全完整型小鼠软骨外种机械负荷对软骨细胞损伤的实时可视化与分析

Bioengineering

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Summary

我们提出了一种方法来评估细胞损伤死亡的空间程度后, 完整的小鼠关节关节应用受控机械负荷或冲击。该方法可用于研究骨关节炎、遗传因素和不同的加载方案如何影响原位软骨细胞的脆弱性。

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Kotelsky, A., Carrier, J. S., Buckley, M. R. Real-time Visualization and Analysis of Chondrocyte Injury Due to Mechanical Loading in Fully Intact Murine Cartilage Explants. J. Vis. Exp. (143), e58487, doi:10.3791/58487 (2019).

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Abstract

关节软骨的稳态取决于常驻细胞 (软骨细胞) 的活力。不幸的是, 机械创伤可导致广泛的软骨细胞死亡, 有可能导致关节的不可逆转的破裂和骨关节炎的开始。此外, 保持软骨细胞活力是重要的骨软骨移植程序, 以获得最佳的手术结果。我们提出了一种方法来评估细胞损伤/死亡的空间程度后, 完整的小鼠滑膜关节应用受控机械负荷或冲击。该方法可用于比较研究, 以研究不同的机械加载方案, 不同的环境条件或遗传操作, 以及不同阶段的软骨退化的短期或长期的影响原位关节软骨细胞的脆弱性。该协议在手稿中介绍的目的是评估小鼠滑膜关节关节表面细胞损伤死亡的空间程度。重要的是, 这种方法能够在不影响本地边界条件的情况下对完全完整的软骨进行测试。此外, 它还允许实时显示严重染色的关节软骨细胞, 并基于单一图像分析的细胞损伤的应用受控静态和冲击加载方案。我们具有代表性的研究结果表明, 在健康软骨外植体中, 细胞损伤的空间程度敏感地取决于负荷大小和冲击强度。我们的方法可以很容易地适应研究不同的机械加载方案, 不同的环境条件或不同的遗传操作对原位关节软骨细胞的机械脆弱性的影响。

Introduction

关节软骨 (ac) 是一种承重组织, 覆盖和保护滑膜关节的骨骼, 提供光滑的关节关节关节连接。组织稳态取决于软骨细胞的活力, 软骨细胞是唯一的细胞类型居住在交流。然而, 软骨暴露于创伤 (跌倒、车辆事故或运动损伤) 或创伤后关节不稳定造成的极端力量, 可能会导致软骨细胞死亡, 导致关节不可逆转的破裂 (骨关节炎)1. 此外, 在旨在修复受损软骨局部缺陷的骨软骨移植程序中, 移植相关的机械创伤降低了软骨细胞的活力, 并对手术结果产生不利影响2

软骨外植体模型常用于研究关节软骨细胞对机械诱导的细胞死亡的敏感性。这些模型通常使用大型动物的外植体来研究装载条件、环境条件和其他因素对细胞脆弱性的影响3,4,5,6, 7,8,9,10,11,12, 13,14,15.然而, 由于本机接头的尺寸很大, 这些模型通常要求从完整关节的关节表面取出一个插头, 从而损害本机边界条件。此外, 它们一般需要施加较大的机械负荷来诱发细胞损伤。另外, 小鼠软骨外植体模型在研究原位软骨细胞的机械脆弱性方面提供了几个比较大的动物模型更有优势。特别是, 由于其较小的尺寸, 这些模型有助于测试完全完整的关节软骨, 而不会改变本地组织的完整性。此外, 小鼠软骨的负荷发生在小的接触区域, 这样软骨细胞死亡/损伤可以诱导小负荷 (& lt;1 n)。最后 , 小鼠基因组很容易纵 , 从而能够测试特定基因如何影响原位软骨细胞对机械损伤的易感性。

本手稿介绍的方法的总体目标是在实时中量化和可视化在体应用机械载荷下的原位细胞死亡/损伤的空间范围。这种方法需要在不影响软骨细胞生存能力的情况下仔细解剖小鼠滑膜关节, 然后使用类似于我们最近开发的测试平台的显微镜安装设备对严重染色的外植体进行机械测试量化小鼠软骨的机械性能16。在机械测试过程中, 解剖骨的大部分 (完整) 关节表面在单个荧光显微镜上可见, 从而能够在施加负载后快速分析细胞的活力。此前对小鼠软骨外植体的表面细胞活力进行了类似的分析, 但没有同时应用负荷17。我们的方法的潜在应用包括比较研究, 以调查关节软骨细胞对不同控制的环境和机械条件的脆弱性, 以及筛选治疗方法, 以降低敏感性软骨细胞的机械负荷。

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Protocol

所有的动物工作都得到了罗切斯特大学动物资源委员会的批准。

1. 解决方案

  1. 准备含钙、镁和无苯酚红色的汉克平衡盐溶液 (1x hbss)。通过添加少量的 hcl 或 naoh, 将 ph 值调整到7.4。
  2. 通过添加氯化钠或去离子水, 将渗透度调整到 303 mosm。在解剖、样品制备和机械测试过程中使用缓冲器。

2. 完全完整的关节软骨对股骨远端和肱骨近端的解剖

  1. 根据机构指南,使用 co2 吸入室, 然后是颈椎脱位, 对小鼠进行安乐死。在整个过程中遵循无菌技术。
    注: 任何菌株和性别的8至81周大的小鼠均可使用。
  2. 使用以下手术工具进行解剖: 微型剪刀 (用于做切口), 标准解剖剪刀 (用于切割骨头), 手术刀与 #11 手术刀刀片 (用于切割软组织), 珠宝钳 (用于去除软组织) 和标准钳子 (用于剥离软组织和皮肤)。
  3. 对于股骨远端的解剖,请按照以下说明操作。
    1. 将鼠标置于仰卧位。
    2. 在膝盖前部的皮肤上做一个小的 (~ 5 毫米) 切口。
    3. 将切口一直延伸到膝盖周围, 拉回皮肤, 露出膝关节和腿部肌肉。
    4. 从股骨近端开始, 使用手术刀刀片 (#11) 沿远端方向切割。将叶片放置在股关节的股关节前侧, 位于股关节的股肌腱单元和前侧之间。将切口延伸到和过去的带状疱疹, 并通过切割通过中间的胫骨肌腱完成, 从而删除四头肌肌腱单位。
    5. 从股骨近端开始, 使用手术刀刀片 (#11) 沿远端方向切割。将刀片放置在腿筋肌腱单元和股轴后侧之间。一旦切割接近膝关节, 开始切割通过软组织, 避免接触之间的手术刀和关节表面上的股骨远端尖锐湿疣。完成膝盖关节的伤口。
    6. 拉回股四头肌和腿筋肌肉, 露出股骨。切断股骨外侧和内侧的多余肌肉。
    7. 在胫骨近端的后侧切割小腿肌肉, 并翻转腿部以显示股骨的后侧。
    8. 通过切除膝关节周围多余的组织, 暴露股骨远端和胫骨近端后表面。
    9. 用手术刀切断前交叉和后交叉韧带, 切断股关节。将胫骨从股骨上拉开, 切断所有韧带, 将小腿与股骨分开。
    10. 使用标准的解剖剪刀, 从侧切开股骨近端的股骨 (股骨关节上方8毫米)。切割骨头后, 擦拭骨头外可见的骨髓, 以避免骨髓细胞可能造成的污染。
      注: 从侧面切割可降低裂纹沿骨骼扩展的风险。
    11. 使用珠宝钳从股骨取出周围的软组织 (韧带和多余的肌肉), 并在股骨远端的两个尖锐湿疣上暴露软骨。避免软骨和钳子之间的接触。
  4. 对于肱骨的解剖,请按照下面的说明操作。
    1. 将鼠标置于仰卧位。
    2. 使用微型剪刀在肘部后侧的皮肤上做一个切口 (~ 5 毫米), 将肘部周围的切口延伸, 并将皮肤拉回来, 露出手臂和肩部的肌肉。
    3. 从肱骨的近端开始, 用手术刀刀片 (#11) 沿着远端方向切割。将叶片放置在三头肌肌腱单元和肱骨后侧之间。将伤口伸向肱骨的远端, 通过三头肌肌腱完成。
    4. 然后将三头肌拉回到肱骨近端, 直到肱骨头暴露。
    5. 使用手术刀刀片 (#11) 切割肱骨头周围的结缔组织, 而不接触关节表面, 并从身体上取出肢体 (手臂和肩膀)。用 hbss 定期补充肱骨头关节表面的水合物。
    6. 首先用钳子断开手臂后侧尺骨的近端, 然后在肱骨远端周围切割结缔组织, 从而断开肱骨的关节。去除肱骨上多余的组织。
    7. 使用标准的解剖剪刀将肱骨后侧的三角结节剪掉。
  5. 将解剖试样放入含有 hbss 缓冲液的 1.5 ml 微离心管中。

3. 现场 (卡尔塞因 am)/死亡 (碘化钠) 染色协议

  1. 使用钙素 am 的污渍, 如下所示。
    1. 在50微克的钙含量 am 瓶中加入12.5 微米的二甲基亚硫酸盐 (dmso), 使钙蛋白 am 的库存溶液, 使库存浓度达到 4 mg/ml (4.02 mm)。
    2. 在 hbss 中稀释股票钙蛋白溶液 1:400, 使钙 am 浓度达到 10μgml (10.05μm) (例如, 在 500μl hbss 中加入1.25 μl 的库存溶液)。
    3. 将稀释后的染色液离心至 2000xg, 以确保所有的染料 (偶尔可能粘附在管壁上) 与缓冲液混合。不要取出上清液。涡流溶液, 以确保适当的混合。
    4. 将解剖样品放入含有500μl 的稀释染色液的 1.5 ml 微离心管中。在37°c 下将样品在热敏管中培养 30分钟, 而搅拌在800转/分。确保管材被铝箔覆盖, 以防止暴露在光线下。
    5. 将标本转移到不含钙的抗钙 hbss 缓冲液中。此时, 试样已准备好进行机械测试。
  2. 制备碘化物 (pi) 染色溶液, 如下所示。
    1. 在 hbss 中稀释购买的库存溶液 (1 mgml, 1.5 mm) 1:25, 使其达到 pi 的 40μgml (60μm), 从而制备 pi 染色溶液。例如, 在 1000μl hbss 中加入40μl 的库存溶液。
    2. 将 pi 染色解决方案覆盖在铝箔中, 以防止其暴露在光线下。在机械测试后立即使用染色液检测受损细胞 (见第4节)。
      注: 可以在加载前进行 pi 染色, 也可以更严格地评估解剖质量。

4. 机械测试协议

  1. 将标本 (股骨或肱骨) 放在定制显微镜安装的机械测试装置的玻璃滑梯上, 使股骨后部关节或肱骨头部的关节表面坐在玻璃上 (图 1)。
    注: 在将其放置在设备上之前, 先将10毫米长的木制施药器 (直径 = 2 毫米) 固定在肱骨的远端一侧, 以稳定试样在平坦的表面上。有关机械测试平台的详细说明, 请参见补充文件 1: 第1节。
  2. 用 hbss 对样品进行水合物处理, 并将该装置与样品放在荧光显微镜上。
  3. 在 (基线) 用4x 干透镜 (na = 0.13) 在荧光显微镜下应用负载之前, 用钙素 am (兴奋/发射波长 = 4X 515 nm) 染色的关节软骨细胞。调整采集设置以优化图像质量。
  4. 在标本顶部施加机械载荷, 使关节软骨被压缩到盖板玻璃上。
    1. 对于静态载荷, 请在试样 (股骨或肱骨) 上施加规定的静态载荷 (例如0.5 n)。按住负载 5分钟, 然后将其卸下。
    2. 对于冲击, 通过从规定的高度 (例如1 厘米) 中丢弃已知重量 (例如0.1 n) 的圆柱形撞击物, 将规定的冲击能量 (例如1mj) 应用到试样上。在撞击后释放负载5秒。
      注: 冲击器的重量 (毫克) 和规定的高度 (h) 可以转换为冲击能量 (e) 使用以下公式: e = mgh。
  5. 在 pi 染色溶液中将样品在室温下培养5分钟。
  6. 在荧光显微镜下成像用钙素 am 和 pi (兴奋发射波长 = 555/617 nm) 染色的关节软骨细胞 (图 2)。

5. 数据分析

  1. 量化由于采用机械加载方案而导致的损伤/死亡细胞的面积。
    1. 打开 imagej18 中机械载荷应用前后获得的关节表面的显微图像.
    2. 将图像合并到堆栈中。
    3. 根据图像分辨率设置图像的比例。
    4. 使用多边形工具定义细胞变成钙阴性 (绿色荧光丢失) 和 pi 阳性 (红色荧光增益) 的区域。这些细胞被认为是受伤或死亡的。
    5. 使用测量工具确定损伤/死亡细胞的面积。

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Representative Results

6种不同的应用加载方案 (静态加载: 0.1 n、0.5 n 和 1 n, 5分钟; 冲击载荷: 1 mj、2 mj 和 4 mj) 可重复诱导可量化的可量化的股骨和肱骨软骨细胞损伤局部区域, 这些区域是从8-10 的 bb/c 小鼠身上获得的 (图 2)。重要的是, 在 imagej 中快速、方便地测量了关节表面软骨细胞损伤的空间范围。研究结果表明, 关节软骨细胞的机械脆弱性受载荷大小和冲击强度的影响。特别是, 较高的负荷大小和较高的撞击强度显著加剧了股骨和肱骨细胞损伤的空间范围 (图 3)。

Figure 1
图 1: 定制机械测试装置的原理图表示.(a) 将装置与用于对试样施加规定的机械载荷和/或撞击能量的圆柱形撞击器组装在一起。在没有样品的情况下显示该设备。(b) 实验的原理图表示。可在解剖标本的顶部施加可控制的静态 (例如0.1 n) 和/或冲击 (例如, 1mj) 载荷, 以便将关节软骨压缩到盖板玻璃上。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 损伤机械载荷作用后关节表面的代表性显微镜.(a) (a) 股骨远端尖锐湿疣和 (b) 肱骨头在有害机械载荷 (分别撞击 [1mj] 和静态载荷 [1 n] 后) 上的关节表面的代表性显微镜。绿色细胞是有完整细胞膜的严重染色软骨细胞, 而红色细胞核则表明损伤细胞有渗透性细胞膜。 (c) 从肱骨头关节表面的损伤细胞 (黄色轮廓) 区域的观察。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 损伤/死亡细胞的面积.(a、b) 和肱骨头 (c, d) 静态(0.1n、 0.5n 和 1 n; n = 6 (每组) 后的股骨远端尖锐湿疣关节表面损伤/死亡细胞面积 (a、b) 和肱骨头 (cd)影响 (1 mj、2 mj 和 4 mj; n = 每组 6) 负载。所有的骨软骨标本都是从8-10 大的雌性 balbce-c 中获得的。数据为平均值 + 标准偏差;括号表示由方差分析 (anova) 和 tukey 后临时比较确定的α= 0.05 时的统计学意义。请点击这里查看此图的较大版本.

补充文件 1.请点击此处下载此文件.

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Discussion

上述方法成功地用于在规定的机械载荷或撞击后, 对小鼠关节的活细胞和原位关节软骨细胞损伤进行可视化。特别是, 我们能够从两个不同的滑膜关节 (膝关节 (股骨远端) 和肩部 (肱骨)) 分析完全完整的关节软骨内软骨细胞的机械脆弱性。我们具有代表性的结果表明, 关节表面细胞损伤的空间范围敏感地取决于载荷大小和冲击强度 (图 3)。重要的是, 使用这种方法有助于调查在生理相关条件下的细胞对机械载荷的反应。也就是说, 它可以在生理和过敏性负荷下测试完整关节上的关节软骨 (见补充文件 1: 第2节)。

鉴于小鼠滑膜关节解剖过程中的学习曲线陡峭, 以及在基线时保留可行的原位软骨细胞方面的挑战, 可能需要对协议进行修改和排除故障。解剖过程中损伤关节软骨细胞的最大风险发生在2.3.5 通过2.3.10 的步骤中, 并通过 2.4.7 2.4.5。为了最大限度地减少手术工具 (例如, 切割组织时的手术刀或珠宝工人的钳子) 与标本关节表面之间的任何接触, 以最大限度地减少手术工具的死亡/死亡。.然而, 用手套触摸关节表面会导致小细胞死亡。为了提高基线细胞的活力, 也可能有必要减少从关节中取出的软组织的数量。此外, 使用更精细的工具通常会减少解剖引起的细胞死亡。最后, 为了严格确认在基线处没有与解剖相关的关节软骨细胞损伤, 最好在加载之前用两种渗透染料 (钙调 am 和 pi) 对标本进行染色, 特别是在研究人员在。熟悉解剖过程(参见补充文件 1: 第3节)。

鉴于小鼠关节体积小, 而且小鼠基因组具有遗传可操作性, 与大型动物模型相比, 小鼠模型提供了多种优势, 可以研究关节软骨细胞对机械负载的脆弱性。然而, 据作者所知, 以前没有进行任何研究来量化原生性关节软骨细胞因完整的小鼠软骨的机械负荷而死亡的方法。调查人员通常使用从大型动物模型关节中取出的外植体来调查 345678,9,10,11,12. 相反, 小鼠模型便于 1) 在给定骨骼上显示几乎整个关节表面;在不影响原生边界条件的情况下, 分析完整关节中加载后或撞击后软骨细胞的活力。此外, 在压缩的同时, 与大型动物模型相比, 老鼠标本产生的接触面积要小得多;因此, 在给定的载荷大小下, 应力比大型动物模型要高得多。因此, 细胞损伤可以由较小的负荷引起。此外, 小鼠模型有助于软骨变性的研究, 特别是骨关节炎, 因为这种疾病可以很容易地诱导小鼠通过遗传19,20,21,22、饮食2324或手术操作 2526、27、28.此外, 自发性骨关节炎发生在几个小鼠菌株, 包括 balb1c57bl629,30

在我们的代表性数据中, 我们使用活力 (活/死) 污渍来量化细胞损伤死亡/死亡5分钟后去除机械负荷。我们承认, 这些实验可能不会从死细胞 (膜永久破裂的细胞) 中区分受伤的细胞 (膜暂时破裂的细胞)。也就是说, 钙蛋白阴性和 pi 阳性的细胞-表明膜以前是渗透性的, 可以修复他们的膜在时间范围内从秒到几分钟31。事实上, 在另一组实验中, 我们已经确定, 在机械创伤中幸存下来的 "受伤" 细胞比例很小 (~ 5%), 但意义重大(见补充文件 1: 第4节)。因此, 活/死染色是膜完整性的直接测量, 并不总是表明细胞的活力。特别是, pi 阳性和钙素阴性细胞最恰当地定义为 "受伤", 其中损伤被定义为由于机械创伤而导致的质膜完整性的 (可能是暂时的) 损失。我们也承认, 我们的代表性数据很可能只反映立即 (坏死) 细胞死亡。在以后的时间点 (例如, 在去除负荷后 48小时) 进行成像的标本应能对坏死和凋亡细胞的死亡进行量化。

使用这些方法时必须考虑几个限制。在这份手稿的试验实验中, 我们使用了8-10 大的雌性 balbc1 小鼠来演示测试平台的功能 (图 3)。然而, 由于老年小鼠股骨细胞密度的明显变化, 对老年股骨的负荷诱导细胞损伤的评估变得更具挑战性 (尽管是可行的) (成功率 = 40%)。相反, 61-81 周龄的 c57bl6 小鼠的腐殖质细胞密度没有明显变化 (见补充文件 1: 第5节), 从而使测试平台对8-81周的人有用。另一个局限性是, 该方法仅用于分析股骨关节关节表面和肱骨头关节表面细胞损伤的空间程度。然而, 该方法可以进一步扩展到分析深度相关的空间程度的细胞损伤, 利用激光扫描共聚焦显微镜。请注意, 后一种方法需要使用更昂贵的设备、更长的图像采集时间以及更多的参与和耗时的分析。最后, 虽然关节软骨和盖板玻璃之间的接触位置在生理上与小鼠32,33有关, 但这一位置没有变化。然而, 如果股骨或肱骨被旋转的骨架夹住, 我们的测试平台允许改变接触位置。

总之, 我们已经开发了一个体外小鼠损伤模型, 使应用控制机械负荷和/或影响的关节表面完整的关节软骨。该模型可在实时、快速的单图像分析中实现荧光标记关节软骨细胞的可视化。重要的是, 不同的机械加载方案, 不同的环境条件或不同的遗传操作对短期或长期软骨细胞活力的影响可以用这种方法来测试。因此, 我们的平台提供了一个工具来询问基础科学问题和筛选治疗目标有关的机械脆弱性的软骨细胞。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者要感谢理查德·沃博士和路易斯·德尔加迪略慷慨使用了他们的 ph 计和温度计。此外, 作者还要感谢安德烈·李对机械测试系统的初步开发做出的贡献。这项研究是由国家卫生研究院 p30 ar069655 资助的。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calcein, AM  Invitrogen by Thermo Fisher Scientific C3100MP 20x50mg , Eugene, OR, USA
Propidium Iodide Invitrogen by Thermo Fisher Scientific P3566 1 mg/mL solution in water, 10mL, Eugene, OR, USA
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich 276855 1L DMSO, anhydrous, ≥99.9%, St. Louis, MO, USA
HBSS (calcium, magnesium, no phenol red)  Gibco by Thermo Fisher Scientific 14025-092 1X, 500mL, Grand Island, NY, USA
Feather surgical blade (#11) VWR 102097-822 Hatfield, PA, USA
Vapor pressure osmometer, VAPRO ELITechGroup Model 5520 Puteaux, France
pH meter  Beckman Model Phi 32  Brea, CA, USA
Eppendorf thermomixer  Eppendorf AG  Model 5350 Hamburg, Germany
Motorized inverted research microscope Olypmus Model IX-81 Center Valley, PA, USA
Wooden applicator Puritan Medical Products Company, LLC 807 6"x100, Guilford, ME, USA
1.5 Glass coverslips Warner Instruments, LLC 64-1696 #1.5, 0.17mm thick, 40mm diameter, Hamden, CT, USA

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