell'utero . (A) Shave, anestetizzare e nastro una diga incinta e preparare il suo addome. (B) dopo la laparotomia, consegnare l'interezza dell'utero di fuori dell'addome per un'identificazione di tutti i feti. (C) posizione del feto con il chirurgo non dominante indice e pollice, mantenendo la tensione con il terzo dito. Identificare la punta dell'ago sotto il microscopio in relazione al feto. (D) A flash di sangue che scorre indietro nell'ago micropipetta deve essere vista al momento l'inserimento di una canula della vena vitellina. (E) dopo un completamento di tutte le iniezioni, inserire tutti i feti nuovamente dentro l'addome. (F) chiudere l'addome con una filza di singolo strato utilizzando suture polygalactin 910 4-0. (G) una volta che l'addome è completamente chiuso, lasciate che la diga di recuperare sotto una lampada di calore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 . Engraftment delle cellule mononucleari intero midollo osseo del donatore dopo un'iniezione di vena vitellina. (A) la differenza nel grado di attecchimento con (tirocinante) e senza (istruttore) la perdita delle cellule è indicata chiaramente nell'ambito di microscopia fluorescente. (B) percentuale chimerismo riflette anche la stessa constatazione mostrata nell'analisi di citometria a flusso. Ogni punto di dati rappresenta il fegato da un feto iniettato diverso. L'esperimento è stato effettuato da un tirocinante e un istruttore. Le barre di errore rappresentano una deviazione standard (SD). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 . Il modello di espressione della proteina fluorescente verde in un embrione fetale 48 h dopo un'iniezione intra-amniotic di annuncio-GFP. (A), questo pannello mostra la cornea (freccia rossa) e la pelle macchiate con GFP a e 14.5 dopo un'iniezione intra-amniotic di annuncio-GFP a 12.5 (E12.5/E14.5). (B) un donatrici della parte posteriore dell'embrione (indicato con una luce blu box nel pannello A) ad un più alto ingrandimento dimostra che la trasduzione virale è limitata alla strato superficiale delle cellule peridermal (frecce rosse) e non dell'epidermide (epi). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il trapianto in utero è una potenziale terapia per molte patologie congenite che possono essere diagnosticate presto nella gestazione. Il modello murino per IUT permette ai ricercatori di esplorare l'ambiente fetale o di sperimentare con diverse terapie. A seconda di ciò che è stato iniettato e che cosa è presi di mira, per via endovenosa o intra-amniotic nell'utero trapianto può fornire una consegna affidabile di un injectant nello spazio desiderato.

Quando la destinazione organi specifici, è importante scegliere l'età appropriata embriologica del feto, nonché la tecnica di iniezione. Mentre l'iniezione endovenosa delle cellule alle E14 è ideale per il targeting nicchia ematologica e l'iniezione intra-amniotic E16 è ideale per il targeting del polmone, queste non sono le uniche opzioni disponibili. Ad esempio, iniezioni intra-amniotic possono essere eseguite per i feti più presto E8 con ultrasuono orientamento8. Consegna sistemica è inoltre possibile prima E14 con iniezioni intra-cardiache ultrasuono-guida alle E9 - E1011. La possibilità di effettuazione di iniezioni nelle varie fasi dello sviluppo del feto offre un grande potenziale per gli esperimenti indagando la sicurezza e l'efficienza dei bonifici gene e trapianti di cellule così come indagare questioni fondamentali di sviluppo biologia.

Inoltre, oltre a una consegna per via endovenosa e intra-amniotic, altri siti sono anche disponibili per il targeting in base allo scopo della terapia o la domanda scientifica perseguito. Lo nell'utero intramuscolare approccio è stato utilizzato per un trasferimento del gene per distrofie muscolari12, un approccio intraspinal per la trasduzione del midollo spinale i neuroni di motore13, e un approccio intracranico per gene trasferisce a target di malattie del sistema nervoso centrale14. Per trapianto di cellule ematopoietiche in utero , itinerari intraepatici ed intraperitoneale sono ulteriori opzioni realizzabili come ogni itinerario della consegna alla fine rivolge la nicchia emopoietica15. Tuttavia, l'itinerario endovenoso trapianto consente un più efficiente homing delle cellule del donatore nella nicchia emopoietica e un dosaggio più grandi delle cellule del donatore, così con conseguente totale superiori livelli di attecchimento a lungo termine stabile di cellula donatrice senza aggiunto la mortalità fetale1.

I protocolli abbiamo dettagliate sopra per eseguire IUT sono strumenti potenti e versatili che consentono un approccio unico in vivo per studiare la biologia delle cellule staminali, inerente allo sviluppo immunologia e induzione di tolleranza immunologica, biologia dello sviluppo, e l'editing della terapia/genomico del gene prenatale. Questi metodi di consegna anche avere implicazioni cliniche pertinenti e sono state la base per gli studi di IUHCT e nell'utero terapia genica in modelli animali preclinici di grandi dimensioni come il canino e il modello ovino4,16. Essi continueranno a servire come uno strumento prezioso per sperimentare nuove idee in biologia inerente allo sviluppo ed esplorare nuove terapie per devastanti patologie congenite genetiche, ematologiche, immunitario e metabolici.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gloves Cardinal Health 2D73DP65
Adson Forceps w/ teeth Fine Science Tools 11027-12
Adson Forceps w/o teeth Fine Science Tools 11006-12
Curved scissors Fine Science Tools 14075-11
Heavy Scissors Fine Science Tools 14002-13
Needle Driver Fine Science Tools 12005-15
Vicryl 2.0 Ethicon JB945
Transfer Pipette Medline GSI135010
Cotton Tipped Applicators Medline MDS202000
50 mL Conical tube Fischer Scientific 14-432-22
Tape 3M 1527-1
Eye lubricant Major LubriFresh 0904-6488
Heating Pad K&H 3060
Stereomicroscope Leica MZ16
Injector Narishige HI01PK01
Glass Capillary tubes Kimble 71900-100
Vertical Micropipette Puller Sutter Instruments P-30
Microelectrode Beveler Sutter Instruments BV-10
IM-300 Pneumatic Microinjector Narishige IM-300
Insulin Syringe  BD  305935
Filter Genesee Scientific 25-244
Compac5 Anesthesia Machine VetEquip Compac5 901812 
Isoflurane Piramal Critical Care NDC 66794-017-25
N2 gas Airgas NI 125
O2 gas Airgas OX 125
Ad-GFP viral vector Penn Vector Core H5'.040.CMV.eGFP

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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