फेफड़े microRNA ओजोन-उजागर चूहों में मद चक्र भर में profiling

Immunology and Infection

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Summary

यहां हम एक विधि का वर्णन करने के लिए miRNAs की फेफड़ों की अभिव्यक्ति का आकलन है कि भड़काऊ जीन को विनियमित चूहों ओजोन या मद चक्र के विभिंन चरणों में फ़िल्टर की गई हवा का उपयोग करने की भविष्यवाणी कर रहे हैं ।

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Fuentes, N., Silveyra, P. Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice. J. Vis. Exp. (143), e58664, doi:10.3791/58664 (2019).

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Abstract

MicroRNA (miRNA) की रूपरेखा जीव विज्ञान और चिकित्सा के विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों में काम कर रहे शोधकर्ताओं के लिए ब्याज की बन गई है. वर्तमान अध्ययन निदान और फेफड़ों के रोगों की देखभाल में miRNAs का उपयोग कर के एक होनहार भविष्य दिखाते हैं । यहां, हम एक ओजोन प्रेरित airway सूजन माउस मॉडल से फेफड़ों के ऊतकों में भड़काऊ जीन को विनियमित करने की भविष्यवाणी की miRNAs के एक समूह के रिश्तेदार बहुतायत को मापने के लिए miRNA रूपरेखा के लिए एक प्रोटोकॉल को परिभाषित । क्योंकि यह दिखाया गया है कि परिसंचारी सेक्स हार्मोन का स्तर महिलाओं में फेफड़े के जन्मजात प्रतिरक्षा के विनियमन को प्रभावित कर सकते हैं, इस विधि का उद्देश्य मादा चूहों में एक भड़काऊ miRNA profiling प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए है, ध्यान में मद चक्र लेने ओजोन एक्सपोजर के समय प्रत्येक जानवर की स्टेज । हम भी limma, एक आर/कंडक्टर सॉफ्टवेयर, और कार्यात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए miRNA खोज और लक्ष्य पहचान तरीकों को लागू bioinformatics दृष्टिकोण को संबोधित जैविक संदर्भ और साथ जुड़े रास्ते को समझने के लिए विभेद miRNA अभिव्यक्ति ।

Introduction

microRNAs (miRNAs) कम कर रहे है (19 से 25 न्यूक्लियोटाइड), स्वाभाविक रूप से होने वाली, गैर-आरएनए अणु कोडन । miRNAs के अनुक्रम प्रजातियों के पार संरक्षित विकासवादी हैं, शारीरिक कार्यों को विनियमित करने में miRNAs के महत्व का सुझाव1। microRNA अभिव्यक्ति रूपरेखा miRNAs की पहचान करने के लिए उपयोगी साबित किया गया है कि प्रक्रियाओं की एक किस्म के विनियमन में महत्वपूर्ण हैं, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया सहित, कोशिका विभेद, विकासात्मक प्रक्रियाओं, और apoptosis2. हाल ही में, miRNAs रोग निदान और चिकित्सकीय में उनके संभावित उपयोग के लिए मांयता प्राप्त किया गया है । जीन विनियमन के तंत्र का अध्ययन शोधकर्ताओं के लिए, miRNA अभिव्यक्ति मापने प्रणालियों विनियामक प्रक्रियाओं के स्तर के मॉडल, विशेष रूप से जब miRNA जानकारी mRNA profiling और अंय जीनोम के साथ विलय कर सकते है स्केल डेटा3। दूसरी ओर, miRNAs भी नमूना प्रकार की एक श्रेणी में mRNAs से अधिक स्थिर होना दिखाया गया है और भी प्रोटीन की तुलना में अधिक से अधिक संवेदनशीलता के साथ मध्यम श्रेणी के4। यह फेफड़ों के रोगों सहित विविध आणविक नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए miRNAs के विकास में काफी रुचि के लिए नेतृत्व किया गया है ।

फेफड़ों में, miRNAs विकास प्रक्रियाओं और homeostasis के रखरखाव में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । इसके अलावा, उनकी असामांय अभिव्यक्ति के विकास और विभिंन फुफ्फुसीय रोगों के प्रगति के साथ जुड़ा हुआ है5। वायु प्रदूषण से प्रेरित भड़काऊ फेफड़ों की बीमारी महिलाओं में अधिक से अधिक गंभीरता और गरीब रोग का निदान का प्रदर्शन किया है, यह दर्शाता है कि हार्मोन और मद चक्र पर्यावरणीय चुनौतियों के जवाब में फेफड़ों जंमजात उन्मुक्ति और miRNA अभिव्यक्ति को विनियमित कर सकते हैं 6. इस प्रोटोकॉल में, हम ओजोन जोखिम, जो वायु प्रदूषण का एक प्रमुख घटक है का उपयोग करें, मादा चूहों में फेफड़ों की सूजन का एक रूप प्रेरित है कि अनुकूली उन्मुक्ति के अभाव में होता है । ओजोन का उपयोग करके, हम airway उपकला कोशिका क्षति और समीपस्थ एयरवेज7में न्यूट्रोफिल और भड़काऊ मध्यस्थों में वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है कि airway hyperresponsiveness के विकास उत्प्रेरण कर रहे हैं. वर्तमान में, वहां अच्छी तरह से नहीं कर रहे है प्रोटोकॉल का वर्णन करने और ओजोन उजागर चूहों में मद चक्र भर में miRNAs विश्लेषण ।

नीचे, हम एक सरल करने के लिए मद चक्र चरणों और मादा ओजोन के संपर्क में चूहों के फेफड़े के ऊतकों में miRNA अभिव्यक्ति की पहचान विधि का वर्णन । हम भी गणना जीव विज्ञान पर जोर देने के साथ miRNA खोज और लक्ष्य पहचान के लिए प्रभावी bioinformatics दृष्टिकोण का पता । हम limma, एक आर/कंडक्टर सॉफ्टवेयर है कि जीन अभिव्यक्ति प्रयोगों8से डेटा का विश्लेषण करने के लिए एक एकीकृत समाधान प्रदान करता है का उपयोग कर microarray डेटा का विश्लेषण । limma से पीसीआर ऐरे डेटा का विश्लेषण शक्ति के मामले में टी परीक्षण आधारित प्रक्रियाओं में एक फायदा है जब arrays की छोटी संख्या का उपयोग कर अभिव्यक्ति की तुलना/ miRNA अभिव्यक्ति परिणामों के जैविक संदर्भ को समझने के लिए, हम तो कार्यात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल किया । आदेश में transcriptional परिवर्तन विनियमन तंत्र को समझने के लिए और संभावना परिणाम की भविष्यवाणी करने के लिए, सॉफ्टवेयर miRNA-अभिव्यक्ति डेटासेट और साहित्य9से ज्ञान को जोड़ती है । यह एक फायदा है जब सॉफ्टवेयर के साथ तुलना में है कि बस miRNAs के सेट के लिए अतिव्यापी में सांख्यिकीय संवर्धन के लिए देखो ।

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Protocol

यहाँ वर्णित सभी पद्धतियों को पेन स्टेट विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु परिचर्या एवं उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है.

1. मद चक्र चरण का मूल्यांकन

  1. ठीक से एक महिला C57BL/6 माउस (8-9 सप्ताह पुरानी) एक हाथ माउस संयम Machholz एट अल.10में वर्णित तकनीक का उपयोग कर नियंत्रित ।
  2. अति शुद्ध पानी के 10 μL के साथ बाँझ प्लास्टिक पिपेट भरें ।
  3. योनि में प्लास्टिक पिपेट के टिप परिचय ।
  4. धीरे से तरल 4-5 बार फ्लश करने के लिए नमूना इकट्ठा ।
  5. एक गिलास स्लाइड पर अंतिम फ्लश युक्त योनि द्रव प्लेस ।
  6. एक 20x उद्देश्य के साथ एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत दाग योनि फ्लश का निरीक्षण ।
    नोट: pseudopregnancy या अन्य कारणों के कारण नियमित चक्र न दिखाने वाले जानवरों को प्रयोग से बहिष्कृत करने की आवश्यकता होती है. यह cyclicity पुष्टि करने के लिए कम से लगातार तीन चक्रों के लिए दैनिक योनि स्राव प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है ।

2. ओजोन को एक्सपोजर

  1. तार जाल ढक्कन के साथ दो १.२ एल ग्लास कंटेनरों में 4 चूहों की एक अधिकतम प्लेस, और पानी विज्ञापन libitum ।
  2. ओजोन चैंबर में एक ग्लास कंटेनर और फ़िल्टर्ड एयर एक्सपोजर चैंबर में दूसरे रखो ।
  3. 2 पीपीएम करने के लिए ओजोन एकाग्रता को समायोजित करने और ओजोन के स्तर को नियमित रूप से निगरानी ।
    नोट: ओजोन तंत्र नियंत्रित तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) और सापेक्ष आर्द्रता (५०%) के साथ एक विनियमित airflow (> 30 हवा में परिवर्तन/ प्रणाली एक विद्युत निर्वहन ozonizer, जो नजर रखी है और एक पराबैंगनी ओजोन विश्लेषक और जन प्रवाह नियंत्रकों द्वारा नियंत्रित, के रूप में पहले11वर्णित द्वारा ओजोन उत्पंन करता है ।
  4. निकालें ग्लास कंटेनरों के बाद 3 ओजोन के एच/ बिस्तर, भोजन, और पानी विज्ञापन libitum के साथ पिंजरे में जानवरों को लौटें ।

3. फेफड़ों का संग्रह

  1. जोखिम के बाद 4 एच, एक ketamine/xylazine कॉकटेल के एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ anesthetize जानवरों (९० मिलीग्राम/किलोग्राम ketamine, 10 मिलीग्राम/xylazine) ।
    नोट: संज्ञाहरण के एक उचित स्तर की पुष्टि करने के लिए, एक पेडल पलटा (फर्म पैर की अंगुली चुटकी) के लिए माउस की जांच करें और आवश्यकतानुसार संवेदनाहारी समायोजित करें ।
  2. ७०% इथेनॉल के साथ माउस त्वचा गीला करना ।
  3. वेना कावा को बेनकाब करने के लिए एक ऑपरेटिंग कैंची और शल्य चिमटी का उपयोग कर एक 2 सेमी midline चीरा बनाओ ।
  4. वेना कावा और महाधमनी के transection द्वारा चूहों का बलिदान । यदि आवश्यक हो, exsanguination करने से पहले रक्त इकट्ठा करने के लिए गुर्दे की नसों के ऊपर वेना कावा में एक 21 जी गेज सुई डालें । वैकल्पिक रूप से, मानक प्रोटोकॉल निंनलिखित दिल पंचर के माध्यम से रक्त इकट्ठा ।
  5. एक शल्य कैंची का प्रयोग करने के लिए खुले उदर गुहा कटौती और त्वचा को हटाने/पसलियों की ओर ऊपर की तरफ बढ़ रहा है ।
  6. डायाफ्राम पंचर करने के लिए एक शल्य कैंची का प्रयोग करें ।
    नोट: फेफड़ों डायाफ्राम से दूर गिर जाएगा ।
  7. दूर ribcage एक शल्य कैंची का उपयोग करने के लिए दिल और फेफड़ों का पर्दाफाश काटा ।
  8. संदंश का उपयोग कर, एक १.५ मिलीलीटर RNase मुक्त microcentrifuge ट्यूब ले लो और यह तरल नाइट्रोजन में डूब ट्यूब भरने के लिए ।
    नोट: तरल नाइट्रोजन को संभालने के लिए चश्मे और सुरक्षात्मक दस्ताने का प्रयोग करें ।
  9. फेफड़ों निकालें, उंहें RNase में जगह-मुक्त microcentrifuge १.५ मिलीलीटर तरल नाइट्रोजन से भरा ट्यूबों स्नैप-फ्रीज करने के लिए ऊतक, और कुछ सेकंड प्रतीक्षा जब तक तरल वाष्प बन जाता है ।
  10. ट्यूब ढक्कन बंद करें और उपयोग करने तक-८० डिग्री सेल्सियस पर ऊतक की दुकान ।

4. आरएनए तैयारी

  1. एक स्टेनलेस स्टील ऊतक चूर्णन का उपयोग कर पूरे फेफड़ों को चूर ।
    नोट: ऊतक चूर्णन को तरल नाइट्रोजन में इस्तेमाल करने से पहले रखा जाना चाहिए. RNAse समाधान के साथ प्रत्येक प्रयोग के बाद चूर्ण को साफ करें ।
  2. दो १.५ मिलीलीटर ट्यूबों (आधा फेफड़ों प्रत्येक) में चूर फेफड़ों और जगह विभाजित ।
  3. नमूना ट्यूब और मिश्रण प्रति guanidinium thiocyanate के ५०० µ एल जोड़ें ।  Homogenize प्रत्येक नमूना 18 जी, 21 जी, और 23 जी सुई, क्रमशः का उपयोग कर ।
    नोट: नमूनों को निष्कर्षण के साथ आगे बढ़ने से पहले एक छोटी आरएनए स्पाइक नियंत्रण में (एक अलग प्रजाति से) ५.६ x 108 प्रतियां के साथ नुकीला किया जा सकता है ।
  4. 15 एस के लिए प्रत्येक नमूने और भंवर को इथेनॉल के ५०० µ एल जोड़ें
  5. एक स्पिन कॉलम में एक संग्रह ट्यूब में मिश्रण लोड और 1 मिनट के लिए १२,००० x g पर केंद्रापसारक । प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
  6. DNase के लिए मैं उपचार (में कॉलम);
    1. आरएनए धो बफर के ४०० µ एल जोड़ें और 1 मिनट के लिए १२,००० x g पर केंद्रापसारक ।
    2. एक RNase में मुक्त ट्यूब, DNase मैं और ७५ µ एल के 5 µ एल जोड़ें 1x डीएनए पाचन बफर और मिश्रण । मिश्रण सीधे कॉलम मैट्रिक्स में जोड़ें ।
    3. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
  7. जोड़ें ४०० µ आरएनए के धोने के स्तंभ के लिए समाधान और 1 मिनट के लिए १२,००० x g पर केंद्रापसारक । प्रवाह-थ्रू छोड़ें और इस चरण को दोहराएँ.
  8. जोड़ें ७०० आरएनए के एल µ स्तंभ के लिए बफर और 1 मिनट के लिए १२,००० x g पर केंद्रापसारक । प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
  9. 2 मिनट के लिए १२,००० x जी पर केंद्रापसारक शेष बफर हटाने के लिए । एक RNase-मुक्त ट्यूब में कॉलम स्थानांतरण ।
  10. elute आरएनए के लिए, DNase/RNase-नि: शुल्क पानी के ३५ µ l को सीधे कॉलम मैट्रिक्स में जोड़ें और १.५ मिनट के लिए १२,००० x g पर केंद्रापसारक करें ।
  11. एक spectrophotometer का उपयोग कर कुल आरएनए एकाग्रता (२६० एनएम) और पवित्रता को मापने । एक १.५ µ एल नमूना aliquot में आरएनए ठहराव प्रदर्शन करने के लिए निर्देशों का पालन करें. DNase/RNase-फ्री रेफरेंस के लिए इस्तेमाल होने वाले पानी के साथ साधन खाली ।
    नोट: एक 260/280 अनुपात ~ २.० आम तौर पर आरएनए के लिए "शुद्ध" के रूप में स्वीकार किया जाता है । ठेठ आरएनए एकाग्रता आमतौर पर ७५० और २,५०० एनजी के बीच पर्वतमाला/µ एल
  12. पर स्टोर-८० ° c ।

5. miRNA profile

  1. रेट्रो-टाइप करना छोटे RNAs, २०० कुल आरएनए के एनजी का उपयोग करें ।
    1. बर्फ पर रिवर्स-प्रतिलेखन प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार (प्रति प्रतिक्रिया कुल मात्रा 20 µ एल है) । प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, 5x बफर के 4 µ एल जोड़ें, 10x न्यूक्लियोटाइड मिश्रण के 2 µ एल, रिवर्स transcriptase के 2 µ एल, और µ के 2 RNase एल-मुक्त पानी. ६०० µ l RNAse में सभी अवयव और aliquot मिलाएं-नि: शुल्क प्लास्टिक ट्यूबों (प्रति प्रतिक्रिया मिश्रण की 10 µ एल) ।
      नोट: रिवर्स-प्रतिलेखन मास्टर मिक्स सभी घटकों टेम्पलेट आरएनए को छोड़कर पहले किनारा सीडीएनए संश्लेषण के लिए आवश्यक हैं.
      नोट: मास्टर मिश्रण तैयार करते समय अतिरिक्त मात्रा (10%)
    2. प्रत्येक ट्यूब रिवर्स-प्रतिलेखन मास्टर मिश्रण युक्त करने के लिए टेंपलेट आरएनए (10 µ एल में २०० एनजी) जोड़ें । मिश्रण, १,००० x जीमें 15 एस के लिए केंद्रापसारक, और बर्फ पर उंहें thermocycler या सूखी ब्लॉक में रखने तक की दुकान ।
    3. ३७ डिग्री सेल्सियस पर ६० मिनट के लिए मशीन ।
    4. ९५ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए मशीन और बर्फ पर ट्यूबों जगह है ।
    5. RNase के २०० µ l को जोड़कर सीडीएनए को पतला-मुक्त जल प्रत्येक 20 µ l रिवर्स-प्रतिलेखन प्रतिक्रिया.
  2. माउस भड़काऊ प्रतिक्रिया और प्रतिरक्षा miRNA पीसीआर सरणी का उपयोग कर वास्तविक समय पीसीआर प्रदर्शन ।
    1. एक प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार करें (कुल मात्रा ११०० µ एल): प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, 2x पीसीआर मास्टर मिक्स के ५५० µ एल जोड़ने के लिए, 10x यूनिवर्सल प्राइमर मिश्रण के ११० µ एल, RNase के ३४० µ एल-मुफ्त पानी, और ३४० µ एल के टेंपलेट सीडीएनए (कदम 5.1.5 से पतला प्रतिक्रिया) ।
    2. एक मल्टीचैनल pipettor का उपयोग पूर्व लोड miRNA पीसीआर सरणी के प्रत्येक कुआं के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण के 10 µ एल जोड़ें ।
    3. ऑप्टिकल चिपकने वाली फिल्म के साथ miRNA पीसीआर सरणी प्लेट सील ।
    4. १,००० x पर 1 मिनट के लिए प्लेट केंद्रापसारक कमरे के तापमान पर जी बुलबुले को दूर करने के लिए ।
    5. कार्यक्रम वास्तविक समय साइकिल चालक, ९५ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए पीसीआर प्रारंभिक सक्रियकरण कदम, 3-कदम विकार युक्त 15 एस के लिए ९४ डिग्री सेल्सियस पर, एनीलिंग 30 एस के लिए ५५ ° c पर, और विस्तार के लिए ७० ° c पर ४० चक्र संख्या के लिए 30 एस ।
      नोट: वास्तविक समय साइकिल चालक स्थापित करने के लिए निर्माता की साइकल शर्तों के निर्देशों का पालन करें । पृथक्करण वक्र वास्तविक समय साइकिल चालक सॉफ्टवेयर में निर्मित कदम प्रदर्शन करते हैं ।
    6. डेटा विश्लेषण निष्पादित करें ।

6. डेटा विश्लेषण

  1. एक विश्लेषण सॉफ्टवेयर में प्रत्येक नमूने के लिए वास्तविक समय पीसीआर सॉफ्टवेयर से सीटी मूल्यों निकालें ।
    नोट: ३४ का सीटी वैल्यू कटऑफ के रूप में माना जाता है । यदि नमूनों में स्पाइक नियंत्रण होते है (उदा., cel-मीर-३९), तो प्रत्येक नमूने के लिए नियंत्रण में स्पाइक के लिए सीटी मानों को सामान्य करें । थ्रेशोल्ड मानों को मैन्युअल रूप से सेट करने की आवश्यकता हो सकती है. आधारभूत मान स्वचालित रूप से सेट हैं ।
  2. SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, निम्नलिखित समीकरण का उपयोग: छह miRNA साफसफाई नियंत्रण की औसत सीटी के लिए सीटी मूल्यों को सामान्य करें:
    ΔCt = (Ct_Target − Ct_housekeeping)
  3. गुना परिवर्तन परिकलन के लिए, संबंधित व्यंजक समीकरण12का उपयोग करते हुए, नियंत्रण के रूप में किसी विशिष्ट नमूने का उपयोग करके ΔΔCt मान परिकलित करें:
    miRNA सापेक्षिक अभिव्यक्ति:
    2-∆ ∆ct, where-∆ ∆ ct =-[∆ सीटी टेस्ट-∆ सीटी कंट्रोल]
    नोट: २०० के एक गुना परिवर्तन cutoff के रूप में माना जाता है.
  4. निर्यात फ़ोल्ड परिवर्तन अभिव्यक्ति मान R पर सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए limma पैकेज का उपयोग करते हुए में unकिा8
  5. Benjamini-Hochberg विधि13का उपयोग कर एकाधिक तुलना के लिए सही है ।
    नोट:  R स्क्रिप्ट की एक प्रतिलिपि पर उपलब्ध है: http://psilveyra.github.io/silveyralab/। डेटासेट और विश्लेषित डेटा भी जीन एक्सप्रेशन सर्वग्राही नंबर GSE111667, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667 के तहत उपलब्ध हैं ।

7. डेटा विश्लेषण: कार्यात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर

  1. डेटासेट व्यवस्थित करें । उनके संबंधित व्यंजक लॉग अनुपात और p-मानों के साथ miRNAs शामिल करें । विशिष्ट dataset स्वरूपण के लिए तालिका 1 देखें ।
  2. कार्यात्मक विश्लेषण सॉफ़्टवेयर (संस्करण 01-10) खोलें ।
  3. निम्न स्वरूप का उपयोग कर dataset अपलोड करें: फ़ाइल स्वरूप: "लचीला स्वरूप", स्तंभ शीर्ष लेख हैं: "हाँ", पहचानकर्ता प्रकार का चयन: "miRBase (परिपक्व)", सरणी प्लेटफ़ॉर्म प्रयोगों के लिए उपयोग किया: सरणी प्लेटफ़ॉर्म चुनें ।
    नोट: स्वीकृत फ़ाइलें स्वरूप. txt (टैब सीमांकित पाठ फ़ाइलें),. xls (excel फ़ाइलें), और. रचनाकार (cuffdiff फ़ाइलें) हैं ।
  4. "प्रेक्षणों का अनुमान" चुनें और सत्यापित करें कि प्रायोगिक समूह लेबलिंग सही है ।
  5. मैप किए गए और बिना मैप किए गए miRNAs की कुल राशि को संशोधित करने के लिए "डेटासेट सारांश" पर जाएं ।
  6. कार्यक्रम के शीर्ष छोड़ दिया पर "नया" बटन पर क्लिक करें । "नया MicroRNA लक्ष्य फ़िल्टर" चुनें और एक MicroRNA डेटासेट अपलोड करें.
    1. स्रोत सेट करने के लिए: TarBase, प्रतिभा विशेषज्ञों निष्कर्षों, miRecords ।
    2. विश्वास को सेट करें: प्रयोगात्मक रूप से मनाया या उच्च (अनुमानित) ।
    3. प्रजातियों, रोगों, ऊतकों, रास्ते और अधिक जैसे लक्ष्यों के बारे में जैविक जानकारी की एक किस्म शामिल करने के लिए "कॉलम जोड़ें" का चयन करें ।
    4. प्रयोग में व्यंजक परिवर्तित किए गए लक्ष्यों पर ध्यान केंद्रित करने के लिए, "mRNA dataset बदलें" का चयन करें । समान या भिंन व्यंजक स्तरों के साथ microRNAs ढूंढने के लिए "व्यंजक युग्मन" का उपयोग करें ।
      नोट: फ़िल्टर विश्लेषण microRNA नाम और प्रतीक प्रदान करेगा, mRNA लक्ष्य, स्रोत जो लक्ष्य संबंध का वर्णन करता है, और अनुमानित संबंध का विश्वास स्तर (चित्र 2) ।
  7. फ़िल्टर किए गए डेटासेट को एक मार्ग कैनवास पर भेजने और अधिक जैविक संबंधों का पता लगाने के लिए "मेरे मार्ग में जोड़ें" पर क्लिक करें.
  8. microRNA प्रभावों का एक प्रकाशन-गुणवत्ता मॉडल बनाने के लिए पथ डिज़ाइनर का उपयोग करें ।
  9. एक वैकल्पिक विकल्प एक कोर विश्लेषण बनाने के लिए है ।
    1. मुख्य विश्लेषण प्रकार के लिए, "व्यंजक विश्लेषण" का चयन करें.
    2. माप प्रकार के लिए, "Expr लॉग अनुपात" का चयन करें ।
    3. विश्लेषण फ़िल्टर सारांश: केवल अणुओं और/या संबंधों पर विचार करें जहां: (प्रजाति = माउस) और (विश्वास = प्रयोगात्मक रूप से देखा) और (डेटा स्रोत = "सरलता विशेषज्ञ निष्कर्षों", "सरलता ExpertAssist निष्कर्षों", "miRecords", "TarBase", या " TargetScan मानव ") ।
    4. p-value = ०.०५ की कटऑफ का चयन करें.
    5. विश्लेषण चलाएं ।
      नोट: रिपोर्ट में शामिल होंगे: विहित मार्ग, ऊपर नियामकों विश्लेषण, रोगों और कार्यों, नियामक प्रभाव, नेटवर्क, अणुओं और अधिक.

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Representative Results

धब्बों में मनाया विभिन्न प्रकार के सेल माउस मद चक्र चरण (चित्रा 1) की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है. ये कक्ष आकृति विज्ञान द्वारा पहचाने जाते हैं । proestrus के दौरान, कोशिकाओं को लगभग विशेष रूप से गोल के आकार का, अच्छी तरह से गठित nucleated उपकला कोशिकाओं (आंकड़ा 1a) समूहों रहे हैं । जब माउस मद चरण में है, कोशिकाओं cornified स्क्वैमस उपकला कोशिकाओं रहे हैं, घनी पैक समूहों में मौजूद (आंकड़ा 1b). metestrus के दौरान, cornified उपकला कोशिकाओं और polymorphonuclear ल्यूकोसाइट्स (चित्रा 1C) देखा जाता है । diestrus में, ल्यूकोसाइट्स (छोटी कोशिकाओं) आम तौर पर अधिक प्रचलित है (चित्रा 1 डी) ।

हम चार माउस फेफड़ों से आरएनए निकाले पहले वर्णित प्रोटोकॉल निंनलिखित । न्यूक्लिक एसिड सांद्रता (एनजी/µ एल) १५८३.१ ± २१५ (तालिका 1) के एक औसत के साथ ११९७.९ और २१७८.१ के बीच की दूरी पर । औसत A260/A280 अनुपात २.०१० से २.०२० २.०१६ ± ०.००२ की औसत के साथ उतारा गया । दूसरी ओर, मनाया A260/A230 अनुपात २.१७९ ± ०.०१८ के एक औसत के साथ २.१३९ और २.२२३ के बीच झूलती ।

तालिका 2 में R पर limma के साथ प्राप्त अंतर अभिव्यक्ति परिणामों को दिखाता है । हम गणना शीर्ष अंतर चूहों ओजोन या proestrus में फ़िल्टर की गई हवा को उजागर के बीच miRNAs (कमांड toptable का प्रयोग करके)14। पहला कॉलम ओजोन और फ़िल्टर हवा उजागर जानवरों के बीच miRNA अभिव्यक्ति में log2 गुना गुना परिवर्तन के मूल्य देता है । स्तंभ t तुलना में प्रत्येक miRNA के लिए परिकलित मॉडरेट t-सांख्यिकीय का प्रतिनिधित्व करता है । स्तंभ p. value और adj. p. मान से पहले और एकाधिक परीक्षण समायोजन के बाद, क्रमशः प्रत्येक तुलना के लिए संबंधित p-मान का प्रतिनिधित्व करते हैं । एक से अधिक तुलना के लिए समायोजन Benjamini और Hochberg की गलत खोज दर15को नियंत्रित करने के लिए विधि के साथ किया गया था । स्तंभ B लॉग-बाधाओं कि miRNA अवकलन8व्यक्त की है का प्रतिनिधित्व करता है ।

हम miRNA लक्ष्य फिल्टर और मुख्य विश्लेषण है कि संवर्धन मार्ग विश्लेषण भी शामिल प्रदर्शन किया । महत्वपूर्ण व्यंजक लॉग अनुपात और p-मान miRNAswith 14 की एक सूची अपलोड करने के बाद, उन सभी miRNA लक्ष्य फ़िल्टर (तालिका 3) द्वारा मैप किए गए थे । परिणाम फ़िल्टर और कुछ रास्ते को पाने के लिए हल किया गया, इस मामले में "सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया". मुख्य विश्लेषण विहित रास्ते, रोगों और समारोह, नियामकों, और नेटवर्क (तालिका 4) के बारे में जानकारी प्रदान की है । कार्यात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर एक नेटवर्क विश्लेषण है कि ब्याज और अंय अणुओं की miRNAs (चित्रा 3) के बीच संबंध से पता चलता है का उत्पादन किया ।

Figure 1
चित्रा 1: मद चक्र चरणों की पहचान. () Proestrus (मुख्यतः nucleated उपकला कोशिकाएँ); () मद (मुख्यतः anucleated cornified कोशिकाएँ); (C) metestrus (सभी तीन प्रकार की कोशिकाएं); और (D) diestrus 2 (ल्यूकोसाइट्स का बहुमत) । स्केल बार = १०० µm. आवर्धन = 20x । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: कार्यात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रतिनिधि परिणाम: miRNA लक्ष्य फ़िल्टर. मद चक्र के विभिंन चरणों में miRNAs की व्यापक प्रोफ़ाइल । miRNA फिल्टर प्रदर्शन करने के बाद, सॉफ्टवेयर जीन और रोगों और अन्य phenotypes, जो फिल्टर और कुछ रास्ते को पाने के लिए तरह हो सकता है में फंसा यौगिकों की विस्तृत लिस्टिंग बचाता है, इस मामले में "सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया". कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: कार्यात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रतिनिधि परिणाम: नेटवर्क । मद चक्र के विभिन्न चरणों में महिलाओं में फ़िल्टर हवा या ओजोन जोखिम से प्रभावित नेटवर्क की तुलना. जैविक नेटवर्क के फेफड़े में miRNAs के साथ जुड़े आरेख proestrus () या गैर proestrus चरणों () में ओजोन बनाम फ़िल्टर की गई हवा को उजागर चूहों । यह आंकड़ा Fuentes एट अल.6से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Id न्यूक्लिक अम्ल (एनजी/µ एल) A260/A280 A260/A230
नमुना १ ११९७.९३० २.०१५ २.१९२
नमूना 2 १३५५.७०३ २.०१८ २.२२३
नमुना ३ २१७८.१०४ २.०२० २.१६३
नमुना ४ १६००.८३७ २.०१० २.१३९
औसत १५८३.१४४ ± २१५ २.०१६ ± ०.००२ २.१७९ ± ०.०१८

तालिका 1: आरएनए सांद्रता और अवशोषण अनुपात २६०, २३० पर, और चार चूहों से शुद्ध फेफड़े के ऊतकों के नमूनों से २८० एनएम का उदाहरण । एकाग्रता एक spectrophotometer के साथ मापा गया ।

logFC टी पी. मान adj. प. वैल बी
mmu-मीर-६९४ १.४९२ ४.०७१ ०.०००१५३ ०.००९५१४ ०.७५९
mmu-मीर-९-5p ०.८३६ ३.९१६ ०.०००२५४ ०.००९५१४ ०.२८९
mmu-मीर-221-3p ०.३८५ ३.१०६ ०.००३०१४ ०.०७५३६१ -१.९८२
mmu-मीर-181d-5p ०.५९७ २.८९१ ०.००५५१६ ०.१०३४२४ -२.५२६
mmu-मीर-९८-5p ०.५५८ २.६९९ ०.००९२४३ ०.१३८६४९ -२.९८७
mmu-मीर-712-5p ०.६६७ २.५६३ ०.०१३१६९ ०.१६४६०९ -३.२९९
mmu-मीर-106a-5p -०.५२८ -२.४१२ ०.०१९२७८ ०.२०६५४७ -३.६३२

तालिका 2: Limma के लिए विश्लेषण परिणाम विभेदक व्यक्त miRNAs ओजोन को उजागर महिलाओं में vs . छान हवा proestrus अवस्था में .

miRNAs आयडी अवलोकन 1 अवलोकन 1 अवलोकन 2 अवलोकन 2
Expr लॉग अनुपात P मान Expr लॉग अनुपात P मान
mmu-मीर-६९४ १.४९२ ०.०००१५३ ०.५४३३१९२०८ ०.००२१३८५
mmu-मीर-९-5p ०.८३६ ०.०००२५४ ०.६७७५९५४२१ ०.००४९९७४३९
mmu-मीर-221-3p ०.३८५ ०.००३०१४
mmu-मीर-181d-5p ०.५९७ ०.००५५१६ ०.३४२२७६६५९ ०.१०६४६७६५७
mmu-मीर-९८-5p ०.५५८ ०.००९२४३ ०.४५५३९२७९९ ०.०३४७२४६९९
mmu-मीर-712-5p ०.६६७ ०.०१३१६९
mmu-मीर-106a-5p -०.५२८ ०.०१९२७८

तालिका 3: एकाधिक-अवलोकन datasets के कार्यात्मक विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के लिए अपलोड करने के लिए उदाहरण स्वरूप । एकाधिक प्रयोगात्मक विभेदक अभिव्यक्ति एक स्प्रेडशीट और अपलोड में समूहीकृत किया जा सकता है, और के रूप में कई टिप्पणियों के रूप में जरूरत जोड़ा जा सकता है । कॉलम: 1) miRNAs आईडी; 2) अवलोकन 1: Expr प्रवेश अनुपात; 3) अवलोकन 1: P मान; 4) अवलोकन 2: Expr प्रवेश अनुपात; 5) अवलोकन 2: P मान ।

गैर-proestrus Proestrus
A. विभेदक व्यक्त miRNAs द्वारा लक्षित जीन
CAMK2N1 PAFAH1B2 SEC23A ABCB9 FGD4 SLC25A27
कारों PDE4B SNX5 APOO FRMD4B SLC38A1
CYP24A1 PDE7A SYT4 ARHGEF38 GPR137B TMCC1
DBF4 PGM3 THAP12 अवेन HMBS TRIM71
HMGN2 Pnp TMED7 CASP3 METAP1 XKR8
KMT5A REV1 TNFAIP2 CCNJ MITF ZCCHC11
LRRC17 RPS19BP1 TNFRSF10C CMTR2 MYC ZIM3
MDH2 RRAD TP53 CNMD RGMB ZNF181
MIS18A SEC62 UBE2V2 DSCR8 SLC14A1
ZNF420
B. शीर्ष रोगों और प्रकार्यों में अंतर
रोगों और विकारों P मान रोगों और विकारों P मान
भड़काऊ रोग 3.84 ई-02-3.84 ई-05 जीव चोट और असामान्यताओं 4.96 ई-02-2.77 ई-14
भड़काऊ प्रतिक्रिया 3.84 ई-02-3.84 ई-05 प्रजनन प्रणाली रोग 2.15 ई-02-2.77 ई-14
जीव चोट और असामान्यताओं 4.17 ई-02-4.17 e-05 कैंसर 4.96 ई-02-1.27 ई-10
C. शीर्ष आणविक और सेलुलर कार्य
आणविक और सेलुलर कार्य मान आणविक और सेलुलर कार्य मान
सेलुलर विकास 2.05 ई-02-5.26 ई-07 सेलुलर आंदोलन 3.77 ई-02-4.47 ई-07
सेलुलर समझौता 3.75 ई-04-3.75 ई-04 सेलुलर मौत और जीवन रक्षा 4.91 ई-02-5.61 ई-06
सेल साइकिल 2.62 ई-03-2.62 ई-03 सेलुलर विकास 4.97 ई-02-1.38 ई-06
D. शीर्ष शारीरिक प्रणाली विकास और समारोह
विकास और समारोह मान विकास और समारोह मान
जीव विकास 4.17 ई-02-1.31 ई-03 भ्रूण विकास 3.30 ई-02-2.12 ई-05
भ्रूण विकास 1.29 ई-02-1.29 ई-02 संयोजी ऊतक विकास और समारोह 1.79 ई-02-6.10 ई-05
संयोजी ऊतक विकास और समारोह 1.93 ई-02-1.93 ई-02 ऊतक आकृति विज्ञान 7.88 ई-05-7.88 ई-05
E. शीर्ष संबद्ध नेटवर्क फ़ंक्शंस
संबद्ध नेटवर्क फ़ंक्शंस स्कोर संबद्ध नेटवर्क फ़ंक्शंस स्कोर
सेलुलर विकास, भड़काऊ रोग, भड़काऊ प्रतिक्रिया जीव चोट और विषमता, प्रजनन प्रणाली रोग, कैंसर
6 19

तालिका 4: कार्यात्मक विश्लेषण सॉफ़्टवेयर गैर में ओजोन को उजागर महिलाओं का सारांश-proestrus बनाम proestrus चरणों। कार्यात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर शीर्ष विहित रास्ते, नदी के ऊपर नियामकों, रोगों & कार्यों, शीर्ष कार्यों, नियामक प्रभाव नेटवर्क और अधिक के विश्लेषण की अनुमति देता है । इस तालिका Fuentes एट अल.6से संशोधित किया गया है ।

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Discussion

MicroRNA profiling दोनों रोग निदान और यंत्रवत अनुसंधान के लिए एक लाभप्रद तकनीक है । इस पांडुलिपि में, हम miRNAs की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल परिभाषित किया है कि विभिन्न मद चक्र चरणों में ओजोन को उजागर मादा चूहों के फेफड़ों में भड़काऊ जीन को विनियमित करने की भविष्यवाणी कर रहे हैं. मद चक्र के निर्धारण के लिए विधियां, जैसे कि दृश्य पता लगाना पद्धति,16बताई गई है । हालांकि, इन एक समय माप पर भरोसा करते हैं, और इसलिए अविश्वसनीय हैं । सही ढंग से सभी मद चक्र महिलाओं कि चक्र नियमित रूप से पहचान करने के लिए, विधि यहां वर्णित की सिफारिश की है । इसके अलावा, यह सरल प्रोटोकॉल भी परोक्ष रूप से चूहों में दैनिक हार्मोनल उतार चढ़ाव का अनुमान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । योनि जलन के कारण अवांछित भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के सक्रियकरण से बचने के लिए, नमूना बस एक बार दैनिक प्रदर्शन करने की जरूरत है । चक्र की लंबाई और आवास के प्रभाव में परिवर्तनशीलता की वजह से, यह एक चक्र मंच पर विचार कर प्रयोग में जानवरों का उपयोग करने से पहले दो से तीन पूरा चक्र के लिए प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

फेफड़ों के ऊतकों से आरएनए के सफल निष्कर्षण के लिए, एक सटीक प्रक्रिया महत्वपूर्ण है । इस प्रोटोकॉल उच्च गुणवत्ता आरएनए पैदावार कि फेफड़ों के ऊतकों से आरएनए को अलग करने के लिए एक दिन की विधि का वर्णन. निर्माता के प्रोटोकॉल में संशोधनों को कुशलतापूर्वक फेफड़ों से आरएनए निकालने के लिए आवश्यक थे । हम धोने बफर के अलावा के रूप में ज्यादा संभव के रूप में बफर हटाने के बाद एक अतिरिक्त केंद्रापसारक कदम जोड़ा । हम भी eluted आरएनए के साथ ३५ µ l के DNase/RNase-मुक्त पानी, १.५ मिनट के लिए स्तंभ केंद्रापसारक उच्च एकाग्रता के स्तर को सुनिश्चित करने के लिए. Spectrofluorometer परिणाम हमारे आरएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता की पुष्टि की । २६० और २८० एनएम (A260/280 अनुपात) में अवशोषक के अनुपात अक्सर आरएनए की तैयारी की शुद्धता का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । न्यूक्लिक एसिड के लिए अधिकतम अवशोषण क्रमशः २६० और २८० एनएम है । यह आरएनए के लिए "शुद्ध" के रूप में स्वीकार किया जाता है अगर अनुपात के बारे में २.०17है । इसी तरह, A260/A230 संदूषण अवशोषण अनुपात के लिए, शुद्धता के लिए मान 2.0 – 2.218की सीमा में हैं । इस अध्ययन में, औसत A260/A280 और A260/A230 अनुपात मनाया २.०१६ ± ०.००२ और २.१७९ ± ०.०१८, क्रमशः (तालिका 1) थे । इसलिए, हमारी आरएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल सफल रहा । इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल का एक अंय लाभ DNAse उपचार के अलावा है । इस जीनोमिक से बचने के लिए महत्वपूर्ण है-डीएनए संदूषण19. इस शाही सेना अलगाव प्रोटोकॉल की एक सीमा शुद्धि कॉलम का उपयोग शराब का उपयोग कर वर्षा के माध्यम से अपशिष्ट त्याग करने के लिए है क्योंकि कुछ फेफड़ों के मलबे या तो आंशिक रूप से या पूरी तरह से, कम पैदावार में जिसके परिणामस्वरूप झिल्ली बाधा हो सकता है । इसके अलावा, अगर homogenization कदम सावधानी से नहीं किया जाता है, फेफड़ों आरएनए की बड़ी मात्रा आसानी से खो जाने या नीचा किया जा सकता है । यदि कम आरएनए पैदावार प्राप्त कर रहे हैं, आरएनए फिर से शुद्ध किया जा सकता है और एक छोटी मात्रा में eluted । वैकल्पिक रूप से, आरएनए20प्रकाशित प्रोटोकॉल के बाद रातोंरात उपजी जा सकता है ।

Microarray प्रौद्योगिकियों miRNA रूपरेखा के लिए लागू कई अनुसंधान क्षेत्रों में उपकरण का वादा कर रहे हैं । हमारे अध्ययन में, हम पीसीआर arrays, जो उच्च का पता लगाने सीमा का लाभ प्रदान करते थे, और सामांय रूप से व्यक्त miRNAs बनाम अंय प्रौद्योगिकियों जैसे जांच आधारित miRNA arrays21का पता लगाने के लिए मानकीकरण रणनीतियों । इस प्रोटोकॉल की एक सीमा है कि यह आरएनए सामग्री शुरू करने की एक ंयूनतम राशि की आवश्यकता है, और ब्याज की miRNAs के लिए प्राइमरों के विशिष्ट सेट की उपलब्धता, जैसे RNAseq के रूप में अंय उपलब्ध तकनीकों का विरोध किया । पीसीआर आधारित सरणियों का एक अन्य लाभ SNORDs की विभेदक अभिव्यक्ति की गणना करने के लिए qPCR सामान्यीकरण (जैसे छोटे nucleolar RNAs या miRNAs) के लिए गैर-miRNA संदर्भ जीन का उपयोग करने का विकल्प है. अंत में, पीसीआर सरणियों का उपयोग डेटा विश्लेषण के लिए कई विकल्प प्रदान करता है, निर्माताओं द्वारा प्रदान की ऑनलाइन उपकरणों से लेकर, पारंपरिक तरीकों को अंतर अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए हालांकि वास्तविक समय पीसीआर । limma के साथ सांख्यिकीय विश्लेषण दोनों microarrays और पीसीआर आधारित सरणियों के लिए सुविधाजनक है और अनुभवजंय Bayes मॉडरेट एफ-statisitcs22का उपयोग करता है । यहां, हम बताते है कि दोनों पी मूल्यों और q-मूल्यों (एकाधिक परीक्षण के लिए समायोजित) कमांड toptable के साथ प्राप्त किया जा सकता है झूठी खोज दर दहलीज समायोजन और विभेदक व्यक्त miRNAs की पहचान ।

कार्यात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर एक वेब मार्ग संदर्भ में डेटा विश्लेषण के लिए आवेदन आधारित है । सॉफ्टवेयर शोधकर्ताओं शक्तिशाली खोज क्षमताओं कि संदर्भ में डेटा सेट या विशिष्ट लक्ष्यों को फ्रेम करने में मदद कर सकते हैं देता है, जैविक महत्व की एक बड़ी तस्वीर के भीतर. हालांकि सॉफ्टवेयर पर्यावरण विश्लेषण के विभिंन प्रकार के लिए लचीला है (यानी, metabolomics, SNPs, प्रोटियोमिक्, microRNA, विषविज्ञान, आदि), हमारे यहां लक्ष्य को miRNA विश्लेषण के पहलुओं पर प्रकाश डाला है । महत्वपूर्ण अभिव्यक्ति लॉग-अनुपात और p-मानों के साथ 14 miRNAs की एक सूची अपलोड करने के बाद, सभी सॉफ़्टवेयर द्वारा मैप किए गए थे । हम miRNA लक्ष्य फिल्टर और कोर विश्लेषण, जो संवर्धन मार्ग विश्लेषण भी शामिल प्रदर्शन किया । हालांकि, इस तरह के विश्लेषण जीन पर विचार जिसके लिए 14 miRNAs लक्ष्य की भविष्यवाणी कर रहे है और नहीं miRNAs खुद को । परिणाम अनुभाग जैसे outputs: विहित रास्ते, रोगों और समारोह, अंतर व्यक्त miRNAs द्वारा लक्षित जीन, शारीरिक प्रणाली विकास, नियामकों, और नेटवर्क (तालिका 4) । मार्ग दृश्य नेटवर्क टैब के अंतर्गत दिखाया गया है, जहां miRNAs और अणुओं को क्लिक करने वाले नोड्स के रूप में दिखाया गया है जो कि ब्याज की जीन (चित्रा 3) से जुड़ी जानकारी के साथ जुड़े हुए हैं । कार्यात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर का एक लाभ उच्च गुणवत्ता वाले miRNA से संबंधित निष्कर्ष है, जिसमें दोनों का प्रयोग मान्य और अनुमानित इंटरैक्शन शामिल है. कार्यात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर डेटाबेस में शामिल हैं: प्रयोगात्मक microRNA-mRNA बातचीत डेटाबेस23,24, कम विश्वास के साथ microRNA-mRNA बातचीत डेटाबेस की भविष्यवाणी की पुष्टि की बातचीत के बाहर रखा (जैसे, लक्ष्य स्कैन)25, प्रयोग मानव, चूहा, और माउस microRNA-mRNA बातचीत डेटाबेस (जैसे, miRecords)26, और साहित्य निष्कर्ष (जैसे, microRNA से संबंधित निष्कर्षोंको मांय मैंयुअल रूप से प्रकाशित साहित्य से उपचारात्मक वैज्ञानिक विशेषज्ञों द्वारा) । miRNA अभिव्यक्ति के साथ जुड़े रास्ते का विश्लेषण करने के लिए प्रभावशीलता और bioinformatics उपकरण के प्रयोज्य की तुलना अंय अध्ययनों से इस सॉफ्टवेयर27की प्रभावशीलता की पुष्टि करें । कुल मिलाकर, गणना के तरीके लागत प्रभावी हैं, कम समय लेने वाली, और आसानी से आणविक तरीकों से मान्य किया जा सकता है. लगातार वृद्धि और जैव चिकित्सा डेटा के संचय के साथ, bioinformatics तरीकों miRNA की खोज में तेजी से शक्तिशाली हो जाएगा-जैविक और रोग प्रक्रियाओं की मध्यस्थता तंत्र ।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी रुचि नहीं है ।

Acknowledgments

इस अनुसंधान NIH K01HL133520 (पी एस) और K12HD055882 (पी एस) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । लेखकों ने ओजोन एक्सपोजर प्रयोगों के साथ सहायता के लिए डॉ॰ जोआना Floros का धन्यवाद किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice The Jackson Laboratory 000664 8 weeks old
UltraPure Water Thermo Fisher Scientific 10813012
Sterile plastic pipette Fisher Scientific 13-711-25 Capacity: 1.7 mL
Frosted Microscope Slides Thermo Fisher Scientific 2951TS
Light microscope Microscope World MW3-H5 10x and 20x objective
Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP Henry Schein Animal Health 55853 90 mg/kg. Controlled drug.
Xylazine Sterile Solution Lloyd Laboratories 139-236 10 mg/kg. Controlled Drug.
Ethanol Fisher Scientific BP2818100 Dilute to 70% ethanol with water.
21 G gauge needle BD Biosciences 305165
Syringe Fisher Scientific 329654 1 mL
Operating Scissors World Precision Instruments 501221, 504613 14 cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip
Tweezer Kit World Precision Instruments 504616
Spectrum Bessman Tissue Pulverizers Fisher Scientific 08-418-1 Capacity: 10 to 50 mg
RNase-free Microfuge Tubes Thermo Fisher Scientific AM12400 1.5 mL
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596026
Direct-zol RNA MiniPrep Plus Zymo Research R2071
NanoDrop Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W
miScript II RT kit Qiagen 218161
Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array Qiagen MIMM-105Z
Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes Thermo Fisher Scientific AM12225 for 20 μL reactions
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control Qiagen 219610
Microsoft Excel Microsoft Corporation https://office.microsoft.com/excel/
Ingenuity Pathway Analysis Qiagen https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/
R Software The R Foundation https://www.r-project.org/
Thermal cycler or chilling/heating block General Lab Supplier
Microcentrifuge General Lab Supplier
Real-time PCR cycler General Lab Supplier
Multichannel pipettor General Lab Supplier
RNA wash buffer Zymo Research R1003-3-48 48 mL
DNA digestion buffer Zymo Research E1010-1-4 4 mL
RNA pre-wash buffer Zymo Research R1020-2-25 25 mL
Ultraviolet ozone analyzer Teledyne API Model T400 http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400
Mass flow controllers Sierra Instruments Inc Flobox 951/954 http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rebane, A., Akdis, C. A. MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132, (1), 15-26 (2013).
  2. Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. How do microRNAs regulate gene expression? Biochemical Society Transactions. 36, (Pt 6), 1224-1231 (2008).
  3. Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nature Reviews Genetics. 13, (5), 358-369 (2012).
  4. Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases. Microrna. 2, (1), 63-71 (2013).
  5. Sessa, R., Hata, A. Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases. Pulmonary Circulation. 3, (2), 315-328 (2013).
  6. Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation. Biology of Sex Differences. 9, (1), 18 (2018).
  7. Aris, R. M., et al. Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy. American Review of Respiratory Disease. 148, (5), 1363-1372 (1993).
  8. Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43, (7), e47 (2015).
  9. Krämer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis. Bioinformatics. 30, (4), 523-530 (2014).
  10. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
  11. Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. In vitro exposure of proteins to ozone. Toxicology Mechanisms and Methods. 12, (1), 1-16 (2002).
  12. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, (4), 402-408 (2001).
  13. Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression. Annals of Applied Statistics. 10, (2), 946-963 (2016).
  14. Smyth, G. K., et al. Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User's Guide. Bioconductor. (2002).
  15. Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57, (1), 289-300 (1995).
  16. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. Public Library of Science ONE. 7, (4), e35538 (2012).
  17. Alves, M. G., et al. Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology. Acta Stomatologica Croatica. 50, (2), 108-115 (2016).
  18. Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques. 22, (3), 478-481 (1997).
  19. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55, (4), 611-622 (2009).
  20. Walker, S. E., Lorsch, J. RNA purification- precipitation methods. Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).
  21. Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16, (5), 991-1006 (2010).
  22. Smyth, G. K. Limma: linear models for microarray data. Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. 397-420 (2005).
  23. Griffiths-Jones, S. miRBase: the microRNA sequence database. Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).
  24. Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets. RNA. 12, (2), 192-197 (2006).
  25. Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
  26. Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions. Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).
  27. Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression. Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).

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