इन विट्रो में ताऊ के एकत्रीकरण का अध्ययन करने के लिए परख प्रोटीन और ड्रग स्क्रीनिंग

Neuroscience
 

Summary

ताऊ का एकत्रीकरण परख इस पांडुलिपि में वर्णित vivo ताऊ का खुलासा और एकत्रीकरण में की प्रत्याशित सुविधाओं की नकल ।

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Crespo, R., Koudstaal, W., Apetri, A. In Vitro Assay for Studying the Aggregation of Tau Protein and Drug Screening. J. Vis. Exp. (141), e58570, doi:10.3791/58570 (2018).

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Abstract

ताऊ प्रोटीन का समुच्चय और युग्मित पेचदार रेशा का गठन अल्जाइमर रोग और अन्य tauopathies की एक बानगी है । neurodegenerative रोगों के साथ जुड़े अन्य प्रोटीन की तुलना में रिपोर्ट इन विट्रो एकत्रीकरण कैनेटीक्स ताऊ प्रोटीन के लिए कम संगत एक अपेक्षाकृत उच्च परिवर्तनशीलता पेश कर रहे हैं. यहाँ हम में एक के विकास का वर्णन इन विट्रो एकत्रीकरण परख कि vivo मेंताऊ का खुलासा और एकत्रीकरण के साथ जुड़े अपेक्षित कदम की नकल । परख सबसे लंबे समय तक ताऊ isoform (huTau441) का उपयोग करता है जो दोनों एन टर्मिनल अंलीय आवेषण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से चार microtubule बंधन डोमेन (MBD) शामिल हैं । इन विट्रो एकत्रीकरण हेपरिन के अलावा द्वारा ट्रिगर किया जाता है और लगातार thioflavin टी प्रतिदीप्ति द्वारा एक ९६ अच्छी तरह से microplate प्रारूप में पीछा किया । ताऊ एकत्रीकरण परख विभिंन कुओं, प्रायोगिक चलाता है और प्रोटीन के बैचों के बीच अत्यधिक reproducible है । एकत्रीकरण ताऊ PHF-की तरह आकृति विज्ञान जो डी नोवो fibrillar संरचनाओं के गठन बोने में बहुत कुशल है की ओर जाता है । ताऊ का खुलासा और एकत्रीकरण के तंत्र का अध्ययन करने में अपने आवेदन के अलावा, वर्तमान परख है कि ताऊ की रोगजनन के साथ हस्तक्षेप कर सकता दवाओं स्क्रीनिंग के लिए एक मजबूत उपकरण है ।

Introduction

अल्जाइमर रोग एक विनाशकारी neurodegenerative विकार है कि एकीकृत Amyloid बीटा1 और intracellular neurofibrillary पेचीदा युक्त extracellular बूढ़ा सजीले टुकड़े के संचय द्वारा परिभाषित histopathologically है है hyperphosphorylated तौ प्रोटीन2. शारीरिक ताऊ monomeric है और 0-2 एन टर्मिनल आवेषण और 3 या 4 microtubule बाध्यकारी डोमेन3,वैकल्पिक ब्याह से उत्पंन होने वाले4 और 2-3 phosphorylations के एक औसत युक्त छह अद्वितीय isoforms के रूप में प्रस्तुत किया । यह माना जाता है कि hyperphosphorylation, खुलासा और fibrillary संरचनाओं में स्वयं एकत्रीकरण ताऊ रोगजनन में प्रमुख तत्वों का गठन, के रूप में रोग पागल व्यक्तियों में मूल्यांकन5,6

एकत्रित neurofibrillary ताऊ पेचीदा न केवल विज्ञापन के लिए, लेकिन यह भी frontotemporal लोबार अध (FTLD) सहित अंय tauopathies के लिए एक बानगी है, उठाओ रोग, प्रगतिशील supranuclear पक्षाघात (PSP), fronto-लौकिक मनोभ्रंश (FTD) और प्राथमिक आयु संबंधी tauopathy (भाग)2. देखने के एक जैव रासायनिक बिंदु से, ताऊ का खुलासा और एकत्रीकरण के तंत्र को समझना विज्ञापन और अन्य tauopathies के साथ जुड़े रोग प्रक्रियाओं पर प्रकाश डालता सकता है. वैज्ञानिक पहलू के अलावा, इन विट्रो एकत्रीकरण परख में मजबूत दवा उम्मीदवारों7,8,9,10की स्क्रीनिंग के लिए मूल्यवान उपकरण हैं । ऐसा माना जाता है कि ताऊ का एकत्रीकरण एक nucleation आश्रित बहुलकीकरण प्रक्रिया (एनडीपी)11,12,13,14के बाद होता है । एनडीपी कैनेटीक्स sigmoidal है और एक तेजी से ऊर्जावान डाउनहिल एकत्रीकरण प्रक्रिया के बाद एक ऊर्जावान प्रतिकूल nucleation कदम के साथ शुरू होता है ।

prion प्रोटीन, amyloid बीटा और α-synuclein सहित अन्य amyloidogenic प्रोटीन के विपरीत, ताऊ सहज रूप से शारीरिक स्थितियों के तहत समग्र नहीं करता है और यहां तक कि चरम पीएचएस या उच्च तापमान एकत्रीकरण के लिए गैर-अनुकूल है15. यह सबसे शायद ताऊ एकत्रीकरण इंटरफेस में मौजूद hydrophylic इंटरैक्शन के कारण है. हालांकि, हेपरिन16 या अन्य polyanions17,18 जैसे उत्प्रेरण जब शारीरिक सांद्रता में ताऊ समुच्चय कुशलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा रहा है.

पिछले प्रयासों में स्थापित करने के लिए इन विट्रो ताऊ एकत्रीकरण परख ताऊ के विवरण पर कुछ प्रकाश डाला है खुलासा और एकत्रीकरण, लेकिन वे नकल उतार क्या vivo ताऊ एकत्रीकरण कैनेटीक्स में माना जाता है की कमी आई । ज्यादातर मामलों में ताऊ के एकत्रीकरण कैनेटीक्स में ताऊ nucleation के साथ जुड़े शुरुआती लैग फेज की कमी थी । यह बहुत उच्च ताऊ प्रोटीन सांद्रता का उपयोग करने का परिणाम हो सकता है, शुरू ताऊ प्रोटीन की तैयारी और/या अधिक शारीरिक पूर्ण लंबाई ताऊ की तुलना में बहुत अधिक एकत्रीकरण प्रवृत्ति के साथ ताऊ टुकड़े का उपयोग में समुच्चय की उपस्थिति प्रोटीन19,20,21,22,23। इसके अलावा, पिछले अध्ययन ताऊ एकत्रीकरण कैनेटीक्स के reproducibility और मजबूती पहलू को संबोधित नहीं किया ।

यहां, हम में एक मजबूत का वर्णन इन विट्रो ताऊ एकत्रीकरण परख जो एक प्रारंभिक अंतराल के साथ एक nucleation निर्भर बहुलकीकरण के मुख्य विशेषताओं की नकल करता है ताऊ nucleation एक घातीय वृद्धि चरण द्वारा पीछा किया । इसके अलावा, उत्पंन रिकॉमबिनेंट ताऊ समुच्चय प्रकृति में fibrillar है और एक अत्यंत उच्च बोने की शक्ति है । परख भी ताऊ बैचों के बीच अत्यधिक reproducible है और एकत्रीकरण अवरोधकों के लिए स्क्रीन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है ।

Protocol

1. रिएजेंट तैयारी

  1. प्रतिक्रिया बफर
    1. प्रतिक्रिया बफ़र तैयार करें: ०.५ एमएम TCEP में पंजाब, पीएच ६.७ TCEP ड्राई पाउडर भंग करके (मेगावाट = २८६.६५ ग्राम/PBSstock समाधान में, पीएच ७.४ ।
      नोट: TCEP की उपस्थिति जंगली प्रकार ताऊ प्रोटीन जो cysteines शामिल का उपयोग कर एकत्रीकरण अध्ययनों को पाटने के कारण है । वर्तमान प्रोटोकॉल में, TCEP केवल ७.४ से ६.७ के लिए पंजाब के पीएच समायोजित करने के लिए प्रयोग किया जाता है और किसी भी redox प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने में कोई भूमिका निभाता है ।
    2. अच्छी तरह से मिश्रण और एक बाँझ ०.२२ माइक्रोन ताकना आकार पी इ एस झिल्ली फिल्टर के माध्यम से समाधान फिल्टर.
    3. Aliquot और स्टोर पर-८० ˚ सी.
    4. पीठ पर गल और उपयोग करने से पहले आरटी पर स्थिर ।
  2. huTau441
    1. निकालें huTau441 (प्रोटीन अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए Apetri एट अल देखें । २४) पासून-८० ˚ सी फ्रीजर.
    2. बेंच पर गल और कमरे के तापमान (आरटी) के लिए equilibrate ।
    3. 5 मिनट के लिए १२,००० x जी में 20-25 ˚ C पर हवा के बुलबुले को खत्म करने के लिए प्रोटीन शेयर के साथ ट्यूब स्पिन ।
    4. २८० एनएम में huTau441by अवशोषण की एकाग्रता को मापने के एक विलुप्त होने गुणांक का उपयोग ०.३१ एमएल मिलीग्राम-1cm-1
  3. Thioflavin टी
    1. ३५ एमएल प्रतिक्रिया बफर में ५०० माइक्रोन thioflavin टी (थट) शेयर समाधान 10 मिलीग्राम थट ड्राई पाउडर (मेगावाट = 318.86 g/
    2. अधिकतम गति पर 20 सेकंड के लिए अच्छी तरह से, भंवर 3 बार मिश्रण है और एक बाँझ ०.२२ माइक्रोन ताकना आकार पी इ एस झिल्ली फिल्टर के माध्यम से समाधान फिल्टर ।
    3. ४११ एनएम पर अवशोषण माप द्वारा एकाग्रता का निर्धारण २२,००० एम-1 सेमी-1 के एक विलुप्त गुणांक का उपयोग कर और ५०० माइक्रोन के लिए थट एकाग्रता समायोजित करें । RT पर प्रकाश से सुरक्षित स्टोर. हर 2 महीने नए सिरे से तैयार करें ।
  4. हेपरिन
    1. 1 मिलीग्राम HMW हेपरिन ड्राई पाउडर (मेगावाट = 17-19 केडीए) 1 मिलीलीटर प्रतिक्रिया बफर में RT पर भंग करके ताजा ५५ माइक्रोन हेपरिन समाधान तैयार करें ।
    2. 5 सेकंड के लिए जोरदार और भंवर 2 बार हिला ।
    3. एक बाँझ ०.२० माइक्रोन ताकना आकार पी इ एस झिल्ली फिल्टर (सिरिंज) के माध्यम से समाधान फ़िल्टर.

2. एक बहु मोड Microplate रीडर पर सतत मोड थट एकत्रीकरण परख

नोट: थट डाई एक सतत मोड (स्वचालित माप) में huTau441 एकत्रीकरण कैनेटीक्स की निगरानी करने के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए जोड़ा जाता है. हालांकि प्रतिक्रिया एक नियमित रूप से एक पारंपरिक cuvette का उपयोग कर fluorometer द्वारा पीछा किया जा सकता है, आपरेशन के मैनुअल प्रकृति माप की आवृत्ति सीमा और दर्ज काइनेटिक घटता की सटीकता समझौता. इस कारण के लिए, एक स्वत: बहु-मोड microplate रीडर का उपयोग किया जाता है ।

  1. साधन स्थापित
    1. कंप्यूटर और बहु-मोड microplate रीडर चालू करें । 10 मिनट के लिए उपकरणों को स्थिर करते हैं ।
    2. सॉफ्टवेयर शुरू और एक प्रोटोकॉल तैयार करते हैं ।
      1. प्रोटोकॉल प्रकार का चयन करें: मानक प्रोटोकॉल (डेटा में कमी प्रत्येक प्लेट के लिए स्वतंत्र रूप से किया जाता है) ।
      2. ३७ ˚ सी पर तापमान सेट और प्रोटोकॉल जारी रखने से पहले कचौरी का चयन करें.
      3. सेट काइनेटिक रन: रन टाइम ५० h/माप अंतराल: 15 min.
      4. निरंतर मोड में ४२५ सीपीएम (3 मिमी) में परिक्रमा मिलाते हुए सेट करें.
      5. पढ़ने के लिए विधि का चयन करें: प्रतिदीप्ति तीव्रता-समापन बिंदु/काइनेटिक-Monochromators तरंग दैर्ध्य: उत्तेजना ४४० एनएम (20 एनएम बैंडविड्थ)/उत्सर्जन ४८५ एनएम (20 एनएम बैंडविड्थ)-प्रकाशिकी स्थिति: शीर्ष सामांय पढ़ें गति-ऊंचाई पढ़ें: ४.५० mm
      6. निर्मित प्रोटोकॉल का उपयोग कर चलाएँ प्रारंभ करें । प्रयोग नाम, नई बनाई गई फ़ाइल के गंतव्य का चयन करें और साधन की अनुमति पूर्व करने के लिए वांछित तापमान equilibrate ।
  2. सहज huTau441 रूपांतरण
    1. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में प्रतिक्रिया नमूना तैयार करें । प्रति प्रतिक्रिया २०० μL मिश्रण का उपयोग करें और कम से कम 4 प्रतिकृतियां (4 के लिए प्रतिक्रिया मात्रा प्रतिकृति = ८०० μL) ।
    2. ८०० μL प्रतिक्रिया नमूना तैयार करें (4 दोहराने के मामले में) 15 माइक्रोन huTau441, 8 माइक्रोन हेपरिन और ५० माइक्रोन थट. प्रतिक्रिया बफर के साथ प्रोटीन मिश्रण से शुरू, हेपरिन और थट जोड़ने और ऊपर और नीचे 5 बार pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण. reagent इसके अलावा के लिए संकेत दिया आदेश का संमान ।
    3. १२,००० x जी और 25 ˚ सी पर 5 मिनट के लिए एयर बुलबुले को खत्म करने के लिए नमूने स्पिन ।
    4. ९६ में अच्छी तरह से प्रति प्रतिक्रिया नमूना के २०० μL वितरण-अच्छी तरह से microplates (९६-अच्छी तरह से काले ठोस microplate, अच्छी तरह से मात्रा ३६० μL, फ्लैट नीचे) । हवाई बुलबुले के गठन से बचें ।
    5. वाष्पीकरण से बचने के लिए मुहर microplate ।
    6. मल्टी मोड microplate रीडर में microplate प्लेस और माप शुरू करते हैं ।
    7. प्रयोग पूरा होने के बाद, उपकरण से थाली निकालें और डेटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर के लिए डेटा निर्यात करें ।
  3. रूपांतरण, बीज संग्रह और भंडारण की गुणवत्ता की जांच ।
    1. थाली और पूल से मुहर निकालें अलग १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में प्रतिकृतियां । अच्छी तरह से pipetting ऊपर और नीचे 2 बार इसे इकट्ठा करने से पहले कुओं में एकत्रित नमूना मिश्रण । समुच्चय अच्छी तरह से नीचे जमा करने के लिए करते हैं ।
