בידוד F1-ATPase מ פרוטיסטים טפילי Trypanosoma brucei

JoVE Journal
Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הטיהור של F1-ATPase משלב חרקים בתרבית של Trypanosoma brucei. ההליך מניב מורכב מאוד טהור, הומוגנית, פעיל מתאימים ללימודי אנזימטי מבניים.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Gahura, O., Zíková, A. Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei. J. Vis. Exp. (143), e58334, doi:10.3791/58334 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

F1-ATPase הוא subcomplex קטליטי ממברנה-חיצוני של F-type ATP סינתאז, אנזים העושה את הכוח המניע של פרוטון מעבר ממברנות ביולוגיות לייצר אדנוזין טריפוספט (ATP). בידודו של ה-F שלם1-ATPase ממקור מקורי שלו הוא תנאי חיוני לאפיון של האנזים חלבון קומפוזיציה קינטית פרמטרים, רגישות מעכבי. מאוד טהור, הומוגניות F1-ATPase יכול לשמש ללימודים מבניים, אשר מספקים תובנה המנגנונים המולקולריים של סינתזת ATP, הידרוליזה. מאמר זה מתאר הליך של הטיהור של F1-ATPase מן Trypanosoma brucei, סוכן סיבתי של אפריקה trypanosomiases. ה F1-ATPase מנותקת שלפוחית מיטוכונדריאלי, אשר מתקבלים על ידי פירוק היפוטוניק של trypanosomes במבחנה תרבותי. השלפוחיות המוגלתיות הן מכנית מפוצל על ידי sonication ו ה נ1-ATPase הוא שוחרר מן קרום מיטוכונדריאלי הפנימי על ידי החילוץ כלורופורם. המתחם אנזימטי מטוהר עוד יותר על ידי exchange אניון רצופים ו כרומטוגרפיה גודל-הדרה. ספקטרומטר מסה רגיש טכניקות הראה כי המתחם מטוהרים נטול מזהמים כמעט כל חלבון, לכן, מייצג חומר מתאים לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן או הקפאה-מיקרוסקופ. ה-F מבודד1-ATPase תערוכות פעילות hydrolytic ATP, אשר יכול להיות מעוכבים באופן מלא על ידי אזיד הנתרן, מעכב חזק של F-type ATP synthases. המתחם מטוהרים נשאר יציב ופעיל לפחות שלושה ימים בטמפרטורת החדר. משקעים על ידי אמוניום סולפט משמש לאחסון לטווח ארוך. נהלים דומים שימשו לטיהור של F1- ATPases רקמות מידע יונקים, שמרים או חיידקים. כך, הפרוטוקול שהוצגו יכול לשמש קו מנחה עבור ה F1-ATPase בידוד של אורגניזמים אחרים.

Introduction

Synthases F-type ATP הם מאוגד-ממברנה סיבוב קומפלקסים multiprotein רוברטסונית פרוטון זה זוג מעבר אנרגיה-transducing ממברנות של חיידקים, המיטוכונדריה מהכלורופלסט עם היווצרות של ATP. הפרטים מולקולרית של מנגנון סיבובי של סינתזת ATP ידועים בעיקר בשל לימודי המבנית של מטוהרים בקטריאליים ו מיטוכונדריאלי synthases ATP ושלהם subcomplexes1. F-type ATP סינתאז שמאורגנים moieties ממברנה-פנימי, חיצוני-ממברנה. החלק ממברנה-חיצוני, המכונה F1-ATPase, מכיל שלושה אתרים קטליטי, שבו מתרחשת זירחון של אדנוזין diphosphate (ADP) ATP או התגובה הפוכה. F1-ATPase יכול להשתחרר השפעול של moiety קרום-מהותי תוך שמירה על היכולת שלה hydrolyze, אבל לא לסנתז, ATP. המגזר מאוגד-ממברנה, שנקרא Fo, ומתווך רוברטסונית חלבון, אשר מניע את הסיבוב של החלק המרכזי של האנזים. F1 ו- Fo . סקטורים מחוברים באמצעות מרכזי והיקפי הגבעול.

הראשון מנסה לטהר את F1-ATPase ניצני שמרים, הלב שור המיטוכונדריה תאריך חזרה לשנות ה-60. פרוטוקולים אלה נעשה שימוש שחולצו המיטוכונדריה, אשר היו מובסים sonication, fractionated על ידי משקעים סולפט אמוניום או מה לעזאזל קרה, ואחריו כרומטוגרפיה אופציונלי step(s) וטיפול בחום2,3,4 5, ,6. הטיהור היה מאוד השתפר, פשוטה על ידי השימוש בכלורופורם, אשר משחרר בקלות את F1-ATPase מן קרום מיטוכונדריאלי שברים7. החילוץ כלורופורם שימש אז כדי לחלץ נ1- ATPases וממקורות שונים בעלי חיים, צמחים, חיידקי (למשל, עכברוש כבד8, תירס9, אראם maculatum10ו Escherichia coli 11). עוד טיהור של F שפורסמו כלורופורם1-ATPase מאת זיקה או גודל-הדרה כרומטוגרפיה (שניות) הניב חלבון טהור מאוד מורכבת, אשר היה מתאים מכשור לקביעת קשיות ומבנה ברזולוציה גבוהה על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, כמו שתיעד את המבנים של F1-ATPase מן הלב שור12,13 ו האפייה14. F1-ATPase מבנים נקבעו גם של אורגניזמים שקשה לטפח, לפיכך, כמות החומר הביולוגי הראשוני היה מוגבל. במקרה זה, ה-F1-ATPase subunits היו באופן מלאכותי הביע ומצורפים המתחם ב e. coliוטיהרו האנזים heterologous כל היה מאת זיקה כרומטוגרפיה דרך של יחידת משנה מתויגות. גישה כזו הובילו הקביעה של F1-ATPase מבני שני המינים חיידקי לרום, Geobacillus stearothermophilus15 , Caldalkalibacillus thermarum16, 17. עם זאת, מתודולוגיה זו הוא מעדיף מצוייה F האיקריוטים1- ATPases מאז זה מסתמך על מכשיר prokaryotic protheosynthetic, עיבוד posttranslational, מכלול מורכבים.

החילוץ מבוססי כלורופורם השתמשת קודם לכן כדי לבודד F1- ATPases Trypanosoma cruziפרזיטים חד־תאיות digenetic18 ו brucei ט19, חשוב פתוגנים בתרבית של גורם אמריקאי ו Trypanosomiases אפריקאי, בהתאמה, ומתוך monogenic חרק טפיל Crithidia fasciculata20. Purifications אלה הובילו רק תיאור פשוט של ה F-1- ATPases, מכיוון שאין יישומים במורד הזרם שימשו לאפיין באופן מלא את הרכב, מבנה ומאפייני אנזימטי של המתחם. מאמר זה מתאר שיטה ממוטב עבור F1-ATPase טיהור מהבמה מחזור חיי חרק בתרבית של brucei טי. השיטה מפותח בהתבסס על הפרוטוקולים הוקמה עבור בידוד של שור ושמרים F1- ATPases21,22. ההליך התשואות מאוד טהור, הומוגניות אנזים מתאים במבחנה אנזימטי או מעכבות מבחני, אפיון מפורט פרוטיאומיה מבנית באמצעות ספקטרומטר מסה23, קביעת מבנה24. פרוטוקול טיהור ואת הידע של F1-ATPase מבנה בשלב האטומי פותח אפשרות לעצב מסכים כדי לזהות מעכבי מולקולה קטנה, וסיוע בפיתוח של תרופות חדשות נגד trypanosomiases אפריקה. יתר על כן, הפרוטוקול ניתן להתאים לטהר F1-ATPase של אורגניזמים אחרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. מאגרי ופתרונות

  1. הכינו את הפתרונות המפורטים להלן. דגה כל מאגרים עבור כרומטוגרפיה נוזלית. מוסיפים מעכבי ADP benzamidine, פרוטאז רק לפני השימוש.
    1. להכין מאגר ת: 50 מ מ טריס מאגר עם חומצת מלח (HCl-טריס) pH 8.0, 0.25 M סוכרוז, benzamidine 5 מ"מ, 5 מ"מ אמינו קפרון מעכבי חומצה (ACA) ולאחר פרוטאז (10 מיקרומטר amastatin 50 מיקרומטר bestatin, pepstatin 50 מיקרומטר, 50 מיקרומטר leupeptin, diprotin 50 מיקרומטר A).
    2. להכין מאגר ב': 50 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 0.25 M סוכרוז, 4 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), benzamidine 5 מ"מ, 5 מ"מ ACA, 1 מ מ. ADP, מעכבי פרוטאז (10 מיקרומטר amastatin 50 מיקרומטר bestatin, pepstatin 50 מיקרומטר, 50 מיקרומטר leupeptin, diprotin 50 מיקרומטר A).
    3. הכנת מאגר Q-עמודה: 20 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 4 מ מ EDTA, 10 מ מ MgSO4, benzamidine 5 מ"מ, 5 מ"מ ACA ו- 1 מ מ ADP.
    4. הכנת מאגר • תנאי Q-עמודה: עמודות Q מאגר עם 1 M NaCl.
    5. הכנת מאגר שניה: 20 מ מ טריס-HCl pH 8.0, 10 מ מ MgSO4, 100 מ מ NaCl, 1 מ"מ ADP.
    6. להכין את הכלורופורם רווי טריס-HCl M 2 pH 8.5. לערבב כלורופורם עם 2 מ' טריס-HCl pH 8.5 בכ-1:1 יחס בבקבוק בורג-קאפ, לנער, אתן את השלבים ולא מימית אורגניים נפרדים, למדוד pH של השכבה העליונה מימית עם רצועת נייר pH-אינדיקטור. לאחסן בטמפרטורת החדר. לפני השימוש, לנער שוב ולתת את שלבי נפרדים. השתמש השכבה התחתונה כלורופורם.
      התראה: כלורופורם הוא תנודתי, מעצבן את העיניים והעור. לעבוד בשכונה fume. השתמש בטיחות משקפיים כאשר רועד.

2. הכנה של חלקיקים תת-מיטוכונדריאלי

  1. Resuspend שלפוחית מיטוכונדריאלי (mitoplasts) מבודדת על ידי פירוק היפוטוניק25 מ עונה 1 פרק 1011 עונה 2 פרק 1011 תאים של procyclic ט brucei ב 5 מ של המאגר הקר א לשמור הדגימה מקורר עד שלב 3.2.
  2. לקבוע ריכוז חלבון ההשעיה על ידי bicinchoninic חומצה (BCA) חלבון assay26 בהתאם להוראות היצרן.
    1. השתמש סדרה דילול אלבומין שור (BSA) במים הנדסה גנטית כדי לבנות את עקומת סטנדרטי. לדלל את כמות קטנה של מדגם 20 - 100 פעמים עם מים הנדסה גנטית כדי להתאים הסטנדרטים טווח של BSA.
    2. לחשב את הסכום הכולל חלבון במדגם ולהביא את ריכוז חלבון 16 מ"ג/מ"ל מאת לדלל אותה עם המאגר הנוסף א
  3. קטע mitoplasts לתוך שלפוחית הפוכה וחתיכות הממברנה על ידי sonication של ההשעיה 7 x עבור 15 s עם האנרגיה הכוללת של 70 עד 100 J לכל דחף עם microtip עם קוטר של 3.9 מ מ. אם מהמגן אולטראסאונד אינו מציג תפוקת האנרגיה, להתחיל אופטימיזציה ב-50% של כוח מקסימלי. דגירה המדגם על הקרח ב-30 s בין דחפים. לאחר sonication, המתלה הופך מעט כהה יותר.
  4. משקעים הקרום קטעים מאת ultracentrifugation g x 54,000 עבור 16 h או 98,000 g x עבור 5 שעות-4 מעלות צלזיוס. Decant את תגובת שיקוע, להמשיך עם מיצוי כלורופורם, או הקפאה המשקע של חנקן נוזלי ואחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס.

3. שחרור של F1-ATPase מן הממברנה על ידי כלורופורם

  1. Resuspend בגדר של ממברנות מיטוכונדריאלי במאגר B בעזרת מהמגן קטן דאונס. חישוב הנפח של מאגר B בהתבסס על הסכום הכולל של מאגר שימוש בנוסחה שלבים 2.1 ו- 2.2 באמצעות הפעולות הבאות: נפח (מאגר B) = נפח (מאגר A) x 12/21. להעביר את המתלים צינור חרוטי 15 - מ או 50-.
  2. להסיר את דגימת קרח ולשמור, מעכשיו, לדוגמה, כל הפתרונות כדי לשמש בטמפרטורת החדר.
  3. להוסיף כלורופורם רווי טריס-HCl M 2 pH 8.5; הנפח של כלורופורם שיתווספו שווה לחצי מנפח של ההשעיה. סגור/י היטב את הכובע. לנער אותו נמרצות בדיוק 20 ס Centrifuge זה מיד על סך של 8,400 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. העברה השלב העליון מימית מעונן 1.6-mL microtubes. מוסיפים מעכבי פרוטאז (10 מיקרומטר amastatin 50 מיקרומטר bestatin, 50 מיקרומטר pepstatin, leupeptin 50 מיקרומטר, מיקרומטר 50 diprotin A) כדי להחליף את מעכבי הוסר על ידי טיפול כלורופורם. Centrifuge את הדגימות ב x 13,000 g למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. להעביר את תגובת שיקוע microtubes טריים וחזור על צנטריפוגה כדי להסיר את כל חומר לא מסיסים.

4. החלפת אניון כרומטוגרפיה

  1. Equilibrate העמודה exchange (Q) 5-mL אניון המחובר למערכת כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהיר עם המאגר Q-עמודה בספיקה של 5 mL/min עד ספיגת ב 280 nm ו את המוליכות לייצב (כ 50 מ"ל של המאגר).
  2. לטעון את תגובת שיקוע מהשלב 3.3 על העמודה equilibrated בספיקה של 1 מ"ל לדקה. חכה עד ספיגת ב 280 ננומטר מייצבת ברקע. להחיל מעבר צבע ליניארי של 25-mL המאגר • תנאי Q-עמודה בין 0% ל-100% בקצב הזרימה של שברים 1-mL לאסוף 0.5 מ ל לדקה.
  3. Assay שברים בודדים המתאימים לשיא • תנאי מרכזי לפעילות hydrolytic ATP על ידי assay פולמן ATPase2 ב- pH 8.0. השתמש µL 10 של כל שבר לכל 1 מ"ל של תערובת התגובה. בריכת שברים כי התערוכה פעילות ATPase. באופן אופציונלי, להפריד בין 10 µL של כל שבר על סודיום dodecyl פוספט לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד), מכתים את הג'ל על-ידי Coomassie כחול להמחיש F בודדים1-ATPase subunits וחלבונים משחיתה.
  4. תתרכז המדגם במאגר אולטראפילטרציה ממברנה באמצעות עמודה ספין עם מסנן MWCO PES 100,000 ל- 200-500 µL. להמשיך שניה או חנות המדגם ללילה בטמפרטורת החדר.

5. גודל-הדרה כרומטוגרפיה

  1. Equilibrate בעמודה שניה המחובר למערכת כרומטוגרפיה נוזלית לפחות 48 מ"ל (שני כרכים עמודה) המאגר שניה בספיקה של 0.5 mL/min.
  2. להחיל את הדגימה על העמודה ולהפעיל כרומטוגרפיה בספיקה של 0.25 mL לדקה לאסוף 0.25-mL שברים.
  3. הפעל את µL 10 של שברים מקבילים הפסגות של UV280nm ספיגת המעקב בדף-מרחביות, תכתים אותם על-ידי Coomassie כחול. השיא העיקרי הראשון מכיל את F1-ATPase. Assay השברים המתאימים זה שיא עבור ATP hydrolytic פעילות של אזיד הרגישות מאת וזמינותו פולמן ATPase. לקבוע ריכוז החלבון על ידי BCA וזמינותו.
  4. לשמור על ה-F מטוהרים1-ATPase בטמפרטורת החדר להשתמש בו בתוך בתלת-ממד לאחר טיהור ליישומים במורד הזרם. לחלופין, לרכז את הדגימה באמצעות עמודה ספין עם מסנן MWCO PES 100,000 > 1.5 מ"ג / מ"ל, precipitate אותו על ידי ערבוב זה עם רוויה אמוניום סולפט להתאים ל- pH 8.0 (1.2 x האחסון), ואחסן אותו ב 4 º C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הוא לטיהור טיפוסי (איור 1) מתחיל עם שלפוחית מיטוכונדריאלי (mitoplasts) מבודד על המילוי ההדרגתי Percoll מ hypotonically lysed עונה 1 פרק 1011 כדי עונה 2 פרק 1011 procyclic ט brucei תאים25 תרבותי בתקן גלוקוז-עשיר SDM-79 בינוני27. Mitoplasts יש מפוצלים מאת sonication, טווים, ונזרקת תגובת שיקוע המכילות מטריקס. ממברנות מיטוכונדריאלי מטופלים עם הכלורופורם לשחרר את F1-ATPase. לאחר צנטריפוגה, יימחקו את שלב אורגני ואת זירז לאטמוספרה. השלב מימית fractionated על ידי יונים כרומטוגרפיה-אמוניום רבעוני, כאמצעי חילופי חזקה אניון (איור 2 א). שברים התואמים • תנאי מרכזי שיא ומכילים את F1-ATPase הם איחדו, מרוכז. חומר זה משמש כקלט עבור שניה, מה שמבטל זיהומים שיורית. הזיהום העיקרי הוא dihydrolipoyl דהידרוגנאז, אשר elutes מן העמודה שניה כמו לשיא דיסקרטית, המסומן באמצעות הפס הירוק כהה ב איור 2B. ה F1-ATPase elutes ב דומיננטי, סימטרי ברובו השיא הראשון (איור 2B).

ההתקדמות של טיהור ואחריו וזמינותו חלבון BCA (או שיטת נפוצה אחרת), עמודים מרחביות, פיקוח על פעילות ATPase. הקצב של הידרוליזה של ATP נמדד על ידי פולמן מ- ATP נוצר assay2, בהתבסס על הירידה של ספיגת של NADH בעקבות תגובות בשילוב. אזיד הנתרן, מעכב הוקמה של F1-ATPase, ישמש בנקודת ריכוז 2-מ מ כדי לקבוע את שיעור של F1-ATPase-ספציפי הידרוליזה של ATP. בדרך כלל, החומר הקלט מכיל בערך 150-300 מ"ג חלבון מיטוכונדריאלי, בהתאם למספר התאים המשמש כמקור של שלפוחית מיטוכונדריאלי. היחס אזיד רגיש של פעילות ATPase הכולל הוא בסביבות 30% עד 40% בשלב זה. אחרי החילוץ כלורופורם, למעלה מ-90% של פעילות ATPase במדגם תרמו את F1-ATPase. ה-F מטוהרים1- ATPase רגישה כמעט לחלוטין הטיפול אזיד (מינימלי שיורית ATPase פעילות ניתן לייחס את autolysis רקע ATP), מייצג סביב 1% של מסה חלבון קלט, עם התשואה המשוערת של 1 - 1.5 מ"ג F1-ATPase לכל עונה 1 פרק 1011 תאים (טבלה 1). דפוס אופייני ללהקה לאחר ההפרדה של ה-F מטוהרים1-ATPase על ג'ל מרחביות-דף ואחריו הכחול Coomassie מכתים מוצג באיור 2C. החלבונים זוהו על ידי המוני פפטיד טביעת אצבע, המאופיינת בפירוט ספקטרומטר מסה שונים גישות23. להקות חלש סדיר בחציו הלהקה β-יחידה משנית מייצג subcomplexes של α3β3 ראש (הדימרים ו oligomers של α - ו β-subunits) ו הם חסרי כל מזהמים לזיהוי על ידי טכניקות רגיש ספקטרומטר מסה. ה-F מטוהרים1-ATPase ניתן לאחסן עד מספר ימים במאגר שניה בטמפרטורת החדר. לחלופין, ה F-1-ATPase מרוכז ≥2 מ"ג/מ"ל יכול להיות זירז ידי אמצעי שווה של רוויה אמוניום סולפט במאגר שניה, עם pH להתאים ל- 8.0, ומאוחסנים ב 4 º C. לפחות שישה חודשים לאחר משקעים האנזים פעיל עם אין השפלה הברורה של כל יחידה משנית וניתן להשיגו באמצעות redissolving את החומר precipitated מאגר שניה או פתרון דומה. עם זאת, אחסון עוד פחות מחודש אחד אינו מתאים התגבשות, כפי שנקבע מדעית.

Figure 1
איור 1 : ערכה של ההליך טיהור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : שני שלבים טיהור של F שפורסמו כלורופורם1-ATPase באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית. (א) • תנאי פרופיל של אניון חילופי גזים (החלונית העליונה) ושברים שנבחר מופרדים על הג'ל טריס-גליצין מרחביות-דף 10-20% צבעונית עם צבע כחול Coomassie (החלונית התחתונה). כחול מעקב: ספיגת UV-280 ננומטר; מעקב אדום: ריכוז של NaCl במאגר • תנאי; קלט: F1-ATPase שפורסמו על ידי כלורופורם; רגל: זרימה דרך. (B) • תנאי פרופיל של שניה (החלונית העליונה) ושברים שנבחר מופרדים על הג'ל מרחביות-דף צבעונית עם צבע כחול Coomassie (החלונית התחתונה). קלט: איחדו שברים של אניון חילופי גזים המכילה F1-ATPase. הסורגים בצבע פאנלים A ו- B לסמן השברים בפרופילי • תנאי נותחו על ידי עמודים מרחביות, מסלולים המתאימים הג'ל בהתאמה. (ג) זהויות של חלבונים בודדים מבודדת F1-ATPase כפי שזוהו על ידי ספקטרומטר מסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

ריכוז חלבון (mg/mL) סה כ חלבון (מ ג) פרופורציה של קלט חומר (%) פעילות
(ΜmolATP x מ ג-1 x דקות-1)
אזיד רגישות (%)
שלפוחית מיטוכונדריאלי במאגר A 16.2 170 100 1.3 25-35
ממברנות מיטוכונדריאלי במאגר B 18.6 97 57 2.4 35-45
כלורופורם חילוץ שברים 2.5 7.9 4.7 12 91-95
F1-ATPase לאחר Q-טור - 2.2 1.3 23 92-96
F1-ATPase לאחר סינון ג'ל - 1.6 0.93 48 93-98

טבלה 1: דוגמה של התקדמות טיפוסי, התשואה של F1-ATPase טיהור של המיטוכונדריה מבודד מן עונה 1 פרק 1011 procyclic ט brucei תאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול עבור F1-ATPase טיהור מ ט brucei פותחה על בסיס שיטות שפורסמו קודם לכן עבור בידודו של F1-ATPase קומפלקסים של מינים אחרים,13,14. השיטה אינה דורשת כל שינוי גנטי (למשל, תיוג) ותשואות מתחם פעיל מלא עם כל subunits הנוכחי. צעד קריטי הוא שחרור הקלו כלורופורם F1-ATPase מהחלק צמוד-ממברנה של האנזים. ב- purifications של כל המינים האיקריוטים שתוארו עד כה, subcomplex פרסמה הכילה subunits α, β, γ, אלפא, חדוה ב סטויכיומטריה של 3:3:1:1:1. ב- brucei ט, ה F-1-ATPase מכיל של שלושה עותקים נוספים של p18 יחידת משנה, רכיב הרומן מוגבלת euglenozoan protists23. יתר על כן, α euglenozoan-יחידת משנה proteolytically מחולק שני קטעים, שניהם stably המשויך28,מורכבים24,29. יחידת משנה OSCP (oligomycin-רגישות-היוועצות חלבון), המקשר בין ה F-1-moiety גבעול היקפיים30, נעדר מן המתחם שפורסמו, שהוא מסכים עם F1-ATPase purifications על ידי כלורופורם מיצוי של מינים אחרים,13,14.

ה F שפורסמו כלורופורם1-ATPase מטוהר נוסף באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית. במקרה של ה-F שור1-ATPase, צעד אחד בלבד כרומטוגרפיה, גודל-הדרה כרומטוגרפיה, די בה כדי להשיג טהור ופעיל מאוד מורכבים31. עם זאת, קביעת שניה אחת הספיקה לטיהור brucei ט נ1-ATPase, כמו שברים מועשר עבור F1-ATPase הכיל חלבון נוספים מזהמים, בעיקר דלתא-1-pyrroline-5-carboxylate דהידרוגנאז. לכן, אניון חילופי גזים הוצג לפני ה-SEC כשלב ראשון וחשוב מטהרת, ומשמש ה-SEC ההליך ליטוש עוקבות. לניסויים התגבשות, השימוש של העמודה Superdex 200 להגדיל הוכיחה להיות חיוני, מאז הטור סיפק חומר שמותר גידול גבישים באיכות טובה. סביר כי הרזולוציה של העמודה מופעלת ההפרדה של אחוז קטן של מתחמי לא שלם התערב עם התגבשות. אולם, עבור יישומים נוספים התגבשות, ההפרדה באמצעות העמודה Superdex 200 היה לא פחות משביע רצון.

כדי להגן על ה-F1-ATPase מורכב מ proteolysis חלקית על ידי נוכחות מיטוכונדריאלי לא ידוע protease(s) lysate, המאגרים הראשונית A ו- B מכיל מגוון רחב של מעכבי פרוטאז. ההשפעה של מעכבי בודדים על proteolysis של F1-ATPase subunits לא נבדק, סביר להניח, הנוכחות של חלק מעכבי הוא מיותר. עבור השלב שניה, מעכבי לא יתווספו יותר, כפי פרוטאזות מזהמים מתבצעת הסרה של ה נ1-ATPase מדגם ידי החילוץ הכלורופורם או הצעד הראשון כרומטוגרפיה.

פרוטוקול שקודמים מוביל באופן בלתי נמנע אובדן חלקי של F1-ATPase. ההפסד המשמעותי ביותר (25% 45% מן הסכום הכולל) מתרחשת במהלך השלב ריכוז על ידי קרום אולטראפילטרציה על עמודה ספין לאחר כרומטוגרפיה אניון-exchange. ה F1-ATPase סביר לאנאפוליס הקרום של העמודה ספין. לפיכך, עבור יישומים מסוימים במורד הזרם זה לא דורש, טהור ומרוכז מאוד מדגם (למשל, מבחני אנזימטי ומסכי מעכבות), ה-F1-ATPase יכול לשמש מיד לאחר כרומטוגרפיה חילופי אניון (ראה איור 2B, ליין קלט).

למרות הטיהור של F1-ATPase של אורגניזמים שונים משתנה בפירוט, תהליך העבודה הכללי נשאר זהה. לכן, פרוטוקול זה יכול לשמש קו מנחה לפיתוח ה-F1-ATPase פרוטוקול בידוד של שפע מקורות אחרים, כגון רקמות או תאים cultivatable בקנה מידה גדול.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו מומן על ידי משרד החינוך ERC CZ הענק LL1205, המענק גרנט סוכנות של צ'כיה 18-17529S, ולא על ידי ERDF/ESF פרויקט מרכז לחקר פתוגניות, התקפה אלימה של טפילים (מס ' CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP) Applichem A0948
Amastatin Hydrochloride Glantham Life Sciences GA1330
Aminocaproic Acid Applichem A2266
BCA Protein Assay Kit ThermoFischer Scientific/Pierce 23225
Benzamidine Hydrochloride Calbiochem 199001
Bestatin Hydrochloride Sigma Aldrich/Merck B8385
Chloroform Any supplier
cOmplete Tablets, Mini EDTA-free Roche 4693159001 Protease inhibitor cocktail tablets
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) Any supplier
Hydrochloric Acid Any supplier For pH adjustment
Ile-Pro-Ile Sigma Aldrich/Merck I9759 Alias Diprotin A
Leupeptin Sigma Aldrich/Merck L2884
Magnesium Sulfate Heptahydrate Any supplier
Pepstatin A Sigma Aldrich/Merck P5318
Protein Electrophoresis System Any supplier
Sodium Chloride Any supplier
Sucrose Any supplier
Tris Any supplier
Name Company Catalog Number Comments
Consumables
Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer Beckman Coulture 328874
DounceTissues Homogenizer 2 mL Any supplier
Glass Vacuum Filtration Device Sartorius 516-7017 Degasing solutions for liquid chromatography
HiTrap Q HP, 5 mL GE Healthcare Life Sciences 17115401 Anion exchange chromatography column
Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm Sartorius 18406--47------N Degasing solutions for liquid chromatography
Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 29091596 Size-exclusion chromatography column
Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES Sartorius VS0641
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
AKTA Pure 25 GE Healthcare Life Sciences 29018224 Or similar FPLC system
Spectrophotometer Shimadzu UV-1601 Shimadzu Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode
Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor Beckman Coulture Or similar ultracentrifuge and rotor
Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000 BioLogics 0-127-0001 Or similar ultrasonic homogenizer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Walker, J. E. Structure, mechanism and regulation of ATP synthases. Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. Wikström, M. The Royal Society of Chemistry. Croydon, UK. 338-373 (2017).
  2. Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase. The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).
  3. Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242, (10), 2552-2560 (1967).
  4. Racker, E., Horstman, L. L. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor. The Journal of Biological Chemistry. 242, (10), 2547-2551 (1967).
  5. Senior, A. E., Brooks, J. C. Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents. Archives of Biochemistry and Biophysics. 140, (1), 257-266 (1970).
  6. Tzagoloff, A., Meagher, P. Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 246, (23), 7328-7336 (1971).
  7. Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles. Biochemical Journal. 148, (3), 533-537 (1975).
  8. Tyler, D. D., Webb, P. R. Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform. Biochemical Journal. 178, (2), 289-297 (1979).
  9. Hack, E., Leaver, C. J. The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion. The EMBO Journal. 2, (10), 1783-1789 (1983).
  10. Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase. Biochemical Journal. 225, (3), 821-824 (1985).
  11. Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies. Journal of Bacteriology. 142, (3), 768-776 (1980).
  12. Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. Structure at 2.8 Å resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria. Nature. 370, (6491), 621-628 (1994).
  13. Lutter, R., et al. Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria. Journal of Molecular Biology. 229, (3), 787-790 (1993).
  14. Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase. The EMBO Journal. 25, (22), 5433-5442 (2006).
  15. Shirakihara, Y., et al. Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism. The FEBS Journal. 282, (15), 2895-2913 (2015).
  16. Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1. Journal of Structural Biology. 152, (2), 140-145 (2005).
  17. Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, (39), 10860-10865 (2016).
  18. Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65, (1), 103-109 (1980).
  19. Williams, N., Frank, P. H. The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety. Molecular and Biochemical Parasitology. 43, (1), 125-132 (1990).
  20. Higa, A. I., Cazzulo, J. J. Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin. Molecular and Biochemical Parasitology. 3, (6), 357-367 (1981).
  21. Walker, J. E., et al. Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria. Journal of Molecular Biology. 184, (4), 677-701 (1985).
  22. Mueller, D. M., et al. Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase. Protein Expression and Purification. 37, (2), 479-485 (2004).
  23. Gahura, O., et al. The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit. The FEBS Journal. 285, (3), 614-628 (2018).
  24. Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (9), 2102-2107 (2018).
  25. Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
  26. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, (1), 76-85 (1985).
  27. Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 99, (1), 89-101 (1999).
  28. Speijer, D., et al. Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata. Molecular and Biochemical Parasitology. 85, (2), 171-186 (1997).
  29. Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase. Molecular and Biochemical Parasitology. 135, (2), 221-224 (2004).
  30. Carbajo, R. J., et al. How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit. Journal of Molecular Biology. 368, (2), 310-318 (2007).
  31. Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 Å resolution. The Journal of Biological Chemistry. 282, (19), 14238-14242 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics