Elevado, mais teste combinado com vídeo que segue o Software para investigar o efeito ansiolítico dos suplementos cetogênica exógenos de labirinto

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Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para investigar as alterações do nível de ansiedade de modelos animais roedores. O elevado e mais labirinto teste (EPM), usado em conjunto com um vídeo, software de monitoramento, fornece um método confiável para documentar o efeito de diversos tratamentos potenciais do ansiolítico em cenários laboratoriais pré-clínicos.

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Ari, C., D’Agostino, D. P., Diamond, D. M., Kindy, M., Park, C., Kovács, Z. Elevated Plus Maze Test Combined with Video Tracking Software to Investigate the Anxiolytic Effect of Exogenous Ketogenic Supplements. J. Vis. Exp. (143), e58396, doi:10.3791/58396 (2019).

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Abstract

O objetivo geral deste estudo é descrever a metodologia da elevada e mais teste de labirinto (EPM) em combinação com um software de monitoramento de vídeo. O objetivo do método é documentar o efeito de diversos tratamentos potenciais do ansiolítico em modelos de roedores de laboratório. O teste EPM baseia-se na tendência dos roedores para ser protegidos, incluidos espaços escuros e incondicionado medo de espaços abertos e alturas e sua motivação intensa inata para explorar novos ambientes. O EPM é um teste comportamental amplamente usado para investigar as respostas ansiolítico ou anxiogenic dos roedores dados drogas que são conhecidas por afetar o comportamento. Observação, demonstrando uma diminuição da proporção de tempo gasto em braços fechados, uma maior percentagem de tempo gasto com os braços abertos, um reduzido número de entradas de braços fechados e um elevado número de entradas para abrir os braços, medidos pelo teste de EPM pode refletir reduzido níveis de ansiedade. Usando esse método, o efeito de suplementos de cetona exógena no comportamento relacionados à ansiedade é testado em ratos Sprague Dawley (SPD). Suplementos de cetona exógenos são cronicamente alimentados aos ratos para 83 dias ou subchronically e gavaged aguda por via oral, diariamente, durante 7 dias, antes de conduzir a EPM testar. Coleta de dados comportamentais é executada usando o vídeo inteligente sistema de rastreamento por um observador cego no final dos tratamentos. As principais conclusões indicam que o teste EPM é um método eficaz para detectar o efeito ansiolítico induzida pelo suplemento de cetona e pode ser considerado uma medida sensível para avaliar as mudanças no comportamento de ansiedade associado com drogas ou metabólica-baseado em terapias.

Introduction

O objetivo deste artigo é descrever a metodologia do teste de EPM em combinação com um vídeo que segue o software para monitorar mudanças no comportamento relacionados à ansiedade e novos tratamentos em modelos de roedores de laboratório. O teste EPM é um método de avaliação comportamental relativamente simples, que foi desenvolvido para a investigação de quantificar os níveis de comportamento de ansiedade e as respostas de ansiedade de ratos após a aplicação dos tratamentos de drogas1. De fato, foi demonstrado que o teste EPM é um ensaio comportamental amplamente utilizado e eficaz para a investigação das alterações dos níveis de ansiedade de roedores1,2. A aplicabilidade do teste de EPM em roedores (principalmente ratos e camundongos) baseia-se na sua tendência para espaços fechados, escuros (abordagem), um incondicionada medo de espaços abertos/alturas (evasão) e seu elevado nível de motivação inata para explorar o romance ambientes. Consequentemente, o teste EPM é uma metodologia bem estabelecida com base em um conflito de aproximação-evitação2,3.

O EPM é um aparelho em forma de adição constituído por quatro braços elevados, que tem sido descrito por Handley e Mithani4 (Figura 1) e consiste de dois braços opostos que estão abertos aos arredors (braços abertos), Considerando que os dois fecharam braços opostos (braços fechados) estão equipados com paredes. Após o tratamento, se o aumento do tempo é gasto com os braços abertos e/ou aumento do número de entradas de braço aberto, comparado com o controle de animais (não tratados) é detectado na EPM, isso indica um efeito de ansiolítico2,3. A resposta mais robusta de evasão foi demonstrada nos primeiro 5 min após o início (colocação dos ratos na interseção de quatro braços da EPM) do EPM ensaio5; Portanto, qualquer comportamento após um tratamento comumente é gravado por 5 min da EPM. Como medidas adicionais de um nível de ansiedade, o número de mergulhos de cabeça, traseiros (vertical em pé o roedor em duas patas), boli fecal, bem como braço total entradas (actividade motora espontânea) e diferentes posturas (alongamento ou congelamento), também pode ser gravado na EPM2. Assim, vários parâmetros comportamentais podem ser compilados para fornecer uma avaliação abrangente de comportamento relacionados à ansiedade.

A fim de aumentar a validade dos resultados, dois ou três ensaios comportamentais são comumente usados, tais como o teste de escolha de claro-escuro, o teste de interação social, e o teste da EPM, para medir os níveis de ansiedade do animal diferente modelos6. O ensaio EPM executado em paz em roedores também é um método adequado para investigar o efeito ansiolítico ou anxiogenic de diferentes drogas7. O teste EPM é sensível não só ao tipo benzodiazepínicos ansiolíticos (por exemplo, diazepam)8, mas também, entre outros, aos compostos aminoácidos ácido, monoamina, peptidérgicos e nucleosidergic (por exemplo, antagonista de N-metil-D-aspartato (NMDA) AP7, antagonista de ácido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (Leandro) CNQX, antagonista BIBP3226 morfina agonista de receptores μ-opioides, NPY1, substância P, grelina, ocitocina, agonistas dos receptores de serotonina e antagonistas como 8-OH-DPAT e Way-100635 e antagonista β1-adrenérgicos betaxolol)9,10,11,12. Consequentemente, o ensaio EPM em roedores é um método adequado e sensível para investigar a influência de diferentes tratamentos que influenciam as áreas do cérebro envolvidas no efeito ansiolítico (por exemplo, a amígdala, hipocampo e áreas límbicas) e mecanismos de ação (por exemplo, o sistema serotoninérgico, gabaérgica e adenosinergic) implicados na ansiedade2. Os agentes testados nestes estudos EPM incluem suplementos de cetona exógenos que alteram o cérebro sinalização de maneiras sutis que podem exigir um método sensível para detectar alterações comportamentais.

Neste artigo, descrevemos o teste EPM usado em combinação com um vídeo, software de monitoramento, que ajuda a eliminar o viés experimental e facilita a coleta e a análise das alterações comportamentais em resposta aos tratamentos de romance ansiolítico.

Protocol

O tratamento de animais e de procedimentos de medição foram realizados em conformidade com as Universidade do Sul da Flórida Animal cuidados e uso Comité (IACUC) as orientações institucionais (protocolo #0006R). Foram envidados todos os esforços para reduzir o número de animais utilizados.

1. preparações

Nota: O protocolo normalmente requer mouse ou ratos de laboratório criados para testes de EPM. No entanto, outros animais, como os porquinhos da Índia, também foram testados em EPMs13. É importante considerar o contraste de cores entre os animais no labirinto e a cor do labirinto, quando usando o controle de vídeo. O contraste é menos importante para os investigadores, observando os animais ao vivo ou através de vídeo. As configurações do vídeo monitoramento software precisa ser configurado para documentar que os animais são preto ou branco em um labirinto ou preto ou branco. Podem ocorrer problemas com definições de configuração com um labirinto de acrílico transparente, mas um labirinto de cinza fosco pode ser ideal para ambas as cores de roedores.

  1. Selecione os animais para o experimento, considerando o potencial de influenciar fatores, tais como o ciclo do estro, estirpe, sexo e idade, bem como corpo peso2.
  2. Com base na experiência individual, determine o número de animais de cada grupo para o teste.
    Nota: Tamanho do grupo vai depender do tamanho do efeito que se espera com o tratamento de teste. Análises de poder são geralmente feitas antes do experimento é iniciado para determinar o número mínimo de sujeitos a serem incluídos tendo em conta a variabilidade nas respostas do animal em qualquer determinada tarefa, bem como o número de grupos/condições experimentais.
  3. Projetar o experimento (em que uma bateria de testes comportamentais diferentes, tais como o teste de campo aberto, teste EPM, teste da placa de orifício e teste de natação forçada será usada) cuidadosamente.
    Nota: Pré-exposição dos roedores para um ambiente de teste romance (tais como um teste de campo aberto), imediatamente antes dos ensaios EPM pode alterar o comportamento dos animais na EPM1,2.
  4. Lidar com todos os animais em uma maneira similar antes do teste EPM.
    Nota: Foi demonstrado que os fatores estressantes diferentes, aplicação de medicamentos (por exemplo, injeções), estresse transporte e manipulação pode mudar o comportamento e respostas comportamentais de roedores em EPM16. Assim, a habituação dos animais para uma casa animal (por exemplo, após a expedição, por 1-2 semanas antes do teste da EPM), condições experimentais e métodos de tratamento (por exemplo, gavaging) são necessários. Também é importante que a manipulação de roedores e alguma experiência com estressores prévias, particularmente imediatamente antes do teste, é consistente em animais e os grupos de tratamento.
  5. Realização dos estudos comportamentais em animais noturnos, tais como ratos e camundongos, usando um ciclo reverso de luz, para que a avaliação comportamental pode ser realizada quando os animais estão na fase de escuro, ativo.
    Nota: Os efeitos de luz e condições de alojamento diferentes ritmos circadian/ciclo sobre o comportamento e sua influência nos resultados EPM foram demonstradas anteriormente17, desde hormônios dos animais são regulados pelo ciclo da luz.
  6. Use os mesmos experimentadores durante os procedimentos e pedir-lhes para evitar perfume ou sabonetes com um odor forte.
  7. Pergunte os experimentadores para não falar perto do animal durante o experimento ou mover objetos perto do ambiente de EPM.
    Nota: É extremamente importante que o observador faz movimentos mínimos e sem barulho, quando a coleta de dados comportamentais.
  8. Limpe a EPM inteira depois de cada tentativa de apagar quaisquer cheiros de animais anteriores que podem interferir com a exploração pelo teste animal.
  9. (Recomendado) Lidar com os animais por vários dias antes do teste EPM (apanha-lo suavemente pelo tronco e segurando-o por um minuto ou dois) para se aclimatá-los para o experimentador.
  10. Quando colocar os animais a EPM, certifique-se de lidar com todos os animais de uma forma consistente e coloque cada roedor na EPM na mesma posição enfrentando o mesmo braço (por exemplo, no centro, enfrentando o braço aberto longe o experimentador).

2. aplicação de suplementos de cetona exógenos

  1. Medir o peso corporal dos animais antes de iniciar quaisquer tratamentos para determinar o cálculo de dosagem para o tratamento (por exemplo, intragástrico gavage).
  2. Familiarizar os animais para o método de gavage intragástrico (período de adaptação) usando água por gavagem para a 5D antes suplementação cetona (dieta padrão roedores chow/padrão [SD] + água gavagem; por exemplo, 2,5 g/kg de peso corporal de água/dia). Exclui o uso de qualquer animal que não se adaptam ao método intragástrico gavage.
  3. Após o período de adaptação, alimentar os animais cronicamente para 83 d e subchronically para a 7D com SD e gavagem diariamente com qualquer água (por exemplo, peso corporal de 5 g/kg/dia; grupo controle: n = 8), cetona suplementos tais como éster cetona (KE; 1,3 - butanodiol-acetoacetato diéster; por exemplo, peso corporal de 5 g/kg/dia; n = 8), sal de cetona (KS; At+/k+\u2012beta-hydroxybutyrate [βHB] sal mineral; por exemplo, peso corporal de 5 g/kg/dia; n = 8), ou KS + triglicérides de cadeia média (proporção 1:1, KSMCT; n = 8)18,19,20.
    Nota: Os animais que receberam gavage intragástrico foram testados no EPM 1 h após o tratamento. Ratos alimentados com padrão chow roedor e gavaged com água (excluindo a suplementação de cetona) servida como grupos de controle.

3. ansiedade ensaio

  1. Aparelhos EPM
    1. Use o mesmo aparelho através de um estudo para padronizar os resultados. O EPM é um instrumento em forma de adição, que consiste de quatro braços (por exemplo, os braços podem ser 10 cm de largura e 50 cm de comprimento): dois braços opostos são abertos, e os dois fechados em frente de braços estão equipados com paredes de alta (por exemplo, 30 cm). O aparelho é elevado acima do solo (por exemplo, por 55 cm)2.
      Nota: Os parâmetros mais comumente usados são o tempo acumulado passado os braços abertos e o número de entradas nos braços abertos; no entanto, o tempo gasto nos braços fechados e centro, e o número de entradas para o centro e braços fechados é medido, bem como a distância percorrida em cada área.
    2. Acender a EPM usando iluminação indireta (i.e., direto da fonte de luz em direção do tecto em vez de diretamente iluminando o aparato EPM) e certifique-se de todos os quatro braços são similarmente iluminados (sem sombras, ver Figura 2).
      Nota: Alterações do nível de luz de alteram o comportamento dos roedores da EPM. Portanto, iluminação similar é necessária em animais experimentais consecutivos e dias (por exemplo, 2.800 lúmens no quarto)2.
  2. Sistema de monitoramento de vídeo
    Nota: Utilize um sistema com uma interface de computador e uma câmera de vídeo para a coleta de dados, que automaticamente irá recolher dados comportamentais em ratos (de rastreamento de vídeoFigura 3). Para o vídeo segue o sistema, uma grande variedade de câmeras analógicas padrão ou fontes de imagem definida pelo usuário (câmeras de infravermelhas, câmara de vídeo, câmera USB compatível com WIA, webcams,etc.) pode ser usado. Ao analisar o vídeo gravado, o software de rastreamento de movimento suporta todos os formatos comuns de vídeo, como AVI, VOB,. wmv,. ASF,. mov, QT,. mpg,. MPEG,. MP4, 3GP e. mkv. Se o vídeo é que não a reprodução corretamente, ele pode requerer um codec específico; formatos de vídeo adicionais são suportados se o codec correspondente está instalado no sistema. O software de rastreamento de movimento também pode ser usado para analisar vídeos previamente adquiridos e processar as imagens de diferentes fontes, tais como gravadores de DVD/HD, arquivos de vídeo digital (. avi,. DivX,. MPEG,etc.), webcams, câmeras DV, e dispositivos de imagem compatível com WIA.
    1. Configuração do sistema
      1. Conecte a chave de instalação do software de controle de movimento de uma porta USB 2.0 e inicie a ferramenta de instalação.
      2. Consertar a câmera acima da área experimental e certifique-se de que ele vai ficar imóvel para a duração do experimento.
      3. Defina uma nova experiência no sistema de software de rastreamento de movimento usando o manual de instruções. Selecione novo experimento. Clique duas vezes no ícone do protocolo que a nova experiência deveria seguir (Figura 3, arquivo complementar 1).
      4. Anota-se a etiqueta/descrever o experimento na caixa de diálogo Informação de experimentar .
      5. Especifica a fonte das sequências de vídeo para processar.
      6. Defina a regra de transformação para a medição de distâncias corretas. O processo de calibração permite que o software de controle de movimento ser informado das dimensões reais da área experimental a fim de obter valores fiáveis para distâncias e velocidades.
      7. Determine as regiões de interesse (zonas) na área de trabalho.
      8. Ajuste os parâmetros do processo de detecção.
        1. Em ordem para o software de controle de movimento detectar precisamente a posição do animal na imagem, alguns ajustes de deteção devem ser definidos.
        2. O processo de controle requer uma imagem clara e bem contrastada usando um ajuste fino dos parâmetros de contraste e brilho geral na seção de brilho e contraste do painel As definições de detecção . Conforme necessário, ajuste essas configurações para a imagem inteira ou para zonas definidas pelo usuário.
      9. Colocar um rato em cada arena para testar o processo de detecção.
      10. Pressione o botão Iniciar teste para verificar se o processo de detecção pode identificar o assunto corretamente. Confirme que a deteção é ativada pelo aparecimento de um ponto no ecrã. O processo de calibração tem que ser feito antes de iniciar o teste.
      11. Deteção é considerada confirmada quando o ponto somente preto mostrado no player é o animal que está sendo monitorado. O vermelho linha de rastreamento precisa acompanhar de perto as deslocações do animal. Acompanhamento adequado também é confirmado com uma etiqueta branca, listando o número de animais e correspondente coordenadas baseiam no deslocamento. Se tal uma detecção não é obtida, ajuste os parâmetros de limite e erosões para otimizar a deteção e o processo de rastreamento.
      12. Ajuste os parâmetros de limite e erosão para obter uma imagem mais nítida e sem ruído de teste.
      13. Se o caminho de rastreamento é detectado corretamente, pressione o botão de Parar teste (Figura 4). Se estes ajustes vão ser usados para cada novo arquivo experimental, pressione o botão salvar como padrão . Pressione o botão " aceitar " para salvar as novas configurações de deteção.
      14. Defina as condições de tempo dos ensaios.
      15. Se o protocolo experimental requer o processo de aquisição de faixa para começar ao mesmo tempo que o assunto é colocado na área experimental, é possível configurar a unidade remota que vem com o software ou usar um mouse sem fio.
        Nota: Esta opção oferece a possibilidade de controlar remotamente o start e stop.
    2. Instalação de temas no sistema
      1. Gerencie banco de dados da experimentação do assunto. Para criar um banco de dados dos sujeitos experimentais, entre no Gerenciador de Temas de banco de dados premindo o botão de sujeitos no bar do Assistente de experimentação .
      2. Pressione a + o botão para adicionar novos temas para o banco de dados.
      3. Com a opção de um assunto já seleccionada, digite código do sujeito.
      4. Preencha o restante das informações do sujeito na seção Propriedades do assunto .
      5. Pressione o botão criar para adicionar o novo tema.
      6. Defina o plano de experimentação. Usar o Agendador para definir as diferentes fases, sessões, ensaios e assuntos planejavam para ser executado no âmbito do projecto experimental. O julgamento é selecionado automaticamente como "o próximo julgamento" para ser executado. Esta propriedade é mostrada como um carrapato verde no lado esquerdo do nome do julgamento.
    3. Aquisição de dados por gravação simultânea e rastreamento
      Nota: Quando uma fonte de imagem ao vivo é seleccionada, o painel do leitor fornece um módulo de gravação embutido para facilmente capturar o vídeo vindo da câmera selecionada.
      1. Prepare o software de controle de movimento para aquisição de dados (calibração, definição de zona, as definições de detecção, configurações de tempo, scheduler).
      2. Abra o painel de aquisição de dados .
      3. Começa a gravar o vídeo do experimento sem o animal ao pressionar o botão Iniciar gravação disponível no software.
      4. Coloque o animal na área experimental.
      5. Inicie o processo de aquisição de dados premindo o botão Iniciar no painel de controle de tempo . O processo de rastreamento realizarão simultânea com o processo de gravação. Conforme a necessidade, pedir o experimentador de anotar as variáveis comportamentais manualmente, tais como fundos, cabeça mergulhos e quedas (Figura 5).
      6. Coletar os dados EPM manualmente, bem como por um observador cego (separado o observador da EPM por uma cortina) na sala de testes.
      7. Esperar até o final da gravação processo de rastreamento ou pressione a tecla Stop do painel de controle de tempo .
      8. Remova o animal da área experimental. Interrompa o processo de gravação de vídeo, pressionando o botão parar disponível sobre o jogador do software de controle de movimento.
      9. Prepare a área experimental para o próximo animal lavando e secando. Repeti o ciclo novamente.
    4. Análise de dados
      1. Para acessar a ferramenta de análise , pressione o botão de análise na barra Assistente de experimentação .
      2. Para gerar relatórios de análise dos ensaios terminados, selecione os ensaios para analisar. Configurar e selecione o relatório de análise. Defina os intervalos de tempo a ser analisado. Gerar e analisar os relatórios. Exporte os resultados para uma planilha ou imagem formatos (Figura 6).
  3. EPM para a medição dos níveis de ansiedade
    1. Realizar os experimentos EPM sob condições de nonstress (numa sala palidamente iluminada e silenciosa) após intubação oral.
      Nota: Certifique-se de que os experimentos são executados em um intervalo de tempo próximo (por exemplo, entre 1200 e 1400) porque o ritmo circadiano pode influenciar o comportamento dos roedores na EPM15,17. Evite movimentos desnecessários e ruído durante o experimento.
    2. Antes do início do teste, certifique-se que a EPM é limpos e secos e o sistema de rastreamento de vídeo está pronto para usar.
    3. Transferi os ratos em sua gaiola em casa para a sala experimental 30 min antes de começar o experimento.
    4. Coloque um rato no cruzamento dos quatro braços da EPM, enfrentando o braço aberto em frente do experimentador.
    5. Executar o software de monitoramento de vídeo, bem como registrar manualmente o comportamento do animal, por 5 min.
    6. Se o animal cair da EPM, buscá-lo e colocá-lo de volta no mesmo ponto de onde caiu o EPM. Exclua os dados comportamentais deste animal a análise.
      Nota: Um barulho ou movimento pode imobilizar/congelar animais de braços abertos. Se um barulho é ouvido durante o experimento, exclua os dados comportamentais do animal submetidos a experiência naquele momento da análise.
    7. No final do teste de 5 min, pare o vídeo software de rastreamento e retire o animal da EPM. Coloque-a volta para sua gaiola em casa.
    8. Antes do próximo experimento/animal, limpe a EPM com um detergente desinfectante (por exemplo, Quatricide), seguida por água da torneira. Seca o aparelho com toalhas de papel.

4. as análises dos dados coletados pelo sistema de vídeo

  1. Com base em dados registados, analisar a quantidade de tempo gasto nos braços abertos e braços fechados; o número de inscrições feitas com os braços abertos, fechados, braços e para a zona centro; a latência de entrada para os braços fechados; a distância percorrida nos braços abertos, fechados, braços e na zona centro.
    Nota: O animal é considerado uma área quando o centro de massa do corpo é nessa área.
  2. Determine os efeitos dos tratamentos sobre o comportamento por meio de análise de variância (ANOVA) com diferença de menos significativa do Fisher (LSD) teste de comparações múltiplas de Tukey/teste.

Representative Results

A experiência atual investiga a hipótese de que a suplementação exógena de cetona ou administrado cronicamente (alimentado por 83 dias) ou subchronically (gavaged por via oral durante 7 dias) tem efeito ansiolítico em dois meses (de ratos machos Sprague-Dawley (SPD) 250-350 g). Administração crônica consistia dos seguintes suplementos cetona: éster de baixa dose cetona (Ike; 1,3-butanodiol-acetoacetato diéster, ~ 10 g/kg/dia, Ike), éster de cetona do elevado-dose (HKE; ~ 25 g/kg/dia, HKE), sal mineral-beta-hidroxibutirato (bHB-S; ~ 25 g / kg/dia, KS) e triglicerídeos de cadeia bHB-S + médio (MCT; ~ 25 g/kg/dia, KSMCT). Para subcrónica experimentos, foram utilizados os seguintes grupos de tratamento: KE, KS e KSMCT (5 g/kg/dia). Os grupos de controle incluíam SD ou SD com gavagem de água (controle). Todos os dados foram representados como a média ± erro padrão da média (SEM). Os resultados foram considerados significativos quando p < 0,05. O significado foi determinado pelo ANOVA One-Way com teste de LSD de Fisher.

Após a alimentação crônica, ratos no grupo KSMCT passaram significativamente mais tempo nos braços abertos (p = 0.0094) comparado ao grupo controle. O tempo gasto nos braços fechados foi significativamente menor nos grupos de Ike, KS e KSMCT (p = 0.0389, 0.0077 e 0.0019, respectivamente), enquanto o grupo KS passou significativamente mais tempo no centro (p = 0.0239) em comparação com o (grupo de controle (SD) Figura 7A) 18.

Ratos no KS e KSMCT grupos viajaram significativamente mais longas nos braços abertos (p = 0.036 e 0.0165), enquanto os ratos nos grupos de Ike, KS e KSMCT mostraram significativamente menos distância percorrida nos braços fechados (p = 0.0252, 0.00041, e 0,0032, respectivamente), em comparação ao grupo controle (SD) (Figura 7B). Quando comparado ao grupo controle, os grupos de KS e KSMCT tiveram maior distância percorrida na área central (p = 0.0206 e 0.0482, respectivamente), enquanto no grupo KSMCT, a latência para a primeira entrada para os braços fechados foi significativamente maior após alimentação crônica (p = 0.0038)18 (Figura 7).

O tempo gasto nos braços abertos foi maior no grupo KE (p = 0.0281) após 7 dias de gavagem oral, enquanto nos grupos KE, KS e KSMCT, o tempo gasto no centro diminuído (p = 0,0005, < 0,0001 e = 0,023, respectivamente), em comparação com o contro l grupo (Figura 8A)18. O KE e KS grupos, o número de entradas para os braços fechados foi significativamente menor (p = 0.0436 e 0.0234, respectivamente) após 7 dias de administração (Figura 8B), enquanto os ratos em KS o grupo também entrou o centro menos frequentemente (p = 0.0193), comparado ao grupo controle (SD).

Figure 1
Figura 1: elevados além de labirinto (EPM), usado para testes ratos. Cada braço é 10 cm de largura e 50 cm de comprimento, com dois braços opostos abriu com uma borda elevada. Os dois fechados em frente de braços estão equipados com paredes de 30 cm de altura. A altura da pista do chão é 55 cm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: exemplos de direta e iluminação indireta. Garantir que a fonte de luz é apontada para o teto, enquanto a luz direta acima da área experimental é bloqueada. É importante usar luz indireta durante experimentos EPM para iluminar da mesma forma todos os quatro braços sem sombras. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: barra de assistente de experimentação do rastreamento de movimento software. Ele é projetado para fornecer acesso para as principais operações. Os botões correspondem a tarefa dentro do processo de experimentação típica, enquanto apenas as tarefas atualmente permitidas estão ativas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: A faixa de assunto é marcada com uma linha vermelha, seguindo o movimento do animal. Ajustando o limite, o fundo pode ser diminuído até que só o animal é detectado e controlado pela linha vermelha. A trilha segue o centro da massa do objecto, e as coordenadas de posição atual são indicadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: elevados além de labirinto (EPM) com um rato Sprague Dawley (SPD) no braço aberto Um exemplo da montagem experimental é demonstrado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: faixa de movimento acumulado do animal durante um julgamento. Como parte da análise dos dados, o rastreamento de trajetória coletados do assunto na área de rastreamento pode ser exibido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: respostas comportamentais de ratos SPD da EPM após 83 dias de alimentação crônica de suplementação exógena cetona. Estes painéis mostram resultados representativos recolhidos pela EPM e o sistema de rastreamento de movimento18. (A), o grupo KSMCT passou uma maior percentagem de tempo nos braços abertos, enquanto o Ike, KS, e grupos KSMCT gasto menos tempo nos braços fechados, comparado ao grupo controle (SD). (B) o KS e KSMCT grupos viajaram mais longe nos braços abertos, enquanto o Ike, KS, e grupos KSMCT viajaram menos distância nos braços fechados, mostrando reduzido em comparação com o controle de ansiedade grupo (SD). (C), o KSMCT grupo entrou os braços fechados depois, indicando a ansiedade reduzida em comparação com o controle de grupo (SD). Abreviaturas: SD = comida roedor padrão + água (25 g/kg de peso corporal (peso corporal) de água/dia); Ike = SD + Ike (1,3-butanodiol-acetoacetato diéster, b.w./day de 10 g/kg); HKE = SD + HKE (b.w./day de 25 g/kg); KS = SD + sal mineral-beta-hidroxibutirato (bHB-S b.w./day de 25 g/kg); KSMCT = SD + triglicéridos de cadeia bHB-S + médio (MCT; b.w./day de 25 g/kg); SPD = ratos Sprague-Dawley; EPM = elevados além de labirinto (* p < 0,05; * * p < 0,01; * * * p < 0,001; * * * p < 0,0001). Esta figura foi modificada de Ari et al. 18. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: respostas comportamentais dos ratos SPD após 7 dias de gavagem oral de suplementação exógena cetona. Resultados representativos foram coletados por meio da EPM teste, usando um software de controle de movimento sistema18. (A), o grupo KE passou uma maior percentagem de tempo nos braços abertos, enquanto o KE, KS, e grupos KSMCT gasto menos tempo no centro (comparado ao grupo controle [SD]), indicando, assim, reduzir a ansiedade. (B) comparado com o controle de grupo (SD), menos as entradas foram detectadas nos braços fechados de ratos nos grupos KE e KS. Abreviaturas: SD = comida roedor padrão + água (5 g/kg de peso corporal de água/dia); KE = SD + cetona éster (1,3-butanodiol-acetoacetato diéster, b.w./day de 5 g/kg); KS = SD + sal mineral-beta-hidroxibutirato (bHB-S, b.w./day de 5 g/kg); KSMCT = bHB-S + SD + MCT (b.w./day de 5 g/kg); SPD = ratos Sprague-Dawley; EPM = elevados além de labirinto (* p < 0,05; * * * p < 0,001; * * * p < 0,0001). Esta figura foi modificada de Ari et al. 18. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Em geral, vários usados testes, tais como o teste de escolha de claro-escuro, o teste de interação social e o teste EPM, são usados para medir o nível de ansiedade em diferentes modelos animais. No entanto, o ensaio EPM sozinho é um método adequado para investigar, por exemplo, o efeito da cetona exógena suplementos dos roedores os níveis de ansiedade18,20.

A principal vantagem do método EPM é que baseia-se na tendência instintiva dos roedores para espaços escuros, fechados, além o incondicionada medo das alturas e evitação de espaços abertos. Por outro lado, outros métodos utilizados para estudar o comportamento de ansiedade são baseados sobre as respostas comportamentais para certos estímulos nocivos, tais como choques elétricos, privação de comida/água, ruídos e exposição ao predador odor3. Estes testes geralmente resultam em uma resposta condicionada, enquanto o EPM também representa uma alternativa mais humana. Além disso, o EPM pode ser uma ferramenta útil para estudar o envolvimento de regiões cerebrais diferentes (por exemplo, regiões do sistema límbicas, hipocampo) e os mecanismos subjacentes (por exemplo, GABA, glutamato, serotonina, adenosina) de ansiedade comportamento2.

Quando a aplicação de tratamentos que são bastante stressantes para os animais (por exemplo, a gavagem oral), é importante que todos os animais são tratados da mesma maneira e pela mesma pessoa, especialmente quando avaliar efeitos sutis, potencial ansiolítico. Se possível, a introdução do medicamento/composto na água potável ou através de um saboroso 'tratar' pode ser um método preferido. Para garantir que a mesma quantidade é administrada a cada animal, uma gavagem oral pode ser usada. Baseada nas propriedades farmacocinéticas do composto, é geralmente aconselhável testar os animais sobre a EPM dentro de 1 hora após a gavaging. Ao selecionar sujeitos experimentais, é importante considerar a sua estirpe, sexo, ciclo do estro e idade, bem como o peso corporal, de acordo com os objectivos e testar substâncias2. Por causa da idade, quando projetar estudos EPM e interpretação dos dados, é importante considerar que a percentagem de entradas de braço aberto aumenta linearmente com a idade de21 e as alterações relacionadas ao envelhecimento em comportamento EPM são específicas de estirpe22.

Quando realizar um teste EPM, existem problemas potenciais que precisam ser abordadas. Às vezes os animais devam ser excluídos da análise devido a tendências outlier (por exemplo, o animal nunca sai da área onde foi colocado, quase cai do aparelho, é distraído por um barulho ou evento fora do aparelho). Outras complicações com EPM testes podem incluir tratamentos que causam sedação ou hiperatividade, porque estes tipos de efeitos precisam ser avaliados através de parâmetros EPM.

É importante expor os animais para o teste EPM apenas uma vez porque a diminuição da atividade sobre os braços abertos e uma diminuição do tempo total gasto na plataforma central foram demonstradas na segunda exposição (repetida) de roedores em comparação com a primeira exposição sobre a EPM 14,15. Portanto, uma única exposição de roedores para o teste EPM é altamente recomendável. No entanto, se há um mínimo de três semanas entre a primeira e o segunda a exposição para a EPM e a afinação EPM é movida para outro quarto (ambiente diferente), os animais podem ser investigados pela EPM teste mais de uma vez2.

A EPM está disponível em diferentes materiais, tamanhos (por exemplo, para o mouse ou rato), e cores, que precisa ser considerado ao escolher estudar matérias. É importante ter em mente que os odores deixados pelo animal anterior sobre o aparelho podem alterar o comportamento do animal subsequente. Portanto, recomendamos usar um EPM feito de um material que seja fácil de limpar, tais como vidro acrílico (não transparente), que não retém odores após a lavagem. Evite aparelhos EPM, feitos de madeira. De preferência, use uma cor fosca que é diferente da cor dos animais testados sobre a EPM (por exemplo, preto se animais brancos são testados). Quanto melhor o contraste entre o animal e o recinto, o melhor a detecção do animal e quanto maior a confiabilidade e precisão dos resultados Obtém (distância percorrida, velocidade, controle). Aparelhos EPM, feitos de material cinza fosco são úteis com animais brancos, pretos e brancos e pretos.

Uma vantagem adicional do sistema de vídeo monitoramento é que além da EPM, oferece uma maneira flexível e fácil de configurá-lo com uma grande variedade de testes comportamentais, tais como o labirinto de água, campo aberto, plus/radial braço/T-Y labirintos, preferência de lugar, forçada a natação e testes de suspensão da cauda.

Em resumo, o objetivo deste artigo é descrever o teste EPM utilizado em combinação com um software de monitoramento de vídeo para coletar e analisar as alterações comportamentais em resposta aos tratamentos de romance ansiolítico. As possíveis aplicações da EPM incluem o prescreening do recém-desenvolvido agentes farmacológicos para o tratamento de distúrbios relacionados à ansiedade. Além dos agentes ansiolíticos e anxiogenic, o efeito comportamental de diferentes hormônios e drogas de abuso podem também ser investigadas. A influência do envelhecimento e a exposição a estressores diversos também pode ser avaliada. Este estudo concluiu que quando são tomadas medidas adequadas, o uso da EPM tem provado para ser um método sensível para avaliar alterações comportamentais associadas a cetona suplementação18,20.

Disclosures

D'Agostino, D.P., Kesl, S., Arnold, p. composições e métodos para produzir elevado e sustentado de cetose. # Patente internacional PCT/US2014/031237. Universidade do Sul da Flórida.

Ari, C., D'Agostino, D.P., cetona exógena suplementos para reduzir comportamento relacionados à ansiedade. Provisório patente #62289749. Universidade do Sul da Flórida.

Dominic P. D'Agostino e Csilla Ari são co-proprietários da empresa cetona Technologies LLC.

Estes interesses foram revistos e gerenciados pela Universidade em conformidade com suas políticas institucionais e individuais sobre conflito de interesses. Todos os autores declaram que não há nenhum adicionais de conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este trabalho foi suportado por uma ONR Grant N000141310062 e um GLUT1D Foundation Grant #6143113500 (para Dominic P. D'Agostino), a agência de desenvolvimento nacional da Hungria (sob Grant no. TIOP-1.3.1.-07/2-2F-2009-2008; para Zsolt Kovács) e pelo departamento de veteranos assuntos (para marcar Kindy). Os autores desejam agradecer a Quest nutrição LLC para apoio à investigação em curso sobre este tema (a Csilla Ari).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elevated Plus Maze for mice and rats Coulbourn Instruments H10-35-EPM
SMART Video Tracking Software Harvard Apparatus SMART 3.0

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