    2. pipetting द्वारा १.५ मिलीलीटर ट्यूब में अच्छी तरह से मिश्रण और नीचे 5 बार और AFM द्वारा समुच्चय का विश्लेषण करने के लिए एक अभ्रक की सतह पर 10-20 μL वितरण (अधिक जानकारी के लिए Apetri एट अल देखें । 24).
    3. 1 घंटे के लिए २०,००० x g और 4 ˚ C पर १.५ मिलीलीटर ट्यूब कताई द्वारा समुच्चय फसल । समुच्चय एक गोली के रूप में ।
    4. एस-मलों द्वारा supernatant को पृथक और विश्लेषित करना (नमूने में monomeric तौ के अभाव की पुष्टि करने के लिए समुच्चय में एक सफल रूपांतरण का संकेत है (अधिक जानकारी के लिए Apetri एट अल देखें । 24).
    5. १.५ एमएल ट्यूब शेष समुच्चय युक्त लेबल (गोली) प्रारंभिक huTau441 प्रोटीन एकाग्रता और नमूना मात्रा का संकेत है । स्नैप-८० ˚ C पर समुच्चय और संग्रह फ़्रीज़ करें ।
  4. अस्तव्यस्त प्रतिक्रिया
    1. से huTau441 समुच्चय निकालें-८० ˚ सी फ्रीजर । लेबल (प्रारंभिक नमूना मात्रा) पर संकेत दिया प्रतिक्रिया बफर की मात्रा जोड़ें और ट्यूब आरटी को स्थिर करने के लिए ऊपर और नीचे 5 से 8 बार pipetting द्वारा एग्रीगेट resuspend ।
    2. एकत्रित नमूना Sonicate । एक २०० μL नमूना के लिए (15 माइक्रोन huTau441), बर्फ पर sonicate एक 1/8 का उपयोग कर "microtip (१०० μL से 10 मिलीलीटर तक) की कुल अवधि के लिए 15 एस की दालों का उपयोग 1 s और pauses 2 s के 30% आयाम (sonicator २५० वाट). Re-equilibrate sample to RT.
      नोट: कार्यरत sonication शर्तों 20-50 एनएम24की लंबाई के साथ ताऊ तंतुओं की एक सजातीय आबादी के लिए सीसा ।
    3. १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में प्रतिक्रिया नमूना तैयार करें । प्रति प्रतिक्रिया २०० μL मिश्रण का उपयोग करें और कम से कम 4 प्रतिकृतियां (4 के लिए प्रतिक्रिया मात्रा प्रतिकृति = ८०० μL) ।
    4. 15 माइक्रोन huTau441, 8 माइक्रोन हेपरिन और ५० माइक्रोन थट से युक्त ८०० μL प्रतिक्रिया नमूना तैयार करें. प्रतिक्रिया बफर के साथ प्रोटीन मिश्रण द्वारा शुरू, हेपरिन और थट जोड़ सकते हैं और pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण 5 बार. reagent इसके अलावा के लिए संकेत दिया आदेश का संमान ।
    5. १२,००० x जी और 25 ˚ सी पर 5 मिनट के लिए एयर बुलबुले को खत्म करने के लिए नमूने स्पिन ।
    6. ९६ में अच्छी तरह से प्रति प्रतिक्रिया नमूना के २०० μL वितरण-अच्छी तरह से (९६-अच्छी तरह से काले ठोस microplate, अच्छी तरह से मात्रा ३६० μL, फ्लैट नीचे) । हवाई बुलबुले के गठन से बचें ।
    7. Homogenize अच्छी तरह से फाइब्रिल नमूना दोहराव से ऊपर और नीचे pipetting (5 बार) और बीज की वांछित प्रतिशत करने के लिए इसी राशि को जोड़ने के लिए अच्छी तरह से । के लिए एक २०० μL अच्छी तरह से कुल मात्रा, 2 μL के अनुरूप बीज के अलावा एक 1% (v/ अच्छी तरह से जोड़ने और हवा के बुलबुले के गठन से बचने जब 3 बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिक्स ।
    8. वाष्पीकरण से बचने के लिए मुहर microplate ।
    9. मल्टी मोड microplate रीडर में microplate प्लेस और माप शुरू करते हैं ।
    10. उपकरण से प्लेट निकालें और एक स्प्रेडशीट के लिए डेटा निर्यात ।

Representative Results

रिकॉमबिनेंट huTau441 C291A और C322A उत्परिवर्तनों और एन टर्मिनल युक्त उनके और सी-टर्मिनल सी-टैग व्यक्त किया गया था और के रूप में पहले24वर्णित शुद्ध । huTau441 बैचों अत्यधिक एसडीएस पृष्ठ पर visualized के रूप में शुद्ध कर रहे है और लगभग १००% monomeric द्वारा मूल्यांकन के रूप में एस-मलों (चित्रा 1) । 15 µ m huTau441 के एकत्रीकरण को 8 µ m HMW हेपरिन के जोड़ से प्रेरित किया गया था और थट प्रतिदीप्ति रीडर का प्रयोग करते हुए रिएक्शन का लगातार पालन किया गया था । उत्तेजना तरंग दैर्ध्य ४४० एनएम (बैंडविड्थ 20 एनएम) था, जबकि उत्सर्जन ४८५ एनएम (बैंडविड्थ 20 एनएम) पर मापा गया था । परख अत्यधिक reproducible है, से परिणाम के साथ 10 व्यक्तिगत कुओं वस्तुतः जा रहा है (चित्रा 2a) । AFM द्वारा ५० ज के बाद थट धनात्मक huTau441 समुच्चय के morphologies का मूल्यांकन किया गया. एकत्रित hutau441 अलग लंबाई के fibrillar संरचनाओं का एक सजातीय मिश्रण है इसी तरह की सूचना दी पूर्व vivo morphologies (चित्रा ए बी) । इसके अलावा, अंतिम प्रतिक्रिया मिश्रण मोनोमर शामिल नहीं है, समुच्चय में एक पूर्ण रूपांतरण का सुझाव के रूप में एस-मलों माप (चित्रा 2c) द्वारा दिखाया गया है । स्वतंत्र प्रायोगिक रन में huTau441 एकत्रीकरण की कैनेटीक्स बहुत समान हैं जैसे sigmoidal घटता और विभेदपूर्ण अंतराल और विकास चरणों (चित्रा ३) से बल मिलता है. प्रोटीन के विभिंन बैचों (चित्रा 4) का उपयोग किया जाता है जब reproducibility के उच्च स्तर बनाए रखा है । इसके अलावा, पहिले huTau441 समुच्चय ताऊ मोनोमर और डी नोवो ताऊ समुच्चय के गठन उत्प्रेरण भर्ती में बहुत कुशल हैं । राशि के रूप में कम के रूप में ०.००२५% (v/v) के पहिले ताऊ समुच्चय nucleation बाईपास और डी नोवो तंतुओं (चित्रा 5) के उत्पादन को ट्रिगर करने में सक्षम हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: रिकॉमबिनेंट huTau441 monomeric और अत्यधिक शुद्ध है । a) denaturing शर्तों के तहत शुद्धता मूल्यांकन 4-12% एसडीएस-पृष्ठ जेल सहित आणविक भार मानक प्रोटीन सीढ़ी (केडीए में) (लेन 1); अंतिम सी टैग संबध शुद्धिकरण चरण (लेन 2) से प्रवाहित करना; कॉलम वॉश अंश (लेन 3), eluted huTau441 प्रोटीन पीक, पहले (लेन 4) और बफर एक्सचेंज (लेन 5) के बाद, क्रमशः) । ख) एस-मलों का विश्लेषण huTau441. प्रोटीन से पता चलता है > ९९.९% monomeric ५१ केडीए के एक दाढ़ मास के साथ और समुच्चय या टुकड़े शामिल नहीं है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: रिकॉमबिनेंट huTau441 का एकत्रीकरण अत्यधिक reproducible है और fibrillar संरचनाओं के लिए मात्रात्मक होता है । क) हेपरिन प्रेरित huTau441 एकत्रीकरण के कैनेटीक्स लगातार ९६ अच्छी तरह से microplate प्रारूप में थट प्रतिदीप्ति द्वारा निगरानी की । huTau441 और हेपरिन की सांद्रता क्रमशः 15 µ m और 8 µ m होती है । 10 व्यक्ति curves एक ही microplate के दस कुओं में एक ही प्रोटीन बैच के रूपांतरण के अनुरूप है और एक औसत के द्वारा विशेषता है (एसडी के साथ) १४.२ ± ०.३८ एच और १८.८ ± ०.४० एच के टी५० के अंतराल चरण । काइनेटिक डेटा एक 5-पैरामीटर logisti के साथ फिट था ऊपरी asymptote में एक रैखिक गिरावट के साथ सी वक्र । लैग चरण और t५० द्वारा अनुमानित मानों के बीच प्रक्षेपित रैखिक प्रतीपगमन द्वारा परिकलित किए गए थे । अंतराल चरण थट प्रतिदीप्ति संकेत की 3% वृद्धि के आधार पर गणना की है । वक्र फिटिंग और सारांश आंकड़े आईबीएम SPSS सांख्यिकी संस्करण 20.0.0.2 का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं । ख). ताऊ समुच्चय ५० ज पर AFM इमेजिंग द्वारा संकेत के रूप में PHF-तरह morphologies दिखा; ग). एस-मलों के विश्लेषण का monomeric huTau441 (टी = ० एच) और रिएक्शन के पूरा होने पर रिएक्शन मिक्सचर का supernatant (टी = ५० ज). ५० ज समय बिंदु पर प्रतिक्रिया मिश्रण २०,००० X g और 4 ˚ सी पर 1 के लिए केंद्रापसारक था और परिणामी supernatant S-मलों पर इंजेक्शन । मोनोमर चोटी के गायब होने से ताऊ का पूरा एकत्रीकरण होने की पुष्टि होती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: ताऊ एकत्रीकरण परख स्वतंत्र प्रयोगात्मक रन के बीच उच्च reproducibility दिखाता है । दो पैनलों huTau441 प्रोटीन का एक ही बैच का उपयोग कर दो स्वतंत्र प्रयोगों में एकत्र सहज huTau441 समुच्चय के लिए चार व्यक्तिगत कैनेटीक्स निशान प्रदर्शित करते हैं । huTau441 और हेपरिन की सांद्रता क्रमशः 15 µ m और 8 µ m होती है । कैनेटीक्स एक औसत (एसडी के साथ) के अंतराल चरण की विशेषता है १२.२ ± ०.१८ एच और १७.८ ± ०.८ एच के टी५० (1 रन) और ११.६ ± 0, 52 एच और टी५० के १७.८ ± ०.२३ एच (2 भागो), क्रमशः । काइनेटिक डेटा ऊपरी asymptote में एक रैखिक गिरावट के साथ एक 5-पैरामीटर रसद वक्र के साथ फिट था । T५० द्वारा अनुमानित मानों के बीच प्रक्षेपित रैखिक प्रतीपगमन द्वारा परिकलित किए गए थे । अंतराल चरण थट प्रतिदीप्ति संकेत की 3% वृद्धि के आधार पर गणना की है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: ताऊ एकत्रीकरण परख huTau441 प्रोटीन के विभिंन बैचों के बीच उच्च reproducibility दिखाता है । प्रत्येक पैनल चार एक विशिष्ट huTau441 बैच के लिए संगत प्रतिकृति दिखाता है । प्रत्येक बैच का एकत्रीकरण स्वतंत्र प्रयोगों के बाद किया गया. huTau441 और हेपरिन की सांद्रता क्रमशः 15 µ m और 8 µ m होती है । एकत्रीकरण कैनेटीक्स चार व्यक्ति ताऊ बैचों के लिए इसी एक औसत (एसडी के साथ) की विशेषता है १५.३ ± ०.३८ एच और २१.१ ± ०.४६ एच (बैच 1) के टी५० के अंतराल चरण; १२.५ ± ०.०७ एच और १९.८ ± ०.३४ एच (बैच 2) के टी५० के अंतराल चरण; १५.१ ± ०.३४ एच और टी५० के अंतराल चरण २१.९ ± ०.८६ एच के (बैच 3) और ११.५ ± ०.२९ एच के और टी५० के अंतराल के चरण १७.८ ± ०.२९ एच (4 बैच), क्रमशः । काइनेटिक डेटा ऊपरी asymptote में एक रैखिक गिरावट के साथ एक 5-पैरामीटर रसद वक्र के साथ फिट था । लैग चरण और t५० द्वारा अनुमानित मानों के बीच प्रक्षेपित रैखिक प्रतीपगमन द्वारा परिकलित किए गए थे । अंतराल चरण थट प्रतिदीप्ति संकेत की 3% वृद्धि के आधार पर गणना की है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: पहिले hutau441 समुच्चय उच्च सीडिंग गतिविधि है । सीडिंग आरंभ करने के लिए sonicated तौ समुच्चय को मोनोमर hutau441 से जोड़ा गया. लाल से नीला, अलग काइनेटिक curves के प्रत्येक रंग जोड़ा बीज की अलग राशि का प्रतिनिधित्व करता है: १.२५%, ०.६३%, ०.३१%, ०.१६%, ०.०८%, ०.०४%, ०.०२%, ०.०१%, ०.००५% और ०.००२५% (वी/वी), क्रमशः । hutau441 के सहज रूपांतरण काले रंग में प्रतिनिधित्व किया है । quadruplicate में सभी शर्तों का परीक्षण किया गया । चार काइनेटिक प्रतिकृति बीज की एक निश्चित एकाग्रता के साथ जुड़े अत्यधिक reproducible और ज्यादातर मामलों में अलग हैं । hutau441 और हेपरिन की सांद्रता क्रमशः 15 µ m और 8 µ m होती है । पूर्व का गठन sonicated fibrillar संरचनाओं की छोटी मात्रा के अतिरिक्त प्रारंभिक अंतराल चरण सहज रूपांतरण में मनाया और प्रभाव बीज की मात्रा के साथ आनुपातिक है समाप्त । लाल से नीला, टी५० में अंतर मनाया (टी५० spont. कनव-टी५० सीडिंग) १८.९, १८.४०, १७.८, १७.३, १६.६, १६.१, १५.४, १४.७, १४.२ और १३.७ घंटे, क्रमशः है । hutau441 के सहज रूपांतरण एक औसत टी५० की विशेषता है (एसडी के साथ) १९.८५ ± ०.५४ h. काइनेटिक डेटा ऊपरी asymptote में एक रैखिक गिरावट के साथ एक 5-पैरामीटर रसद वक्र के साथ फिट था । t५० द्वारा अनुमानित मानों के बीच प्रक्षेपित रैखिक प्रतीपगमन द्वारा परिकलित किए गए थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

कई प्रयासों के बावजूद, ताऊ एकत्रीकरण कैनेटीक्स रिपोर्ट करने के लिए साहित्य में reproducibility के वांछित स्तर की कमी और/या एक nucleation आश्रित की सुविधाओं में से कुछ बहुलकीकरण19,20,21 , 22 , 23 , 25. इस पर अक्सर एक लैग फेज की कमी, ताऊ समुच्चय के अकुशल सीडिंग और नॉन-fibrillar नेचर पर जोर दिया जाता है । इन कमियों के कारण भिंन हो सकते है और उप इष्टतम ताऊ प्रोटीन गुणवत्ता (विखंडन, समुच्चय की उपस्थिति, कम शुद्धता, आदि), प्रोटीन और उत्प्रेरण रिएजेंट और या प्रयोगात्मक शर्तों के विकल्प शामिल हैं । एक अन्य जटिल कारक दो cysteine अवशेषों ताऊ एकत्रीकरण अंतरफलक है कि इंट्रा या अंतर आणविक डाइसल्फ़ाइड पुलों के redox वातावरण पर निर्भर करता है और ताऊ एकत्रीकरण की दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं के आसपास स्थित हैं । ऐसे डीटीटी या TCEP के रूप में रिएजेंट को कम करने के दृष्टिकोण में कम रूपों में cysteine अवशेषों को बनाए रखने और इस प्रकार reproducibility25के स्तर में वृद्धि करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इसके अलावा, ताऊ के विलुप्त गुणांक बहुत कम है जो प्रोटीन एकाग्रता की सटीक माप में कठिनाइयों की ओर जाता है ।

हम विशेष रूप से कुछ मापदंडों और गुणवत्ता विशेषताओं पर ध्यान केंद्रित किया है कि हम ताऊ प्रोटीन के लिए एक मजबूत, reproducible और प्रतिनिधि एकत्रीकरण प्रोफ़ाइल के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है: अंतर और अंतर आणविक डाइसल्फ़ाइड गठन की संभावना को नष्ट करने, एक अत्यधिक शुद्ध ताऊ मोनोमर पैदा करने और एकाग्रता दृढ़ संकल्प की सटीकता में सुधार । इन सभी एजेंट संबंधित सवाल संभावित ध्यान कहते है कि हम इष्टतम परख विकास के लिए महत्वपूर्ण माना जाता है । इन मुद्दों को संबोधित करने के लिए, पूर्ण लंबाई huTau441 दो उत्परिवर्तनों, C291A और C322A के साथ व्यक्त किया गया था, और एन के साथ-और सी-टर्मिनल टैग । cysteine अवशेषों के उत्परिवर्तन से ताऊ प्रोटीन पर कम प्रभाव पड़ता है, जबकि डाइसल्फ़ाइड ब्रिजिंग को नियंत्रित करने के लिए अन्यथा बहुत मुश्किल को दूर करते हैं । अपेक्षाकृत कम N और सी के साथ प्रोटीन एक्सप्रेस-टर्मिनल टैग हमें एक दो कदम समानता शुद्धि प्रोटोकॉल जो बहुत उच्च शुद्धता, अखंडता और मोनोमर सामग्री के लिए नेतृत्व को आगे बढ़ाने की अनुमति दी । इसके अलावा, हम एक F8W उत्परिवर्तन कि प्रोटीन के विलुप्त होने गुणांक वृद्धि की शुरुआत की और अधिक सटीक एकाग्रता24माप की अनुमति दी ।

उच्च गुणवत्ता वाले प्रोटीन रिएजेंट का उपयोग करने के अलावा, अंय परख मानकों को भी अनुकूलित किया गया । इष्टतम ताऊ: हेपरिन अनुपात के आसपास ०.५ (एम/एम) जो पहले से प्रकाशित अध्ययन26के साथ कतार में है की पहचान की थी । इसके अलावा, यांत्रिक और ऑप्टिकल वाद्य सेटिंग्स reproducibility सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं और इष्टतम मापदंडों निर्माता के आधार पर कुछ हद तक अलग हो सकता है ।

इस परख में वर्णित ताऊ का एकत्रीकरण उन विशेषताओं से पता चलता है जो कि AD और related tauopathies में ताऊ रोगजनन से जुड़े हैं । प्रक्रिया एक प्रारंभिक अंतराल उच्च ऊर्जा नाभिक के गठन के लिए इसी चरण के साथ शुरू होता है और एक तेजी से विकास चरण है कि फाइब्रिल विकास से मेल खाती है के बाद है । अंतराल समय पर्याप्त बीज सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला को कवर बोने की प्रक्रिया के विस्तार में अध्ययन करने के लिए एक व्यापक विंडो खोलने के लिए लंबा है (चित्रा 5), जबकि अभी भी बहुत लंबा नहीं है तो प्रोटीन क्षरण और/या गैर विशिष्ट एकत्रीकरण बचा रहे है (चित्रा 2). इन माध्यमिक घटनाओं विशेष रूप से हो सकता है जब एक आंतरिक रूप से huTau441 जैसे प्रोटीन शारीरिक स्थितियों के लिए समय की लंबी अवधि के लिए उजागर होता है । प्राप्त ताऊ समुच्चय विज्ञापन रोगियों के दिमाग से अलग PHFs की आकृति विज्ञान प्रदर्शित और monomeric ताऊ की भर्ती में बहुत कुशल है और यह डी नोवो उत्पंन समुच्चय को बदलने, एक प्रक्रिया बोने के रूप में भेजा । परख अत्यधिक reproducible, काइनेटिक घटता कुओं, प्रयोगात्मक रन और प्रोटीन बैचों के बीच लगभग भेद किया जा रहा है । हालांकि वर्तमान परख केवल सबसे लंबे समय तक ताऊ isoform, huTau441 पर केंद्रित है, आवेदन के लिए ताऊ के अंय रूपों के रूपांतरण का अध्ययन अनुकूलित किया जा सकता है (Ameijde एट अल., Acta Neuropathologica संचार, प्रेस में) इसके अलावा, यह सक्षम बनाता है यंत्रवत अध्ययन ताऊ isoforms के नाटक पर ध्यान केंद्रित किया और संभवत: विज्ञापन में ताऊ रोगजनन के बीच मतभेद पर प्रकाश डाला जहां दोनों 3R और 4R isoforms PHFs और विध की बीमारी या Frontotemporal डिमेंशिया में मौजूद हैं जहां ताऊ पैथोलॉजी में मुख्यत 3R व 4R तौ isoforms, क्रमशः२७.

बहुत उच्च परख के reproducibility पाठकों को यह उनके विशिष्ट प्रयोगशाला सेटिंग्स में रिश्तेदार आसानी से लागू करने की अनुमति चाहिए । परख की नकल करता है क्या माना जा रहा है vivo में खुलासा और ताऊ के एकत्रीकरण, यंत्रवत अध्ययन है कि ताऊ रोगजनन पर प्रकाश डाला जाएगा सक्षम करने और यह दवा उंमीदवारों स्क्रीनिंग के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का गठन और उनके हस्तक्षेप का मूल्यांकन रोगजनन प्रक्रिया के विभिंन चरणों के साथ ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक के लिए उत्कृष्ट तकनीकी सहायता और डेटा विश्लेषण के लिए मार्टिन Winsen के लिए huTau441, हैना Inganäs और मार्गोट वान Koldijk की अभिव्यक्ति और शुद्धि के लिए हेक्टर Quirante शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thioflavin T Sigma-Aldrich T3516-5G dry powder (Mw = 318.86 g/mol)
Heparin  Sigma-Aldrich H3393-50KU dry powder (Mw = 17-19 kDa)
TCEP Sigma-Aldrich 75259-1G dry powder (MW= 286.65 g/mol)
PBS Gibco-Life Technologies 10010-015 Sterile, pH 7.4 (1X)
0.22 μm sterile filter Corning 431160 PES membrane 
0.20 μm sterile serynge filter Corning 431229 PES membrane 
96-well microplates Thermo Scientific 9502867 Black, flat botton
Microplate sealers  R&D Systems DY992 Adhesive strips 
Synergy Neo2 Multi-Mode Microplate Reader  Biotek Synergy Neo2 Hybrid Technology, Gen5 Software
Eppendorf Tubes Eppendorf  0030 120.086 1,5 ml tubes
Ultrasonics-Branson SFX250 Branson 101-063-966R 1/2" Solid Horn and 1/8" microtip 

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References

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