Förhöjd Plus labyrint Test kombinerat med Video mjukvara för att undersöka den ångestdämpande effekten av exogena ketogen kosttillskott

Behavior
JoVE Journal
Behavior
AccessviaTrial
 

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att undersöka förändringar i ångest av gnagare djurmodeller. Den förhöjda plus labyrint (EPM) test, som används tillsammans med en video som spårning programvara, ger en tillförlitlig metod för att dokumentera effekten av olika potentiella ångestdämpande behandlingar i prekliniska laboratorium scenarier.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ari, C., D’Agostino, D. P., Diamond, D. M., Kindy, M., Park, C., Kovács, Z. Elevated Plus Maze Test Combined with Video Tracking Software to Investigate the Anxiolytic Effect of Exogenous Ketogenic Supplements. J. Vis. Exp. (143), e58396, doi:10.3791/58396 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Det övergripande målet med denna studie är att beskriva metodiken för högstämt plus labyrint (EPM) test i kombination med en video som spårning programvara. Syftet med metoden är att dokumentera effekten av olika potentiella ångestdämpande behandlingar på laboratoriet gnagare modeller. EPM testet baseras på gnagare benägenhet mot skyddade, slutna mörka utrymmen och ovillkorlig rädsla för öppna platser och höjder och deras medfödda intensiv motivation att utforska nya miljöer. EPM testet är en allmänt använd beteendemässiga test för att undersöka de ångestdämpande eller anxiogenic svar av gnagare får läkemedel som är kända att påverka beteende. Observation som visar en minskad andel av tid som tillbringas på slutna armar, en ökad andel tid som tillbringas på öppna armar, ett minskat antal poster till slutna armar och ett förhöjt antal poster öppna armar mätt med EPM testet kan avspegla minskade ångest nivåer. Med den här metoden, är effekten av exogena keton kosttillskott på ångest-relaterade beteenden testad hos Sprague Dawley (SPD) råttor. Exogena keton kosttillskott matas kroniskt till råttorna för 83 dagar eller subchronically och akut oralt gavaged, dagligen i 7 dagar, innan du utför EPM testa. Beteendemässiga data collection utförs med hjälp av SMART video spårande system av en blindad observatör i slutet av behandlingar. De viktigaste resultaten indikerar att testet EPM är en effektiv metod att upptäcka keton supplement-inducerad ångestdämpande effekten och kan anses vara en känslig åtgärd för att bedöma förändringar i ångest beteende som förknippas med drog - eller metabolisk-baserade terapier.

Introduction

Målet med denna artikel är att beskriva metodiken för EPM testet i kombination med en video som spårning programvara för att övervaka förändringar i ångest-relaterade beteenden och nya behandlingar i laboratoriet gnagare modeller. EPM testet är en relativt enkel beteendemässiga bedömningsmetod, som utvecklats för utredning av kvantifiera ångest beteende nivåer och ångest Svaren hos råttor efter tillämpningen av drogen behandlingar1. Det har faktiskt visat att testet EPM är en allmänt använd och effektiv beteendevetenskaplig analys för utredning av förändringar i ångest nivåer av gnagare1,2. Tillämpligheten av EPM testet hos gnagare (främst råttor och möss) är baserad på deras benägenhet mot slutna, mörka utrymmen (strategi), en ovillkorlig rädsla för öppna platser/höjder (undvikande) och deras hög inneboende motivation att utforska roman miljöer. Följaktligen, EPM testet är en väletablerad metod baserad på en strategi-undvikande konflikt2,3.

EPM är en plus-formad apparat bestående av fyra upphöjda armar, som har beskrivits av Handley och Mithani4 (figur 1), och består av två motsatta armar som är öppna till omgivningen (öppna armar), medan de två stängda motsatt armar (stängt vapen) är utrustade med väggar. Efter behandling, om ökad tid som spenderas på de öppna armarna och/eller ett ökat antal öppen arm poster jämfört med kontroll (obehandlat) djur upptäcks på EPM indikerar en ångestdämpande effekt2,3. Den mest robusta undvikande Svaren har visats i de första 5 min efter start (placering av råttorna i skärningspunkten mellan fyra armarna på EPM) av EPM assay5; därför registreras vanligen någon beteende efter en behandling för 5 min till EPM. Som ytterligare åtgärder av en ångest nivå, antalet huvud dips, föder upp (vertikalt stående av gnagare på två bakben), fekal boli, samt totala arm kan poster (spontan motorisk aktivitet) och olika ställningar (stretching eller frysning), också registreras på den EPM-2. Således kan flera behavioral parametrar sammanställas för att ge en övergripande bedömning av ångest-relaterade beteenden.

För att öka giltigheten av resultaten, två till tre beteendemässiga analyser används vanligen tillsammans, till exempel ljus-mörker val prov, social interaktion, och EPM testet, för att mäta ångest nivåerna av olika djur modeller6. EPM analysen utförs ensam på gnagare är också en lämplig metod att undersöka ångestdämpande eller anxiogenic effekten av olika droger7. EPM testet är känsliga inte bara till bensodiazepin-typ anxiolytika (t.ex., diazepam)8, men också, bland annat till amino syra, Mao, peptiderga och nucleosidergic föreningar (t.ex., det N-metyl-D-aspartat (NMDA)-antagonist AP7, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syra (AMPA) antagonist CNQX, µ-opioida receptoragonist morfin, NPY1-antagonist BIBP3226, substans P, ghrelin, oxytocin, serotonin receptoragonister och antagonister såsom 8-OH-DPAT och Way-100635 och β1-adrenerg betaxolol)9,10,11,12. Följaktligen, EPM analysen på gnagare är en lämplig och känslig metod att undersöka påverkan av olika behandlingar som påverkar hjärnområden som ingår i den ångestdämpande effekten (t.ex., amygdala, hippocampus och limbiska områden) och verkningsmekanismer (t.ex., serotonerga GABAergic och adenosinergic systemet) inblandade i ångest2. Agenterna testas i dessa EPM studier inkluderar exogena keton kosttillskott som förändrar hjärnan signalerar på ett subtilt sätt som kan kräva en känslig metod för att upptäcka beteendeförändringar.

I den här artikeln beskriver vi den EPM-test som används i kombination med en video som spårning programvara, som hjälper till att eliminera experimentella bias och underlättar insamling och analys av beteendemässiga förändringar som svar på romanen ångestdämpande behandlingar.

Protocol

Behandlingen av djur och mätmetoder som utfördes enligt University of South Florida institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) riktlinjer (protokoll nr 0006R). Alla ansträngningar har gjorts att minska antalet djur som används.

1. förberedelser

Obs: Protokollet normalt kräver laboratorium-uppfödda råtta eller mus för EPM testning. Andra djur, såsom marsvin, har dock även testats på EPMs13. Det är viktigt att överväga kontrasten mellan djur i labyrinten och labyrint färg när du använder video spårning. Kontrasten är mindre viktigt för forskare tittar på djuren live eller via video. Inställningarna för videon spårning programvara behöver konfigureras för att dokumentera att djuren är svart eller vitt på antingen en svart eller vit labyrint. Problem med konfigurationsinställningarna kan uppstå med en klar akryl labyrint, men en matt grå labyrint kan vara optimalt för både gnagare färger.

  1. Välj djur för experimentet, med tanke på den potential som påverkande faktorer, såsom stam, kön, estrus cykel, och ålder, samt kropp vikt2.
  2. Utifrån enskilda experimentet, avgör antalet djur per grupp för testet.
    Obs: Gruppens storlek kommer att vara beroende av storleken effekt som förväntas med test behandling. Power analyser görs allmänt innan försöket påbörjas för att fastställa det minsta antalet ämnen som skall ingå ges variabiliteten i djurets svar i någon given uppgift, liksom antalet experimentella grupper/villkor.
  3. Utforma experimentet (där ett batteri av olika beteendemässiga tester, såsom öppen-fältprov, EPM test, hål-styrelsen test och tvingade-simning test kommer att användas) noggrant.
    Obs: Före exponeringen av gnagare till en roman testmiljö (t.ex. en öppna-fältprov) omedelbart före EPM proven kan ändra beteendet hos djuren på EPM1,2.
  4. Hantera alla djur på ett liknande sätt innan testet EPM.
    Obs: Det har visats att olika stressfaktorer, tillämpning av droger (e.g., injektioner), sjöfart stress och hantering kan ändra beteende och beteendemässiga Svaren gnagare på EPM16. Tillvänjning av djuren till ett djurs hus (t.ex., efter leverans, 1-2 veckor innan testet EPM), experimentella förhållanden och behandling förfaranden (t.ex., gavaging) är alltså nödvändiga. Det är också viktigt att hanteringen av gnagare och någon erfarenhet av tidigare stressfaktorer, särskilt omedelbart före testning, är konsekvent över djur och behandlingsgrupperna.
  5. Utföra de beteendevetenskapliga studierna på nattaktiva djur, som råttor och möss, med en omvänd ljus cykel, så att beteendemässiga bedömningen kan utföras när djuren är i deras mörka, aktiv fas.
    Obs: Effekterna av olika boendeförhållanden och ljus cykel/circadian rytmer på beteende och deras inflytande på EPM resultat visades tidigare17, eftersom djurens hormoner regleras av lätta cykeln.
  6. Använda de samma praktiker under förfarandena och be dem att undvika parfym eller tvålar med en stark lukt.
  7. Be de praktiker inte att prata nära djuret under experimentet eller flytta objekt nära EPM miljö.
    Obs: Det är kritiskt viktigt att observatören gör minimala rörelser och inget buller när du samlar in beteendedata.
  8. Ren hela EPM efter varje försök att radera eventuella lukter av tidigare djur som kan störa utforskandet av försöksdjur.
  9. (Rekommenderas) Hantera djuren för flera dagar före testet EPM (plocka upp försiktigt av bålen och håller den i en minut eller två) att vänja dem att experimenter.
  10. När du placerar djuren på EPM, se till att hantera alla djur på ett konsekvent sätt och placera varje gnagare i EPM i samma position inför samma arm (t.ex., i stadens inför öppna armen från experimenter).

2. tillämpning av exogena keton kosttillskott

  1. Mäta djurens kroppsvikt innan du påbörjar någon behandling för att avgöra Läkemedelsräkning för behandling (t.ex., intragastrisk sondmatning).
  2. Bekanta djuren till metoden intragastrisk sondmatning (anpassningsperiod) med vatten genom sondmatning för 5 d innan keton komplettering (standard gnagare chow/standard kost [SD] + vatten sondmatning; t.ex., 2,5 g/kg kroppsvikt av vatten/dag). Utesluta användningen av alla djur som inte anpassar till metoden intragastrisk sondmatning.
  3. Efter anpassningsperioden, mata djuren kroniskt för 83 d och subchronically för 7 d med SD och sondmatning dagligen med antingen vatten (t.ex., 5 g/kg kroppsvikt och dag; kontrollgrupp: n = 8), keton kosttillskott som keton ester (KE; 1,3 - butandiol-etylacetoacetat diesteren; t.ex.5 g/kg kroppsvikt/dag; n = 8), keton salt (KS; Na+k+\u2012beta-hydroxybutyrate [βHB] mineral salt; t.ex.5 g/kg kroppsvikt/dag; n = 8), eller KS + medium chain triglyceride (1:1 ratio, KSMCT; n = 8)18,19,20.
    Obs: De djur som fick intragastrisk sondmatning testades på EPM 1 h efter behandling. Råttor utfodras med standard gnagare chow och gavaged med vatten (exklusive keton komplettering) tjänstgjorde som kontrollgrupper.

3. ångest Assay

  1. EPM apparater
    1. Använda samma utrustning över en studie för att standardisera resultaten. EPM är en plus-formad apparat, som består av fyra armar (t.ex.armarna kan vara 10 cm brett och 50 cm lång): två motsatta armar öppnas, och de två stängda mittemot armar är utrustade med hög (t.ex., 30 cm) väggar. Apparaten är förhöjd över golvet (t.ex., av 55 cm)2.
      Obs: De vanligaste parametrarna är den ackumulerade tid i de öppna armarna och antalet poster i de öppna armarna; men tid som tillbringas i slutna armar och center, och antalet inträden i slutna armar och center mäts, liksom avstånd reste i varje område.
    2. Lyser upp EPM med hjälp av indirekt belysning (dvs.direkt ljus källa mot taket istället för direkt lysande EPM apparaten) och se till att alla fyra armar belyses likaså (utan skuggor, se figur 2).
      Obs: Ändringar i ljusnivån förändra beteendet hos gnagare på EPM. Därför behövs liknande belysning i på varandra följande experimentella djur och dagar (t.ex., 2800 lumen i rummet)2.
  2. Video uppföljningssystemet
    Obs: Använd en video spårningssystem med en datorgränssnitt och en videokamera för datainsamlingen, som samlar automatiskt in beteendedata i råttor (Figur 3). För video tracking system, ett brett utbud av vanliga analoga kameror eller användardefinierade bildkällor (värmekameror, videokamera, WIA-kompatibel USB-kamera, webbkameror,etc.) kan användas. När man analyserar den inspelade videon, stöder rörelse-tracking programvaran alla vanliga videoformat som AVI, VOB, .wmv, .asf, .mov, .qt, .mpg, .mpeg, .mp4, .3gp och .mkv. Om videon inte inte uppspelning korrekt, kan det krävas en viss codec; ytterligare videoformat stöds om motsvarande codec-enheten är installerad i systemet. Rörelse-mjukvara kan också användas för att analysera tidigare förvärvade videor och bearbeta bilderna från olika källor, såsom DVD/HD-inspelare, digitala videofiler (.avi, .divx, .mpeg,etc.), webbkameror, DV-kameror, och WIA-kompatibel bildenheter.
    1. Systeminställningarna
      1. Koppla in installationsnyckel av rörelse-mjukvara i en USB 2.0-port och starta installationsverktyget.
      2. Fixa kameran ovanför området experimentell och säkerställa att det förblir orörlig under experimentet.
      3. Ställa in ett nytt experiment i rörelse-spårning programvara systemet med hjälp av instruktionsboken. Välj nytt Experiment. Dubbelklicka på ikonen i protokollet att nya experimentet bör följa (figur 3, kompletterande fil 1).
      4. Ange detaljer att etikett/beskriva experimentet i dialogrutan Experimentera Info .
      5. Ange källan till de videosekvenser att bearbeta.
      6. Definiera omvandling regeln för rätt avstånd mätning. Kalibreringen kan rörelse-mjukvara ska informeras om de faktiska måtten av området experimentell för att erhålla tillförlitliga värden för avstånd och hastigheter.
      7. Fastställa regionerna av intresse (zoner) i arbetsområdet.
      8. Justera parametrarna för identifieringsprocessen.
        1. För rörelse-mjukvara att exakt identifiera positionen för djuret i bilden, måste vissa upptäckt justeringar anges.
        2. Spårning processen kräver en tydlig och väl kontrasterade bild genom att använda en finjustering av allmänna ljusstyrka och kontrast parametrar i avsnittet ljusstyrka & kontrast i panelen Inställningar för rörelseavkänning . Vid behov, justera dessa inställningar för hela bilden eller användardefinierade zoner.
      9. Sätta en råtta i varje arena att testa identifieringsprocessen.
      10. Tryck på knappen Starta Test för att kontrollera om identifieringsprocessen kan identifiera ämnet korrekt. Bekräfta att upptäcka aktiveras genom uppkomsten av en prick på skärmen. Kalibreringsprocessen måste göras innan du påbörjar testen.
      11. Upptäckten anses bekräftad när den endast Svarta pricken visas i spelaren är det djur som spåras. Den röda spårning linje måste noga följa alla djurets förskjutningar. Korrekt spårning bekräftas också med en vit etikett de animaliska kontrollnumret och motsvarande koordinater baserat på förskjutning. Om en sådan identifiering inte erhålls, justera tröskeln och erosioner parametrar för optimering att upptäcka och spåra processen.
      12. Justera tröskeln och Erosion parametrar för att få en skarpare och brusfri testbild.
      13. Om sökvägen spårning identifieras korrekt, tryck på knappen Stoppa Test (figur 4). Om dessa justeringar ska användas för varje ny experimentell filen, tryck på knappen Spara som standard . Tryck på knappen acceptera att spara de nya inställningarna.
      14. Ange villkor efter tid av prövningar.
      15. Om det experimentellt protokollet kräver spår förvärvsprocessen starta samtidigt föremål placeras i området experimentell, är det möjligt att konfigurera fjärrenheten som medföljer programvaran eller använda en trådlös mus.
        Obs: Detta alternativ ger möjlighet till fjärrstyrning av start och stopp.
    2. Inställning av försökspersonerna i systemet
      1. Hantera experimenterande motivets databas. Skapa en databas med experimentella ämnen, ange Försökspersoner databasadministratören genom att trycka på knappen försökspersoner i baren Experimenterande assistenten .
      2. Tryck på + -knappen för att lägga till nya ämnen i databasen.
      3. Med ett ämne redan valda alternativet, ange motivets kod.
      4. Fyll i resten av motivets information i avsnittet Angående egenskaper .
      5. Tryck på knappen skapa för att lägga till nya föremål.
      6. Definiera experimenterande planen. Använd Schemaläggaren för att definiera de olika faserna, sessioner, prövningar och ämnen planeras att utföras inom det experimentella projektet. Rättegången väljs automatiskt som ”nästa rättegången” ska utföras. Detta boende är visas som en grön bock till vänster om rättegång namn.
    3. Datainsamling genom samtidig inspelning och spårning
      Obs: När en levande bildkälla väljs, panelen spelare ger en inbäddade inspelning modul för att enkelt fånga video från den valda kameran.
      1. Förbereda rörelse-mjukvara för datainsamling (kalibrering, zon definition, inställningar, tidsinställningar, scheduler).
      2. Öppna panelen datainsamling .
      3. Börja spela in video av experimentet utan djuret genom att trycka på knappen Starta inspelning tillgänglig i programvaran.
      4. Placera djuret i området experimentell.
      5. Starta data förvärvsprocessen genom att trycka på Start -knappen på Kontrollpanelen i tid . Processen spårning kommer att genomföras samtidigt med inspelningsprocessen. Som behövs, be försöksledaren att anteckna de beteendemässiga variablerna manuellt, som föder upp, head dips, och falls (figur 5).
      6. Samla in EPM data manuellt samt av en blindad observatör (separat observatören från EPM av en gardin) i testning rummet.
      7. Vänta tills slutet av spårning-processen inspelningen eller tryck på Stop knappen på Kontrollpanelen i tid .
      8. Tar bort djuret från området experimentell. Stoppa videoinspelning processen genom att trycka på stopp -knappen tillgänglig på spelarens rörelse-spårning programvara.
      9. Förbereda området experimentell för nästa djuret genom tvättning och torkning. Upprepa cykeln igen.
    4. Analys av data
      1. Öppna verktyget genom att tryck på knappen analys i baren Experimenterande assistenten .
      2. Generera analysrapporter av färdiga prövningar, Välj försöken att analysera. Konfigurera och välj analysrapporten. Ställ in tidsintervall som ska analyseras. Generera och granska rapporter. Exportera resultaten till ett kalkylblads- eller image-format (figur 6).
  3. EPM för mätning av ångest nivåer
    1. Utföra de EPM experiment under nonstress förhållanden (i ett svagt upplysta och tyst rum) efter oral sondmatning.
      Obs: Kontrollera att experimenten drivs i ett nära tidsintervall (t.ex., mellan 1200 och 1400) eftersom dygnsrytmen kan påverka gnagare beteende på EPM15,17. Undvik onödiga rörelser och buller under experimentet.
    2. Innan start av testet, se till att EPM är rengöras och torkas och videon spårande system är redo att använda.
    3. Överföra råttorna i deras hem bur till experimentella rummet 30 min innan experimentet.
    4. Placera en råtta i skärningspunkten mellan de fyra armarna för EPM inför öppen arm mittemot försöksledaren.
    5. Kör videon spårning programvara, samt registrera manuellt beteendet hos djuret, för 5 min.
    6. Om djuret faller av EPM, plocka upp och placera den tillbaka på samma punkt för EPM där den ramlade av. Utesluta den beteendemässiga datan av detta djur från analysen.
      Obs: Ett högt ljud eller rörelse kan immobilisera/frysa djur på öppna armar. Om ett högt ljud hörs under experimentet, utesluta de beteendemässiga datan av djur som genomgår experimentet i det ögonblicket från analysen.
    7. I slutet av testet 5 min, stoppa videon spårning programvara och ta bort djuret från EPM. Lägg tillbaka i sin hem bur.
    8. Innan nästa experiment/djuret, ren EPM med Desinficerande rengöringsmedel (t.ex., Quatricide) följt av kranvatten. Torka apparaten med hushållspapper.

4. analys av Data som samlas in av videon Tracking System

  1. Baserat på inspelade data, analysera mängden tid som tillbringats i de öppna armarna och i de slutna armarna; antalet poster som gjort att de öppna armarna, slutna armar, och den centrala zonen. latensen för inträde på de slutna armarna; tillryggalagd sträcka i de öppna armarna, slutna armar, och i den centrala zonen.
    Obs: Djuret anses vara i ett område när centrum av kroppen massa är i området.
  2. Fastställa effekterna av behandlingar på beteende med hjälp av en variansanalys (ANOVA) med Fishers minst signifikanta skillnaden (LSD) test/Tukeys flera jämförelser test.

Representative Results

Det nuvarande experimentet undersöker hypotesen att exogena keton tillskott administrerad antingen kroniskt (matas för 83 dagar) eller subchronically (oralt gavaged i 7 dagar) har en ångestdämpande effekt på två månader gamla manliga Sprague-Dawley (SPD) råttor ( 250-350 g). Kronisk administrering bestod av följande keton tillägg: låg dos keton ester (LKE; 1,3-Butandiol-etylacetoacetat diesteren, ~ 10 g/kg/dag, LKE), högdos keton ester (HKE; ~ 25 g/kg/dag, HKE), beta-hydroxibutyrat-mineral salt (bHB-S; ~ 25 g / kg/dag, KS), och bHB-S + medellång kedja triglycerider (MCT; ~ 25 g/kg/dag, KSMCT). För subkronisk experiment, användes följande behandlingsgrupperna: KE, KS, och KSMCT (5 g/kg/dag). Kontrollgrupperna medföljer SD eller SD vatten sondmatning (kontroll). Alla data var representerade som medelvärdet ± standardavvikelsen för medelvärdet (SEM). Resultaten ansågs betydande när p < 0,05. Betydelsen bestämdes av envägs ANOVA med Fisher's LSD test.

Efter kronisk utfodring, råttor i gruppen KSMCT spenderat betydligt mer tid i de öppna armarna (p = 0.0094) jämfört med kontrollgruppen. Tid i stängda armarna var betydligt mindre i grupperna LKE, KS och KSMCT (p = 0.0389, 0.0077 och 0,0019, respektive), medan KS gruppen tillbringade betydligt mer tid i centrum (p = 0.0239) jämfört med kontrollen (SD) gruppen ( Figur 7A) 18.

Råttor i grupperna KS och KSMCT rest betydligt längre avstånd i de öppna armarna (p = 0,036 och 0.0165), medan råttorna i grupperna LKE, KS och KSMCT visade betydligt mindre avstånd reste i slutna armar (p = 0.0252, 0.00041, och 0.0032, respektive), jämfört med kontrollgruppen (SD) (figur 7B). Jämfört med kontrollgruppen, grupperna KS och KSMCT hade större avstånd reste i området center (p = 0.0206 och 0.0482, respektive), medan i gruppen KSMCT latens till första ingången till stängda armarna var signifikant större efter kronisk utfodring (p = 0.0038)18 (figur 7 c).

Tiden i de öppna armarna var större i gruppen KE (p = 0.0281) efter 7 dagars oral sondmatning, medan i KE, KS och KSMCT grupper, tid som tillbringas i stadens minskade (p = 0,0005, < 0,0001, och = 0.023, respektive), jämfört med contro l gruppen (figur 8A)18. I grupperna KE och KS, antalet poster till stängda armarna var signifikant lägre (p = 0.0436 och 0.0234, respektive) efter 7 dagar efter administrering (figur 8B), medan råttorna i KS grupp också in stadens mindre ofta (p) = 0,0193), jämfört med kontrollgruppen (SD).

Figure 1
Figur 1: förhöjda plus labyrint (EPM) används för att testa råttor. Varje arm är 10 cm bred och 50 cm lång, med två motsatta armar öppnas med en upphöjd kant. De två stängda mittemot armar är utrustade med 30 cm höga väggar. Landningsbanan höjd från golvet är 55 cm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: exempel på direkt och indirekt belysning. Säkerställa att ljuskällan är pekade mot taket, medan det direkta ljuset ovanför området experimentell är blockerade. Det är viktigt att använda indirekt ljus under EPM experiment för att på samma sätt belysa alla fyra armar utan skuggor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: experimenterande assistent bar den rörelse-spårningsprogram. Den är utformad att ge tillgång till den huvudsakliga verksamheten. Knapparna motsvarar uppgiften inom typiska experimenterande processen, medan bara aktiviteter som är tillåtna är aktiva. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: angående banan är markerad med en röd linje efter djurets rörelse. Genom att justera tröskeln, kan bakgrunden minskas tills endast djuren identifieras och spåras av den röda linjen. Spåret följer centrum av massan av föremål, och de nuvarande positionskoordinater indikeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: förhöjda plus labyrint (EPM) med en Sprague Dawley (SPD) råtta i den öppna arm Ett exempel på den experimentella set-up demonstreras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: ackumulerade rörelse koll på djuret under en provperiod. Som en del av dataanalysen, kan insamlade bana tracen av föremål i området spårning visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: beteendemässiga Svaren av SPD råttor i EPM efter 83 dagar av kronisk utfodring av exogena keton komplettering. Dessa paneler visar representativa resultat samlas in av EPM och de rörelse-tracking system18. (A), den KSMCT gruppen tillbringade en större andel av tiden i de öppna armarna, medan LKE, KS, och KSMCT grupper tillbringade mindre tid i slutna armar, jämfört med kontrollgruppen (SD). (B) The KS och KSMCT grupper reste mer distans i de öppna armarna, medan LKE, KS, och KSMCT grupper reste kortare sträcka i slutna armar, visar minskad ångest jämfört med kontroll (SD) grupp. (C), KSMCT gruppen in stängda armarna senare indikerar minskad ångest jämfört med kontroll (SD) grupp. Förkortningar: SD = standard gnagare chow + vatten (25 g/kg kroppsvikt (BW) av vatten/dag); LKE = SD + LKE (1,3-Butandiol-etylacetoacetat diesteren, 10 g/kg kroppsvikt/dag); HKE = SD + HKE (25 g/kg kroppsvikt/dag); KS = SD + beta-hydroxibutyrat-mineral salt (bHB-S, 25 g/kg kroppsvikt/dag); KSMCT = SD + bHB-S + medellång kedja triglycerider (MCT, 25 g/kg kroppsvikt/dag); SPD = Sprague-Dawley råtta; EPM = förhöjd plus labyrint (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001; *** p < 0,0001). Denna siffra har ändrats från Ari et al. 18. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: beteendemässiga Svaren av SPD råttor efter 7 dagars oral sondmatning av exogena keton komplettering. Representativa resultat samlades genom EPM prov, med en rörelse-spårning programvara system18. (A), KE gruppen tillbringade en större andel av tiden i de öppna armarna, medan KE, KS, och KSMCT grupper tillbringade mindre tid i stadens (jämfört med kontrollgruppen [SD]), vilket indikerar minskad ångest. (B) jämfört med kontroll (SD) gruppen, mindre poster upptäcktes i slutna armar från råttor i grupperna KE och KS. Förkortningar: SD = standard gnagare chow + vatten (5 g/kg b.w. vatten/dag); KE = SD + keton ester (1,3-Butandiol-etylacetoacetat diesteren, 5 g/kg kroppsvikt/dag); KS = SD + beta-hydroxibutyrat-mineral salt (bHB-S, 5 g/kg kroppsvikt/dag); KSMCT = SD + bHB-S + MCT (5 g/kg kroppsvikt/dag); SPD = Sprague-Dawley råtta; EPM = förhöjd plus labyrint (* p < 0,05; *** p < 0,001; *** p < 0,0001). Denna siffra har ändrats från Ari et al. 18. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Discussion

I allmänhet vanliga flera tester, såsom ljus-mörker val testet, testet social interaktion och EPM testet, används för att mäta ångest nivån i olika djurmodeller. Dock EPM analysen enbart är en lämplig metod att undersöka, till exempel effekten av exogena keton kosttillskott på gnagare ångest nivåer18,20.

Den största fördelen med metoden EPM är att det bygger på gnagare instinktiva benägenhet mot mörka, slutna utrymmen, förutom den obetingade rädslan för höjder och undvikande av öppna ytor. Däremot, baseras andra metoder som används för att studera ångest-liknande beteende på vissa skadliga stimuli, såsom elektriska stötar, mat/vatten deprivation, höga ljud och exponering för predator lukt3beteendemässiga svaren. Dessa tester resultera brukar i en betingad respons, medan EPM representerar också ett mer humant alternativ. Dessutom EPM kan vara ett användbart verktyg att studera olika hjärnregioner (t.ex., limbiska regioner, hippocampus) och bakomliggande mekanismer (t.ex., GABA, Glutamat, serotonin, adenosin) ångest beteende2.

Vid tillämpningen av behandlingar som är ganska stressande för djuren (e.g., den oral sondmatning), är det viktigt att alla djur hanteras på samma sätt och av samma person, särskilt vid bedömningen av potentiella, subtila ångestdämpande effekter. Om möjligt, kan införandet av drogen/föreningen i dricksvatten eller via en välsmakande 'behandla' vara en rekommenderad metod. För att säkerställa att samma belopp ges till varje djur, kan en oral sondmatning användas. Baserat på de farmakokinetiska egenskaperna för föreningen, är det oftast klokt att testa djuren på EPM inom 1 timme efter gavaging. När du väljer experimentella ämnen, är det viktigt att överväga sin stam, kön, estrus cykel, och ålder, samt kroppsvikt, enligt målen och testa ämnen2. I hänsyn till ålder, när utforma EPM studier och tolka data, är det viktigt att anse att andelen öppen arm poster ökar linjärt med ålder21 och de åldersrelaterade förändringarna i EPM beteende är stamspecifika22.

När de utför en EPM-test, finns det potentiella problem som behöver åtgärdas. Djur behöver ibland undantas från analysen på grund av avvikande tendenser (t.ex., djuret aldrig lämnar området där den placerades, nästan faller utanför apparaten, är distraherad av en buller eller händelse utanför apparaten). Ytterligare komplikationer med EPM tester kan omfatta behandlingar som orsaka sedering eller hyperaktivitet eftersom dessa typer av effekter måste bedömas via EPM parametrar.

Det är viktigt att exponera djur på EPM-prov en gång eftersom minskad aktivitet på de öppna armarna och en minskad total tid som spenderas på den centrala plattformen visades på den andra (upprepat) exponeringen av gnagare jämfört med den första exponeringen på EPM 14,15. En enda exponering av gnagare på EPM prov rekommenderas därför starkt. Dock om det finns minst tre veckor mellan den första och andra exponeringen för EPM och EPM set-up flyttas till ett annat rum (olika miljö), djuren kan utredas av EPM testa mer än en gång2.

EPM finns i olika material, storlekar (t.ex., för mus eller råtta) och färger, som måste beaktas när man väljer studera ämnen. Det är viktigt att komma ihåg att lukter kvar av tidigare djuret på apparaten kan ändra beteendet för efterföljande djuret. Därför rekommenderar vi använder en EPM gjord av ett material som är lätt att rena, såsom akrylglas (inte transparent), som inte bevarar lukt efter tvätt. Undvika EPM apparater av trä. Helst använda en matt färg som skiljer sig från färgen på de djur som testats på EPM (t.ex., svart om vita djur testas). Ju bättre kontrasten mellan djuret och inneslutningen, desto bättre detektion av djuret och ju högre den tillförlitlighet och precision av resultaten erhållits (sträcka, hastighet, spårning). EPM apparater tillverkad i Matt grå material är användbara med vit, svart, och vitt och svart djur.

En ytterligare fördel med video uppföljningssystemet är att det förutom EPM erbjuder ett flexibelt och lätt sätt att ställa upp med ett brett utbud av beteendemässiga tester, såsom vatten labyrinten, öppna fält, plus/radiella arm/T-Y labyrinter, plats preferens, tvingade simning , och svans suspension tester.

Sammanfattningsvis är syftet med denna artikel att beskriva EPM testet används i kombination med en video spårningsprogram att samla in och analysera beteendemässiga förändringar som svar på romanen ångestdämpande behandlingar. De möjliga tillämpningarna av EPM omfattar i prescreening av nyutvecklade farmakologiska medel för behandling av ångest-relaterade sjukdomar. Utöver de ångestdämpande och anxiogenic ombud, kan också beteendemässiga effekten av olika hormoner och av missbruksdroger undersökas. Påverkan av åldrande och exponering för olika stressorer kan också bedömas. Denna studie har dragit slutsatsen att när rätt åtgärder, användning av EPM har visat sig vara en känslig metod för att bedöma beteendemässiga förändringar i samband med keton komplettering18,20.

Disclosures

D'Agostino, D.P., Kesl, S., Arnold, P. kompositioner och metoder för att producera förhöjda och ihållande ketos. Internationella Patent # PCT/US2014/031237. University of South Florida.

Ari, C., D'Agostino, D.P., exogena keton kosttillskott för att minska ångest-relaterade beteenden. Provisoriska patent #62289749. University of South Florida.

Dominic P. D'Agostino och Csilla Ari är delägare i företaget keton Technologies LLC.

Dessa intressen har granskats och förvaltas av universitetet i enlighet med sina institutionella och individuella intressekonflikter politik. Alla författarna förklarar att det finns inga ytterligare intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av en ONR Grant N000141310062 och en GLUT1D Foundation Grant #6143113500 (till Dominic P. D'Agostino), av den nationella utvecklingen byrån av Ungern (under Grant nr TIOP-1.3.1.-07/2-2F-2009-2008; till Zsolt László Kovács) och av de institutionen av Veterans Affairs (att markera Kindy). Författarna vill tacka Quest Nutrition LLC för att stödja pågående forskning om detta ämne (till Csilla Ari).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elevated Plus Maze for mice and rats Coulbourn Instruments H10-35-EPM
SMART Video Tracking Software Harvard Apparatus SMART 3.0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. Validation of open : closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 14, (3), 149-167 (1985).
  2. Walf, A., Frye, C. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nature Protocols. 2, (2), 322-328 (2007).
  3. Barnett, S. A. The rat: A study in behavior. University of Chicago Press. Chicago, IL. (1975).
  4. Handley, S. L., Mithani, S. Effects of alpha-adrenoceptor agonists and antagonists in a maze-exploration model of 'fear'-motivated behaviour. Naunyn Schmiedebergs Archives. In Pharmacology. 327, (1), 1-5 (1984).
  5. Montgomery, K. C. The relation between fear induced by novel stimulation and exploratory behavior. Journal of Comparative Physiology and Psychology. 48, (4), 254-260 (1955).
  6. Sarkisova, K. Y., Midzianovskaia, I. S., Kulikov, M. A. Depressive-like behavioral alterations and c-fos expression in the dopaminergic brain regions in WAG/Rij rats with genetic absence epilepsy. Behavioral Brain Research. 144, (1-2), 211-226 (2003).
  7. Jain, N., Kemp, N., Adeyemo, O., Buchanan, P., Stone, T. W. Anxiolytic activity of adenosine receptor activation in mice. British Journal of Pharmacology. 1116, (3), 2127-2133 (1995).
  8. Paslawski, T., Treit, D., Baker, G. B., George, M., Coutts, R. T. The antidepressant drug phenelzine produces antianxiety effects in the plus-maze and increases in rat brain GABA. Psychopharmacology (Berlin). 127, (1), 19-24 (1996).
  9. Florio, C., Prezioso, A., Papaioannou, A., Vertua, R. Adenosine A1 receptors modulate anxiety in CD1 mice. Psychopharmacology (Berlin). 136, (4), 311-319 (1998).
  10. Engin, E., Treit, D. The effects of intra-cerebral drug infusions on animals' unconditioned fear reactions: a systematic review. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 32, (6), 1399-1419 (2008).
  11. Botton, P. H., et al. Aged mice receiving caffeine since adulthood show distinct patterns of anxiety-related behavior. Physiology and Behavior. 170, 47-53 (2017).
  12. Hughes, R. N., Hancock, N. J., Henwood, G. A., Rapley, S. A. Evidence for anxiolytic effects of acute caffeine on anxiety-related behavior in male and female rats tested with and without bright light. Behavioural Brain Research. 271, 7-15 (2014).
  13. Rex, A., Marsden, C. A., Fink, H. Effect of diazepam on cortical 5-HT release and behaviour in the guinea-pig on exposure to the elevated plus maze. Psychopharmacology (Berlin). 110, (4), 490-496 (1993).
  14. Almeida, S. S., Garcia, R. A., de Oliveira, L. M. Effects of early protein malnutrition and repeated testing upon locomotor and exploratory behaviors in the elevated plus-maze. Physiology of Behaviour. 54, (4), 749-752 (1993).
  15. Bertoglio, L. J., Carobrez, A. P. Behavioral profile of rats submitted to session 1-session 2 in the elevated plus-maze during diurnal/nocturnal phases and under different illumination conditions. Behavioural Brain Research. 132, (2), 135-143 (2002).
  16. Korte, S. M., De Boer, S. F. A robust animal model of state anxiety: fear-potentiated behaviour in the elevated plus-maze. European Journal of Pharmacology. 463, (1-3), 163-175 (2003).
  17. Carobrez, A. P., Bertoglio, L. J. Ethological and temporal analyses of anxiety-like behavior: the elevated plus-maze model 20 years on. Neuroscience & Biobehavioural Reviews. 29, (8), 1193-1205 (2005).
  18. Ari, C., et al. Exogenous ketone supplements reduce anxiety-related behavior in Sprague-Dawley and Wistar Albino Glaxo/Rijswijk rats. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 137 (2016).
  19. D'Agostino, D. P., et al. Therapeutic ketosis with ketone ester delays central nervous system oxygen toxicity seizures in rats. American Journal of Physiology: Regulation Integration and Comparative Physiology. 304, (10), R829-R836 (2013).
  20. Kovács, Z., D'Agostino, D. P., Ari, C. Anxiolytic effect of exogenous ketone supplementation is abolished by adenosine A1 receptor inhibition in Wistar Albino Glaxo/Rijswijk rats. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, 29 (2018).
  21. Lynn, D. A., Brown, G. R. The ontogeny of anxiety-like behavior in rats from adolescence to adulthood. Developmental Psychobiology. 52, (8), 731-739 (2010).
  22. Ferguson, S. A., Gray, E. P. Aging effects on elevated plus maze behavior in spontaneously hypertensive, Wistar-Kyoto and Sprague-Dawley male and female rats. Physiology of Behavior. 85, (5), 621-628 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics