Unraveling i giocatori chiave di immunità umorale: avanzata e ottimizzata protocollo di isolamento del linfocita da Patches murino placche di Peyer

Cancer Research

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Summary

In questo studio, presentiamo un romanzo e un efficace protocollo per l'isolamento dei linfociti da placche di Peyer (PPs), che può essere utilizzati successivamente per saggi funzionali in vivo ed in vitro come pure gli studi cytometric di flusso di follicolare T Helper e cellule centro germinale B.

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Yazicioglu, Y. F., Aksoylar, H. I., Pal, R., Patsoukis, N., Boussiotis, V. A. Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer's Patches. J. Vis. Exp. (141), e58490, doi:10.3791/58490 (2018).

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Abstract

Nella mucosa dell'intestino, cellule immunitarie costituiscono un'entità unica immunologica, che promuove la tolleranza immunitaria mentre contemporaneamente conferimento difesa immunitaria contro gli agenti patogeni. È affermato che di Peyer (PPs) hanno un ruolo essenziale nella rete immune mucosa ospitando diversi T effettrici e sottoinsiemi delle cellule B. Una certa frazione di queste cellule effettrici, follicolare T helper (TFH) e cellule di B del centro germinativo (GC) sono professionalizzata nella regolazione dell'immunità umorale. Quindi, la caratterizzazione di questi sottoinsiemi di cellule all'interno di PPs in termini di loro programma di differenziazione e proprietà funzionali può fornire informazioni importanti sull'immunità mucosale. A tal fine, un metodo facilmente applicabile, efficace e riproducibile di isolamento dei linfociti da PPs sarebbe prezioso per i ricercatori. In questo studio, abbiamo mirato a generare un metodo efficace per isolare i linfociti da mouse PPs con resa elevata delle celle. Il nostro approccio ha rivelato che l'elaborazione come l'uso di reagenti digestivi e agitazione del tessuto, il tessuto iniziale così come colorazione condizioni e selezione dei pannelli di anticorpo delle cellule, hanno una grande influenza sulla qualità e identità dei linfociti isolati e il risultati sperimentali.

Qui, descriviamo un protocollo che consente ai ricercatori di isolare in modo efficiente popolazioni linfocitarie da PPs permettendo la valutazione di base di citometria a flusso riproducibile dei sottoinsiemi di cellule T e B concentrandosi soprattutto su sottoinsiemi di cellule TFH e GC B.

Introduction

L'intero tratto gastrointestinale dall'inizio alla fine è addobbato con una vasta rete di linfoide che contiene le cellule immunitarie più di qualsiasi altro organo in essere umano e del mouse1. Peyer di patch (PPs) costituiscono una componente importante del ramo intestinale di questa organizzazione immune cellulare, cosiddetto tessuto linfoide associato all'intestino (GALT)2,3. All'interno di PPs, migliaia di milioni di antigeni derivati da materiali dietetici, agenti patogeni e commensale microbiota sono campionati continuamente e quando necessarie e appropriato le risposte immunitarie verso di loro sono montato così mantenere immunitario intestinale omeostasi. In questo senso, PPs può essere denominata come "tonsille del piccolo intestino". PPs sono costituiti principali sub-compartimenti: cupola subepiteliale (SED), ampie zone di B-cellula del follicolo; l'epitelio sovrastante follicolo-collegata (FAE) e la regione interfollicular (IFR) dove le cellule T sono situati4. Questa compartimentazione unica di PPs sottoinsiemi di cellule effettrici diverse consente di cooperare, conferisce quindi, immunocompetenza nell'intestino.

PPs mancano vasi linfatici afferenti, e proprio per questo motivo, gli antigeni trasportati in PPs dal piccolo intestino non sono stati condotti attraverso i vasi linfatici in contrasto con la maggior parte degli altri organi linfoidi. Invece, le cellule epiteliali specializzate situate in FAE, cosiddette cellule M, sono responsabili per il trasferimento degli antigeni luminal in PPs5. Successivamente, gli antigeni trasportati sono stati prelevati dalle cellule dendritiche (DCs) e fagociti che si trovano nella regione subepiteliale cupola (SED) sotto la FAE6,7. Questo processo di cernita di antigene da DCs in PP è fondamentale per avviare la generazione successiva di IgA che secerne le cellule9e risposta immunitaria adattativa8 .

Dovuto il pesante fardello antigenico da flora commensale e materiale alimentare, PPs host in modo endogeno attivato T effettrici e sottoinsiemi di cellule B in grande abbondanza come TFH e IgA+ GC B cellule10, suggerendo che il PPs rappresentano un sito di attivo immune risposta di11. Rilevazione di fino a 20 – 25% cellule TFH all'interno totale CD4+ T cell vano e fino a 10 – 15% GC B cellule all'interno di cellule B totali è possibile in PPs raccolti da non immunizzati giovane di topi C57BL/612. A differenza di altri tipi di cellula dell'assistente di T (cioè., Th1, Th2, Th17 cellule), TFH cellule mostrano tropismo unico in follicoli di cellule B principalmente a causa di espressione CXCR5, che promuove l'homing delle cellule TFH lungo gradienti CXCL1313. Nelle zone delle cellule di B del follicolo di PPs, TFH cellule inducono IgA classe interruttore ricombinazione e ipermutazione somatica in cellule di B attivate da cui ad alta affinità IgA producendo cellule differenziano14. Successivamente, queste cellule di plasma disecrezione migrare verso la lamina propria (LP) e regolano l'omeostasi immune nell' intestino10.

Identificazione e caratterizzazione di popolazioni di cellule TFH e GC B all'interno di PPs potrebbe consentire ai ricercatori di studiare la dinamica della risposta immunitaria umorale sotto condizioni di stato stazionario senza la necessità di modelli di immunizzazione richiede molto tempo utilizzato tradizionalmente in TFH-GC B cella studi15,16,17,18. Analizzando le cellule TFH entro PPs non è così semplice come altri sottoinsiemi di cellule. Sfide tecniche includono identificare condizioni di tessuto ideale preparazione, combinazione di anticorpo-indicatore della superficie, così come la selezione di appropriati controlli positivi e negativi. Campi di ricerca sia TFH e PP presentano grande variabilità in termini di procedure sperimentali e sono tutt'altro che conferisce un consenso per stabilire protocolli standardizzati per diversi motivi. In primo luogo, ogni sottoinsieme delle cellule all'interno di PPs tende a risentire differenzialmente condizioni di preparazione dei tessuti che richiedono ulteriori modifiche nel modo di sottoinsieme specifico delle cellule. In secondo luogo, c'è una discrepanza significativa tra i metodi segnalati per quanto riguarda i dettagli della preparazione delle cellule da PPS. terzo, il numero di studi comparativi basati su protocollo studiando tecniche di preparazione del tessuto ideale e condizioni sperimentali per PP e TFH ricerca è piuttosto limitato.

Attuali studi basati su protocollo suggeriti per PP cella preparazione19,20,21,22 non erano TFH - o GC delle cellule di B-oriented. Inoltre, alcune condizioni di preparazione del tessuto consigliati per PPs19,20 come digestione basati su collagenosi sono stati trovati per influenzare negativamente il risultato dell'identificazione di TFH tramite flusso cytometry18. Su questa base, abbiamo ragionato che un protocollo ottimizzato, standardizzato e riproducibile che può essere utilizzato per studiare la dinamica cellulare TFH e GC B all'interno di PPs sarebbe prezioso per gli investigatori lavorando su questo argomento. Questa necessità ci ha dato l'impulso per generare un protocollo migliorato e aggiornato per l'isolamento e la caratterizzazione dei linfociti PP finemente ottimizzato per recupero cellulare, redditività ed efficienza per la caratterizzazione di cytometric di flusso delle diverse T e B sottoinsiemi di cellule. Abbiamo anche mirato a escludere diversi passaggi di laboriosa preparazione suggeriti nei precedenti protocolli, quindi, riducendo le opportune manipolazioni e i tempi per la preparazione di tessuti e cellule da PPs.

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Protocol

Tutti gli studi e gli esperimenti descritti in questo protocollo sono state condotte sotto le linee guida secondo istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) del Beth Israel Deaconess Medical Center.

1. progettazione di set-up sperimentale e Mouse gruppi

  1. (Opzionale) Co-casa topi sperimentali per facilitare la trasmissione orizzontale del microbiota dell'intestino tra topi sperimentali e per ridurre la variabilità non specifici all'interno di linfociti PP. Inoltre, è possibile utilizzare controlli littermate dello stesso sesso per ridurre al minimo la variabilità.

2. escissione e passaggi di preparazione del tessuto:

  1. Rimozione chirurgica del piccolo intestino (SI)
    1. Eutanasia topi usando CO2 asfissia o ogni altro metodo equivalente approvato dal comitato di etica animale istituzionale.
    2. Trasferimento il mouse in un'area dedicata per l'asportazione chirurgica. Posizionare sul retro verso il basso e sanificare l'addome con etanolo al 70%. Eseguire una laparotomia tagliando la pelle addominale e il peritoneo lungo la linea mediana dal pube alla gabbia toracica aprendo così la cavità peritoneale.
      Nota: Eseguire la prima incisione su una zona relativamente piccola della pelle per evitare di penetrare nella cavità peritoneale e danneggiare il tessuto intestinale. Continuare l'asportazione fino al bordo anatomico desiderato.
    3. Identificare l'intestino cieco, che è un ideale punto di riferimento per la rilevazione dell'ileo terminale, che costituisce il segmento distale dell'intestino tenue.
      Nota: Caecum solitamente si trova sul lato inferiore sinistro dell'addome del mouse.
    4. Individuare la giunzione ileocaecal e fare un taglio a questo livello come distale come possibile separare l'intestino tenue dall'intestino cieco. Durante i prossimi passi, evitare il contatto fisico eccessivo con la parete intestinale perché fragile PPs comprimere facilmente al tatto.
    5. Rimuovere delicatamente l'intero piccolo intestino fino al sphincter pilorico tagliando il mesentery usando le forbici. Identificare la giunzione tra il piloro e il duodeno, e snip duodeno a questo livello, che porterà a completare il distacco del piccolo intestino dalla cavità addominale.
      Nota: (i) evitare l'iperestensione come ciò potrebbe causare la rottura della parete intestinale. (ii) volendo isolamento del linfocita LP oltre ai linfociti PP, la completa rimozione del grasso mesenterico è necessaria. Tuttavia, per l'isolamento del PP, restanti grasso mesenterico potrebbe fornire alcuni vantaggi durante la procedura di isolamento ulteriore; di conseguenza, dovrebbe essere preservata.
    6. Posto staccato piccoli intestini in una piastra a 6 pozzetti riempito con RPMI freddo + 10% siero bovino fetale (FBS) e agitare delicatamente i tessuti manualmente fino a quando tutti i segmenti intestinali sono sommerso nei media freddi. Mantenere i tessuti sul ghiaccio durante i passaggi successivi.
    7. Dopo il numero desiderato di mouse piccoli intestini di dissezione, procedere all'asportazione di PP da raccolti piccoli intestini.
  2. Asportazione chirurgica del PPs e la preparazione della sospensione unicellulare:
    1. Delicatamente trasferimento piccolo intestino su un tovagliolo di carta nel grasso mesenterico utilizzando pinze di presa e posizionare il lato mesenterico rivolto verso il tovagliolo di carta. Inumidire l'intero segmento intestinale con freddo RPMI + 10% FBS per evitare la disidratazione del tessuto e la viscosità.
      Nota: Restanti grasso mesenterico può essere utile in questa fase perché segmenti di tessuto grasso sul sito mesenterico di SI attaccherà a mantenere il sito anti-mesenterico rivolto verso l'alto il tovagliolo di carta.
    2. Identificare il PPs, che appaiono come aggregati multi-lobulated bianchi a forma di "cavolfiore-come" sul lato anti-mesenterica della parete intestinale.
      Nota: Smascherare il contenuto luminale non è raccomandato fino a quando tutti i PPs sono asportate. Lo svuotamento del contenuto luminale potrebbe causare il crollo del PPs e impedirà il contrasto di colore tra PPs e la parete intestinale, che è molto utile per l'identificazione visiva di PPs.
    3. Dopo aver identificato i PPs sul lato anti-mesenterico, posizionare la forbice fine curvo chirurgica su PPs (curva dovrebbe affrontare) trattenente PP dal relativo bordo distale e prossimale.
      Opzionale: Spingere il PP dolcemente verso le lame della forbice utilizzando la punta di un dito. Questa manovra porterà all'esclusione meglio di PP non tessuto circostante. Asportare il PPs delicatamente, escludendo il circostante tessuto intestinale.
      Nota: (i) questo passaggio è fondamentale per ottenere il massimo rendimento delle celle PP, riducendo al minimo la contaminazione delle cellule dai vicini intestinale scomparti come LP e l'epitelio intestinale, che sono anche ricchi di cellule T. (ii) da un SI asportato dal topo C57BL/6, 5-10 PPs (dimensione media, multi-lobulated) possono essere raccolti. Puntando ancora più piccolo PPs (non multi-lobulated), raccolta di fino a 12-13 PPs per topo (C57BL/6) è possibile utilizzare questo protocollo.
    4. Trasferimento il PPs asportato ad una piastra di coltura del tessuto 12-pozzetti riempito con gelida RPMI + 10% FBS e mantenuto il ghiaccio con pinze o forbici chirurgiche curve.
      Nota: (i) immediatamente dopo l'asportazione del PPs, muco e contenuto intestinale sulla superficie PP possono essere puliti strofinando delicatamente il tessuto su un tovagliolo di carta. Questo passaggio vi aiuterà a migliorare la vitalità dei linfociti PP. (ii) invece di trasferire il PPs su un piatto, trasferimento di separati tubi può anche essere considerato a seconda del numero totale del campione.
    5. Opzionale: Quando l'asportazione PP e la disposizione successiva nella piastra ben sono stati completati, il numero e le dimensioni di PPs raccolti da gruppi sperimentali/mouse diverso può essere documentate scattando una foto della piastra di coltura del tessuto che contiene PPs.
    6. Preparare una serie di provette coniche da 50 mL riempita con 25 mL di RPMI + 10% FBS (preriscaldato a 37 ° C). Utilizzando un paio di forbici, tagliare il bordo di una punta di 1.000 µ l dalla distanza che permette l'aspirazione del PPs con pipetta da 1 mL. Aspirare il PPs con pipetta da 1 mL e trasferirli dalla piastra di coltura del tessuto 12-pozzetti il provette coniche da 50 mL preparato.
      Nota: Utilizzare un nuovo puntale per ogni campione del mouse per evitare contaminazioni incrociate tra i campioni.
    7. Avvitare il coperchio e posizionare i tubi verticalmente in un agitatore orbitale a 37 ° C con agitazione continua a 125-150 rpm per 10 min. Nel frattempo, preparare una nuova serie di provette da 50 mL e posizionare un colino di cella di 40 µm sulla cima di ogni tubo, attraverso il quale verrà preparati sospensione unicellulare.
      Nota: (i) il passo di agitazione rimuoverà il restanti intestinali contenuto, muco e detriti cellulari, che diminuire la vitalità cellulare e recupero dei linfociti PP se non vengono rimossi. (ii) non applicare alcun tipo di enzimi digestivi sul tessuto PP perché il processo di digestione provoca una drammatica perdita di espressione di CXCR5 dalla superficie delle cellule.
    8. Dopo l'agitazione, trasferire il PPs al 40 µm cella filtro posizionato sulla parte superiore dei tubi appena preparato conica 50 mL. Utilizzo il lato arrotondato di un pistone della siringa da 10 mL, delicatamente perturbare il PPs attraverso il filtro delle cellule per generare sospensione unicellulare. Risciacquare il filtro con 15 – 20 mL di RPMI freddo + 10% FBS.
      Nota: (i) prima del filtraggio, agitare le provette contenenti il PPs orizzontalmente. Questo frullato di breve faciliterà il trasferimento di PPs in filtri a cella. (ii) utilizzando un colino di cella di 70 µm per l'isolamento di cellule immunitarie non linfoidi (ad es., monociti, macrofagi, DCs) è raccomandato.
    9. Centrifugare le sospensioni di singola cellula a 350-400 x g per 10 min a 4 ° C.
    10. Attentamente, scartare il surnatante e risospendere le cellule ad una concentrazione di 10 x 106 cellule/mL. Contare le celle utilizzando un emocitometro.
      Nota: (i) prima di conta cellulare, il numero totale di celle per ogni gruppo di mouse PP può essere approssimativamente stimato utilizzando la seguente formula: "0,5-1 x 106 celle x (numero di PPs) = conteggio totale delle cellule". Ulteriori diluizioni con trypan blu per il conteggio delle cellule potrebbero essere necessari. (ii) in alternativa al conteggio manuale, cella automatizzata contatori possono essere utilizzati.
    11. Trasferimento di 2-2,5 x 106 cellule nel volume appropriato (ad es., 200 µ l) in una piastra a 96 pozzetti fondo tondo.
      Nota: Per singolo colore e campioni di controllo negativo, 0,5-1 x 106 celle potrebbero essere sufficiente.
    12. Centrifugare la piastra a 350 x g per 5 min a 4 ° C. Scorri la piastra.
    13. Lavare le cellule in 200 µ l di tampone di macchiatura.

3. superficie dell'anticorpo che macchia

  1. Redditività di colorazione:
    1. Dopo il lavaggio finale, risospendere le cellule in 100 μL di attuabilità risolvibile colorante diluito in PBS (1:1, 000). Incubare per 30 min in ghiaccio o a 4 ° C al buio.
      Nota: (i) intracellulare che macchia per la rilevazione della trascrizione fattori quali Foxp3 o Bcl-6 richiede la fissazione delle cellule. In tal caso, la vitalità non fissabile coloranti (ad es., 7-AAD, DAPI) non può essere utilizzato. (ii) per diluire la tintura di attuabilità risolvibile, non utilizzare qualsiasi colorazione buffer che contiene la proteina. I media utilizzati in questo passaggio deve essere privo di proteine. (iii) esclusione di cellule morte utilizzando vitalità colorazione è fondamentale perché le cellule morte possono causare gravi difficoltà tecniche nell'analisi di citometria a flusso attraverso l'emissione di autofluorescenza e legando gli anticorpi di superficie non specifico, che potrebbe condurre a false risultati positivi.
    2. Lavare le cellule due volte con tampone di colorazione. Centrifuga a 350 x g per 5 min a 4 ° C. Scorri la piastra.
  2. Blocco di FC e superficie - strato I:
    1. Preparare la soluzione di Fc-blocco diluendo l'anticorpo anti-CD16/32 (1: 200) in tampone di macchiatura.
    2. Risospendere le cellule in 20 μL di soluzione preparata di Fc-blocco. Incubare per 15 minuti sul ghiaccio.
    3. Senza lavaggio, aggiungere 80 µ l di anticorpo di superficie di cocktail (Vedi tabella 1 per l'anticorpo Riepilogo) preparato alle appropriate diluizioni. Incubare in ghiaccio per almeno 30 min.
    4. Lavare due volte con l'aggiunta di buffer di colorazione eccessiva. Centrifuga a 350 x g per 5 min a 4 ° C. Scorri la piastra.
  3. Superficie - livello II:
    1. Preparare soluzione colorante streptavidina diluendo streptavidina fluorocromo-coniugate nel buffer di colorazione.
    2. Dopo il lavaggio finale, risospendere le cellule con 100 μL di streptavidina pre-diluito (1: 100) soluzione di colorazione. Incubare per almeno 15 min su ghiaccio al buio.
    3. Lavare due volte con tampone di colorazione. Centrifuga a 350 x g per 5 min a 4° C. Scorri la piastra.
      Opzionale: Se colorazione intracellulare per il rilevamento di cellula T regolatrice follicolare non è desiderato, dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le cellule in 200 μL di macchiatura buffer e trasferimento nelle provette appropriati per acquisire dati nel citometro a flusso. Quando i campioni non sono fissi, acquisizione di dati mediante citometria a flusso deve essere eseguita all'interno di 3 – 4 h per ottenere risultati accurati.

4. cellula fissazione

  1. Preparare la soluzione di lavoro di fissazione/permeabilizzazione (Fix/Perm) utilizzando i reagenti da Foxp3/trascrizione fattore di macchiatura Buffer impostato. Mescolare una parte di fissazione/permeabilizzazione concentrato con tre parti di fissazione/permeabilizzazione diluente al volume finale desiderato.
  2. Dopo il lavaggio finale, risospendere le cellule in 200 μL di soluzione di lavoro di correzione/Perm.
  3. Incubare la piastra in ghiaccio o a 4 ° C per 20 min. Non superare i 20 min per questo passaggio. Tempo di incubazione più lungo potrebbe diminuire notevolmente il recupero delle cellule.
  4. Centrifuga a 350 x g per 5 min a 4 ° C. Scorri la piastra. (Opzionale) Dopo questo passaggio, si possono depositare celle fisse per diversi giorni a 4 ° C nella macchiatura tampone contenente albumina di siero bovino (BSA) o FBS fino alla successiva intracellulare macchiatura o flusso cytometry acquisizione.
  5. Risospendere le cellule in 200 μL di permeabilizzazione Buffer (x1) appena pre-diluito in acqua deionizzata purificata.
  6. Centrifugare a 350 x g per 5 min a temperatura ambiente (TA).
  7. Lavare una volta con 200 μL di tampone di permeabilizzazione e centrifugare a 350 x g per 5 minuti a TA.

5. intracellulare di colorazione

  1. Preparare la soluzione di Fc-blocco diluendo l'anticorpo anti-CD16/32 (1: 200) nel buffer di permeabilizzazione.
    Nota: Dopo la fase di fissazione, le cellule devono essere mantenute nel buffer di permeabilizzazione fino alla fine del processo di colorazione intracellulare.
  2. Dopo il lavaggio finale, risospendere le cellule in 20 μL di soluzione di Fc-blocco. Incubare per 10 – 15 min a temperatura ambiente al buio.
  3. Senza lavaggio, aggiungere 80 µ l di anticorpo intracellulare cocktail (volume finale di 100 μL) pre-diluito in un tampone di permeabilizzazione. Incubare per 30 minuti a TA.
  4. Aggiungere 100 μL di tampone di Perm e centrifuga a 350 x g per 5 minuti a TA.
  5. Lavare una volta con 200 μL di tampone di permeabilizzazione, centrifugare a 350 x g per 5 minuti a TA.
  6. Dopo il lavaggio finale, risospendere le cellule in 200 μL di tampone di colorazione e trasferire le cellule nelle provette appropriati (volume finale di 400 μL nel buffer di colorazione) e acquisire dati tramite flusso cytometry. Campioni macchiati in piastra a 96 pozzetti possono essere eseguiti anche senza trasferire nelle provette se un citometro a flusso con opzione lettore piatto è disponibile. Questo passaggio minimizza la perdita di cellule durante il trasferimento delle cellule.
  7. Acquisire un minimo di 5 x 105 cellule totali sul citofluorimetro per essere in grado di eseguire analisi riproducibili di TFH, TFR, nonché GC B cellule.

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Representative Results

In contrasto con un precedente protocollo20, abbiamo osservato che PPs non sono distribuiti uniformemente in tutto il SI, ma sono localizzati più densamente verso l'estremità distale e prossimale del SI, come mostrato Figura 1A. L'analisi cytometric di flusso ha mostrato che, se seguite correttamente, il nostro protocollo dà una popolazione di linfociti PP che illustra la distribuzione di forward-side scatter simile a splenocytes (Figura 2AE e 2D, H) con > 95% delle cellule vitalità (Figura 2B e 2F). A differenza di altri organi linfoidi secondari (SLOs), in topi C57BL/6 circa il 70-80% dei linfociti totali PP consistono delle cellule B, mentre CD4+ T cellule costituiscono solo il 10 – 15% dei linfociti totali PP (Figura 2 e 2 G).

Siete pregati di notare che CD4+ CD19+ cellule positive doppia (DP) costituiscono ≈ 1% dei linfociti totali di PP. Con alcune precauzioni durante la preparazione della cella come esecuzione Fc-blocco contro Fc recettori delle cellule B ed escluse doppietti, CD4+ CD19+ DP popolazione delle cellule potrebbe essere ridotto al minimo (Figura 3A e B). Tuttavia, una frazione di DPs che non mostrano caratteristiche di forward scatter (FSC) di doppietti è inevitabile e dovrebbe essere recintata fuori dai cancelli delle cellule B e T positivi singoli (Figura 3B). I nostri risultati hanno rivelato che le cellule di B all'interno delle cellule DP CXCR5 altamente espressa sulla loro superficie (Figura 3) che potrebbe portare a risultati falsi positivi nel cancello TFH che viene regolata base CXCR5 espressione in CD4+ T cellule. D'altra parte, abbiamo trovato che GL7, un marcatore delle cellule B attivate, si esprime anche in CD4+ CD19+ DP cellule (Figura 3D), che potrebbero causare interferenze con GC B cella gating.

Esempi di TFH e GC B cella gating algoritmi sono rappresentati in Figura 4. Per GC B cella gating, usiamo GL7 etichettatura contro CD38, che identifica le cellule di B di GC come GL7+ CD38 le cellule di B di (fig. 4A-B). PNA etichettatura potrebbe essere utilizzato invece di GL723 mentre CD38 può essere sostituito con uno dei seguenti marcatori: IgD, Bcl-6 e CD95. Gating strategie per GC B cellule sono dimostrate alternativa Figura S1. Rapporto delle cellule di GC B in PPs Mostra grande variabilità in topi C57BL/6. Tuttavia, rispetto ad altri SLOs, PPs sono significativamente più alto rapporto delle cellule di GC B con una gamma di 2-10% delle cellule totali di B in condizioni di stato stazionario. Gating strategia per le cellule PP TFH è descritto come CD19 CD4+ PD-1Ciao CXCR5+ T cellule (Figura 4A, C). "Zebra trama" è stato trovato per essere un metodo di dimostrazione ottimale per TFH gating come esso raffigura PD-1Ciao popolazione più discreto rispetto ad altri tipi di trama (Figura 4). TFR, un sottoinsieme delle cellule TFH che esprimono Foxp3, sono gated come CD19 CD4+ PD-1Ciao CXCR5+ Foxp3+ T cellule (Figura 4). Come GC B cellule, la frazione di cella TFH varia anche in soggetti non immunizzati mouse con una gamma di 10 – 20% del totale CD19 CD4+ PP linfociti. Dettagli di algoritmi alternativi gating per cellule TFH sono descritti nella Figura 4E, F e Figura S1C, D.

Per evitare false positività a causa di una colorazione di fondo e autofluorescenza, controlli di isotipo o controlli equivalenti alternativi come fluorescenza Minus One (FMO) dovrebbero essere inclusa nel pannello colorazione come controllo negativo per gli indicatori delle cellule TFH e GC B ( Figura 4-J).

Per ottimizzare le condizioni di preparazione dei tessuti PP, abbiamo sviluppato una nuova strategia sperimentale internamente controllata, in cui PPs sono stati raccolti da un mouse singolo e raggruppati separatamente a seconda della loro origine anatomica (ad es., duodenale, ileale). Per l'esecuzione di esperimenti, PPs pool sono stati assegnati a singoli gruppi così che ogni sperimentale e gruppo di controllo includeva un numero uguale di PPs da ogni regione anatomica (Figura 5A). Da questo approccio, abbiamo trovato che digestione enzimatica basata su collagenosi (testato a 37,5 mg di collagenasi II o IV per 25 mL di miscela di digestione = 1,5 mg/mL), che è comunemente usato per l'isolamento da vari tessuti mucosi, CXCR5 significativamente ridotta espressione in linfociti PP (figura 5B), particolarmente in cellule di TFH (Figura 5F-io), mentre l'espressione di altre molecole di superficie (ad es., CD19, CD4) è rimasto intatto (Figure 5 C-E). Riduzione di CXCR5 rilevazione era prominente affinché l'espressione di CXCR5 su cellule trattate con collagenasi TFH era quasi indistinguibile dal controllo di isotipo (Figura 5F-io). Ulteriori esperimenti hanno mostrato che il livello di interferenza di digestione enzimatica con espressione CXCR5 dipendeva il clone di anticorpo CXCR5 utilizzato (Figura 6A-F). In particolare, previo trattamento di collagenasi II, la capacità di rilevamento di CXCR5 anticorpo clone 2 8 era più significativamente alterata, rispetto alla capacità di rilevamento del clone dell'anticorpo CXCR5 L138D7 (Figura 6A-D).

Digestione enzimatica ridotto non solo l'espressione di CXCR5, ma anche la percentuale di linfociti totali all'interno delle cellule PP come determinato dalle caratteristiche FSC-SSC, mentre una frazione considerevole di cellule isolate da digerito PPs esposto in avanti e di lato dispersione di una maggiore intensità di linfociti PP (figura 7A-C). Gli effetti della collagenasi sul recupero delle cellule si è verificato in maniera dose-dipendente (figura 7A, H-J). Digestione enzimatica aumentato l'attuabilità delle cellule (Figura 7, E). Tuttavia, questo beneficio non era causativo legato alla digestione della collagenosi perché le cellule isolate da PPs dopo l'agitazione senza collagenosi sono state favorite allo stesso modo (Figura 7F). L'individuazione del fattore di trascrizione nucleare Foxp3, che è di particolare interesse perché solitamente è valutata durante l'isolamento di TFH per identificare le celle TFR, è stato migliorato dall'agitazione a 37 ° C indipendentemente dalla digestione della collagenosi (Figura 7 ).

Figure 1
Figura 1: struttura macroscopica e distribuzione anatomica di murino di Peyer. (A). l'immagine ottenuta da duodenale-fine del piccolo intestino con lo stomaco. Due PPs strettamente situato nel duodeno sono indicati con frecce nere. (B). PPs raccolti da undici topi C57BL/6 sono stati immagazzinati singolarmente in una piastra a 12 pozzetti. (C). immagine del mouse appena asportato PPs visualizzata su un colino di cella di 40 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: flusso cytometric caratterizzazione e algoritmo di gating base per i linfociti PP. (A). trame Dot dimostrano la distribuzione dei linfociti PP unfixed appena isolati lungo assi FSC e SSC, che esibiscono la grande somiglianza a splenocytes raffigurato in (D). (B). l'esclusione delle cellule morte per mezzo di espressione 7AAD. 7AAD cellule rappresentano le cellule vive. (C). CD19 e CD4-basata immunophenotyping delle cellule T e B fra pre-gated cellule vive di PP. (E-G). Analisi di flusso rappresentativi dei linfociti PP fissi. (H). caratteristiche di flusso rappresentativo degli splenocytes fisso. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: CD4+ CD19+ doppio positivo (DP) cellule causa false positività in TFH e GC B cella gating. (A). CD4+CD19+ DP linfociti all'interno di cellule vive di PP sono dimostrati. (B). celle di separazione di DP basano sulle caratteristiche FSC come doppietti e canottiere. (C,D). CXCR5 e GL7 espressione delle cellule di DP sono raffigurati in appezzamenti di istogramma. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: strategia di gating di cella rappresentante TFH e GC B. PPs sono stati raccolti da un 3 - mese vecchio mouse e linfociti sono stati isolati come descritto nella sezione protocollo. (A) CD19 e CD4 etichettatura dei linfociti PP dal vivo sono raffigurati. (B) CD38lo GL7CiaoCD19+ B cellule erano gated come cellule di B di GC. (C), TFH cellule erano gated come CXCR5+PD-1Ciao CD4+ cellule. (D) il TFR cellule sono una frazione di cellule TFH che esprimono il fattore di regolamentazione cellula-specifico trascrizione Foxp3 insieme ai marcatori TFH e sono gated come CXCR5+ PD-1Ciao Foxp3+ CD4+ T cellule. (E-F) Gating strategia per TFH marcatori di superficie confermati negli splenocytes isolato da mouse NP-ovuli-immunizzati per mezzo di espressione di BCL-6. (G-J) Controlli di fluorescenza Minus One (FMO) per chiave TFH-TFR e gli indicatori delle cellule di GC sono raffigurati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: digestione enzimatica basata su collagenosi conduce ad una riduzione massiccia di rilevazione CXCR5. PPs (A) da un 2 mesi mouse situato nel duodeno (≈ 1/3 prossimale), digiuno (≈ 1/3 medio) e ileo (≈ 1/3 distale) sono stati raccolti e raggruppati separatamente. PPs in pool sono stati equamente distribuiti ai gruppi sperimentali. Digestione enzimatica con collagenasi II o IV alla concentrazione di 1,5 mg/mL è stata effettuata con agitazione per 10 min a 37 ° C. (B-E) Istogramma trame raffigurante l'espressione di molecole di superficie (CXCR5, CD19, PD-1, CD4) delle cellule isolate da PPs che sono stati sottoposti a digestione della collagenosi-basato. (F-io) TFH gating entro la collagenasi-amministrati e gruppi di controllo è dimostrato nelle trame della zebra. I dati rappresentano tre esperimenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: l'effetto della collagenosi CXCR5 espressione ha mostrato grande differenza a seconda il clone di anticorpo anti-CXCR5. PP linfociti raccolti da un 6-mese-vecchio mouse, pool e separati in diversi gruppi per quanto riguarda l'anticorpo clonare applicazione di digestione enzimatica e usate. (A-F) La proporzione di cellule TFH è raffigurata nelle piazzole zebra interno pre-gated dal vivo, CD19 CD4+ T cellule. (A, C e E) cellule PP sono state macchiate con l'anticorpo di CXCR5 anti-topo coniugato con biotina (2 8 clona), e streptavidina coniugata con BV421 fluorocromo. Cellule PP (B, D e F) sono state macchiate con un anticorpo primario del CXCR5 anti-topo coniugato (clone di L138D7). (A-B) TFH gating trame dai linfociti PP non digeriti. (C-D) PPs digerito con collagenasi II (20 mg/25 mL di miscela di digestione) e agitato per 10 min a 37 ° C. I dati rappresentano due esperimenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: digestione della collagenosi-basato e agitazione a 37 ° C influenzare attuabilità delle cellule, il recupero e l'efficienza di colorazione intracellulare. È stato sacrificato un 3 mouse C57BL/6 mesi; PPs sono stati raccolti e riuniti come descritto in Figura 5A. (A) dopo la raccolta di PPs, i tessuti sono stati agitati in presenza di collagenasi II (37,5 mg/25 mL di miscela di digestione) per 10 min, FSC e SSC caratteristiche delle cellule PP fisse sono raffigurate in (A) e vitalità colorazione trama è raffigurato nel ( D). (B, E) dopo la raccolta di PPs, i tessuti sono stati tenuti sul ghiaccio senza agitazione o digestione enzimatica; FSC e SSC caratteristiche delle celle fisse di PPs sono raffigurate in (B) e vitalità colorazione è raffigurato nella (E). (C, F) Dopo la raccolta di PPs, tessuti erano agitati a 125-150 rpm per 10 min a 37° C in assenza di collagenasi; Caratteristiche FSC e SSC e vitalità colorazione delle celle fisse PP sono raffigurati (C, F), rispettivamente. (G) confronto dell'espressione di Foxp3 nelle cellule di T regolarici isolato da agitato e sfida PPs senza amministrazione di collagenasi è raffigurato nella trama istogramma. (H-J) PPs raccolti da un 6 - mese-vecchio mouse C57BL/6 e sono state trattate con diverse concentrazioni di collagenasi II: 25 mg al mix di digestione di 25 mL, 15 mg / 25 mL digestione mix o no della collagenosi. Trame FSC e SSC che rivelano gli effetti di digestione enzimatica sul recupero delle cellule PP e rendimento sono raffigurati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: il modello molecolare e la sequenza completa dell'amminoacido di CXCR5. (A) passa sette-struttura della proteina del transmembrane di CXCR5 è modellato. (B) la sequenza completa dell'amminoacido di CXCR5 è dimostrato. La sequenza delle regioni extracellulare è indicata in rosso e aminoacidi extracellulari con legami chimici sensibili presumable collagenosi sono dimostrati in giallo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Antigene Clone Fluourochrome Diluizione
CD4 GK1.5, RM4-5 APC, PECy7, PerCpCy5.5, FITC 1: 100
CD19 5 DI 6 FITC, APC/Cy7 1: 100
PD-1 J43 Ef PE 610 (Texas Red) 1: 100
ICOS F9 15, 7E.17G9 PE 1: 100
FLV FLV PerCp/CY 5.5 1: 75
CXCR5 2 8,L138D7 * Biotina 01:50
BCL-6 1 DI 7 PE/Cy7 01:50
FOXP3 FJK-16 APC, PE 1: 100
Streptavidina - BV421, PE 1: 100
Tintura di FixableViability - 510(AQUA) BV 1:1,000
7AAD - PerCp/CY 5.5 1: 500
FcBlock (CD16/32) 2.4G2 - 1: 200

Tabella 1: riepilogo anticorpo. Sono indicate le diluizioni, cloni e coniugazioni fluorocromo per la relativi anticorpi e coloranti di attuabilità. La diluizione ottima potrebbe variare a seconda delle condizioni sperimentali e molte qualità del prodotto. Primario clonato L138D7 BV421-coniugato alle 01:20 diluizione ha mostrato capacità di rilevamento CXCR5 paragonabile con il coniugato con biotina 2 8 clone alle 01:50 diluizione. Pertanto, L138D7 primaria-coniugato può essere utilizzato come alternativa al coniugato con biotina 2 8 clone.

Figura complementare 1 (S1): alternativa gating strategie per cellule TFH e GC B. (A) sono raffigurati i linfociti PP Live da un mouse 3 mesi sullo sfondo C57BL/6. (B-C) Le cellule di B di GC sono gated come CD38GL7+ (B) e BCL-6+ GL7+ B cellule (C). (D-E) Cellule TFH sono raffigurate come PD-1Ciao CXCR5+ (D) e come ICOS+CXCR5+ CD4 + T cellule (E). Per favore clicca qui per scaricare questo file.

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Discussion

Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per la caratterizzazione di cytometric di flusso delle cellule TFH e GC B. Uno dei vantaggi principali del nostro protocollo è che permette l'isolamento di fino a 10 cellule PP totale7 (media 4 – 5 x 106 cellule) da un singolo mouse (ceppo C57BL/6) senza alcun processo digestivo. Abbiamo osservato che la resa totale delle cellule è stata correlata positivamente con il numero di PPs e poteva essere stimata dalla seguente equazione semplice che è utile per la pianificazione sperimentale: "totale PP delle cellule totali per mouse = 0,5 – 1 x (numero di PP asportato a mouse) x 106". Questo rendimento elevato delle cellule è stato completato con la vitalità cellulare avanzata (> 95%). Recupero migliore delle cellule e l'attuabilità consentito eseguire analisi citofluorimetrica delle varie sottopopolazioni linfocitarie in PPs utilizzando anticorpi diversi pannelli in parallelo.

Rispetto ad un recente protocollo di isolamento PP pubblicato da De Jesus et al. 20 e precedenti rapporti19,21, ha dato il nostro protocollo considerevolmente più alto rendimento delle celle totale e redditività, nonostante l'assenza della digestione con collagenasi. Anche se l'identificazione di PPs potrebbe essere "difficile" per il prima volta gli investigatori, la curva di apprendimento per questo protocollo è piuttosto ripida, e se masterizzato, la nostra tecnica permette l'identificazione e l'asportazione chirurgica del PPs dal piccolo intestino in un breve tempo. Se non viene raggiunto il numero PP desiderato dopo il primo tentativo, ti consigliamo di ripetere la fase di identificazione PP concentrandosi sull'estremità distale e prossimale del SI. Nella nostra pratica, quasi in ogni mouse, due PPs posizionato vicino alla fine duodenale (Figura 1A) e almeno 2 – 3 PPs entro gli ultimi 5 cm dell'ileo erano rilevabili.

TFH colorazione può essere più esigenti di altri sottoinsiemi di cellule all'interno del PPs, così richiedendo l'attenzione supplementare18. Se alcuni passaggi sono persi durante la lavorazione del tessuto e isolamento delle cellule, i risultati potrebbero essere abbastanza fuorviante. Quindi, consigliamo di ricercatori per prestare attenzione alle seguenti sperimentale "punte". Dal markers delle cellule chiave TFH e GC B come CXCR5 e GL7 può essere espresso in cellule di T e B, è fondamentale includere un indicatore delle cellule B in pannelli di anticorpo per evitare risultati falsi positivi a causa del contaminante CD19+CD4 cellule+ DP24 ( Figura 2). Siete pregati di notare che gating strategie basato su indicatori a cellula T solo25 non fornirà sufficiente dell'esclusione delle celle di DP, poiché queste cellule anche altamente esprimono marcatori di cellula T compreso CD3 (dati non mostrati) e CD4. Oltre l'esclusione delle cellule di DP, risultati cytometry di flusso devono essere convalidate e confermati con l'ausilio di appropriati controlli negativi (ad es., controlli di isotipo, protocolli). Non solo false positività, ma anche fuori luogo TFH cancello può portare a falsi risultati e conclusioni. Regolazione del cancello TFH a volte potrebbe essere difficile soprattutto se popolazione cellulare TFH non è abbondante, quindi non apparendo come una popolazione discreta in citometria a flusso. Per aggirare questa limitazione, l'aggiunta di più indicatori di TFH (ad es., BCL-6, PD-1, ICOS) in anticorpo pannello potrebbe fornire opportunità alternative di gating e aumentare la precisione26. Per motivi pratici, BCL-6 è stato trovato per essere che un indicatore ideale co-colorazione per alternativa TFH gating come può essere utilizzato per gating GC B cellule contemporaneamente16 (Figura S1C).

Inoltre, avendo un campione di controllo positivo contenente un'alta percentuale TFH potrebbe fornire ai ricercatori buona navigazione per posizionare correttamente il cancello TFH. Nei nostri esperimenti, abbiamo usato i campioni PP da topi invecchiati (più vecchi di 6 mesi) come controllo positivo poiché abbiamo trovato che l'invecchiamento causa l'aumento di TFH cellule all'interno di PPs fino al 40% del totale CD4+ T cellule in regime stazionario (dati non mostrati). Incoraggiamo inoltre i ricercatori che hanno ulteriore interesse in dettagli tecnici di TFH macchiatura per guardare i metodi nel libro protocollo pubblicato per cella TFH macchiatura18.

Prove sperimentale ipotesi in PP possono essere relativamente difficile e potrebbero richiedere un numero molto elevato di topi al gruppo di raggiungere significatività statistica21. Sfruttando il rendimento delle celle alta del nostro protocollo, abbiamo aggirato questo ostacolo con le seguenti strategie sperimentali. In primo luogo, abbiamo asportato PPs e li ha ordinati separatamente a seconda della loro origine anatomica (ad es., duodenale, digiunale e ileale). Quindi, abbiamo distribuito ugualmente questi pool PPs in diversi sperimentali e gruppi di controllo. Questa strategia sperimentale internamente controllata permette di ridurre al minimo la differenza interindividuale nei topi, mentre tutte le cellule sono state ottenute da un singolo mouse.

Inoltre, variabilità tra i diversi compartimenti intestinale (ad es., duodeno vs. ileo)-precedentemente segnalata per essere significativo2 — è stato evitato come sperimentale e gruppi di controllo costituito da un numero uguale di PPs al regione anatomica (Figura 5A). Mediante l'esecuzione di ripetizioni di esperimenti indipendenti utilizzando lo stesso approccio, abbiamo migliorato l'affidabilità e l'importanza dei nostri risultati. Oltre ad eliminare variazioni non specifici, questa metodologia aiuta anche tempo, reagenti e topi di ricambio.

Durante lo sviluppo e l'ottimizzazione del nostro protocollo, i nostri risultati hanno rivelato che collagenosi digestione basati su II e IV ha ridotto in maniera sconvolgente CXCR5 espressione (figura 5B) mentre altre molecole di superficie per il rilevamento di TFH e cellule di GC B è rimasto intatto ( Figura 5 -E) . In un recente segnalati JoVE protocollo19, collagenosi II è stata indicata per essere molto efficace per l'isolamento da PPs e LPs. Tuttavia, collagenosi II precedentemente è stata segnalata per avere un'alta attività triptica, che si traduce nella fenditura di diverse molecole di superficie. Data la sua natura amichevole di molecola di superficie27 a causa della minore attività triptica e l'utilizzo più comune nella letteratura28,29,30, collagenasi IV era stato anche incluso oltre a collagenosi II in il nostro studio e utilizzato nelle concentrazioni come consigliato in questi rapporti precedenti. L'uso di collagenasi ed enzimi equivalenti è stato un problema di contraddittorio in immunologia delle mucose a causa degli effetti indesiderati della digestione su cellule del sistema immunitario alterate come superficie della molecola espressione31,27.

Precedentemente è stato segnalato che l'uso di diversi tipi di collagenasi poteva interferire con il flusso cytometric CXCR5 rilevamento all'interno dell'intestino umano32 e tonsilla campioni18. Al contrario, altri studi hanno dimostrato l'isolamento di cellule TFH e GC B da PPs senza l'uso di collagenasi24,33. Tuttavia, fino ad ora nessun approccio comparativo era stato intrapreso per valutare se l'inclusione o l'esclusione di digestione della collagenosi rappresenterebbe la condizione ottima per l'isolamento di cellule esprimenti CXCR5 TFH da murino PPS. Mouse CXCR5 è un aminoacido 374 proteina di membrana lungo sette-pass con regioni extracellulare relativamente breve rispetto ad altre proteine transmembrane come CD4, CD19 che sono abbondantemente espressi in cellule linfoidi in PPs (dati ottenuti da UniProt). In Figura 8A-B, un modello molecolare e la sequenza di amminoacido totale del mouse CXCR5 sono raffigurati con le sequenze di destinazione presunta della digestione della collagenosi-basato, che tende a dissociare i legami chimici tra glicina (Gly) e neutral amino acidi34. I domini extracellulari breve risultante struttura molecolare del transmembrane sette-pass potrebbero essere responsabili di rendendo CXCR5 molecola vulnerabile a digestione enzimatica (Figura 8A). Curiosamente, abbiamo trovato che la determinazione dell'espressione CXCR5 dopo trattamento di collagenasi è dipenda il clone dell'anticorpo utilizzato. Anche se 2 8 e cloni di L138D7 ha mostrato prestazioni simili nel gruppo PP non digerito, come determinato tramite la rilevazione delle frazioni TFH comparabili, nel gruppo PP digerito, clone di L138D7 ha rivelato circa 3 x (≈ 9%) più alta frazione di cellule CD4 TFH+ Cellule di T rispetto al 8 2 clone (≈ 3%) (Figura 6). Questa scoperta suggerisce che la macchiatura CXCR5 ridotta potrebbe essere secondaria alla configurazione di epitopo tridimensionale modificate dall'attività enzimatica di collagenasi. I nostri risultati indicano che basati su collagenosi digestione deve essere evitata durante la preparazione del PP.

L'interferenza di dissociazione della collagenosi con rilevazione della molecola CXCR5 fu aggirata escludendo la fase di digestione. Tuttavia, dovrebbe essere notato che per alcuni tessuti, come LP, rottura meccanica non è sufficiente per isolare le cellule e per tali tessuti, digestione enzimatica sarebbe richiesto19. In futuro, sarà fondamentale per testare condizioni alternative digestione così come cloni di digestione-compatibile anticorpo per bypassare questa limitazione tecnica per tessuti che richiedono processi digestivi enzimatici. Fino ad allora, tecniche di imaging come microscopia di fluorescenza immune rimarrà come il metodo di scelta per il rilevamento di TFH in questi tessuti. Oltre a isolare cellule di LP, l'isolamento di alcuni sottoinsiemi di cellule ematopoietiche come DCs e cellule di plasma da PPs richiedono digestione enzimatica35. Quando si impiega il nostro protocollo, i ricercatori che desiderano isolare questi sottoinsiemi di cellule da PPs dovrebbero includere l'appropriata digestione enzimatica passo20. Possibili interferenze di digestione enzimatica con l'espressione di marcatori di DC dovrebbero essere presi in considerazione e condizioni di digestione devono essere ottimizzate secondo le necessità. Quando l'isolamento delle cellule TFH e GC B è richiesta oltre a un sottoinsieme di cella che richiede collagenosi digestione36, PPs raccolti da ogni mouse potrebbe essere separato in due gruppi per il trattamento con e senza trattamento collagenasi in quadri di parallelo.

Gli effetti della collagenosi sui linfociti PP non erano limitati all'espressione di superficie della molecola. I nostri risultati hanno rivelato che la digestione enzimatica causata una relativa diminuzione della percentuale dei linfociti all'interno delle cellule PP in maniera dose-dipendente (Figura 7). La diminuzione della frazione del linfocita potrebbe essere una conseguenza del rilascio di collagenasi-mediata di altri tipi di sottoinsiemi di cellule ematopoietiche come fagociti e DCs da PPs che sono più grandi e più granulare delle cellule linfoidi. È anche possibile che la digestione della collagenosi mediata cellula rilascio dai vicini LP e scomparti intraepiteliale potrebbero contribuire al cambiamento del profilo di FSC-SSC. Questa contaminazione di cella da altri comparti dell'intestino potrebbe anche causare interferenze l'analisi del flusso dei linfociti PP. Su tale base, per massimizzare la purezza delle cellule, abbiamo anche evitare l'aggiunta di reagenti come EDTA o DTT che sono ampiamente usati per estrarre le cellule epiteliali e muco20, mantenendo condizioni di preparazione dei tessuti come fisiologica e unmanipulated possibile. Nonostante questi effetti negativi della digestione enzimatica, effetti benefici sui linfociti PP sono stati scoperti anche come miglioramento della colorazione intracellulare e di attuabilità delle cellule (Figura 7-F, G). Tuttavia, ulteriori analisi hanno rivelato che questi effetti sono stati attribuiti al processo di agitazione a 37 ° C indipendentemente dalla digestione enzimatica, perché la vitalità cellulare e colorazione intracellulare di Foxp3 sono stati favoriti in misura paragonabile quando le cellule sono state agitate in l'assenza della collagenasi. Meccanicistico, l'effetto benefico di agitazione potrebbe essere a causa della rimozione migliorata del contenuto intestinale e muco da PPs.

In sintesi, abbiamo descritto un protocollo semplificato per l'isolamento dei linfociti da PPS. isolato cellule possono essere macchiate per la caratterizzazione di cytometric di flusso delle diverse sottopopolazioni cellulari o può essere sottoposto a ordinamento delle cellule e successivamente utilizzate in vari in vitro e in vivo saggi funzionali.

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Disclosures

Conflitti di interesse non dichiarati.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare Laura Strauss e Peter Sage per utili discussioni e supporto con analisi di citometria a flusso.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-mouse CD4 antibody eBioscience, Biolegend* 17-0041-81 ,10054* For detailed information see Table 1
anti-mouse CD19 antibody eBioscience MA5-16536 For detailed information see Table 1
anti-mouse PD-1 antibody eBioscience 61-9985-82 For detailed information see Table 1
anti-mouse ICOS antibody eBioscience 12-9942-82 For detailed information see Table 1
anti-mouse GL7 antibody Biolegend 144610 For detailed information see Table 1
anti-mouse CXCR5 antibody Biolegend*, BD Bioscience 145512*, 551960 For detailed information see Table 1
anti-mouse BCL-6 antibody Biolegend 358512 For detailed information see Table 1
anti-mouse Foxp3 antibody eBioscience 17-5773-82 For detailed information see Table 1
Streptavidin-BV421 BD Bioscience 563259 For detailed information see Table 1
FixableViability Dye eBioscience L34957 For detailed information see Table 1
7AAD Biolegend 420404 For detailed information see Table 1
FcBlock (CD16/32) BD Bioscience 553141 For detailed information see Table 1
Collagenase II Worthington LS004176
Collagenase IV Worthington LS004188
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set eBioscience 00-5523-00
6-well,12-well & 96-well plates Falcon/Corning 353046,353043/3596
50 mL conical tubes Falcon 3520
40 µm cell strainer Falcon 352340
10 mL syringe-plunger Exel INT 26265
RPMI Corning 15-040-CV
PBS Corning 21-040-CM
FBS Atlanta Biologicals S11150
Orbital shaker VWR Model 200
Curved-end scissor
Fine Serrated Forceps
Small curved scissor

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References

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