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Extracellular ट्रिपनोसोम का शुद्धिकरण, अफ्रीकी सहित, द्वारा रक्त से Anion-एक्सचेंजर्स (Diethylaminoethyl-सेलुलोस कॉलम)

Immunology and Infection

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Summary

रक्त से trypanosome जुदाई की इस विधि उनकी सतह चार्ज पर निर्भर करता है स्तनधारी रक्त कोशिकाओं से कम नकारात्मक जा रहा है । संक्रमित रक्त रखा जाता है और एक anion-एक्सचेंजर कॉलम पर इलाज किया । इस विधि, अफ्रीकी trypanosomiasis के लिए सबसे फिटिंग नैदानिक, immunological, जैविक, जैव रासायनिक, दवा और आणविक जीव विज्ञान की जांच के लिए शुद्ध परजीवी प्रदान करता है ।

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Courtois, P., Nabos, P., Nzoumbou-Boko, R., Reix, C. E., Dauchy, F. A., Daulouede, S., Bringaud, F., Robinson, D. R., Vincendeau, P. Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns). J. Vis. Exp. (146), e58415, doi:10.3791/58415 (2019).

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Abstract

इस विधि trypanosomes के पृथक्करण की अनुमति देता है, परजीवी जानवर और मानव अफ्रीकी trypanosomiasis के लिए जिंमेदार (टोपी), संक्रमित रक्त से । यह पहले चरण टोपी के निदान के लिए सबसे अच्छा तरीका है और इसके अलावा इस परजीवी शोधन विधि सीरम वैज्ञानिक और अनुसंधान जांच परमिट ।

हैट की वजह से होता है सीटसे फ्लाई ट्रांसमिट ट्रिपनोसोमा ब्रुआफॅ गैंबिएनसे और टी. बी. रोडीसींस । संबंधित ट्रिपनोसोम, पशु ट्रिपनिसोमिआसिस के रोगजनक कारक हैं । ट्रिपैनोकुछ जांच हाच निदान, उपचार और अनुवर्ती के लिए आवश्यक है । यहां वर्णित तकनीक सबसे संवेदनशील परजीवी जांच तकनीक है, जो टी. बी. गैंबींस हैट के निदान के लिए क्षेत्र की स्थितियों के अनुकूल है और इसे एक घंटे के भीतर पूरा किया जा सकता है । रक्त एक anion पर स्तरित है-एक्सचेंजर कॉलम (डीएए सेलुलोस) पहले से 8 पीएच को समायोजित, और रेफरेंस बफर जोड़ा जाता है । अत्यधिक ऋणात्मक आवेशित रक्त कोशिकाएँ स्तंभ पर अधिशोषित होती हैं जबकि कम ऋणात्मक प्रभारित ट्रिपनोसोम के माध्यम से गुजरती हैं । एकत्रित ट्रिपनोसोम अपकेंद्रण द्वारा पेल्टेड होते हैं और माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया जाता है । इसके अलावा, परजीवी सेलुलर नुकसान के बिना तैयार कर रहे है whilst उनके infectivity बनाए रखने ।

शुद्धि ट्रिपनोसोम प्रतिरक्षा परीक्षण के लिए आवश्यक हैं; वे trypanolysis परख, टोपी serology में सोने के मानक में उपयोग किया जाता है । दाग परजीवी क्षेत्र serology के लिए कार्ड समूहन परीक्षण (catt) में उपयोग किया जाता है । प्यूरेफाइड ट्रिपनोसोम से एंटीजन, जैसे भिन् न पृष् ठ ग्लाइकोप्रोटीन, बहिर्वेतिजन, विभिन् न प्रतिरक्षा में भी प्रयोग किए जाते हैं यहां वर्णित प्रक्रिया अफ्रीकी trypanosomes के लिए बनाया गया है; नतीजतन, क्रोमैटोग्राफी शर्तों प्रत्येक trypanosome तनाव के लिए अनुकूलित किया जाना है, और अधिक आम तौर पर, मेजबान स्तनपायी की प्रत्येक प्रजाति के रक्त के लिए ।

इन आकर्षक रोगजनकों आसानी से शुद्ध और biochemical में उपयोग करने के लिए उपलब्ध हैं, आणविक और कोशिका जीवविज्ञान मेजबान कोशिकाओं के साथ सह संस्कृति सहित अध्ययन करने के लिए मेजबान की जांच करने के लिए झिल्ली रिसेप्टर्स के स्तर पर परजीवी रिश्तों, संकेतन, और जीन अभिव्यक्ति विट्रो मेंदवा परीक्षण; जीन विलोपन, उत्परिवर्तन, या चयापचय की प्रक्रिया पर overexpression, cytoकंकाल जीवजनन और परजीवी अस्तित्व की जांच ।

Introduction

प्रस्तुत विधि यहां वर्णित trypanosomes के पृथक्करण की अनुमति देता है, परजीवी जानवर और मानव के लिए जिंमेदार अफ्रीकी trypanosomiasis (टोपी), रक्त से । यह पहले चरण टोपी के निदान के लिए सबसे अच्छा तरीका है और इसके अलावा इस परजीवी शोधन विधि मजबूत सीरम विज्ञानी और अनुसंधान जांच परमिट ।

हैट की वजह से होता है सीटसे फ्लाई ट्रांसमिट ट्रिपनोसोमा ब्रुआफॅ गैंबिएनसे और टी. बी. रोडीसेंस1. ये प्रोटोजोआन परजीवी रोग के पहले चरण (hemलसीका चरण) के दौरान खून, लसीका, और अंतरालीय तरल पदार्थ में extracellularly गुणा । दूसरे चरण (meningoencephalitic अवस्था) जब परजीवी रक्त मस्तिष्क बाधा पार शुरू होता है; एक नींद विकार है, जो अपने नाम "सो बीमारी" इस रोग के लिए दिया गया है सहित स्नायविक लक्षण, इस दूसरे चरण2की विशिष्ट हैं । संबंधित ट्रिपनोसोम (टी. एवंसी, टी. congolense, टी. विवैक्स, टी. बी. ब्रुआफॅ), पशु अफ्रीकन ट्रिपान्सोमोसिस (AAT)3के प्रेरणा कारक हैं ।

विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) २०२० द्वारा एक सार्वजनिक स्वास्थ्य समस्या के रूप में टोपी को खत्म करने और २०३०4द्वारा संचरण रोकने के लिए करना है । तेजी से निदान परीक्षणों के हाल ही में परिचय सीरम विज्ञानी निदान1,4,5में सुधार हुआ है । कई आण्विक नैदानिक परीक्षणों को विकसित किया गया है लेकिन क्षेत्र निदान में उनकी भूमिका अभी तक स्थापित नहीं की गई है5। वे ब्रूआफॅ समूह और atypical ट्रिपनोसोमिआसिस की उप प्रजातियों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है परजीवी के लिए जिंमेदार के कारण जानवरों trypanosomosis6

परजीवी का पता लगाने के निदान, उपचार और अनुवर्ती के लिए आवश्यक है, के रूप में सीरोलॉजी झूठी सकारात्मक और दुर्भाग्य से झूठी नकारात्मक परिणाम1दे सकते हैं । टी. बी. गैंबिएंसके कारण होने वाले हैट मामलों में, (मामलों की ९५% से अधिक) कम परजीवी के रूप में नियम हैं, जबकि टी. बी. rhoडीजींसकी वजह से टोपी के लिए, एक बड़ी है इन hemoflagellate प्रोटिस्टों की प्रत्यक्ष सूक्ष्मदर्शीय अवलोकन मुश्किल है रक्त में परजीवी की संख्या अक्सर मौजूद होते हैं । विभिंन एकाग्रता तकनीकों का इस्तेमाल किया गया है, जैसे मोटी बूंद और केशिका ट्यूब केंद्रापसारक (सीटीसी), लेकिन anion के एक कॉलम द्वारा रक्त से परजीवी के पृथक्करण-एक्सचेंजर (डीएए सेलुलोस) केंद्रापसारक और सूक्ष्मदर्शी अवलोकन के बाद गोली, सबसे संवेदनशील विधि है (लगभग ५० परजीवी/एमएल रक्त का पता लगाया जा सकता है)1,7. फलस्वरूप, इस anion द्वारा trypanosomes की शुद्धि-एक्सचेंजर्स (डीएए सेलुलोस) विधि सबसे अच्छा है और, तारीख करने के लिए, visualizing और टोपी निदान के लिए खून से परजीवी अलग करने के लिए संदर्भ विधि । क्षेत्रीय परिस्थितियों में, डीएएई सेलुलोस का एक लघु कॉलम सफलतापूर्वक प्रयोग किया गया है और कई सुधार माइक्रोस्कोकल प्रेक्षण7,8में मदद कर चुके हैं ।

रक्त से trypanosome जुदाई की विधि, नीचे वर्णित, परजीवी सतह चार्ज है, जो कम नकारात्मक है पर निर्भर करता है स्तनधारी रक्त कोशिकाओं9। दिलचस्प है, इस विधि ५० साल पहले विकसित किया गया था, १९६८ में Dr. शीला Lanham द्वारा, और पता लगाने और खून trypanosomes की तैयारी के लिए सोने के मानक बनी हुई है । यह तेजी से है और स्तनधारियों की एक विस्तृत श्रृंखला से लार trypanosomes के लिए reproducible, दोनों जानवर और मानव trypanosomiasis के निदान की अनुमति10

जीवित प्राप्त करने के लिए, शुद्ध परजीवी, संक्रमित रक्त एक anion-एक्सचेंजर कॉलम पर जोड़ा जाता है । Chromatography शर्तों (मुख्य रूप से पीएच, बफ़र्स की आयनिक शक्ति/मीडिया) प्रत्येक trypanosome प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जाना है, और अधिक आम तौर पर, स्तनधारी रक्त कोशिकाओं के प्रत्येक मिश्रण करने के लिए और10trypanosome । Elution बफर ठीक सबसे अफ्रीकी trypanosomes10के लिए पीएच 8 को समायोजित किया है । इस विधि से रोगियों के रक्त में पाए जाने वाले परजीवी की एकाग्रता का उपकार होता है, क्योंकि पैरासेमियस को भी सूक्ष्मदर्शी प्रेक्षण द्वारा ही पता लगाया जा सकता है, और यह प्रयोगशाला जांच को भी सक्षम बनाता है । ताजा अलग trypanosomes के साथ काम करने और संक्रमित पशुओं से खून पर, इस तकनीक का उपयोग कर, परजीवी है कि एक अनिश्चित अवधि के लिए प्रयोगशाला में असंदूषित स्थितियों में किया गया है के साथ अध्ययन से विभिंन जांच के लिए और अधिक प्रासंगिक है ।

मेजबान-परजीवी संबंधों को सबसे अच्छा एक अपने प्राकृतिक मेजबान को संक्रमित परजीवी के साथ अध्ययन कर रहे हैं, इसलिए, टी musculi, एक प्राकृतिक म्यूरिन परजीवी, जो extracellular trypanosomes के प्रतिनिधि है, murine संक्रमण के रूप में कई फायदे है एक में शामिल है लघु प्रयोगशाला पशु और जैव जोखिम सुरक्षा स्तर (बीएसएल) की स्थिति की आवश्यकता नहीं है । टी musculi असुरक्षित चूहों को मारने नहीं है, मानव रोगजनकों सहित कई अन्य trypanosoma प्रजातियों के विपरीत । T. musculi टी सेल में समाप्त नहीं कर रहे हैं-वंचित चूहों और परजीवी भोजन और पोषक तत्वों का सेवन11संशोधित करके संक्रमित चूहों में बढ़ाया जा सकता है. यह परजीवी अन्य रोगजनकों12के साथ सह-संक्रमणों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया modulates. T . musculi संक्रमित चूहों से सुसंस्कृत टी musculi से मतभेद प्रदर्शन, उदाहरण के लिए, झिल्ली एफसी रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति टी में खो जाता है musculi असंदूषित संस्कृतियों, संक्रमित चूहों से शुद्ध परजीवी की तुलना में13 , 14. उत्सर्जित-स्रावित कारकों (esf) भी गुणात्मक और मात्रात्मक कम एक्जेनिक trypanosome संस्कृतियों में व्यक्त कर रहे है और स्थानिकमारी वाले क्षेत्रों में अलग उपभेदों के बीच अलग15। ESF पहली एंटीजन मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली को प्रदर्शित करने के लिए कर रहे है और इसलिए प्रारंभिक मेजबान प्रतिरक्षा16प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं ।

प्रायोगिक रूप से संक्रमित पशुओं में प्रयोगशाला जांच के लिए, इस प्रोटोकॉल परजीवी की एक बड़ी संख्या पर प्रयोग की सुविधा, विशेष रूप से जब immunosuppressed जानवरों का उपयोग कर आवश्यक चूहों की संख्या को कम करने । बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग में ट्रिपनोसोमिएसिस (CATT) के लिए कार्ड Agglutination परीक्षण में उपयोग किया जाता है कि संस्करण सतह नच (VSGs) अभी भी trypanosomes है कि चूहों में प्रचारित कर रहे हैं से शुद्ध कर रहे हैं । दो तेजी से नैदानिक परीक्षणों (व्यक्तिगत कैसेट लिपटे) है कि क्षेत्र में उपयोग के लिए अब उपलब्ध हैं, अभी भी देशी vsgs के एक संक्रामक मॉडल स्रोत का उपयोग कर रहे है और नहीं विट्रो में सुसंस्कृत trypanosomes1,4, 5. trypanosome प्रतिरक्षा विज्ञान और जीव विज्ञान के अध्ययन में प्रगति की सुविधा के बाद से इन डीईए सेलुलोस शुद्ध परजीवी आसानी से प्राकृतिक रूप से या प्रयोगात्मक संक्रमित मेजबान से बड़ी मात्रा में प्राप्त किया जा सकता है, और विशेष रूप से, rodents ।

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Protocol

प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए दिशा निर्देशों के अनुरूप जांच (एनआईएच प्रकाशन सं 85 ± 23, संशोधित १९९६) । प्रोटोकॉल हमारी स्थानीय आचार समिति द्वारा अनुमोदित किए गए थे ।

1. पशु

  1. महिला स्विस रखें (के-1) चूहों आठ से दस सप्ताह पुराने, 20-25 जी, एक पशु आवास सुविधा में पंद्रह दिनों के प्रत्येक प्रयोग से पहले । उंहें हवादार बक्से में घर है कि एक संरक्षित, तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) और आर्द्रता में रखा जाता है (५०%) /बंद प्रकाश चक्र पर 12 घंटे के साथ कमरे, नियंत्रित ।
  2. पशुओं को भोजन व पानी तक मुफ्त पहुंच दें । दर्द, पीड़ा और कष्ट को कम करने और पर्यावरण के संवर्धन प्रदान करते हैं ।
  3. आवास के लिए, लकड़ी की छड़ें और कार्डबोर्ड सुरंगों के साथ साफ-दीवारों पिंजरों, संवर्धन का उपयोग करें । इसे पिंजरे से हाथ की हथेली पर स्थानांतरित करने के लिए एक सुरंग में एक जानवर को धीरे से ड्रा करें ।
  4. साष्टांग, सामाजिक अलगाव, शरीर की चोट, बाल, या सौंदर्य की कमी के लक्षण का आकलन करने के लिए दैनिक निगरानी करते हैं ।
  5. प्रति सप्ताह एक बार एक जानवर तौलना । एक पशुचिकित्सा द्वारा नियमित निरीक्षण करते हैं ।
  6. प्राकृतिक परजीवी के लिए, परजीवीमिया के चरम पर रक्त इकट्ठा करने और पशुओं की मौत के कारण परजीवी के लिए, माना मौत से पहले दिन रक्त इकट्ठा ।
    नोट: विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित दिशानिर्देशों के अनुसार, समर्पित कमरों में संक्रामक एजेंटों के साथ सभी प्रयोगों का प्रदर्शन किया जाता है ।

2. बफ़र्स, मीडिया तैयारी

  1. प्रत्येक पदार्थ का वजन और निम्नलिखित बफ़र्स के लिए आसुत जल जोड़ें:
    1. तैयार केंद्रित फॉस्फेट-Buffered खारा (2x):
      ना2hpo4 (एनहाइड्रोस) (MW १४१.९६ g) १०.१४ g
      णः2पीओ4∙ 2h2O (MW १५६.०१ g) ०.६२ g
      NaCl (मेगावाट ५८.४४ ग्राम) २.५५ ग्राम
      डिस्टिल्ड एच2ओ से 1 L
    2. फॉस्फेट-Buffered खारा-ग्लूकोज तैयार:
      ना2hpo4 (एनहाइड्रोस) (MW १४१.९६ g) ५.३९ g
      णः2पीओ4∙ 2h2O (MW १५६.०१ g) ०.३१ g
      NaCl (मेगावाट ५८.४४ ग्राम) १.७० ग्राम
      ग्लूकोज (मेगावाट १८० ग्राम) 10 ग्राम
      डिस्टिल्ड एच2ओ से 1 L
    3. तैयार 1 M ख2पो4.
    4. वेफरेंस बफर तैयार: अनुपूरक फॉस्फेट-Buffered खारा-ग्लूकोज के साथ
      पेनिसिलिन (१०० U/mL), स्ट्रेप्टोमाइसिन (१०० μg/mL), और फीनॉल लाल (5 μg/एमएल) ।

3. डीएए-सेलुलोस की तैयारी

  1. डीएए-सेलुलोस तैयारी के लिए लगभग 5 घंटे की योजना बनाएं ।
  2. एक संकीर्ण गर्दन के साथ एक कुप्पी में आसुत जल के साथ डीआे-सेलुलोस के १०० जी धो और व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं, तो ठीक कणों को छोड़ दें । दोहराने washes जब तक supernatant स्पष्ट है ।
  3. ध्यान केंद्रित 2x फॉस्फेट के 3 एल-Buffered खारा और हलचल जोड़ें ।
  4. 1 एम ख2पीओ4 के साथ ८.० को पीएच समायोजित करें और supernatant छोड़ें ।
  5. आसुत जल के साथ दो बार धो लें और बसने के लिए छोड़ दें ।
  6. धोने और 3 लीटर फॉस्फेट-Buffered खारा-ग्लूकोज के साथ दो बार बसने और supernatants त्यागने की अनुमति ।
  7. सेलूलोज़ की मात्रा को मापने और फॉस्फेट-Buffered खारा-ग्लूकोज की एक समान मात्रा को जोड़ने, प्लास्टिक की बोतलों में वितरित और-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.

4. परजीवी

  1. मानव और पशु trypanosomiasis के लिए स्थानिक क्षेत्रों में trypanosome उपभेदों लीजिए । परजीवी को तरल नाइट्रोजन में जम कर रखें ।
    नोट: ट्रिपैनोसोमा musculi मानव के लिए गैर रोगजनक है और विभिन्न प्रयोगशाला प्रयोगों में सुरक्षित रूप से रोगजनक trypanosoma की जगह के लिए इस्तेमाल एक extracellular trypanosoma है.
  2. प्रयोगशाला जांच के मामले में मानव रोगजनकों की आवश्यकता होती है, समर्पित उपयुक्त biohazard सुरक्षा स्तर (बीएसएल) की स्थिति और सावधानियों में देखभाल के साथ प्रयोग संभाल; टी. बी. रोडीजीेंसेके लिए टी. बी. गैंबींस और BSL3 के लिए BSL2. क्षेत्र की स्थितियों में, मानक माइक्रोबायोलॉजिकल अभ्यास की स्थापना की जाती है: सुरक्षित नमूनाकरण, यांत्रिक पिख्ता, सतहों के अक्सर विसंदूषण, और अपशिष्ट की नसबंदी.

5. माउस संक्रमण

  1. तेजी से ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक जल स्नान में परजीवी गल ।
  2. एक माइक्रोस्कोप से संक्रमित रक्त की एक बूंद का प्रेक्षण कीजिए । मोटाइल रूपों के प्रतिशत को मापने के द्वारा परजीवी व्यवहार्यता का आकलन17
  3. परजीवी intraperitoneally चूहों में सुई (प्रति माउस ०.५ मिलीलीटर) । प्रत्येक दिन, संक्रमण के बाद, सुई पंचर द्वारा 20 μL पूंछ रक्त इकट्ठा करने और एक खुर्दबीन के नीचे का पालन करें । कई माइक्रोस्कोप क्षेत्रों में परजीवी गिनती द्वारा Herbert और Lumsden18 के अनुसार परजीवी का मूल्यांकन, या एक haemocytometer का उपयोग करके ।
  4. जब पैरासिमिया एक सीमा है कि प्रत्येक तनाव के लिए परिभाषित किया गया है तक पहुँचता है, रक्त (1 मिलीलीटर/माउस) के वेशन बफर (5 मिलीलीटर/
    नोट: Lanham और Godfrey के मूल और उपंयास काम एक पीएच ८.० स्टॉक समाधान से कई मेजबान/परजीवी प्रजातियों के लिए फॉस्फेट buffered खारा ग्लूकोज की इष्टतम आयनिक शक्ति की सूचना दी ।

6. परजीवी जुदाई

नोट: इस बिंदु के बाद से सभी प्रयोगों एक ऊतक संस्कृति हुड पहने हुए दस्ताने में किया जाना चाहिए । उपयोग की जाने वाली प्रयोगशालाओं में कमरे का तापमान और आर्द्रता क्रमशः 22 डिग्री सेल्सियस और ४५% थी । फील्ड स्थितियों में, परजीवी जुदाई ३४ डिग्री सेल्सियस पर सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया गया है ।

  1. एक ऊर्ध्वाधर समर्थन में एक 10 मिलीलीटर सिरिंज प्लेस और एक पहले से कटौती परिपत्र, फिल्टर कागज, कांच ऊन या सेलुलोस स्पंज का टुकड़ा जोड़ें ।
  2. 8 मिलीलीटर स्तर तक पहुंच गया है जब तक सिरिंज में डीएए सेलुलोस डालो, और फिर 25 मिलीलीटर के साथ वेफरेंस बफर धो लें ।
  3. ध्यान से कॉलम के शीर्ष पर पतला रक्त की 2 मिलीलीटर जोड़ें और फिर रेफरेंस मध्यम जोड़ें । ट्रिपनोसोम के पारगमन के अनुसार नियमित रूप से वेफरेंस बफर जोड़ें ।
  4. एक अपकेंद्रज नली में स्तंभों से बहिर्वाही बूँदें लीजिए और सूक्ष्मदर्शी के साथ परजीवी की उपस्थिति के लिए नियमित रूप से जांच करें ।
  5. जब परजीवी अब स्तंभ बहिस्त्राव में नहीं पाए जाते हैं, तो ट्यूब (१,८०० x g, 10 मिनट, प्रयोगशाला में 4 डिग्री सेल्सियस पर और क्षेत्र परिस्थितियों में परिवेश के तापमान पर) सेंट्रीफ्यूज ।
  6. सुपर्णांत निकालें और परजीवी को अगले खोजी कदम के लिए आवश्यक प्रासंगिक माध्यम के 1 मिलीलीटर में निलंबित करें ।
  7. एक hemocytometer के साथ परजीवी गिनती और उचित माध्यम में उन्हें पतला यदि आवश्यक हो.

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Representative Results

शुद्धित ट्रिपनोसोम का प्रयोग भेषज परीक्षणों में किया गया है । परजीवी संस्कृति कुओं में स्थानांतरित कर रहे है विशिष्ट दवाओं के सीरियल dilutions युक्त, या तो अकेले या मिश्रित19। सूक्ष्मदर्शी अवलोकन, गतिशीलता का मूल्यांकन व्यवहार्यता का एक मार्कर है, जब केवल कुछ dugs परीक्षण किया जा रहा है, जबकि AlamarBlue सेल व्यवहार्यता परख दवा स्क्रीनिंग20के दौरान बड़ी गतिशीलता assays के लिए एक उत्कृष्ट तरीका है किया जा सकता है । पेंटमिडीन, हैट थेरेपी में प्रयुक् त एक संदर्भ औषधि का प्रभाव चित्र 1में प्रदर्शित होता है ।

मैक्रोफेज फीडर कोशिकाओं के रूप में संस्कृतियों में बहुत उपयोगी होते हैं । वे, विट्रो में , दीक्षा और trypanosome संस्कृतियों के विकास की अनुमति21। हमने बताया है कि वैकल्पिक रूप से सक्रिय मैक्रोफेज की संख्या trypanosome-संक्रमित स्तनधारियों में वृद्धि हुई है जिसमें वे परजीवी विकास22एहसान । यह वैकल्पिक मैक्रोफेज सक्रियण आपूर्ति L-ornithine, जो परजीवी विकास के लिए आवश्यक है । इन विट्रो मैक्रोफेज-परजीवी सह संस्कृतियों में दिखाया गया है कि trypanosomes स्रावित कारकों के माध्यम से मैक्रोफेज वैकल्पिक सक्रियण प्रेरित । कोशिकाबाह्य ट्रिपनोसोम स्राव एक kinesin जो बांधता मैक्रोफेज मैनोज बाध्यकारी रिसेप्टर्स arginase अभिव्यक्ति प्रदान करने के लिए प्रेरित करने एल-ornithine उत्पादन पक्ष परजीवी भेदभाव और गुणा23,24 ( चित्रा 2) । मननोस kinesin बंधन और arginase प्रेरण रोकता है, और mannose रिसेप्टर की कमी चूहों मैक्रोफेज पर kinesin के लक्ष्य को स्पष्ट (चित्रा 3).

के बाद से कई trypanosome जीनोम अब sequenced और एनोटेटेड किया गया है, हम इन बड़े डेटा सेट का लाभ लेने में सक्षम है । बाद में, हम आगे ले जाने के लिए और इन परजीवियों पर आनुवंशिकी रिवर्स करने में सक्षम है । इन आंकड़ों का उपयोग कर, शुद्ध रक्तप्रवाह फार्म trypanosomes की विशेषता है और ऐसे कशाभी जेब (एफपी) और इसके जुड़े cytoskeleton के रूप में महत्वपूर्ण संरचनाओं का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । एफपी trypanosomes में एंडो और exocytosis का एकमात्र स्थल है और यह भी है जहां चर सतह नच endomembrane प्रणाली25से अवैध व्यापार कर रहे हैं । कशाभी पॉकेट कॉलर (fpc) एक वलयाकार आकार संरचना है कि इस बिंदु पर कशाभ से जुड़ा हुआ है, जहां यह FP से बाहर निकालता है, लेकिन हाल ही में जब तक कम fpc के प्रोटीन घटकों के बारे में जाना जाता था । हम fpc, टीबीBILBO1 के एक प्रमुख प्रोटीन की पहचान की है, और पता चला है कि यह दोनों के लिए आवश्यक है परजीवी अस्तित्व दोनों में सुसंस्कृत कीट सीसी मक्खी फार्म और खून के रूप में26। Rnai द्वारा टीबीBILBO1 के knockdown FP गठन रोकता है और कई अन्य महत्वपूर्ण cytoskeletal संरचनाओं के जीवजनन को रोकता है, fpc और एफपी सभी रोगजनक trypanosomes में हस्तक्षेप के लिए महत्वपूर्ण लक्ष्य बना रही है । टीबीBILBO1 को एंटीबॉडी के साथ शुद्ध या सभ्य परजीवी कोशिकाओं की जांच से पता चलता है कि खून के रूप में और procyclic (कीट) फार्म, यह एक अंगूठी के आकार का ढांचा है कि flagellum खतना बनाता है । इस तरह के लेबल, एक खून के रूप में, चित्रा 4में दिखाया गया है ।

शुद्ध रक्त रूप trypanosomes कई असामांय जैव रासायनिक और चयापचय peculiarities के लक्षण वर्णन की अनुमति दी है, ग्लूकोज के चयापचय सहित, जो peroxisome में जगह लेता है ग्लाइकोसोम बुलाया organelles ( चित्रा 5देखें) । यह आम तौर पर स्वीकार किया गया था कि पायरुवेट मुख्य अंत-उत्पाद खून trypanosomes द्वारा ग्लूकोज चयापचय से उत्सर्जित है, लगभग नहीं succinate और mitochondrion अंदर एसीटेट के उत्पादन के साथ । इसके विपरीत, procyclic trypanosomes में परिवर्तित थ्रिऑनीन एसीटेट और ग्लूकोज में succinate और एसीटेट27,28. Trypanosomatids के ऊर्जा चयापचय उपलब्ध कार्बन स्रोतों के लिए अनुकूलन द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । संयोजन रिवर्स आनुवंशिकी और metabolomic विश्लेषण ग्लूकोज-व्युत्पन्न पायरुवेट और threonine से एसीटेट के खून trypanosomes के mitochondrion में उत्पादन की पुष्टि की, के रूप में अच्छी तरह के रूप में ग्लूकोज से succinate के उत्पादन19,20 (चित्र 5) । उदाहरण के लिए, 4 मिमी ग्लूकोज युक्त पीबीएस में इन्सेट किए गए ट्रिपनोसोम द्वारा उत्सर्जित अंत उत्पादों के 1एच-एनएमआर विश्लेषण से पता चला है कि ग्लूकोज मुख्य रूप से पाइरुवेट (उत्सर्जित अंत उत्पादों का ८५.१%) में परिवर्तित हो जाता है, जिसका लघु उत्पादन एलनिन (९.२%), एसीटेट (४.९%) और succinate (०.८%)29. ये मार्ग, जो ग्लूकोज से पाइरुवेट उत्पादन की तुलना में चयापचय प्रवाह के मामले में गौण हैं, परजीवी के विकास के लिए आवश्यक हैं । इस प्रकार नए ट्रिपैन्सिडल औषधियों के विकास के लिए एक अच्छा संभावित लक्ष्य माना जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1 : पेंटामिडीन के विट्रो प्रभाव में टी. बी. ब्रुआफॅ. पेंटामिडीन की कमजोरियां 2 x 105 परजीवी में जोड़ी गई थीं जो ५०% (IC50) द्वारा परजीवी वृद्धि को रोकते हुए एकाग्रता का निर्धारण करते हैं । खुराक-संस्कृति के 24 घंटे में प्रभाव घटता है । त्रुटि पट्टियां 5 स्वतंत्र प्रयोगों से माध्य की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : ट्रिपैनोसोम-mediated arginase प्रेरण । ट्रिपनोसोम द्वारा जारी एक kinesin सी-टाइप लेक्टिन रिसेप्टर्स arginase प्रेरण के लिए अग्रणी करने के लिए बांधता है । यह एल-ऑर्निथिन और पॉलियामीन के उत्पादन में वृद्धि, परजीवी विकास और भेदभाव के लिए आवश्यक है, और l-arginine गिरावट में परिणाम, साइटोटोक्सिक के कम उत्पादन में जिसके परिणामस्वरूप मैक्रोफेज नग द्वितीय । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : मैक्रोफेज आर्जिनेस गतिविधि । नियंत्रण चूहों और मैनोस रिसेप्टर नॉकआउट से मैक्रोफेज में Arginase गतिविधि (KO) चूहों के साथ या बिना kinesin या mannose के लिए मध्यम में विट्रो में ४८ घंटे के लिए सभ्य । त्रुटि पट्टियां 5 स्वतंत्र प्रयोगों से माध्य की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करती हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

Figure 4
चित्रा 4 : टीबी BILBO1 एक खून रूप का लेबल ट्रिपनोसोमा ब्रुआफॅ ब्रुआफॅ कोशिका () एक खून, संस्कृति के रूप, ४२७ 90-13 सेल कि विरोधी BILBO1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ जांच की गई है की प्रतिरक्षा प्रतिदीप्ति लेबलिंग एक fitc लेबल विरोधी माउस एंटीबॉडी के बाद और पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग कर कल्पना, (टीबी BILBO1 हरे रंग की वलयाकार संकेत हैं) और डीएनए बाइंडिंग डाई DAPI (ब्लू सिग्नल) () एक. स्केल पट्टी के dapi, विरोधी BILBO1 और चरण विपरीत छवियों का एक विलय 10 μm के बराबर होती है । विरोधी BILBO1 माउस मोनोक्लोनल 1:10 pbs और माध्यमिक एंटीबॉडी में पतला था ( विरोधी माउस IgM FITC) 1:100 पतला था । एक डिजिटल कैमरा के साथ लगे माइक्रोस्कोप पर छवियां ली गईं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

Figure 5
चित्रा 5 : खून के रूप में ग्लूकोज और थ्रिऑनीन चयापचय के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व trypanosomes. उत्सर्जित अंत उत्पादों से ग्लूकोज और थ्रिऑनीन चयापचय बॉक्स्ड हैं. घने नीले तीर ग्लूकोज चयापचय पायरुवेट उत्पादन, जो मुख्य अंत-उत्पाद ग्लाइकोलिसिस से उत्सर्जित करने के लिए अग्रणी के एंजाइमी कदम से संकेत मिलता है । काले तीर ग्लूकोज और थ्रिऑनीन गिरावट है, जो परजीवी के विकास के लिए आवश्यक है से मामूली चयापचय रास्ते की अनदेखी का प्रतिनिधित्व करते हैं । संकेत एंजाइमों के योगदान प्रयोगात्मक रूप से मांय किया गया है: ACH, एसिटाइल-CoA thioesterase (ईसी 3.1.2.1); ASCT, एसीटेट: सक्सिनेट सीओए-ट्रांस्ट्रान्सेस (EC 2.8.3.18); AKCT, 2-अमीनो-3-ketobutyrate कोएंजाइम एक ligase (ईसी 2.3.1.29); पेक, फ़ॉसफोएनोलपाइरुवेट कार्बोक्सिकिनेस (EC 4.1.1.49); पीडीएच, पाइरुवेट डिहाइड्रोजनेज कॉम्प्लेक्स (EC 1.2.4.1); Tdh, थ्रिऑनीन 3-डिहाइड्रोजनेज (EC 1.1.1.103). संक्षिप: AcCoA, एसिटाइल-CoA; AOB, अमीनो oxobutyrate; धाप, डाइहाइड्रोक्सीएसीटोन फॉस्फेट; G3P, ग्लिसलडिहाइड 3-फॉस्फेट; मल, मलते; OA, oxaloacetate; पीईपी, फॉसफोनोपाइरुवेट; PYR, pyruvate. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

शुद्ध trypanosomes प्रतिरक्षा विज्ञान, जैव रसायन, सेलुलर और आणविक जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली साधन का प्रतिनिधित्व करते हैं । डेटा और परिणामों के बड़े विस्तार trypanosomes से प्राप्त किया गया है, जो फिर से अंय यूक्योटिक कोशिकाओं30से जानकारी प्राप्त करने में मदद की है । Trypanosomes भी महत्वपूर्ण है और दिलचस्प अनुसंधान के विषय है क्योंकि वे कई तंत्र है कि उंहें जीवित और दो बहुत अलग वातावरण में बढ़ने की अनुमति तैयार की है: सीसी मक्खी वेक्टर और स्तनधारी मेजबान23, 31. विभिंन तकनीकों trypanosomes को अलग करने की सूचना दी गई है, और microfluidics पर एक समीक्षा आधारित दृष्टिकोण हाल ही में३२प्रकाशित किया गया है । इसलिए परजीवी अलगाव के लिए एक पुनरुद्बल और मजबूत साधन जरूरी है ।

डीएए सेलुलोस तैयारी इस परजीवी तैयारी प्रोटोकॉल में एक अपरिहार्य कदम है । धोने की स्थिति को सतर्क करने के लिए ठीक कणों को खत्म करने के लिए किया जाना है, और राल equilibrate, और पीएच ठीक से समायोजित किया जाना चाहिए (पीएच ८.० सबसे trypanosome प्रजातियों के लिए उपयुक्त है) । परजीवी की व्यवहार्यता और सेलुलर संपत्तियों को बनाए रखते हुए परजीवी शोधन और उपज में सुधार लाने के लिए सभी चरणों का समायोजन किया जाना चाहिए । महत्वपूर्ण बात यह है कि परजीवी व्यवहार्यता और संक्रामकता को एक डीईएई-सेलुलोस कॉलम के माध्यम से शुद्धिकरण के बाद रखा गया है । हालांकि, कुछ उपभेदों दूसरों की तुलना में अधिक नाजुक है और३३शुद्धि के बाद कम संक्रामक हो सकता है । इसलिए, पेलिकुलर झिल्ली घटकों, परजीवी चयापचय, सिग्नलिंग, न्यूकलिक अम्ल कार्यों और पशु संक्रमणकता पर पृथक्करण शर्तों के प्रभाव का मूल्यांकन किया जाना चाहिए और पृथक्करण शर्तों को तदनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए ।

इस तकनीक के लिए सीमाएं है कि इस प्रक्रिया को एक दिया मेजबान में प्रत्येक trypanosome प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया है और यह भी समय लगता है । इसके अलावा, डीएए सेलुलोस अब महंगा हो गया है । प्रारंभिक assays जुदाई की स्थिति, विशेष रूप से मीडिया, जो आयनिक ताकत और एक सटीक पीएच अलग हो सकता है का अनुकूलन करने के लिए आवश्यक हैं । पूर्व स्तंभ, थक्कारोधी पसंद, पूर्व केंद्रापसारक सहित एरिथ्रोसाइट्स, buffy कोट का उपयोग करें, और एरिथ्रोसाइट lysis के बहुमत को हटाने के लिए कदम, प्रत्येक प्रयोग के अनुसार चुना जाता है । एक ही पैरामीटर पर सटीक परिवर्तन (बफ़र्स, प्रोटोकॉल भर में तापमान, केंद्रापसारक मापदंडों) बहुत संख्या में वृद्धि हो सकती है, शुद्धि और परजीवी की व्यवहार्यता की डिग्री३३प्राप्त की । परजीवी प्रजातियों और स्तनधारी रक्त कोशिकाओं को अलग किया जा करने के लिए के अनुसार नए पृथक्करण मापदंडों के विकास, आवश्यक हो सकता है । प्रारंभिक Lanham और Godfrey के प्रोटोकॉल के समायोजन के लिए जैविक और antigenically संरक्षित टी cruzi से रक्त३४की शुद्धि की अनुमति दी है । नई रेजिन भी परीक्षण किया जा सकता है और विभिंन प्रजातियों३५के लिए उपयुक्त परिस्थितियों के साथ प्रयोग किया जाता है ।

ट्रिपनोसोमेटिड द्वारा उत्सर्जित/स्रावित कारकों (ईएस) की प्रमुख भूमिका पर हाल ही में16जोर दिया गया है । ES विकृति और immunomodulation में शामिल अणुओं जैसे kinesin, जो trypanosomes के बीच संरक्षित है24होते हैं । शुद्ध परजीवी से ES तैयारी विशेष देखभाल के लिए रेफरेंस मीडिया घटकों द्वारा संदूषण से बचने और परजीवी लीजड ड की आवश्यकता है ।

लीशमैनियाके खिलाफ प्रभावी एक ES-आधारित वैक्सीन, एक संबंधित परजीवी, पहले से मौजूद है और उपलब्ध है (CaniLeish virbac)३६। परजीवी अस्तित्व और विकास में आवश्यक भूमिका निभाने वाले संरक्षित अणुओं का संघ, एक स्वास्थ्य दृष्टिकोण में, मनुष्यों और पशुओं, दोनों के लिए, ट्रिपनोसोम के विरुद्ध भविष्य के टीके के लिए आधार का प्रतिनिधित्व कर सकता है । DEAE-सेल्यूलोज कॉलम, सुधार के साथ द्वारा रक्त से अफ्रीकी trypanosomes का शुद्धिकरण, स्थानिक क्षेत्रों में कम परजीवी के साथ प्राकृतिक मेजबान में trypanosomes पता लगाने के लिए सोने के मानक रहता है और बड़ी संख्या में परजीवी के लिए की आवश्यकता के लिए प्रायोगिक जांच की ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम UMR के सभी सदस्यों को धंयवाद १७७ INTERTRYP IRD CIRAD विश्विद्यालय डे बोर्डो । इस शोध के बोर्डो और समर्थन से विश्वविद्यालय से आंतरिक धन द्वारा समर्थित किया गया था और ANR, LABEX परफरप ANR से-11-LABX-0024, और एसोसिएशन से डालो ले développement डे ला रीचेरचे एन पैराकोटोलोजी एट médecine tropicale और सेवा de coopération et d ' कार्रवाई cultuरिले de l ' एंबैसेड डी फ्रांस à बांगुई (Centrafrique).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL Pipettes  Falcon 357,551
2 mL Pipettes  Falcon 352,507
Centrifugation tube 50 mL Falcon 352,070
Centrifuge Sigma Aldrich 4K15
DEAE cellulose Santa Cruz s/c- 211213 100 G
filter paper  Whatman 1,001,125
Flat bottom flask narrow neck Duran 21 711 76 6000 mL
Glucose  VWR 101174Y 500 G
Heparin Sigma Aldrich H3149-50KU 5 000 U
KH2PO4 VWR 120 26936.260 500 G
Microscope Olympus CH-20
Microscope coverslips Thermofisher scientific CB00100RA020MNT0
Microscope slides Thermofisher scientific AGAA000001
Na2HPO4  VWR 100 28026;260 500 G
NaCl VWR 27800.291 1 KG
NaH2PO4  VWR 110 33616;262 500 G
Nalgene Plastic Media Bottles size 125 mL Thermofisher scientific 342024-0125
Nalgene Plastic Media Bottles size 500 mL Thermofisher scientific 342024-0500
Pasteur Pipette VWR BRND125400
Penicillin 10,000 UI/Streptomycin 10,000 µg EUROBIO CABPES01 OU 100 mL
Phenol red Sigma Aldrich P0290 100 mL
Syringue  Dutscher SS+10S21381
Tissue culture hood Thermoelectro Corporation MSC-12
Trypanosoma brucei brucei Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). ANTAT 1.1
Trypanosoma brucei gambiense Institute of Tropical Medicine (Antwerp, Belgium). ITMAP 1893
Trypanosoma musculi London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK) Partinico II

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References

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