Forhøyet pluss labyrint Test kombinert med Video sporingsprogrammer undersøke angstdempende effekten av eksogene ketogen kosttilskudd

Behavior
 

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å undersøke endringer i angst nivået av gnager dyremodeller. Den forhøyede pluss labyrinten (EPM) test, sammen med en video sporing, gir en pålitelig metode for å dokumentere effekten av ulike potensielle angstdempende behandlinger i preklinisk laboratorium scenarier.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ari, C., D’Agostino, D. P., Diamond, D. M., Kindy, M., Park, C., Kovács, Z. Elevated Plus Maze Test Combined with Video Tracking Software to Investigate the Anxiolytic Effect of Exogenous Ketogenic Supplements. J. Vis. Exp. (143), e58396, doi:10.3791/58396 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Det overordnede målet med denne studien er å beskrive metodikk forhøyet pluss labyrinten (EPM) test i kombinasjon med en video sporingsprogrammer. Formålet med metoden er å dokumentere effekten av ulike potensielle angstdempende behandlinger på laboratoriet gnagere modeller. EPM testen er basert på gnagere proclivity mot beskyttet, lukkede mørke rom og unconditioned frykt for åpne plasser og høyder, og medfødte intens motivasjon å utforske romanen miljøer. EPM testen er en mye brukt atferdsmessige test for å undersøke angstdempende eller anxiogenic svarene på gnagere gitt legemidler som er kjent for å påvirke atferden. Observasjon demonstrere en redusert andelen av tidsbruk på lukket armer, en økt andelen av tidsbruk på åpne armer, et redusert antall oppføringer lukket armer og en forhøyet antall oppføringer å åpne armer målt ved EPM testen kan gjenspeile redusert angst nivåer. Bruker denne metoden, er effekten av eksogene keton kosttilskudd på angst-relaterte atferd testet i Sprague Dawley (SPD) rotter. Eksogene keton kosttilskudd er kronisk lei for rottene 83 dager eller subchronically og akutt muntlig gavaged, daglig for 7 dager, før gjennomfører EPM test. Atferdsdata samling utføres med SMART video system for sporing av en blendet observatør på slutten av behandlingene. De viktigste funnene viser at EPM testen er en effektiv metode for å oppdage keton supplement-indusert angstdempende effekten og kan anses som sensitive mål å vurdere endringer i angst oppførsel som er assosiert med narkotika - eller metabolske-baserte terapier.

Introduction

Målet med denne artikkelen er å beskrive metodikk EPM testen i kombinasjon med en video sporing for å overvåke endringer i angst-relaterte atferd og romanen behandlinger i laboratoriet gnager modeller. EPM testen er en relativt enkel behavioral assessment, som ble utviklet for undersøkelse av kvantifisere angst atferd nivåer og angst svar av rotter etter narkotika behandlinger1. Faktisk har det vært vist at EPM testen er en mye brukt og effektiv opptreden analysen for etterforskningen av endringer i angst nivåer av gnagere1,2. Anvendelse av EPM testen i Red (hovedsakelig rotter og mus) er basert på deres proclivity mot innesluttet, mørke områder (tilnærming), en unconditioned frykt for åpne plasser/høyder (unngå) og sin høye nivå av medfødte motivasjon til å utforske roman miljøer. Derfor er EPM testen en etablert metode basert på en tilnærming-unngå konflikt2,3.

EPM er en pluss-formet apparater som består av fire hevede armer, som har blitt beskrevet av Handley og Mithani4 (figur 1), og består av to motsatte armer som er åpne til omgivelsene (åpne armer), mens de to lukket motsatt armer (lukket armer) er utstyrt med vegger. Etter behandling, hvis økt tid på de åpne armene og/eller et økt antall åpne arm poster sammenlignet med kontrollsigaretter (ubehandlet) dyr oppdages på EPM, angir en angstdempende effekt2,3. Mest robuste unngåelse svaret har vist i den første 5 min etter starten (plassering av rottene i skjæringspunktet mellom fire armer EPM) av EPM analysen5; Derfor er alle opptreden etter en behandling vanligvis registrert for 5 min til EPM. Som ytterligere tiltak for en angst nivået, antall hodet dips, steiler (loddrett stående av gnager på to bakben ben), fecal boli, samt totale arm kan oppføringer (spontan motor aktivitet) og ulike stillinger (strekker eller frysing), også registreres på EPM2. Dermed kan flere atferdsmessige parametere kompileres for å gi en omfattende vurdering av angst-relaterte atferd.

For å øke gyldigheten av resultatene, to til tre atferdsmessige analyser brukes ofte sammen, for eksempel lys og mørke valg testen, sosial interaksjon testen, og EPM testen, for å måle angst nivåene av forskjellige dyr modeller6. EPM analysen utføres alene på gnagere er også en egnet metode for å undersøke angstdempende eller anxiogenic effekten av ulike medikamenter7. EPM testen er følsom ikke bare for benzodiazepin-type anxiolytics (f.eks, diazepam)8, men også blant annet til amino acid, monoamin, peptidergic og nucleosidergic forbindelser (f.eks, N-methyl-D-aspartate (NMDA) antagonist AP7, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syre (AMPA) antagonist CNQX, μ-opioid reseptor Agonistiske morfin, NPY1 antagonist BIBP3226, substans P, ghrelin, oxytocin, serotonin reseptor agonister og antagonister som 8-OH-DPAT og Way-100635 og β1-adrenerge antagonist betaxolol)9,10,11,12. Derfor EPM analysen på gnagere er egnet og følsom metode å undersøke påvirkning av ulike behandlinger som påvirker hjernen områder i angstdempende effekten (f.eks, amygdala, hippocampus og limbiske områder) og virkningsmekanismer (f.eks, serotonergic, GABAergic og adenosinergic systemet) innblandet i angst2. Agentene testet i disse EPM-studier omfatter eksogene keton kosttilskudd som endrer hjernen signalering i subtile måter som krever en følsom metode å oppdage atferdsendringer.

I denne artikkelen beskrive vi EPM testen brukes i kombinasjon med en video sporing, som bidrar til å eliminere eksperimentelle bias og forenkler innsamling og analyse av atferdsmessige endringer svar på romanen angstdempende behandlinger.

Protocol

Dyr behandling og måle prosedyrer ble utført i henhold til University of South Florida institusjonelle dyr omsorg og bruk Committee (IACUC) veiledning (Protocol #0006R). Alle forsøk ble gjort for å redusere antall dyr som brukes.

1. forberedelser

Merk: Protokollen krever vanligvis laboratorium-bred rotter eller musen for testing av EPM. Men har andre dyr som marsvin, også blitt testet på EPMs13. Det er viktig å vurdere fargekontrast mellom dyrene i labyrinten og labyrinten farge når du bruker video sporing. Kontrasten er mindre viktig for forskerne å se dyr live eller via video. Innstillingene for videoen sporing programvare må konfigureres slik at dyrene er svart eller hvit på enten svart eller hvit labyrint. Problemer med konfigurasjonsinnstillingene kan oppstå med en klar akryl labyrint, men en Matt grå labyrint kan være optimal for både gnager farger.

  1. Velg dyr for eksperimentet, vurderer potensialet påvirke faktorer, slik som belastning, sex, estrus syklus, og alder, samt kroppen vekt2.
  2. Basert på personlige eksperimentet, bestemme antall dyr per gruppe for testen.
    Merk: Gruppestørrelsen vil være avhengig av effekten størrelsen som forventes med test behandling. Makt analyser utføres vanligvis før forsøket er startet for å bestemme minimum antall emner inkluderes gitt variasjon i dyr svar i oppstartskostnad, samt antall eksperimentelle grupper/forhold.
  3. Utforme eksperimentet (der et batteri av ulike atferdsmessige tester, som åpen-feltet testen, EPM test, hull-styret test og tvunget svømmende test vil bli brukt) nøye.
    Merk: Før eksponering for gnagere et romanen testmiljø (for eksempel en åpne-feltet test) umiddelbart før EPM testene kan endre oppførselen til dyrene på EPM1,2.
  4. Håndtere alle dyr på en lignende måte før EPM testen.
    Merk: Har det vært vist at ulike stress faktorer, anvendelse av legemidler (f.eks, injeksjoner), frakt stress og håndtering kan endre virkemåten og atferdsmessige responser av gnagere på EPM16. Dermed habituering av dyrene en dyr huset (f.eksetter levering, 1-2 uker før EPM testen), eksperimentelle forhold og behandling prosedyrer (f.eks, gavaging) er nødvendig. Det er også viktig at håndtering av gnagere og erfaring med tidligere stressorer, spesielt umiddelbart før testing, er konsekvent på tvers av dyr og behandlingsgrupper.
  5. Utføre den atferdsmessige studier i nattaktive dyr, som rotter og mus, med en omvendt lys syklus, slik at atferdsdata vurderingen kan utføres når dyrene i deres mørke, aktiv fase.
    Merk: Effekten av ulike boforhold og lyset syklus/circadian rytmer på atferd og deres innflytelse på EPM resultater ble vist tidligere17, siden dyr hormoner er regulert av lys syklusen.
  6. Bruk de samme forskere under prosedyrene og be dem om å unngå parfyme eller såper med en sterk lukt.
  7. Spør forskere ikke å snakke nær dyret under eksperimentet eller flytter objekter i EPM-miljø.
    Merk: Det er kritisk viktig at observatøren gjør minimale bevegelser og ingen støy når atferdsdata.
  8. Rengjør hele EPM etter hvert forsøk å slette alle lukter av tidligere dyr som kan forstyrre utforskningen av testen dyret.
  9. (Anbefales) Håndtere dyrene i flere dager før EPM testen (plukker den opp forsiktig av torso og holder den i et minutt eller to) å acclimate seg å eksperimentator.
  10. Når du plasserer dyrene på EPM, sørg for å håndtere alle dyr på en konsekvent måte og plassere hver gnager i EPM i samme posisjon mot samme armen (f.eksi sentrum mot åpne armen fra eksperimentator).

2. Bruk av eksogene keton kosttilskudd

  1. Måle kroppsvekten av dyrene før du starter noen behandlinger for å fastslå dosering beregningen for behandling (f.eks, intragastric gavage).
  2. Kjent dyrene for metoden intragastric gavage (tilpasning periode) bruker vann av gavage for 5 d før keton tilskudd (standard gnager chow/standard diett [SD] + vann gavage; f.eks2.5 g/kg kroppsvekt vann/Day). Utelukk bruk av noen dyr som ikke kobles til metoden intragastric gavage.
  3. Etter tilpasning perioden, mate dyrene kronisk for 83 d og subchronically for 7 d med SD og gavage daglig med enten vann (f.eks, 5 g/kg kroppen vekt/dag; kontrollgruppe: n = 8), keton kosttilskudd som keton ester (KE; 1,3 - butandiol-acetoacetate diester; eksempel5 g/kg kroppen vekt/dag; n = 8), keton salt (KS; Na+/K+\u2012beta-hydroxybutyrate [βHB] mineral-salt; eksempel5 g/kg kroppen vekt/dag; n = 8), eller KS + medium chain triglyserider (1:1 ratio, KSMCT; n = 8)18,19,20.
    Merk: Dyrene har mottatt intragastric gavage ble testet på EPM 1 h etter behandling. Rotter fôret med standard gnager chow og gavaged med vann (unntatt keton tilskudd) som kontroll grupper.

3. angst analysen

  1. EPM apparater
    1. Bruk samme apparatet over en studie for å standardisere resultater. EPM er en pluss-formet apparater, som består av fire våpen (f.eksarmene kan være 10 cm bred og 50 cm lang): to motsatte armer er åpnet, og de to lukket overfor armer er utstyrt med høy (f.eks, 30 cm) vegger. Apparatet er hevet over gulvet (f.ekspå 55 cm)2.
      Merk: De vanligste parameterne er akkumulert tidsbruk i de åpne armene og antall oppføringer i åpne armer; men tiden tilbrakte i lukket armer og og antall oppføringer i lukket armer og center er målt, og avstanden reist i hvert område.
    2. Lyse opp EPM ved hjelp av indirekte belysning (dvs., direkte lys kilde mot taket i stedet for direkte belysning EPM apparatet) og sikre alle fire armer er tilsvarende opplyst (uten skygger, se figur 2).
      Merk: Endringer i nivået av lys endre atferden til gnagere på EPM. Derfor er ligner belysning nødvendig i påfølgende forsøksdyr og dager (f.eks, 2800 lumen i rommet)2.
  2. Video sporingssystem
    Merk: Bruk en video sporingssystem med en datamaskin-grensesnitt og et videokamera for datainnsamlingen, som samler automatisk atferdsdata i rotter (Figur 3). For video sporing system, en rekke standard analoge kameraer eller brukerdefinert image kilder (infrarøde kameraer, videokamera, WIA-kompatible USB-kamera, webcams,etc.) kan brukes. Når du analyserer den innspilte videoen, støtter bevegelse sporing programvaren alle vanlige videoformater som AVI, .vob, WMV, ASF, MOV, QT, MPG, MPEG, .mp4, .3gp og mkv. Hvis videoen ikke ikke avspilling riktig, kan det kreve en spesifikk koden; flere videoformater støttes hvis tilsvarende kodeken er installert i systemet. Bevegelse-sporing programvare kan også brukes til å analysere tidligere anskaffet videoer og behandle bildene fra forskjellige kilder, for eksempel DVD/HD-opptakere, digitale videofiler (AVI, .divx, MPEG,etc.), webkameraer, DV-kameraer, og WIA-kompatible bildeenheter.
    1. Systemoppsett
      1. Koble installasjonen nøkkel bevegelsen-sporing programvare til en USB 2.0-port, og start installasjonsverktøyet.
      2. Fastsette kameraet over eksperimentell området og sikre at det vil bli immobile for varigheten av eksperimentet.
      3. Definere et nytt eksperiment i bevegelse-sporing programvaresystemet ved hjelp av bruksanvisningen. Velg nytt eksperiment. Dobbeltklikk på ikonet for protokollen at den nye eksperimentet bør følge (Figur 3 supplerende fil 1).
      4. Angi detaljer etikett/beskrive eksperimentet i dialogboksen Eksperimentere Info .
      5. Angi datakilden videosekvenser behandle.
      6. Definere transformasjon regelen for en riktig avstand måling. Kalibreringsprosessen gjør bevegelse sporing programvare informeres om den faktiske størrelsen på eksperimentell området for å få pålitelige verdier for avstander og hastigheter.
      7. Bestemme regionene rundt (soner) i arbeidsområdet.
      8. Justere parameterne i søkeprosessen.
        1. For bevegelse-sporing programvare nøyaktig oppdage plasseringen av dyret i bildet, må justeringer gjenkjenning angis.
        2. Det oppsporer forarbeide krever et klart og godt kontrast bilde med en finjustering av generelle lysstyrken og kontrasten parametere i delen lysstyrke og kontrast i Innstillinger for duplikatregistrering -panelet. Nødvendig justere disse innstillingene for hele bildet eller brukerdefinert soner.
      9. Sette en rotte i hver arena å teste søkeprosessen.
      10. Trykk Start Test for å bekrefte hvis søkeprosessen kan identifisere emnet riktig. Bekrefte registreringen er aktivert av utseendet på en prikk på skjermen. Kalibreringsprosessen må gjøres før du starter testen.
      11. Gjenkjenning anses bekreftet når den bare svarte prikken i spilleren er dyret spores. Den røde sporing linje må følge nøye alle dyr forskyvninger. Riktig sporing er også bekreftet med en hvit etikett liste hvor dyr og tilsvarende koordinatene basert på forskyvning. Hvis slik en oppdagelsen ikke er oppnådd, justere parameterne terskelen og erosjoner for optimalisering deteksjon og sporing av prosessen.
      12. Justere terskelen og erosjon parametere for å få et skarpere og støyfri testavbildningen.
      13. Hvis sporing banen oppdages riktig, trykker du på Stopp Test -knappen (Figur 4). Hvis disse justeringene skal brukes for hver nye eksperimentelle filen, trykker du knappen som standard . Trykk på godta -knappen for å lagre de nye innstillingene for gjenkjenning.
      14. Angi tid forholdene i forsøkene.
      15. Hvis eksperimentelle protokollen krever spor oppkjøpet å starte samtidig emnet plasseres i eksperimentell området, er det mulig å konfigurere den eksterne enheten som følger med programvaren eller bruke en trådløs mus.
        Merk: Dette alternativet gir mulighet for eksternt styre start og stopp.
    2. Oppsett av fagene i systemet
      1. Administrere eksperimentering emnet databasen. For å opprette en database med eksperimentelle fag, angi Fag Database manager ved å trykke knappen emner i baren Eksperimentering hjelperen .
      2. Trykk + for å legge til nye emner i databasen.
      3. Med alternativet ett emne allerede er valgt, kan du angi emnet kode.
      4. Fylle resten av emnet informasjon under Emnet egenskaper .
      5. Trykk på Opprett -knappen for å legge til den nye gjenstand.
      6. Definere eksperimentering planen. Bruk Oppgaveplanlegging til å definere de ulike fasene, økter, prøvelser og fag planlagt å utføres i eksperimentelle prosjektet. Rettssaken velges automatisk som "den neste trial" skal utføres. Denne egenskapen vises som en grønn sjekke på venstre side av rettssaken navnet.
    3. Datainnsamling av samtidig opptak og sporing
      Merk: Når det velges en levende bilde kilde, spilleren panelet gir en innebygd opptak modul for lett videoinnspilling kommer fra valgte kameraet.
      1. Klargjør bevegelse sporing programvare for datainnsamling (kalibrering, sone definisjon, innstillinger for duplikatregistrering, tidsinnstillinger, planlegger).
      2. Åpne datainnsamling panelet.
      3. Starte innspillingen video av eksperimentet uten dyr ved å trykke knappen starte innspillingen tilgjengelig i programvaren.
      4. Plassere dyret i eksperimentell området.
      5. Start data oppkjøpet prosessen ved å trykke Start -knappen på tid kontrollpanelet. Det oppsporer forarbeide utføres samtidig i innspillingsprosessen. Etter behov, spør eksperimentator å notere atferdsmessige variablene manuelt, for eksempel steiler, lede dips, og faller (figur 5).
      6. Samle EPM data manuelt i tillegg av en blendet observatør (separate observatøren fra EPM med en gardin) i testing rom.
      7. Vente til slutten av oppsporer forarbeide opptak, eller trykk Stopp tid kontrollpanelet.
      8. Fjerne dyret fra experimental området. Stopp video-opptak prosessen ved å trykke på Stopp -knappen tilgjengelig på bevegelse-sporing programvare spilleren.
      9. Forberede eksperimentelle området ved vasking og tørking det neste dyret. Gjenta syklusen igjen.
    4. Dataanalyse
      1. For å adgang analyseverktøyet , trykk på analyse i baren Eksperimentering hjelperen .
      2. Vil generere analyserapporter av ferdig, Velg forsøkene å analysere. Konfigurer og velg analyserapporten. Angi tidsintervallet som skal analyseres. Generere og vise rapporter. Eksportere resultatene til et regneark eller bilde formater (figur 6).
  3. EPM for måling av angst nivåer
    1. Utføre EPM forsøkene under nonstress forhold (i en svakt opplyst og stille rom) etter muntlig gavage.
      Merk: Kontroller at eksperimentene kjøres i et tett tidsintervall (f.eksmellom 1200 og 1400) fordi døgnrytmen kan påvirke gnagere oppførsel på EPM15,17. Unngå unødvendige bevegelser og støy under eksperimentet.
    2. Før starten av testen, kontroller at EPM er rengjort og tørket og videoen sporingssystem er klar til bruk.
    3. Overføre rottene i deres hjem bur til eksperimentelle rommet 30 min før begynnelsen eksperimentet.
    4. Plass en rotte i skjæringspunktet mellom fire armer EPM, mot åpne arm overfor eksperimentator.
    5. Kjøre videoen sporing, samt manuelt registrere virkemåten til dyret, i 5 min.
    6. Hvis dyret faller av EPM, plukke den opp og legge den tilbake på det samme punktet EPM hvor det falt av. Utelukke atferdsdata av dette dyret fra analysen.
      Merk: En høy lyd eller bevegelse kan immobilize/Frys dyr på åpne armer. Hvis en høy lyd høres under eksperimentet, utelukke atferdsdata av dyret under eksperimentet i det øyeblikket fra analyse.
    7. På slutten av 5 min test, stoppe videoen sporing og fjerne dyret fra EPM. Legg den tilbake i buret sitt hjem.
    8. Før den neste eksperiment/dyr, rengjør du EPM med desinfiserende vaskemiddel (f.eksQuatricide) etterfulgt av vann fra springen. Tørr apparatet med papirhåndklær.

4. Analyser data samlet inn av videoen sporingssystem

  1. Basert på de innspilte dataene, analysere tiden tilbrakte i de åpne armene og lukket armene; antall oppføringer i åpne armer, lukket armer, og sonen center; ventetiden til inn lukket armene; avstanden reist i de åpne armene, lukket armer, og i den midtre sonen.
    Merk: Dyr anses å være i bygningskomplekset når midten av kroppen er i dette området.
  2. Fastslå effekten av behandlinger på atferd ved å bruke en variansanalyse (ANOVA) med Fishers minst signifikant forskjell (LSD) test/Tukey flere sammenligninger test.

Representative Results

Gjeldende eksperimentet undersøker hypotesen at eksogene keton tilskudd administrert enten kronisk (matet 83 dager) eller subchronically (muntlig gavaged for 7 dager) har en angstdempende effekt på to måneder gammel mannlig Sprague-Dawley (SPD) rotter ( 250-350 g). Kronisk administrasjon besto av følgende keton kosttilskudd: lav dose keton ester (LKE; 1,3-butandiol-acetoacetate diester, ~ 10 g/kg/dag, LKE), høy dose keton ester (HKE; ~ 25 g/kg/dag, HKE), beta-hydroksybutyrat-mineral-salt (bHB-S, ~ 25 g / kg/dag, KS), og bHB-S + medium chain triglyserider (MCT; ~ 25 g/kg/dag, KSMCT). For Subkronisk eksperimenter, følgende behandlingsgrupper ble brukt: KE, KS, og KSMCT (5 g/kg/dag). Kontroll grupper inkludert SD- eller SD med vann gavage (kontroll). Alle data var representert som gjennomsnittet ± standard feil av gjsnitt (SEM). Resultatene ble vurdert betydelig når p < 0,05. Betydningen ble bestemt av veis VARIANSANALYSE med Fisher's LSD test.

Etter kronisk fôring, rotter i gruppen KSMCT brukt betydelig mer tid i de åpne armene (p = 0.0094) sammenlignet med kontrollgruppen. Tid brukt i lukket armene var mindre i LKE, KS og KSMCT grupper (p = 0.0389, 0.0077 og 0.0019, henholdsvis), mens gruppen KS brukte betydelig mer tid i midten (p = 0.0239) sammenlignet med kontroll (SD) gruppe ( Figur 7A) 18.

Rotter i KS og KSMCT grupper reiste betydelig lengre avstander i de åpne armene (p = 0.036 og 0.0165), mens rotter i gruppene LKE, KS og KSMCT viste signifikant mindre avstand reist i lukket armene (p = 0.0252, 0.00041, og 0.0032, henholdsvis), sammenlignet med kontrollgruppen (SD) (figur 7B). Sammenlignet med kontrollgruppen, KS og KSMCT gruppene hadde større distanse i center-området (p = 0.0206 og 0.0482, henholdsvis), mens i KSMCT gruppen, ventetiden av første inngangen til lukket armene ble betydelig større etter kronisk fôring (p = 0.0038)18 (figur 7C).

Tid brukt i de åpne armene var større i gruppen KE (p = 0.0281) etter 7 dager med muntlige gavage, mens i KE, KS og KSMCT grupper, tid brukt i midten redusert (p = 0,0005, < 0,0001, og = 0.023, henholdsvis), sammenlignet med contro l gruppe (figur 8A)18. KE og KS grupper, antall oppføringer til lukket armene var betydelig lavere (p = 0.0436 og 0.0234, henholdsvis) etter 7 dager etter administrasjon (figur 8B), mens rottene i KS gruppen også inn midten mindre ofte (p = 0.0193), sammenlignet med kontrollgruppen (SD).

Figure 1
Figur 1: opphøyet pluss labyrinten (EPM) brukes til å teste rotter. Hver arm er 10 cm bred og 50 cm lang, med to armer som motsatte åpnes med hevet kant. De to lukket overfor armer er utstyrt med 30 cm høye vegger. Rullebane fra gulvet er 55 cm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: eksempler på direkte og indirekte belysning. Kontroller lyskilden er pekte mot taket, mens direkte lys over eksperimentell området er blokkert. Det er viktig å bruke indirekte lys under EPM eksperimenter for å belyse tilsvarende alle fire armer uten skygger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: eksperimentering assistent bar bevegelse sporing programvare. Det er utformet for å gi tilgang til de viktigste operasjonene. Knappene tilsvarer oppgaven typisk eksperimentering prosessen, mens bare er tillatt aktivitetene er aktive. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: emne sporet er markert med en rød linje følgende dyrets bevegelse. Ved å justere terskelverdien, kan bakgrunnen bli redusert til bare dyret er oppdaget og sporet av den røde linjen. Sporet følger midten av massen av faget, og gjeldende posisjonskoordinatene er markert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: opphøyet pluss labyrinten (EPM) med rotte Sprague Dawley (SPD) i den åpne armen Et eksempel på den eksperimentelle set-up er demonstrert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: akkumulert bevegelse spor av dyret under et prøveabonnement. Som del av dataanalyse, kan samlet bane spor av emnet i området sporing vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: atferdsmessige responser av SPD rotter i EPM etter 83 dager av kronisk fôring av eksogene keton kosttilskudd. Disse skjermbildene viser representant resultater samlet av EPM og bevegelse-sporing systemet18. (A) gruppen KSMCT tilbrakte en større prosentandel av tid i de åpne armene, mens LKE, KS og KSMCT grupper tilbrakte mindre tid i lukket armene, sammenlignet med kontrollgruppen (SD). (B) The KS og KSMCT reiste mer avstand i de åpne armene, mens LKE, KS og KSMCT grupper reiste liten avstand i lukket armene, viser redusert angst forhold til kontrollen (SD)-gruppen. (C) KSMCT gruppen inn lukket armene senere indikerer redusert angst sammenlignet med kontrollen (SD)-gruppen. Forkortelser: SD = standard gnager chow + vann (25 g/kg kroppsvekt (b.w.) av vann i døgnet); LKE = SD + LKE (1,3-butandiol-acetoacetate diester, 10 g/kg b.w./day); HKE = SD + HKE (25 g/kg b.w./day); KS = SD + beta-hydroksybutyrat-mineral-salt (bHB-S, 25 g/kg b.w./day); KSMCT = SD + bHB-S + medium chain triglyserider (MCT, 25 g/kg b.w./day); SPD = Sprague-Dawley rotte; EPM = opphøyet pluss labyrint (* p < 0,05; ** p < 0.01; *** p < 0,001; *** p < 0,0001). Dette tallet er endret fra Ari et al. 18. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: atferdsmessige responser av SPD rotter etter 7 dager av muntlig gavage av eksogene keton tilskudd. Representant resultater ble samlet gjennom EPM teste, bruke en bevegelse-sporing programvare system18. (A) gruppen KE tilbrakte en større prosentandel av tid i de åpne armene, mens KE, KS og KSMCT grupper tilbrakte mindre tid i center (sammenlignet med kontrollgruppen [SD]), noe som indikerer at redusert angst. (B) sammenlignet med kontrollen (SD) gruppe, mindre oppføringer ble funnet i lukket armene fra rotter i gruppene KE og KS. Forkortelser: SD = standard gnager chow + vann (5 g/kg b.w. vann/Day); KE = SD + keton ester (1,3-butandiol-acetoacetate diester, 5 g/kg b.w./day); KS = SD + beta-hydroksybutyrat-mineral-salt (bHB-S, 5 g/kg b.w./day); KSMCT = SD + bHB-S + MCT (5 g/kg b.w./day); SPD = Sprague-Dawley rotte; EPM = opphøyet pluss labyrint (* p < 0,05; *** p < 0,001; *** p < 0,0001). Dette tallet er endret fra Ari et al. 18. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Generelt, vanlig flere tester, som lys og mørke svaralternativer og sosial interaksjon testen EPM testen, brukes til å måle angst nivået i forskjellige dyr modeller. Men EPM analysen alene er en egnet metode for å undersøke, for eksempel effekten av eksogene keton kosttilskudd på Red angst nivåer18,20.

Den største fordelen med EPM metoden er at den er avhengig av gnagere instinktivt proclivity mot mørke, lukkede rom, i tillegg til unconditioned frykt for høyder og unngå vidder. På den annen side, er andre metoder for å studere angst-lignende oppførsel basert på visse skadelige stimuli, som elektrisk støt, mat/vann savn, høye lyder og eksponering for predator lukt3atferdsdata svar. Disse testene resultere vanligvis i en betinget respons, mens EPM representerer også en mer human alternativ. Videre EPM kan være et nyttig verktøy å studere involvering av ulike hjernen regioner (f.eks, limbiske regioner, hippocampus) og de underliggende mekanismene (f.eksGABA, glutamat, serotonin, adenosin) av angst oppførsel2.

Når du bruker behandlinger som er veldig stressende for dyr (f.eksden muntlige gavage), er det viktig at alle dyrene behandles på samme måte og av samme person, spesielt når du vurdere potensielle, subtile angstdempende effekter. Hvis mulig, kan innføring av stoffet/sammensatte i drikkevann eller via en akseptabel "behandle" være en foretrukket metode. For å sikre at samme administreres til hvert dyr, kan en muntlig gavage brukes. Basert på farmakokinetiske egenskapene til sammensatt, er det vanligvis lurt å teste dyrene på EPM innen 1 time etter gavaging. Når du velger eksperimentelle fag, er det viktig å vurdere deres belastning, sex, estrus syklus, og alder, samt kroppsvekt, ifølge målene og teste stoffer2. I forhold til alder, når utforme EPM studier og tolke data, er det viktig å vurdere at prosentandelen av åpne arm oppføringer øker lineært med alderen21 og aldring-relaterte endringene i EPM atferd er stammen spesifikke22.

Når du utfører en EPM-test, er det potensielle problemer som må håndteres. Noen ganger dyr trenger å bli ekskludert fra analysen på grunn av avvikende tendenser (f.eksdyret aldri forlater området der den ble plassert, nesten faller av apparatet, er distrahert av en støy eller hendelse utenfor apparatet). Ytterligere komplikasjoner med EPM testing kan inkludere behandlinger som forårsaker sedasjon eller hyperaktivitet fordi disse typer effekter må være vurdert via EPM parametere.

Det er viktig å utsette dyr EPM test bare en gang fordi redusert aktivitet på de åpne armene og en redusert totale tid brukt på sentrale plattformen ble vist på andre (gjentatt) eksponering av gnagere sammenlignet med første eksponering på EPM 14,15. Derfor anbefales en enkelt eksponering av gnagere EPM test sterkt. Men hvis det er minst tre uker mellom første og andre eksponering for EPM og EPM-oppsett flyttes til et annet rom (ulike miljø), dyrene kan undersøkes av EPM test flere ganger2.

EPM er tilgjengelig i forskjellige materialer, størrelser (f.eksfor mus eller rotten) farger, som må vurderes når du velger studere fag. Det er viktig å huske på at lukt igjen av tidligere dyret på apparatet kan endre virkemåten til etterfølgende dyret. Derfor anbefaler vi bruker en EPM laget av et materiale som er lett å feilfri, som akryl glass (ikke gjennomsiktig), som ikke beholder lukt etter vask. Unngå EPM apparater laget av tre. Bruk gjerne en maskefarge som er forskjellig fra fargen på dyrene testet på EPM (f.ekssvart hvis hvit dyrene er testet). Jo bedre kontrasten mellom dyr og kabinettet, jo bedre gjenkjenning av dyret og jo høyere pålitelighet og nøyaktighet av resultatene oppnådd (distanse, hastighet, sporing). EPM apparater laget av Matt grå materiale er nyttig med hvit, svart, og hvit og svart dyr.

Enda en fordel av video sporingssystemet er at i tillegg til EPM, den tilbyr en fleksibel og enkel måte å sette den opp med en rekke atferdsmessige tester, som vann labyrinten, åpne-feltet, pluss/radial arm/T-Y labyrinter, sted preferanse, tvunget svømme , og hale suspensjon tester.

I sammendraget er målet med denne artikkelen å beskrive EPM testen brukes i kombinasjon med en video sporingsprogrammer å samle og analysere atferdsmessige endringer svar på romanen angstdempende behandlinger. De mulige anvendelser av EPM inkluderer prescreening av nyutviklet farmakologiske agenter for behandling av angst-relaterte lidelser. I tillegg til angstdempende og anxiogenic agenter, kan atferdsmessige effekten av ulike hormoner og narkotika misbruk også bli undersøkt. Påvirkning av aldring og eksponering for ulike stressfaktorer kan også vurderes. Denne studien konkluderte med at når riktig skritt er tatt, bruk av EPM har vist seg for å være en følsom å vurdere opptreden endre forbundet med keton kosttilskudd18,20.

Disclosures

D'Agostino, DP, Kesl, S., Arnold, P. komposisjoner og metoder for å produsere opphøyet og vedvarende Ketosis. Internasjonal Patent # PCT/US2014/031237. University of South Florida.

Ari, C., D'Agostino, D.P., eksogene keton kosttilskudd for å redusere angst-relaterte atferd. Foreløpig patent #62289749. University of South Florida.

Dominic P. D'Agostino og Csilla Ari er medeiere i selskapet keton Technologies LLC.

Disse interessene har blitt vurdert og styres av universitetet i samsvar med sin Institutional og personlige interessekonflikt politikk. Alle forfattere erklærer at det er ingen flere interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av en ONR Grant N000141310062 og en GLUT1D Foundation Grant #6143113500 (til Dominic P. D'Agostino), ved National Development Agency i Ungarn (under Grant nr. TIOP-1.3.1.-07/2-2F-2009-2008; til Zsolt Kovács) og ved Institutt for Veteraner saker (for å markere Kindy). Forfatterne ønsker å takke Quest ernæring LLC for å støtte pågående forskning på dette emnet (til Csilla Ari).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elevated Plus Maze for mice and rats Coulbourn Instruments H10-35-EPM
SMART Video Tracking Software Harvard Apparatus SMART 3.0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. Validation of open : closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 14, (3), 149-167 (1985).
  2. Walf, A., Frye, C. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nature Protocols. 2, (2), 322-328 (2007).
  3. Barnett, S. A. The rat: A study in behavior. University of Chicago Press. Chicago, IL. (1975).
  4. Handley, S. L., Mithani, S. Effects of alpha-adrenoceptor agonists and antagonists in a maze-exploration model of 'fear'-motivated behaviour. Naunyn Schmiedebergs Archives. In Pharmacology. 327, (1), 1-5 (1984).
  5. Montgomery, K. C. The relation between fear induced by novel stimulation and exploratory behavior. Journal of Comparative Physiology and Psychology. 48, (4), 254-260 (1955).
  6. Sarkisova, K. Y., Midzianovskaia, I. S., Kulikov, M. A. Depressive-like behavioral alterations and c-fos expression in the dopaminergic brain regions in WAG/Rij rats with genetic absence epilepsy. Behavioral Brain Research. 144, (1-2), 211-226 (2003).
  7. Jain, N., Kemp, N., Adeyemo, O., Buchanan, P., Stone, T. W. Anxiolytic activity of adenosine receptor activation in mice. British Journal of Pharmacology. 1116, (3), 2127-2133 (1995).
  8. Paslawski, T., Treit, D., Baker, G. B., George, M., Coutts, R. T. The antidepressant drug phenelzine produces antianxiety effects in the plus-maze and increases in rat brain GABA. Psychopharmacology (Berlin). 127, (1), 19-24 (1996).
  9. Florio, C., Prezioso, A., Papaioannou, A., Vertua, R. Adenosine A1 receptors modulate anxiety in CD1 mice. Psychopharmacology (Berlin). 136, (4), 311-319 (1998).
  10. Engin, E., Treit, D. The effects of intra-cerebral drug infusions on animals' unconditioned fear reactions: a systematic review. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 32, (6), 1399-1419 (2008).
  11. Botton, P. H., et al. Aged mice receiving caffeine since adulthood show distinct patterns of anxiety-related behavior. Physiology and Behavior. 170, 47-53 (2017).
  12. Hughes, R. N., Hancock, N. J., Henwood, G. A., Rapley, S. A. Evidence for anxiolytic effects of acute caffeine on anxiety-related behavior in male and female rats tested with and without bright light. Behavioural Brain Research. 271, 7-15 (2014).
  13. Rex, A., Marsden, C. A., Fink, H. Effect of diazepam on cortical 5-HT release and behaviour in the guinea-pig on exposure to the elevated plus maze. Psychopharmacology (Berlin). 110, (4), 490-496 (1993).
  14. Almeida, S. S., Garcia, R. A., de Oliveira, L. M. Effects of early protein malnutrition and repeated testing upon locomotor and exploratory behaviors in the elevated plus-maze. Physiology of Behaviour. 54, (4), 749-752 (1993).
  15. Bertoglio, L. J., Carobrez, A. P. Behavioral profile of rats submitted to session 1-session 2 in the elevated plus-maze during diurnal/nocturnal phases and under different illumination conditions. Behavioural Brain Research. 132, (2), 135-143 (2002).
  16. Korte, S. M., De Boer, S. F. A robust animal model of state anxiety: fear-potentiated behaviour in the elevated plus-maze. European Journal of Pharmacology. 463, (1-3), 163-175 (2003).
  17. Carobrez, A. P., Bertoglio, L. J. Ethological and temporal analyses of anxiety-like behavior: the elevated plus-maze model 20 years on. Neuroscience & Biobehavioural Reviews. 29, (8), 1193-1205 (2005).
  18. Ari, C., et al. Exogenous ketone supplements reduce anxiety-related behavior in Sprague-Dawley and Wistar Albino Glaxo/Rijswijk rats. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 137 (2016).
  19. D'Agostino, D. P., et al. Therapeutic ketosis with ketone ester delays central nervous system oxygen toxicity seizures in rats. American Journal of Physiology: Regulation Integration and Comparative Physiology. 304, (10), R829-R836 (2013).
  20. Kovács, Z., D'Agostino, D. P., Ari, C. Anxiolytic effect of exogenous ketone supplementation is abolished by adenosine A1 receptor inhibition in Wistar Albino Glaxo/Rijswijk rats. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, 29 (2018).
  21. Lynn, D. A., Brown, G. R. The ontogeny of anxiety-like behavior in rats from adolescence to adulthood. Developmental Psychobiology. 52, (8), 731-739 (2010).
  22. Ferguson, S. A., Gray, E. P. Aging effects on elevated plus maze behavior in spontaneously hypertensive, Wistar-Kyoto and Sprague-Dawley male and female rats. Physiology of Behavior. 85, (5), 621-628 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics