Verhoogde Plus doolhof Test gecombineerd met Video Tracking Software om te onderzoeken van het Effect van de Anxiolyse van exogene ketogeen supplementen

Behavior
 

Summary

Hier presenteren we een protocol voor het onderzoek naar veranderingen in het niveau van de angst van knaagdier diermodellen. De verhoogde plus doolhof (EPM) test, samen met een video voor het bijhouden van software, gebruikt biedt een betrouwbare methode om te documenteren het effect van verschillende potentiële Anxiolyse behandelingen in preklinische laboratorium scenario's.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ari, C., D’Agostino, D. P., Diamond, D. M., Kindy, M., Park, C., Kovács, Z. Elevated Plus Maze Test Combined with Video Tracking Software to Investigate the Anxiolytic Effect of Exogenous Ketogenic Supplements. J. Vis. Exp. (143), e58396, doi:10.3791/58396 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Het algemene doel van deze studie is om te beschrijven van de methodologie van de verhoogde plus doolhof (EPM) test in combinatie met een video voor het bijhouden van software. Het doel van de methode is voor het documenteren van het effect van verschillende potentiële Anxiolyse behandelingen op laboratorium knaagdier modellen. De EPM-test is gebaseerd op de knaagdieren neiging richting beschermde, ingesloten donkere ruimten en onvoorwaardelijke angst voor open ruimtes en hoogten, en hun aangeboren intens motivatie om te verkennen van nieuwe omgevingen. De EPM-test is een veelgebruikte gedrags test voor het onderzoeken van de Anxiolyse of anxiogenic antwoorden van knaagdieren gegeven medicijnen waarvan bekend is dat het gedrag beïnvloeden. Opmerking een verminderde hoeveelheid tijd besteed aan gesloten armen, een grotere evenredigheid van de tijd op open armen, een beperkt aantal posten gesloten armen en een verhoogde aantal inzendingen te openen wapens gemeten door de EPM-test aan te tonen kan weerspiegelen verminderde angst niveaus. Met behulp van deze methode, wordt het effect van exogene keton supplementen op angst-gerelateerde gedrag getest bij Sprague-Dawley (SPD) ratten. Exogene keton supplementen zijn chronisch gevoed aan de ratten 83 dagen of subchronically en acuut mondeling gavaged, dagelijks voor 7 dagen, vóór het uitvoeren van de EPM-test. Gedrags-gegevens collectie wordt uitgevoerd met behulp van de intelligente video tracking systeem door een geblindeerde waarnemer aan het einde van de behandelingen. De belangrijkste bevindingen wijzen erop dat de EPM-test is een effectieve methode om te ontdekken het keton supplement-geïnduceerde Anxiolyse effect en kan worden beschouwd als een gevoelige maatregel te beoordelen van wijzigingen in de angst-gedrag drug of metabole gebaseerde therapieën zijn gekoppeld.

Introduction

Het doel van dit artikel is voor het beschrijven van de methodologie van de EPM-test in combinatie met een video voor het bijhouden van software om wijzigingen in de angst-gerelateerde gedrag en nieuwe behandelingen in laboratorium knaagdier modellen te volgen. De EPM-test is een relatief eenvoudige gedrags assessment-methodiek, die werd ontwikkeld voor onderzoek van het kwantificeren van de angst-gedrag-niveaus en angst reacties van ratten na de toepassing van de drug behandelingen1. Inderdaad, is gebleken dat de EPM-test een algemeen gebruikte en doeltreffende gedrags assay voor het onderzoek van wijzigingen in de angst niveaus voor knaagdieren1,2 is. De toepasselijkheid van de EPM-test bij knaagdieren (voornamelijk ratten en muizen) is gebaseerd op hun neiging naar gesloten, donkere ruimtes (benadering), een onvoorwaardelijke angst voor open ruimtes/hoogten (voorkomen) en de hoge mate van aangeboren motivatie om te verkennen van de roman omgevingen. De EPM-test is derhalve een gevestigde methode op basis van een benadering te vermijden conflict2,3.

De EPM is een plus-vormige apparaten die bestaat uit vier verhoogde armen, die is beschreven door Handley en Mithani4 (Figuur 1), en bestaat uit twee tegenovergestelde takken die openstaan voor de omgeving (open armen), overwegende dat de twee tegenovergestelde armen gesloten (gesloten arms) zijn uitgerust met muren. Na de behandeling, indien meer tijd wordt besteed aan de open armen en/of een groter aantal open arm vermeldingen in vergelijking met de (onbehandelde) controledieren wordt ontdekt op de EPM, betekent dit een Anxiolyse effect2,3. De meest robuuste vermijden reactie is aangetoond in de eerste 5 min na de start (plaatsing van de ratten in het snijpunt van de vier armen van de EPM) van de EPM-assay5; elk gedrag na een behandeling wordt daarom vaak geregistreerd voor 5 min op de EPM. Als aanvullende maatregelen voor een angst niveau, het aantal hoofd dips, steigert (verticale positie van het knaagdier op twee achterpoten), fecale boli, evenals de totale arm kunnen posten (spontane motorische activiteit) en verschillende houdingen (uitrekken of bevriezing), ook worden opgenomen op de EPM-2. Zo kunnen meerdere gedrags parameters worden gecompileerd om te zorgen voor een uitgebreide evaluatie van angst-gerelateerde gedrag.

Teneinde de geldigheid van de resultaten, twee tot drie gedrags testen vaak samen worden gebruikt, zoals de licht-donker keuze test, de sociale interactie, en de EPM-test, voor het meten van de angst niveaus van verschillende dierlijke modellen6. De EPM-bepaling uitgevoerd alleen op knaagdieren is ook een geschikte methode om te onderzoeken van het effect van het Anxiolyse of anxiogenic van verschillende drugs7. De EPM-test is gevoelig is niet alleen voor benzodiazepine-type anxiolytica (b.v., diazepam)8, maar ook o.a. aan amino acid, monoamino, peptidergic en nucleosidergic stoffen (bijv., N-methyl-D-aspartaat (NMDA)-antagonist AP7, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic zuur (AMPA) antagonist CNQX, µ-opioide receptor agonist morfine, NPY1-antagonist BIBP3226, substantie P, ghreline, oxytocine, serotonine receptor agonisten en antagonisten zoals 8-OH-DPAT en Way-100635 en β1-adrenergic antagonist betaxolol)9,10,11,12. Bijgevolg de EPM-bepaling op knaagdieren is een geschikt en gevoelige methode om de onderzoeken van de invloed van verschillende behandelingen die van invloed zijn hersengebieden die betrokken zijn bij het Anxiolyse effect (bijvoorbeeld, de amygdala, hippocampus en limbische gebieden) en de mechanismen van de actie (bijvoorbeeld, het serotonerge, GABAergic en adenosinergic systeem) betrokken bij angst,2. De agenten getest in deze EPM studies omvatten exogene keton supplementen die hersenen signalering in subtiele manieren waarvoor een gevoelige methode om te detecteren gedragsveranderingen kan veranderen.

In dit artikel beschrijven we de EPM-test gebruikt in combinatie met een video voor het bijhouden van software, die helpt bij het elimineren van experimentele bias en vergemakkelijkt het verzamelen en analyseren van gedragsmatige veranderingen in reactie op de roman Anxiolyse behandelingen.

Protocol

De behandeling van het dierlijk en het meten van de procedures werden uitgevoerd overeenkomstig de University of South Florida institutionele dierlijke zorg en gebruik Comité (IACUC) richtsnoeren (Protocol #0006R). Alle inspanningen geleverd om het aantal proefdieren.

1. voorbereiding

Opmerking: Het protocol vereist normaliter laboratorium-gefokt ratten of muis voor het testen van EPM. Echter zijn ook andere dieren, zoals cavia's, getest op EPMs13. Het is belangrijk om te overwegen het kleurcontrast tussen de dieren in het doolhof en de kleur van de maze wanneer met behulp van video bijhouden. Het contrast is minder belangrijk voor onderzoekers kijken naar dieren live of via video. De instellingen van de video tracking software moet worden geconfigureerd voor het document dat de dieren zijn zwart of wit op een zwarte of witte doolhof. Problemen met configuratie-instellingen kunnen optreden met een heldere acryl doolhof kan, maar een mat grijs doolhof optimaal is voor beide knaagdier kleuren.

  1. Selecteer dieren ten behoeve van het experiment, gezien de invloed van factoren, zoals spanning, seks, estrus cyclus, en leeftijd, evenals lichaam gewicht2mogelijkheden.
  2. Op basis van de individuele experiment, bepalen het aantal dieren per groep voor de test.
    Opmerking: De grootte van de groep worden afhankelijk van de grootte van het effect dat met de behandeling van de test wordt verwacht. Macht analyses zijn over het algemeen gedaan voordat het experiment wordt gestart en controleer het minimale aantal onderwerpen worden opgenomen de variabiliteit in dier reacties in een bepaalde taak, evenals het aantal groepen/proefomstandigheden gegeven.
  3. Ontwerpen van het experiment (waarin een batterij van verschillende gedrags tests, zoals de open-veldtest EPM test, hole-board test en gedwongen-zwemmen test zal worden gebruikt) zorgvuldig.
    Opmerking: Pre Gasbedwelming met behulp van de knaagdieren die een roman testomgeving (zoals een open-veld test) onmiddellijk vóór de EPM-tests kan het veranderen van het gedrag van de dieren op de EPM1,2.
  4. Behandelen alle dieren op een gelijkaardige manier voor de EPM-proef.
    Opmerking: Het is aangetoond dat verschillende stressfactoren, toepassing van medicijnen (bijvoorbeeld, injecties), scheepvaart stress, en behandeling het gedrag en de gedragsproblemen reacties van knaagdieren op de EPM-16 veranderen kan. Gewenning van de dieren naar een dierlijke huis (bijvoorbeeld, na verzending, voor 1-2 weken voordat de EPM-test), experimentele omstandigheden en behandeling procedures (bijvoorbeeld, gavaging) zijn dus noodzakelijk. Het is ook belangrijk dat de behandeling van de knaagdieren en enige ervaring met voorafgaande stressoren, met name onmiddellijk vóór de proef, over dieren en behandelgroepen strookt.
  5. Voeren de behavioral studies in nachtdieren, zoals ratten en muizen, met behulp van een omgekeerde licht fietsen, zodat de gedrags beoordeling kan worden uitgevoerd wanneer de dieren in hun donkere, actieve fase zijn.
    Opmerking: De effecten van verschillende huisvestingsomstandigheden en licht cyclus/circadiane ritmes op gedrag en de invloed daarvan op EPM resultaten werden gedemonstreerd eerder17, aangezien de dieren hormonen worden geregeld door de lichte cyclus.
  6. Gebruik van de dezelfde onderzoekers tijdens de procedures en vraag hen om parfum of zeep met een sterke geur te voorkomen.
  7. Vragen de onderzoekers niet te praten in de buurt van het dier tijdens het experiment of verplaatsen van objecten in de buurt van het EPM-milieu.
    Opmerking: Het is uitermate belangrijk dat de waarnemer minimale bewegingen en geen lawaai maakt bij het verzamelen van gedrags-gegevens.
  8. Schoon de hele EPM na elk experiment om te wissen van alle geuren van vorige dieren die met de verkenning van het proefdier interfereren kunnen.
  9. (Aanbevolen) Met de dieren omgaan voor meerdere dagen voordat de EPM-test (het oppakken van zachtjes door de romp en houdt het voor een minuut of twee) om hen aan de experimentator acclimatiseren.
  10. Bij het plaatsen van de dieren op de EPM, zorg ervoor dat alle dieren op een consistente wijze behandelen en plaats elke knaagdier in de EPM in dezelfde positie tegenover de dezelfde arm (bijvoorbeeld, in het centrum, tegenover de open arm uit de buurt van de experimentator).

2. toepassing van exogene keton supplementen

  1. Het meten van het lichaamsgewicht van de dieren voordat eventuele behandelingen om te bepalen voor de berekening van de dosering voor de behandeling (bijvoorbeeld, intragastric maagsonde).
  2. Vertrouwd de dieren aan de methode intragastric maagsonde (aanpassingsstage) met behulp van water door middel van een maagsonde voor 5 d voordat keton suppletie (standaard knaagdier chow/standaard dieet [SD] + water maagsonde; bijvoorbeeld2,5 g/kg lichaamsgewicht van water/dag). Het gebruik van alle dieren die niet aan te aan de methode intragastric maagsonde passen uitsluiten.
  3. Na de aanpassingsstage, het voeden van de dieren chronisch voor 83 d en subchronically voor 7 d met SD en maagsonde dagelijks met ofwel water (bijvoorbeeld5 g/kg lichaamsgewicht/dag, controlegroep: n = 8), keton supplementen zoals keton ester (KE; 1,3 - butaandiol-acetoacetaat diester; bijvoorbeeld5 g/kg lichaamsgewicht/dag; n = 8), keton zout (KS; NB+/K+\u2012beta-hydroxybutyrate [βHB] minerale zout; bijvoorbeeld5 g/kg lichaamsgewicht/dag; n = 8), of KS + middellange keten triglyceriden (1:1 verhouding, KSMCT; n = 8)18,19,20.
    Opmerking: De dieren waarvoor intragastric maagsonde werden getest op de EPM-1 h na de behandeling. Ratten gevoed met standaard knaagdier chow en gavaged met water (exclusief keton suppletie) diende als controlegroep.

3. angst Assay

  1. EPM toestellen
    1. Gebruik de dezelfde apparatuur over een studie op de standaardisering van de resultaten. De EPM is een plus-vormige apparaten, die uit vier armen bestaat (bijvoorbeeldde armen kunnen worden 10 cm breed en 50 cm lang): twee tegenovergestelde takken worden geopend, en de twee gesloten tegenover wapens zijn uitgerust met hoge (b.v., 30 cm) muren. Het apparaat is verheven boven de vloer (bijvoorbeelddoor 55 cm)2.
      Opmerking: De meest gebruikte parameters zijn de geaccumuleerde tijd doorgebracht in de open armen en het aantal items in de open armen; echter, de tijd doorgebracht in de gesloten armen en center, en het aantal items in de armen gesloten en center worden gemeten, evenals de afstand reisde in elk gebied.
    2. Oplichten van de EPM met behulp van indirecte verlichting (d.w.z., direct de lichtbron naar het plafond in plaats van direct het verlichten van het EPM-apparaat) en zorgen voor alle vier armen zijn ook verlicht (zonder schaduw, Zie Figuur 2).
      Opmerking: Wijzigingen in het niveau van het licht veranderen het gedrag van de knaagdieren op de EPM. Daarom is vergelijkbaar verlichting nodig in de opeenvolgende proefdieren en dagen (bijvoorbeeld, 2.800 lumen in de kamer)2.
  2. Video trackingsysteem
    Opmerking: Gebruik een tracking systeem met een computerinterface en een videocamera voor het verzamelen van gegevens, die automatisch gedrags-gegevens in ratten verzamelen zal (videoFiguur 3). Voor de tracking systeem, een breed scala aan standaard analoge camera's of gebruiker gedefinieerde beeldbronnen (infraroodcamera's, camcorder, WIA-compatibele USB-camera, webcams, videoetc.) kan worden gebruikt. Bij het analyseren van de opgenomen video, ondersteunt de verkeer-tracking-software alle gemeenschappelijke videoformaten, zoals AVI, .vob, .wmv, .asf, .mov, .qt, .mpg, .mpeg, .mp4, .3gp en .mkv. Doet de video afspelen niet correct, wellicht het een specifieke codec; extra video-indelingen worden ondersteund als de desbetreffende codec is geïnstalleerd in het systeem. De beweging-tracking-software kan ook worden gebruikt om eerder verworven video's analyseren en verwerken van de beelden van verschillende bronnen, zoals DVD/HD-recorders, digitale videobestanden (.avi, .divx, .mpeg,etc.), webcams, DV-camera's, en WIA-compatibele imaging-apparatuur.
    1. Systeeminstellingen
      1. Sluit de installatie-toets van de beweging-tracking-software op een USB 2.0-poort en start de installatie gereedschap.
      2. Los van de camera boven het experimentele gebied en ervoor zorgen dat het onbeweeglijk voor de duur van het experiment blijven zal.
      3. Een nieuw experiment in het verkeer-tracking softwaresysteem instellen met behulp van de handleiding. Selecteer Nieuw Experiment. Dubbelklik op het pictogram van het protocol dat de nieuwe experiment (Figuur 3, aanvullende bestand 1) moet volgen.
      4. Geef details etiket/beschrijven het experiment in de infodialoog met Experimenteren .
      5. Geef de bron van de videofragmenten om te verwerken.
      6. Het definiëren van de transformatie-regel voor een meting van de juiste afstanden. Het kalibratieproces kan de beweging-tracking software te worden ingelicht omtrent de werkelijke afmetingen van het experimentele gebied met het oog op een betrouwbare waarden voor de afstanden en snelheden.
      7. Het bepalen van de regio's van belang (zones) in het werkgebied.
      8. Aanpassen van de parameters van het detectieproces.
        1. Om de beweging-tracking-software om op te sporen precies de positie van het dier in de afbeelding, moeten enkele aanpassingen detectie worden ingesteld.
        2. Het controleproces vereist een duidelijk en goed contrasterende beeld met behulp van een fijne aanpassing van de algemene helderheid en het contrast parameters in de sectie van het helderheid & Contrast van hettoezichtpanel Detectie-instellingen . Zo nodig, deze instellingen voor de hele afbeelding of voor gebruiker gedefinieerde zones aanpassen.
      9. Zet een rat in elke arena om te testen het detectieproces.
      10. Druk op de knop Test starten om te controleren als het detectieproces correct het onderwerp kunt identificeren. Bevestig dat de detectie wordt geactiveerd door het uiterlijk van een stip op het scherm. Het kalibratieproces moet worden gedaan vóór de aanvang van de test.
      11. Detectie wordt beschouwd als bevestigd beschouwd als het alleen zwarte stip weergegeven in media player is het dier wordt bijgehouden. De rode lijn volgen moet volgen op de verplaatsingen van het dier. Goede tracking is ook bevestigd met een white label lijst het nummer van de dierlijke en overeenkomstige coördinaten gebaseerd op verplaatsing. Als een dergelijke detectie niet verkregen wordt, passen de drempel en erosies parameters voor het optimaliseren van de opsporing en het proces voor het bijhouden.
      12. Pas de drempel en erosie parameters om een testafbeelding scherper en ruisvrij.
      13. Als het pad volgen correct wordt gedetecteerd, drukt u op de knop Test stoppen (Figuur 4). Als deze aanpassingen worden gebruikt voor elke nieuwe experimentele bestand zullen, drukt u op de knop Opslaan als standaard . Druk op de knop accepteren de nieuwe detectie-instellingen op te slaan.
      14. Stel de criteria van de tijd van de proeven.
      15. Als de experimentele protocol de track acquisitie proces om te beginnen op hetzelfde moment die het onderwerp in het experimentele gebied wordt geplaatst vereist, is het mogelijk om de externe eenheid die wordt geleverd met de software of een draadloze muis te gebruiken.
        Opmerking: Deze optie biedt de mogelijkheid om op afstand controleren van de begin- en eindtijd.
    2. Installatie van de onderwerpen in het systeem
      1. Van het onderwerp van experimenten-database beheren. Voor het maken van een database van experimentele onderwerpen, voert u de Onderwerpen Database manager door het indrukken van de knop van de onderwerpen in de Assistent experimenten bar.
      2. Druk op de + knop nieuwe onderwerpen toevoegen aan de database.
      3. Met de optie één onderwerp is al geselecteerd, de certificaathouder voer.
      4. Vul de rest van de certificaathouder informatie in de sectie Eigenschappen van het onderwerp .
      5. Druk op de knop maken om toe te voegen van het nieuwe onderwerp.
      6. Vastleggen hoe experimenten. Gebruik de planner om de verschillende fasen, sessies, proeven en onderwerpen gepland om te worden uitgevoerd binnen het experimenteel project definiëren. Het proces automatisch als "het volgende proces" is geselecteerd om te worden uitgevoerd. Deze eigenschap wordt weergegeven als een groen vinkje op de linkerkant van het proces naam.
    3. Data-acquisitie door gelijktijdige opname en bijhouden
      Opmerking: Als een live beeld-bron is geselecteerd, het paneel van de speler voorziet in een ingesloten opname module gemakkelijk vastleggen van de video vanuit de geselecteerde camera.
      1. Bereiden de verkeer-tracking-software voor data-acquisitie (kalibratie zone definitie, detectie-instellingen, tijdinstellingen, scheduler).
      2. Open het deelvenster Data-acquisitie .
      3. Start de opname van de video van het experiment zonder het dier door op de knop opnemen beschikbaar in de software.
      4. Plaats het dier in het experimentele gebied.
      5. Start de data acquisitie proces door te drukken op de knop Start op het bedieningspaneel van de tijd . Het proces voor het bijhouden zal worden uitgevoerd gelijktijdig met het opnameproces. Indien nodig, vragen de experimentator te noteren de gedrags variabelen handmatig, zoals steigert, hoofd dips en falls (Figuur 5).
      6. Verzamelen van de EPM-gegevens handmatig, alsmede door een geblindeerde waarnemer (aparte de waarnemer van de EPM door een gordijn) in de test kamer.
      7. Wachten tot het einde van de opname proces voor het bijhouden of druk op de knop stoppen op het bedieningspaneel van de tijd .
      8. Het verwijderen van het dier uit het experimentele gebied. Het video-opname-proces beëindigen door het indrukken van de knop stoppen op de beweging-tracking software speler.
      9. Het experimentele gebied voor te bereiden voor het volgende dier door wassen en drogen. Herhaal de cyclus opnieuw.
    4. Data-analyse
      1. Voor toegang tot de analysetool , drukt u op de knop analyse in de Experimenten-assistent bar.
      2. Selecteer voor het genereren van analyserapporten van de afgewerkte proeven, de processen te analyseren. Configureren en selecteer het analyserapport. Stel de tijdsintervallen te analyseren. Genereren en de evaluatieverslagen. De resultaten exporteren naar een werkblad- of beeld formaten (Figuur 6).
  3. EPM voor het meten van angst niveaus
    1. De EPM-experimenten onder nonstress omstandigheden (in een vaag verlicht en rustige kamer) na mondelinge maagsonde uitvoeren
      Opmerking: Zorg ervoor dat de experimenten zijn uitgevoerd in een nauwe tijdsinterval (bijvoorbeeldtussen 1200 en 1400), omdat het circadiane ritme het gedrag van de knaagdieren op de EPM15,17 beïnvloeden kan. Vermijd onnodige verplaatsingen en lawaai tijdens het experiment.
    2. Vóór het begin van de test, ervoor te zorgen dat de EPM is gereinigd en gedroogd en de video tracking systeem klaar is voor gebruik.
    3. De ratten in hun kooi overbrengen in de laboratoriumruimte 30 minuten vóór het begin van het experiment.
    4. Plaats een rat op het kruispunt van de vier armen van de EPM, geconfronteerd met de open arm tegenover van de experimentator.
    5. Uitvoeren van de video voor het bijhouden van software, evenals het handmatig vastleggen van het gedrag van het dier, voor 5 min.
    6. Als het dier eraf valt de EPM, oprapen en plaats deze weer op hetzelfde punt van het EPM waar het viel. De gedrags-gegevens van dit dier uitsluiten in de analyse.
      Opmerking: Een luid geluid of beweging kan immobiliseren/bevriezen dieren op open armen. Als u een luid geluid hoort tijdens het experiment, sluiten de gedrags-gegevens van het dier in de experiment op dat moment van de analyse.
    7. Aan het eind van de 5 minuten test, stoppen van de video voor het bijhouden van software en verwijder het dier van de EPM. Plaats het terug in zijn kooi.
    8. Schoon voordat het volgende experiment/dier, de EPM met een reinigingsactief, desinfecterend schoonmaakmiddel (b.v.Quatricide) gevolgd door leidingwater. Droog het apparaat met papieren handdoeken.

4. analyse van de gegevens verzameld door de Video Tracking Systeem

  1. Op basis van de opgenomen gegevens, het analyseren van de hoeveelheid tijd doorgebracht in de open armen en in de gesloten armen; het aantal vermeldingen aangebracht in de open armen, gesloten armen, en de zone van het centrum; de latentie aan post in de gesloten armen; de afstand reisde in de open armen, gesloten wapens, en in de zone van het centrum.
    Opmerking: Het dier in een gebied wordt beschouwd als het centrum van het lichaam massa is in dat gebied.
  2. Bepalen van de effecten van behandelingen op gedrag met behulp van een variantieanalyse (ANOVA) met Fisher's minst significante verschil (LSD) test/Tukey meerdere vergelijkingen.

Representative Results

Het huidige experiment onderzoekt de hypothese dat suppletie van exogene keton toegediend hetzij chronisch (voor 83 dagen gevoed) of subchronically (mondeling gavaged voor 7 dagen) heeft een Anxiolyse effect op twee-maand-oude mannelijke Sprague-Dawley (SPD) ratten () 250-350 g). Chronische toediening bestond uit de volgende keton-supplementen: lage dosis keton ester (LKE; 1,3-butaandiol-acetoacetaat diester, ~ 10 g/kg/dag, LKE), hoge dosis keton ester (HKE; ~ 25 g/kg/dag, HKE), bèta-hydroxybutyraat-mineraal zout (bHB-S; ~ 25 g / kg/dag, KS), en bHB-S + middellange keten triglyceriden (MCT; ~ 25 g/kg/dag, KSMCT). Voor subchronische experimenten, de volgende behandeling in groepen werden gebruikt: KE, KS, en KSMCT (5 g/kg/dag). De controlegroepen opgenomen SD of SD met water maagsonde (control). Alle gegevens waren vertegenwoordigd als het gemiddelde ± de standaardfout van het gemiddelde (SEM). De resultaten werden beschouwd als belangrijke wanneer p < 0.05. De significantie werd bepaald door one-way ANOVA met Fisher's LSD test.

Na chronische voeding, ratten in de groep van de KSMCT aanzienlijk meer tijd doorgebracht in de open armen (p = 0.0094) in vergelijking met de controlegroep. De tijd doorgebracht in de armen gesloten was aanzienlijk minder in de groepen LKE, KS, en KSMCT (p = 0.0389, 0.0077 en 0.0019, respectievelijk), terwijl de KS-groep aanzienlijk meer tijd in het centrum doorgebracht (p = 0.0239) in vergelijking met de controle (SD) groep ( Figuur 7A) 18.

Ratten in de groepen KS en KSMCT reisde aanzienlijk langere afstanden in de open armen (p = 0,036 en 0.0165), terwijl de ratten in de groepen van het LKE, KS en KSMCT bleek aanzienlijk minder afstand in de gesloten armen reisde (p = 0.0252, 0.00041, en 0.0032, respectievelijk), in vergelijking met de controlegroep (SD) (figuur 7B). In vergelijking met de controlegroep, de groepen KS en KSMCT had grotere afstand reisde in het centrum-gebied (p = 0.0206 en 0.0482, respectievelijk), terwijl in de KSMCT-groep, de latentie bij de eerste ingang de gesloten armen was significant groter na chronische voeding (p = 0.0038)18 (Figuur 7 c).

De tijd doorgebracht in de open armen werd groter in de KE-groep (p = 0.0281) na 7 dagen van mondelinge maagsonde, terwijl in de KE, KS en KSMCT groepen, de tijd doorgebracht in het centrum daalde (p = 0.0005, < 0,0001, en = 0.023, respectievelijk), vergeleken met de contro l groep (figuur 8A)18. In de groepen KE en KS, het aantal posten naar de gesloten armen was aanzienlijk lager (p = 0.0436 en 0.0234, respectievelijk) na 7 dagen na toediening (figuur 8B), terwijl de ratten in de KS groep ook ingevoerd het centrum minder vaak (p = 0.0193), in vergelijking met de controlegroep (SD).

Figure 1
Figuur 1: verhoogde plus doolhof (EPM) gebruikt voor het testen van de ratten. Iedere tak is 10 cm breed en 50 cm lang, met twee tegenovergestelde armen opende met een verhoogde rand. De twee gesloten tegenover wapens zijn uitgerust met 30 cm hoge muren. De hoogte van de start-en landingsbaan van de vloer is 55 cm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: voorbeelden van directe en indirecte verlichting. Zorg ervoor dat de lichtbron is wees naar het plafond, terwijl het directe licht boven het experimentele gebied is geblokkeerd. Het is belangrijk om het gebruik van indirecte licht tijdens EPM experimenten om te verlichten ook alle vier armen zonder schaduw. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: de experimenten assistent bar van het verkeer-opsporingssoftware. Het is ontworpen om toegang tot de belangrijkste activiteiten. De knoppen komen overeen met de taak binnen het proces van de typische experimenten, terwijl alleen de momenteel toegestane taken actief zijn. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: de onderwerp-track is gemarkeerd met een rode lijn na van het dier verkeer. Door de drempel aan te passen, kan de achtergrond wordt verlaagd totdat alleen het dier wordt gedetecteerd en wordt bijgehouden door de rode lijn. De track volgt het midden van de massa van het onderwerp, en de huidige positie coördinaten worden aangegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: verhoogde plus doolhof (EPM) met een rat Sprague-Dawley (SPD) in de open wapen Een voorbeeld van de experimentele opstelling wordt aangetoond. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: geaccumuleerde verkeer spoor van het dier tijdens een proef. Als onderdeel van de data-analyse, kan de verzamelde traject trace van het onderwerp in het tracking-gebied worden weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: Behavioral reacties voor SPD rats in de EPM na 83 dagen chronische vervoederen van exogene keton suppletie. Deze panelen Showresultaten representatieve verzameld door de EPM en de beweging-tracking systeem18. (A) de KSMCT-groep uitgegeven een groter percentage van de tijd in de open armen, terwijl de LKE, KS, en KSMCT groepen minder tijd in gesloten armen, in vergelijking met de controlegroep (SD). (B) de KS en KSMCT groepen reisde meer afstand in de open armen, terwijl de LKE, KS, en KSMCT groepen reisde minder afstand in de gesloten armen, tonen verminderd angst ten opzichte van het besturingselement (SD) groep. (C) de KSMCT groep ingevoerd de gesloten armen later, die aangeeft verlaagde angst ten opzichte van het besturingselement (SD) groep. Afkortingen: SD = standaard knaagdier chow + water (25 g/kg lichaamsgewicht (BW) van water/dag); LKE = SD + LKE (1,3-butaandiol-acetoacetaat diester, 10 g/kg b.w./day); HKE = SD + HKE (25 g/kg b.w./day); KS = SD + beta-hydroxybutyraat-mineraal zout (bHB-S; 25 g/kg b.w./day); KSMCT = SD + bHB-S + middellange keten triglyceriden (MCT, 25 g/kg b.w./day); SPD = Sprague-Dawley ratten; EPM = verhoogde plus doolhof (* p < 0.05; ** p < 0,01; *** p < 0.001; *** p < 0.0001). Dit cijfer is gewijzigd van Ari et al. 18. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 8
Figuur 8: Behavioral reacties van SPD ratten na 7 dagen van mondelinge maagsonde van exogene keton suppletie. Representatieve resultaten werden verzameld door middel van de EPM-test, waarbij een beweging-tracking software systeem18. (A) de groep KE uitgegeven een groter percentage van de tijd in de open armen, terwijl de KE, KS, en KSMCT groepen minder tijd in het centrum (ten opzichte van de controlegroep [SD]), dus die aangeeft verminderd angst. (B) ten opzichte van het besturingselement (SD) groep, minder posten werden ontdekt in de gesloten armen van ratten in de groepen KE en KS. Afkortingen: SD = standaard knaagdier chow + water (5 g/kg b.w. van water/dag); KE = SD + keton ester (1,3-butaandiol-acetoacetaat diester, 5 g/kg b.w./day); KS = SD + beta-hydroxybutyraat-mineraal zout (bHB-S, b.w./day 5 g/kg); KSMCT = SD + bHB-S + MCT (5 g/kg b.w./day); SPD = Sprague-Dawley ratten; EPM = verhoogde plus doolhof (* p < 0.05; *** p < 0.001; *** p < 0.0001). Dit cijfer is gewijzigd van Ari et al. 18. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

In het algemeen gebruikte verschillende tests, zoals de licht-donker multiple-choice test, de test van de sociale interactie en de EPM-test, worden gebruikt voor het meten van de angst niveau in verschillende diermodellen. Echter, de EPM-bepaling alleen is een geschikte methode om te onderzoeken, bijvoorbeeld het effect van exogene keton supplementen op knaagdieren angst niveaus18,20.

Het belangrijkste voordeel van de EPM-methode is dat het is gebaseerd op de knaagdieren instinctieve neiging richting van donkere, afgesloten ruimten, naast de onvoorwaardelijke angst voor hoogten en het vermijden van open ruimtes. Aan de andere kant, zijn andere methoden gebruikt bij het bestuderen van de angst-achtig gedrag gebaseerd op de gedrags reacties op bepaalde schadelijke stimuli, zoals elektrische schok, voedsel/water ontbering, luide geluiden en blootstelling aan predator geur3. Deze tests resulteert dit meestal in een geconditioneerde reactie, terwijl de EPM ook een menselijker alternatief voorstelt. Bovendien, de EPM kan hierbij een nuttig instrument te bestuderen van de betrokkenheid van verschillende hersengebieden (b.v., limbische regio's, hippocampus) en de onderliggende mechanismen (bijvoorbeeldGABA, glutamaat, serotonine, adenosine) van angst gedrag2.

Bij de toepassing van behandelingen die heel belastend voor de dieren (bijvoorbeeldde mondelinge maagsonde), is het belangrijk dat alle dieren dezelfde manier worden behandeld en door dezelfde persoon, zijn met name bij de beoordeling van de potentiële, subtiele Anxiolyse effecten. Inleiding van de drug/stof in drinkwater of via een smakelijk 'behandelen' mogelijk indien mogelijk, een voorkeur. Om ervoor te zorgen dat hetzelfde bedrag wordt toegediend aan elk dier, kan een mondelinge maagsonde worden gebruikt. Op basis van de farmacokinetische eigenschappen van de stof, is het meestal verstandig te testen van de dieren op de EPM binnen 1 uur na gavaging. Bij het selecteren van experimentele onderwerpen, is het belangrijk om te overwegen hun stam, geslacht, estrus cyclus, en leeftijd, evenals lichaamsgewicht, volgens de doelstellingen en het testen van stoffen2. Met betrekking tot leeftijd, wanneer ontwerpen van EPM studies en interpreteren van gegevens, is het belangrijk om te overwegen die het percentage van de open arm posten lineair toeneemt met de leeftijd21 en de veroudering-gerelateerde veranderingen in gedrag van EPM zijn stam-specifieke22.

Bij het uitvoeren van een EPM-test, zijn er potentiële problemen die moeten worden aangepakt. Soms dieren moeten worden uitgesloten van de analyse als gevolg van de uitbijter tendensen (bijvoorbeeldhet dier nooit verlaat de ruimte waar het werd geplaatst, valt bijna uit het apparaat, wordt afgeleid door een ruis of gebeurtenis buiten het apparaat). Verdere complicaties met EPM testen bevatten behandelingen die sedatie of hyperactiviteit veroorzaken omdat deze soorten effecten moeten worden beoordeeld via EPM-parameters.

Het is belangrijk om de dieren naar de EPM-test slechts eenmaal bloot, want daalde van activiteit op de open armen en een verminderde totale tijd doorgebracht op het centrale platform werden gedemonstreerd op de tweede (herhaalde) blootstelling van knaagdieren in vergelijking met de eerste blootstelling op de EPM 14,15. Een eenmalige blootstelling van knaagdieren aan de EPM-test wordt daarom sterk aanbevolen. Echter als er is een minimum van drie weken tussen de eerste en tweede blootstelling aan de EPM en de opbouw van EPM wordt verplaatst naar een andere kamer (andere omgeving), de dieren kunnen worden onderzocht door de EPM test meerdere keren2.

De EPM is beschikbaar in verschillende materialen, maten (bijvoorbeeldvoor muis of rat) en kleuren, die moet worden overwogen bij het kiezen van studie onderwerpen. Het is belangrijk om te houden in het achterhoofd dat de geuren achtergelaten door het vorige dier op het apparaat kunnen het gedrag van het latere dier veranderen. Daarom is het raadzaam een EPM gebruik gemaakt van een materiaal die gemakkelijk te reinigen, zoals acryl glas (niet transparant), die geen geuren na het wassen bewaart. Vermijd EPM toestellen gemaakt van hout. Bij voorkeur, gebruik een matte kleur die afwijkt van de kleur van de dieren getest op de EPM (bijvoorbeeld, zwarte als witte dieren worden getest). Hoe beter het contrast tussen het dier en de behuizing, hoe beter de detectie van het dier en hoe hoger de betrouwbaarheid en nauwkeurigheid van de resultaten verkregen (afgelegde afstand, snelheid, tracking). EPM toestellen gemaakt van mat grijs materiaal zijn handig met wit, zwart, en wit en zwart dieren.

Een ander voordeel van de video-trackingsysteem is dat naast de EPM, het biedt een flexibele en gemakkelijke manier om in te stellen met een breed scala aan gedrags proeven, zoals water doolhof, open-veld, plus/radiale arm/T-Y doolhoven, plaats de voorkeur, gedwongen zwemmen , en staart schorsing proeven.

Kortom is het doel van dit artikel voor het beschrijven van de EPM-test gebruikt in combinatie met een video voor het bijhouden van software voor het verzamelen en analyseren van gedragsmatige veranderingen in reactie op de roman Anxiolyse behandelingen. De mogelijke toepassingen van de EPM omvatten de prescreening van nieuw ontwikkelde farmacologische agenten voor de behandeling van angst-gerelateerde aandoeningen. Naast de Anxiolyse en anxiogenic agenten, kunnen de gedrags effect van verschillende hormonen en drugs misbruik ook worden onderzocht. De invloed van de veroudering en blootstelling aan verschillende stressoren kan ook worden beoordeeld. Deze studie heeft geconcludeerd dat wanneer de juiste stappen worden genomen, het gebruik van de EPM heeft bewezen te zijn van een gevoelige methode te beoordelen gedragsveranderingen keton suppletie18,20is gekoppeld.

Disclosures

D'Agostino, D.P., Kesl, S., Arnold, P. composities en methoden voor de productie van verhoogde en volgehouden ketose. Internationale Patent # PCT/US2014/031237. Universiteit van Zuid-Florida.

Ari, C., D'Agostino, D.P., exogene keton supplementen voor het verminderen van angst-gerelateerde gedrag. Voorlopige patent #62289749. Universiteit van Zuid-Florida.

Dominic P. D'Agostino en Csilla Ari zijn mede-eigenaren van het bedrijf keton Technologies LLC.

Deze belangen zijn geëvalueerd en beheerd door de Universiteit overeenkomstig haar institutionele en individuele belangenconflict beleid. Alle auteurs verklaren dat er geen extra belangenconflicten.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door een ONR Grant N000141310062 en een GLUT1D Stichting Grant #6143113500 (naar Dominic P. D'Agostino), door de nationale ontwikkeling Bureau van Hongarije (onder Grant nr. TIOP-1.3.1.-07/2-2F-2009-2008; aan de Zsolt Kovács) en door het Department of Veterans Affairs (tot het Mark nodig). De auteurs bedank Quest Nutrition LLC voor het steunen van lopend onderzoek over dit onderwerp (naar Csilla Ari).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elevated Plus Maze for mice and rats Coulbourn Instruments H10-35-EPM
SMART Video Tracking Software Harvard Apparatus SMART 3.0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. Validation of open : closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 14, (3), 149-167 (1985).
  2. Walf, A., Frye, C. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nature Protocols. 2, (2), 322-328 (2007).
  3. Barnett, S. A. The rat: A study in behavior. University of Chicago Press. Chicago, IL. (1975).
  4. Handley, S. L., Mithani, S. Effects of alpha-adrenoceptor agonists and antagonists in a maze-exploration model of 'fear'-motivated behaviour. Naunyn Schmiedebergs Archives. In Pharmacology. 327, (1), 1-5 (1984).
  5. Montgomery, K. C. The relation between fear induced by novel stimulation and exploratory behavior. Journal of Comparative Physiology and Psychology. 48, (4), 254-260 (1955).
  6. Sarkisova, K. Y., Midzianovskaia, I. S., Kulikov, M. A. Depressive-like behavioral alterations and c-fos expression in the dopaminergic brain regions in WAG/Rij rats with genetic absence epilepsy. Behavioral Brain Research. 144, (1-2), 211-226 (2003).
  7. Jain, N., Kemp, N., Adeyemo, O., Buchanan, P., Stone, T. W. Anxiolytic activity of adenosine receptor activation in mice. British Journal of Pharmacology. 1116, (3), 2127-2133 (1995).
  8. Paslawski, T., Treit, D., Baker, G. B., George, M., Coutts, R. T. The antidepressant drug phenelzine produces antianxiety effects in the plus-maze and increases in rat brain GABA. Psychopharmacology (Berlin). 127, (1), 19-24 (1996).
  9. Florio, C., Prezioso, A., Papaioannou, A., Vertua, R. Adenosine A1 receptors modulate anxiety in CD1 mice. Psychopharmacology (Berlin). 136, (4), 311-319 (1998).
  10. Engin, E., Treit, D. The effects of intra-cerebral drug infusions on animals' unconditioned fear reactions: a systematic review. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 32, (6), 1399-1419 (2008).
  11. Botton, P. H., et al. Aged mice receiving caffeine since adulthood show distinct patterns of anxiety-related behavior. Physiology and Behavior. 170, 47-53 (2017).
  12. Hughes, R. N., Hancock, N. J., Henwood, G. A., Rapley, S. A. Evidence for anxiolytic effects of acute caffeine on anxiety-related behavior in male and female rats tested with and without bright light. Behavioural Brain Research. 271, 7-15 (2014).
  13. Rex, A., Marsden, C. A., Fink, H. Effect of diazepam on cortical 5-HT release and behaviour in the guinea-pig on exposure to the elevated plus maze. Psychopharmacology (Berlin). 110, (4), 490-496 (1993).
  14. Almeida, S. S., Garcia, R. A., de Oliveira, L. M. Effects of early protein malnutrition and repeated testing upon locomotor and exploratory behaviors in the elevated plus-maze. Physiology of Behaviour. 54, (4), 749-752 (1993).
  15. Bertoglio, L. J., Carobrez, A. P. Behavioral profile of rats submitted to session 1-session 2 in the elevated plus-maze during diurnal/nocturnal phases and under different illumination conditions. Behavioural Brain Research. 132, (2), 135-143 (2002).
  16. Korte, S. M., De Boer, S. F. A robust animal model of state anxiety: fear-potentiated behaviour in the elevated plus-maze. European Journal of Pharmacology. 463, (1-3), 163-175 (2003).
  17. Carobrez, A. P., Bertoglio, L. J. Ethological and temporal analyses of anxiety-like behavior: the elevated plus-maze model 20 years on. Neuroscience & Biobehavioural Reviews. 29, (8), 1193-1205 (2005).
  18. Ari, C., et al. Exogenous ketone supplements reduce anxiety-related behavior in Sprague-Dawley and Wistar Albino Glaxo/Rijswijk rats. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 137 (2016).
  19. D'Agostino, D. P., et al. Therapeutic ketosis with ketone ester delays central nervous system oxygen toxicity seizures in rats. American Journal of Physiology: Regulation Integration and Comparative Physiology. 304, (10), R829-R836 (2013).
  20. Kovács, Z., D'Agostino, D. P., Ari, C. Anxiolytic effect of exogenous ketone supplementation is abolished by adenosine A1 receptor inhibition in Wistar Albino Glaxo/Rijswijk rats. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, 29 (2018).
  21. Lynn, D. A., Brown, G. R. The ontogeny of anxiety-like behavior in rats from adolescence to adulthood. Developmental Psychobiology. 52, (8), 731-739 (2010).
  22. Ferguson, S. A., Gray, E. P. Aging effects on elevated plus maze behavior in spontaneously hypertensive, Wistar-Kyoto and Sprague-Dawley male and female rats. Physiology of Behavior. 85, (5), 621-628 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics