폐 예측에 관한 프로 파일링 걸쳐 the Estrous 사이클 오존에 노출 된 쥐에

Immunology and Infection

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Summary

여기 우리가 폐 식 평가 하는 방법을 설명 예측 하는 miRNAs의 염증 유전자를 조절 하기 위해 마우스를 사용 하 여 오존에 노출 또는 estrous 주기의 여러 단계에서 공기를 필터링.

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Fuentes, N., Silveyra, P. Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice. J. Vis. Exp. (143), e58664, doi:10.3791/58664 (2019).

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Abstract

(미르) 예측에 관한 프로 파일링 생물학과 의학의 다양 한 연구 분야에서 일 하는 연구원에 게 관심사의 되고있다. 현재 학문은 보여준다는 약속 miRNAs 및 폐 질환 진단에 사용의 미래. 여기, 우리 미르 규제는 오존 유발 기도 염증 마우스 모델의에서 폐 조직에 염증 유전자를 예측 하는 miRNAs의 그룹의 관계 되는 풍부를 측정 하는 프로 파일링에 대 한 프로토콜을 정의 합니다. 보였다는 순환 호르몬 수준의 영향을 미칠 수 여성에서 폐 타고 난 면제의 규칙, 때문에이 방법의 목적은 프로 파일링 프로토콜 estrous 주기를 고려 하는 여성 쥐에는 염증 미르 설명 하 오존 노출 시간에 각 동물의 단계. 우리는 또한 limma, R/Bioconductor 소프트웨어를 사용 하 여 미르 검색 및 대상 식별 방법에 적용 가능한 생물 정보학 접근 주소 및 생물 학적 컨텍스트 및 경로 이해 하기 기능 분석 소프트웨어와 관련 된 차동 미르 식입니다.

Introduction

microRNAs (miRNAs)는 짧은 (19-25의 뉴클레오티드), 자연스럽 게 발생, 비 코딩 RNA 분자. MiRNAs의 순서는 진화 생리 기능1조절에 miRNAs의 중요성을 제안 하는 종에 걸쳐 보존 이다. 예측에 관한 식 프로 파일링 miRNAs 다양 한 면역 반응, 세포 분화, 발달 과정 및 apoptosis2를 포함 하 여 프로세스의 규칙에 중요 한 식별 하는 데 도움이 될 입증 되었습니다. 더 최근에, miRNAs 질병 진단 및 치료에 그들의 잠재적인 사용에 대 한 인정을 받고 있다. 유전자 규칙의 기계 장치를 공부 하는 연구원에 대 한 측정 미르 식 수 계몽 규제 프로세스의 시스템-레벨 모델 미르 정보가 mRNA 프로 파일링과 다른 게놈 규모 데이터3병합 하는 경우에 특히. 다른 한편으로, miRNAs mRNAs 견본 종류의 범위에서 보다 더 안정적인 것으로 표시 되었습니다 또한 되며 또한 단백질4보다 큰 감도와 측정. 이 폐 병을 포함 한 다양 한 분자 진단 응용을 위한 생체로 miRNAs의 개발에 상당한 관심을 주도하 고 있다.

폐, miRNAs 개발 프로세스 및 항상성 유지에 중요 한 역할을 재생합니다. 또한, 그들의 비정상적인 식 개발 및 다양 한 폐 질환5진행 관련 된 되었습니다. 공기 오염에 의해 유도 된 염증 성 폐 질환 큰 심각도 및 여성, 호르몬과 estrous 주기 환경 문제에 대 한 응답에서 폐 선 천 적 면역과 미르 식 규제 수 나타내는에서 가난한 예 후를 시연 하고있다 6.이 프로토콜을 사용 하 여 오존 노출, 대기오염의 주요 구성 요소인 적응 면역의 부재에서 발생 하는 여성 쥐에서 폐 염증의 형태를 유도. 오존을 사용 하 여 우리 기도 상피 세포 손상 및 호 중구 증가 염증 성 중재자 인접 항공7에 관련 된 기도 hyperresponsiveness의 개발을 유도 하. 현재, 거기에 잘 설명된 프로토콜 특성화 및 오존 노출 쥐에서 estrous 주기 miRNAs 분석 되지 않습니다.

아래, 우리 estrous 주기 단계 및 오존에 노출 여성 쥐의 폐 조직에서 miRNA 식을 식별 하는 간단한 방법을 설명 합니다. 우리는 또한 효과적인 생물 정보학 전산 생물학에 대 한 강조와 함께 미르 검색 및 대상 식별, 접근 주소. Limma, 진 식 실험8에서 데이터 분석을 위한 통합된 솔루션을 제공 하는 R/Bioconductor 소프트웨어를 사용 하 여 microarray 데이터 분석. Limma 에서 PCR 배열 데이터의 분석 비교 식 배열/샘플 작은 수를 사용 하는 경우 t-검정에 근거한 절차를 통해 권력의 측면에서 장점이 있다. MiRNA 식 결과의 생물 학적 맥락 이해, 우리는 다음 기능 분석 소프트웨어를 사용. Transcriptional 변화를 조절 하는 메커니즘을 이해 하 고 예측 가능성이 결과, 소프트웨어 미르 식 데이터 집합 및 문학9에서 지식을 결합 합니다. 이것은 통계 농축 miRNAs의 세트에 중복에 보면 소프트웨어와 비교 하면 이점이 다입니다.

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Protocol

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 펜실베니아 주립 대학에 의해 승인 되었습니다.

1입니다. Estrous 주기 단계의 평가

  1. 제대로 C57BL/6 마우스 (8-9 주 이전)을 사용 하 여 한 손으로 마우스 억제 기술 Machholz 외.10에서 설명 하는 여성을 제 지 하십시오.
  2. 매우 순수한 물 10 μ로 살 균 플라스틱 피 펫을 채우십시오.
  3. 질에 플라스틱 피 펫 팁을 소개 합니다.
  4. 부드럽게 플러시 액체 4-5 회 샘플을 수집.
  5. 질 액체 유리 슬라이드에 포함 된 최종 플러시를 놓습니다.
  6. 20 x 목적으로 가벼운 현미경 흠 없는 질 플러시를 관찰 합니다.
    참고: 일반 사이클 pseudopregnancy 또는 다른 원인으로 인해 표시 되지 않는 동물 실험에서 제외 될 필요가 있다. Cyclicity 확인을 3 개 이상 연속 사이클에 대 일 분 비 물 매일 수행 하는 것이 좋습니다.

2입니다. 오존에 노출

  1. Ad libitum 와이어 메쉬 뚜껑, 그리고 물 두 1.2 L 유리 용기에 최대 4 마우스를 놓습니다.
  2. 오존 챔버와 필터링 된 공기 노출 챔버에 다른 한 유리 용기를 넣어.
  3. 정기적으로 2 ppm 및 모니터 오존 수준 오존 농도 조정 합니다.
    참고: 레 귤 레이트 된 공기 흐름을 제공 하는 오존 장치 (> 30 공기 변화/h)와 제어 온도 (25 ° C) 및 상대 습도 (50%). 시스템 모니터링 하 고 앞에서 설명한11자외선 오존 분석기 및 질량 유량 컨트롤러에 의해 제어 되는 전기 방전 오존 발생기에 의해 오존을 생성 합니다.
  4. 오존/필터링 공기 노출의 3 h 후 유리 컨테이너를 제거 합니다. 침구, 음식, 그리고 물 ad libitum 케이지를 동물을 반환 합니다.

3. 폐 컬렉션

  1. 노출 후 4 h anesthetize는 케 타 민/xylazine 칵테일 (마 취 제 90 mg/kg, 10mg/kg xylazine)의 복 주사와 동물.
    참고: 마 취의 적절 한 수준을 확인 하려면 체크는 페달에 대 한 마우스 (회사 발가락 핀치) 반사 고 필요에 따라 마 취를 조정.
  2. 70% 에탄올과 마우스 피부를 적십니다.
  3. 2 cm 중간 절 개를 베 나 정 맥을 노출 하는 운영가 위 및 수술 핀셋을 사용 하 여 확인 합니다.
  4. 의해 transection 베 나 정 맥과 대동맥의 쥐를 희생. 필요한 경우, exsanguination 전에 혈액을 수집 하는 신장 정 맥 위에 베 나 정 맥에 21 G 게이지 바늘을 삽입 합니다. 또는 심장 찔린 다음 표준 프로토콜을 통해 혈액을 수집 합니다.
  5. 복 부 구멍을 자르면 갈비뼈 쪽으로 위쪽으로 이동 하는 피부/위 근육을 제거 하는 수술가 위를 사용 합니다.
  6. 수술가 위를 사용 하 여 횡 경 막 펑크.
    참고: 폐는 횡 경 막에서 붕괴 됩니다.
  7. 컷 멀리 심 혼 및 폐를 노출 하는 수술가 위를 사용 하 여 흉 곽.
  8. 집게를 사용 하 여, 1.5 mL microcentrifuge 튜브 RNase 무료 고 튜브를 채우기 위해 액체 질소에 잠수함.
    참고: 보호 장갑 및 고글을 사용 하 여 액체 질소를 처리 하.
  9. 폐를 제거 하 고 스냅-동결 조직에 액체 질소로 채워진 RNase 무료 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 넣어 액체 증발 될 때까지 몇 초 동안 기다립니다.
  10. 관 뚜껑 닫고 사용까지 조직-80 ° C에서 저장 합니다.

4. RNA 준비

  1. 스테인리스 스틸 조직 분쇄기를 사용 하 여 전체 폐 격파
    참고: 조직 분쇄기를 사용 하기 전에 액체 질소에 배치 될 필요가 있다. RNAse 솔루션과 각 사용 후에 분쇄기를 청소.
  2. 분할 분쇄 폐 고 두 1.5 mL 튜브 (각 반 폐) 합니다.
  3. 샘플 튜브 당 guanidinium 안산의 500 µ L을 추가 하 고 섞으십시오.  각각 18 G, G 21 및 23 G 바늘를 사용 하 여 각 샘플 균질
    참고: 샘플 108 사본의 작은 RNA 스파이크에 컨트롤 (종)에서 추출 진행 하기 전에 x 5.6 아군 될 수 있습니다.
  4. 각 샘플을 15 소용돌이 에탄올의 500 µ L를 추가 s.
  5. 로드 컬렉션 튜브를 1 분에 12000 x g 에서 원심 분리기에서 회전 열에 혼합물을 통해 흐름 폐기.
  6. DNase 대 나 치료 (서 열);
    1. 12000 x g 1 분 동안에 RNA 워시 버퍼 및 원심 분리기의 400 µ L를 추가 합니다.
    2. RNase 무료 튜브에 추가 5 DNase의 µ L 나 DNA 소화 x 1의 75 µ L 버퍼와 혼합. 직접 열 매트릭스를 믹스를 추가 합니다.
    3. 15 분 동안 실 온에서 품 어.
  7. 12000 x g 에서 원심 분리기 1 분 통해 흐름 삭제에 대 한 열을 RNA prewash 솔루션의 400 µ L을 추가 하 고이 단계를 반복 합니다.
  8. 열에 RNA 워시 버퍼의 700 µ L을 추가 하 고 1 분에 12000 x g 에서 원심 분리기를 통해 흐름 삭제.
  9. 12000 x g 2 분 나머지 버퍼 제거에서 원심. RNase 무료 튜브로 열을 전송 합니다.
  10. RNA을 elute 열 매트릭스 1.5 분 12000 x g 에서 원심 분리기에 직접 DNase/RNase 무료 물 35 µ L를 추가 합니다.
  11. 총 RNA 농도 측정 (260 nm)와 순도 분 광 광도 계를 사용 하 여. Aliquot 1.5 µ L 샘플에서 RNA 정량화를 수행 하는 지침을 따릅니다. 차입에 대 한 사용 하는 DNase/RNase 없는 물으로 악기를 빈.
    참고: ~2.0의 260/280 비율 이다 RNA에 대 한 "순수"로 일반적으로 수용 된다. 전형적인 RNA 농도 일반적으로 750와 2500 ng / µ L 사이 범위.
  12. -80 ° c.에 게

5. 미르 프로 파일링

  1. 레트로-작은 RNAs, 사용 200 ng 총 RNA의 녹음.
    1. (반응 당 총 볼륨은 20 µ L) 얼음에 반전 녹음 방송 반응 혼합을 준비 합니다. 각 반응에 대 한 버퍼, 뉴클레오티드 혼합 10 x 2 µ L, 역전사의 2 µ L RNase 무료 물 2 µ L x 5의 4 µ L를 추가 합니다. 모든 구성 요소와 600 µ L RNAse 무료 플라스틱 튜브 (혼합 반응 당 10 µ L)에서 약 수를 혼합.
      참고: 리버스-전사 마스터 믹스 템플릿 RNA 제외 하 고 첫번째 물가 cDNA 합성에 필요한 모든 구성 요소를 포함 합니다.
      참고: 믹스 마스터를 준비할 때 초과 볼륨 (10%)를 계산 합니다.
    2. 추가 서식 파일 RNA (200 10 µ L에서 ng) 리버스 전사 마스터 믹스를 포함 하는 각 관에. 믹스, 15에 대 한 원심 분리기 1000 x g, s thermocycler 또는 건조 블록 배치까지 얼음에 그들을 저장 하 고.
    3. 37 ° c.에 60 분 동안 품 어
    4. 95 ° C에서 5 분 동안 incubate 고 얼음에 튜브를 놓습니다.
    5. 각 20 µ L 반전 녹음 방송 반응에 RNase 무료 물 200 µ L을 추가 하 여는 cDNA를 희석.
  2. 실시간 PCR PCR 배열 마우스 염증 반응 및 면역 미르를 사용 하 여 수행 합니다.
    1. 반응 혼합 (총 볼륨 1100 µ L) 준비: 각 반응에 대 한 추가 2 x PCR 마스터 믹스의 550 µ L, 보편적인 뇌관 믹스 x 10의 110 µ L, RNase 무료 물, 340 µ L 및 템플릿 cDNA (희석된 반응 단계의 5.1.5)의 340 µ L.
    2. 사전 로드 된 miRNA PCR 배열 사용 하 여 멀티 채널 pipettor의 각 음에 반응 혼합의 10 µ L를 추가 합니다.
    3. MiRNA 광학 접착제 필름으로 PCR 배열 접시를 봉인.
    4. 거품 제거를 실 온에서 1000 x g 에서 1 분 동안 접시 원심
    5. 실시간 cycler, PCR 초기 활성화 단계 95 ° C에서 15 분, 15에 대 한 3 단계 자전거 포함 변성 프로그램 s 30에 대 한 어 닐 링 94 ° C에서 55 ° C와 30에 대 한 확장에서 s s 40에 대 한 70 ° C에서 사이클 수.
      참고: 따라 제조 업체의 사이클링 실시간 cycler 설정 지침 조건. 실시간 cycler 소프트웨어에 내장 된 분리 곡선 단계를 수행 합니다.
    6. 데이터 분석을 수행 합니다.

6. 데이터 분석

  1. 분석 소프트웨어는 각 샘플에 대 한 실시간 PCR 소프트웨어에서 Ct 값을 추출 합니다.
    참고: A Ct 값 34의 구분으로 간주 됩니다. 샘플 포함 스파이크 컨트롤 (예:, cel-미르-39), 각 샘플에 대 한 제어에 스파이크를 Ct 값을 표준화 됩니다. 임계값 값을 수동으로 설정 해야 합니다. 초기 계획 값을 자동으로 설정 됩니다.
  2. 6 미르 가사 컨트롤의 평균 Ct Ct 값 정상화: SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, 다음 수식을 사용 하 여:
    ΔCt (Ct_Target − Ct_housekeeping) =
  3. 겹 변경 계산, 상대 식 수식12를 사용 하 여 컨트롤로 특정 샘플을 사용 하 여 ΔΔCt 값을 계산:
    miRNA 상대 식:
    2-∆∆Ct, 어디에-∆∆Ct =-[∆Ct 테스트-∆Ct 제어]
    참고: 200의 배 변화 구분으로 간주 됩니다.
  4. 수출 배 Bioconductor8 limma 패키지를 사용 하 여 R에 통계 분석을 수행 하기 위해 식 값을 변경 합니다.
  5. 13Benjamini Hochberg 메서드 사용 하 여 여러 비교에 대 한 수정.
    참고:  R 스크립트의 사본은에서 유효 하다: http://psilveyra.github.io/silveyralab/. 데이터 집합 및 데이터 분석된 번호 GSE111667에서 유전자 식 옴니 버스에서 사용할 수 있습니다 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.

7. 데이터 분석: 기능 분석 소프트웨어

  1. 데이터 집합을 정렬 합니다. MiRNAs와 그들의 각각 식 로그 비율 및 p-값이 포함 됩니다. 특정 데이터 집합 형식에 대 한 표 1 을 참조 하십시오.
  2. 오픈 기능 분석 소프트웨어 (버전 01-10).
  3. 다음 형식을 사용 하 여 데이터 집합을 업로드: 파일 형식: "유연한 형식", 포함 하는 열 머리글: "예", 식별자 종류 선택: "miRBase (성숙)", 실험을 위해 사용 하는 배열 플랫폼: 배열 플랫폼 선택.
    참고: 파일 형식을.txt은 허용 (탭 구분 텍스트 파일).xls (엑셀 파일), 및.diff (파일 cuffdiff 파일).
  4. "유추 관측"를 선택 하 고 실험적인 그룹 라벨 올바른지 확인 합니다.
  5. "데이터 집합 요약" 매핑된 및 매핑되지 않은 miRNAs의 총 금액을 수정 하려면로 이동 합니다.
  6. 상단에 "새" 버튼을 클릭 프로그램의 왼쪽. "새로운 예측에 관한 대상 필터"를 선택 하 고 예측에 관한 데이터 집합을 업로드.
    1. 소스 설정: TarBase, 창의력 전문가 연구 결과, miRecords.
    2. 신뢰 설정: 실험적으로 관찰 또는 높은 (예측).
    3. 다양 한 종, 질병, 조직, 경로 등 대상에 대 한 생물학적 정보를 포함 하도록 "열 추가"를 선택 합니다.
    4. 실험에서 식 변경 된 대상에 초점을 선택 "추가 / 대체 mRNA 데이터 집합". 동일 하거나 다른 식 레벨 microRNAs 찾으려고 "식 페어링"을 사용 합니다.
      참고: 필터 분석 예측에 관한 이름과 기호, mRNA 대상, 대상 관계, 그리고 예측된 관계 (그림 2)의 신뢰 수준을 설명 하는 소스를 제공 합니다.
  7. "추가를 내 통로" 통로 캔버스에 필터링 된 데이터 집합을 전송 하 고 더 많은 생물 학적 관계를 찾아보기를 클릭 합니다.
  8. 경로 디자이너를 사용 하 여 예측에 관한 효과의 게시-품질 모델을 만듭니다.
  9. 대체 옵션 코어 분석을 만드는 것입니다.
    1. 핵심 분석 유형에 대 한 "식 분석"을 선택 합니다.
    2. 측정 유형에 대 한 "Expr 로그 비율"을 선택 합니다.
    3. 분석 필터 요약: 고려 분자 또는 관계 어디: (종 = 마우스)와 (자신감 = 실험적으로 관찰)와 (데이터 원본 = "창의력 전문가 연구 결과", "창의력 ExpertAssist 발견", "miRecords", "TarBase", 또는 " TargetScan 인간 ")입니다.
    4. P-값의 구분 선택 = 0.05.
    5. 분석을 실행 합니다.
      참고: 보고서 포함 됩니다: 정식 경로, 업스트림 레 귤 레이 터 분석, 질병 및 기능, 레 귤 레이 터 효과, 네트워크, 분자 및 더 많은.

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Representative Results

얼룩에 관찰 하는 다른 세포 유형 마우스 estrous 주기 단계 (그림 1)를 식별 하는 데 사용 됩니다. 이러한 세포 형태학에 의해 식별 됩니다. Proestrus, 동안 세포는 거의 독점적으로 라운드 모양, 올바른 nucleated 상피 세포 (그림 1A)의 클러스터. 마우스 발 정기 단계에 있을 때 셀 cornified 편평 상피 세포, 밀도가 포장된 클러스터 (그림 1B)에 있습니다. Metestrus, 동안 cornified 상피 세포와 백혈구 polymorphonuclear 볼 수 있습니다 (그림 1C). Diestrus, 백혈구 (작은 세포)는 일반적으로 더 널리 (그림 1D).

우리는 이전에 설명한 프로토콜을 다음과 같은 4 개의 마우스 폐에서 RNA를 추출. 핵 산 농도 (ng / µ L) 1197.9 2178.1 1583.1 ± 215 (표 1)의 평균 사이 였다. A260/A280 비율이 평균 2.020 2.016 ± 0.002의 평균에 2.010에서 요동 쳤 다. 다른 한편으로, 관찰된 A260/A230 비율 oscillated 2.139 2.179 ± 0.018의 평균 2.223 사이.

표 2 는 r.에 limma 와 함께 차동 식 결과 우리는 쥐 사이 최고 차동 표현된 miRNAs 오존에 노출 또는 proestrus (사용 하 여 명령 toptable)14공기를 필터링을 계산 합니다. 첫 번째 열 미르 식 오존 필터링 된 공기 노출 동물 사이에서 log2 배 배 변경의 값을 제공합니다. 열 t 적당 한 t 통계 비교에서 각 miRNA에 대 한 계산을 나타냅니다. 열 p.value 및 adj.p.value 관련된 p-값 각 비교에 대 한 여러 테스트 조정 전후 각각 나타냅니다. 여러 비교에 대 한 조정 틀린 발견 비율15를 제어 하는 Benjamini 및 Hochberg의 방법으로 이루어졌다. B 열 대표는 미르는 차동 로그-확률 표현8.

우리 농축 경로 분석을 포함 하는 miRNA 대상 필터 및 핵심 분석 수행. 업로드 후 14 miRNAswith 중요 한 식 로그 비율의 목록 및 p-값, 그들 모두는 미르 대상 필터 (표 3)에 의해 매핑된 했다. 결과 필터링 하 고 정렬 "세포질 면역 반응"이 경우에서 특정 경로에 도착 했다. 핵심 분석 정식 경로, 질병 및 기능, 레 귤 레이 터, 및 네트워크 (표 4)에 대 한 정보를 제공. 기능 분석 소프트웨어 생산의 miRNAs와 다른 분자 (그림 3) 사이의 관계를 보여 주는 네트워크 분석.

Figure 1
그림 1: estrous 주기 단계 식별. (A) Proestrus (주로 nucleated 상피 세포); (B) 발 정기 (주로 anucleated cornified 셀); (C) metestrus (셀의 모든 3 가지의 유형); 그리고 (D) diestrus 2 (백혈구의 대다수). 눈금 막대 = 100 µ m. 배율 20 배 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 기능 분석 소프트웨어 대표 결과: 미르 대상 필터. Estrous 주기의 여러 단계에서 miRNAs의 포괄적인 프로 파일. MiRNA 필터를 수행한 후 소프트웨어 유전자와 질병 및 필터 및 정렬 "세포질 면역 반응"이이 경우에 특정 경로를 얻을 수 있는 다른 고기에 연루의 상세한 목록을 제공 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 기능 분석 소프트웨어 대표 결과: 네트워크. Estrous 주기의 여러 단계에서 필터링 된 공기 또는 오존 노출 여성에 의해 영향을 받는 네트워크의 비교. Proestrus (A) 또는 비 proestrus 단계 (B)에 오존 대 필터링 된 공기에 노출 되는 여성 쥐의 폐에 miRNAs와 관련 된 생물학적 네트워크의 도표. 이 그림은 푸 엔 테 스 외.6에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

ID 핵 산 (ng / µ L) A260/A280 A260/A230
샘플 1 1197.930 2.015 2.192
샘플 2 1355.703 2.018 2.223
샘플 3 2178.104 2.020 2.163
샘플 4 1600.837 2.010 2.139
평균 1583.144 ± 215 2.016 ± 0.002 2.179 ± 0.018

표 1: RNA 농도 흡 광도 비율 260, 230, 및 280의 예 4 쥐에서 순화 된 폐 조직 샘플에서 nm. 농도 분 광 광도 측정 했다.

logFC t P.Value 조정 P.Val B
mmu-미르-694 1.492 4.071 0.000153 0.009514 0.759
mmu-미르-9-5 p 0.836 3.916 0.000254 0.009514 0.289
mmu-미르-221-3 p 0.385 3.106 0.003014 0.075361 -1.982
mmu-미르-181 d-5 p 0.597 2.891 0.005516 0.103424 -2.526
mmu-미르-98-5 p 0.558 2.699 0.009243 0.138649 -2.987
mmu-미르-712-5 p 0.667 2.563 0.013169 0.164609 -3.299
mmu-미르-106a-5 p -0.528 -2.412 0.019278 0.206547 -3.632

표 2: Limma 오존에 노출 된 여성에서 차동 표현된 miRNAs에 대 한 분석 결과 vs . proestrus 단계에서 공기를 필터링.

miRNAs ID 관찰 1 관찰 1 관찰 2 관찰 2
Expr 로그 비율 P 값 Expr 로그 비율 P 값
mmu-미르-694 1.492 0.000153 0.543319208 0.0021385
mmu-미르-9-5 p 0.836 0.000254 0.677595421 0.004997439
mmu-미르-221-3 p 0.385 0.003014
mmu-미르-181 d-5 p 0.597 0.005516 0.342276659 0.106467657
mmu-미르-98-5 p 0.558 0.009243 0.455392799 0.034724699
mmu-미르-712-5 p 0.667 0.013169
mmu-미르-106a-5 p -0.528 0.019278

표 3: 기능 분석 소프트웨어에 데이터 집합의 여러 관측 업로드 예제 형식. 여러 실험 차동 식 단일 스프레드시트에 그룹화 및 업로드, 수 고 많은 관측 필요에 따라 추가할 수 있습니다. 열: 1) miRNAs ID; 2) 관찰 1: Expr 로그 비율; 3) 관찰 1: P 값; 4) 관찰 2: Expr 로그 비율; 5) 관찰 2: P 값입니다.

비-proestrus Proestrus
A. 유전자 차동 대상이 miRNAs 표현
CAMK2N1 PAFAH1B2 SEC23A ABCB9 FGD4 SLC25A27
자동차 PDE4B SNX5 APOO FRMD4B SLC38A1
CYP24A1 PDE7A SYT4 ARHGEF38 GPR137B TMCC1
DBF4 PGM3 THAP12 타방 HMBS TRIM71
HMGN2 PNP TMED7 CASP3 METAP1 XKR8
KMT5A REV1 TNFAIP2 CCNJ MITF ZCCHC11
LRRC17 RPS19BP1 TNFRSF10C CMTR2 MYC ZIM3
MDH2 RRAD TP53 CNMD RGMB ZNF181
MIS18A SEC62 UBE2V2 DSCR8 SLC14A1
ZNF420
B. 차이 최고 질병 및 biofunctions
질병 및 장애 P 질병 및 장애 P
염증 성 질환 3.84E-02-3.84E-05 Organismal 상해 및 이상 4.96E-02-2.77E-14
염증 반응 3.84E-02-3.84E-05 생식 계 질병 2.15E-02-2.77E-14
Organismal 상해 및 이상 4.17E-02-4.17E-05 4.96E-02-1.27E-10
C. 최고 분자 및 세포 기능
분자 및 세포 기능 P 분자 및 세포 기능 P
휴대 전화 개발 2.05E-02-5.26E-07 세포 운동 3.77E-02-4.47E-07
세포 손상 3.75E-04-3.75E-04 세포 죽음 및 생존 4.91E-02-5.61E-06
세포 주기 2.62E-03-2.62E-03 휴대 전화 개발 4.97E-02-1.38E-06
D. 정상 생리 시스템 개발 및 기능
개발 및 기능 P 개발 및 기능 P
Organismal 개발 4.17E-02-1.31E-03 배아 개발 3.30E-02-2.12E-05
배아 개발 1.29E-02-1.29E-02 결합 조직 개발 및 기능 1.79 E-02-6.10E-05
결합 조직 개발 및 기능 1.93E-02-1.93E-02 조직 형태 7.88E-05-7.88E-05
5. 상단 관련 네트워크 기능
네트워크 기능 관련 점수 네트워크 기능 관련 점수
휴대폰 개발, 염증 성 질환, 염증 반응 Organismal 부상과 이상, 생식 계 질병, 암
6 19

표 4: 기능 분석 소프트웨어 여성 proestrus 단계 대 비 proestrus에 오존 노출의 요약. 기능 분석 소프트웨어는 최고 정식 경로, 업스트림 레 귤 레이 터, 질병 및 기능, 최고의 기능, 레 귤 레이 터 효과 네트워크 등의 분석을 수 있습니다. 이 테이블은 푸 엔 테 스 외.6에서 수정 되었습니다.

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Discussion

예측에 관한 프로 파일링 질병 진단 및 기계 론 적인 연구에 대 한 유리한 기술입니다. 이 원고에 다른 estrous 주기 단계에 있는 오존에 노출 여성 쥐의 폐에 염증 유전자를 조절 하는 것으로 예측 하는 miRNAs의 식을 평가 하는 프로토콜을 정의 했습니다. Estrous 주기 시각 탐지 방법 등의 결정에 대 한 방법이 설명된16되었습니다. 그러나, 이러한 1 회 측정에 의존 하 고 따라서 신뢰할 수 있는 하지 않습니다. 정기적으로 주기 여성에서 모든 estrous 주기 단계를 정확 하 게 식별 하려면 여기에 설명 하는 방법은 것이 좋습니다. 또한,이 간단한 프로토콜 매일 호르몬 변동에 쥐를 직접 추정 하도 사용할 수 있습니다. 매일 한 번만 수행 되어야 하는 요구를 샘플링 질 자극으로 인해 원치 않는 염증 성 반응의 활성화 방지를 위해. 사이클 길이에 영향 주택 가변성, 이므로 2 ~ 3 주기 단계를 고려 하는 실험에서 동물을 사용 하기 전에 완전 한 사이클에 대 한 프로토콜을 수행 하는 것이 중요.

폐 조직에서 RNA의 성공적인 추출, 정확한 절차는 중요 합니다. 이 프로토콜 높은-품질 RNA를 생성 하는 폐 조직에서 RNA를 분리 하는 1 일 방법을 설명 합니다. 제조 업체의 프로토콜에 대 한 수정 효율적으로 폐에서 RNA를 추출할 필요 했다. 우리는 가능한 만큼 버퍼를 제거 하는 워시 버퍼의 추가 후 추가 원심 분리 단계를 추가. 우리 또한 eluted RNA DNase/RNase 무료 물 35 µ L로 centrifuging 높은 농도 위해 1.5 분 동안 열. Spectrofluorometer 결과 우리의 RNA 추출 프로토콜의 효과를 확인 했다. 260과 280 nm (A260/280 비율)에서 흡 광도의 비율 자주 RNA 준비의 순수성을 평가 하는 데 사용 됩니다. 핵 산에 대 한 최대 흡 광도 각각 260 및 280 nm입니다. 약 2.017이 경우 그것은 "순수"로 RNA에 대 한 허용 됩니다. 마찬가지로, A260/A230 오염 흡 광도 비율에 대 한 순수성에 대 한 값 2.0-2.218의 범위에 있습니다. 이 연구에서는 관찰 평균 A260/A280 및 A260/A230 비율 각각 2.016 ± 0.002와 2.179 ± 0.018, 했다 (표 1). 따라서, 우리의 RNA 추출 프로토콜은 성공적 이었다. 사용 하는 프로토콜의 또 다른 장점은 DNAse 치료의 추가 이다. 이 게놈 DNA 오염19를 피하기 위해 중요 하다. 이 RNA 격리 프로토콜의 한계는 정화 열 낭비를 삭제를 사용 하 여 부분적으로 또는 완전히 일부 폐 파편 멤브레인을 방해 수 있습니다 때문에 알코올을 사용 하는 강 수를 통해 낮은 수율 결과. 또한, 균질 단계는 신중 하 게 수행 되지 않습니다, 만약 폐 RNA의 대량 수 수 쉽게 분실 또는 저하. 낮은 RNA 수율 가져온 경우 RNA 정화 다시 고 작은 볼륨에 eluted. 또는, RNA 침전 된 하룻밤 다음 게시 프로토콜20수 있습니다.

Microarray 기술 미르 프로 파일링에 적용 된 많은 연구 분야에서 유망한 도구가 있습니다. 우리의 연구에서 우리는 PCR 배열, 프로브 기반 미르21배열 같은 다른 기술 대 차동 표현된 miRNAs의 검출에 대 한 높은 검출 임계값 및 표준화 전략의 이점을 제공 하는 사용. 이 프로토콜의 한계가 이다 RNA 소재, 및 RNAseq와 같은 다른 사용할 수 있는 기술 반대로 관심의 miRNAs에 대 한 프라이 머의 특정 세트의 시작의 최소 금액을 요구 한다. PCR 기반 배열의 또 다른 장점은 miRNAs의 차동 식 계산을 정량 정규화 (예: nucleolar 작은 RNAs 또는 SNORDs)에 대 한 비 미르 참조 유전자를 사용 하 여 옵션. 마지막으로, PCR 어레이 사용 하 여 데이터 분석, 실시간 PCR 하지만 차동 식 감지 하는 기존의 방법에 제조 업체에서 제공 하는 온라인 도구에서 배열에 대 한 몇 가지 옵션을 제공 합니다. Limma 통계 분석 microarrays 그리고 PCR 기반 배열에 대 한 편리 하 고 경험적 베이즈 검토 f-statisitcs22를 사용 합니다. 여기, 우리 p-값과 q 값 (여러 테스트에 대 한 조정) 모두 틀린 발견 비율 임계값 조정 명령 toptable 얻어질 수 있다 고 miRNAs 표현 차동 식별 표시.

기능 분석 소프트웨어 통로 컨텍스트에서 데이터 분석을 위한 웹 기반 응용 프로그램입니다. 소프트웨어 연구원 프레임 데이터 세트 또는 생물학 중요성의 더 큰 그림에서 맥락에서 구체적인 목표를 도울 수 있는 강력한 검색 기능을 제공 합니다. 소프트웨어 환경 분석의 종류에 유연 하지만 (즉, 대사체학, Snp, proteomics, 예측에 관한, 독극물, 등), 우리의 목표는 여기 미르 분석의 측면을 강조 하는. 업로드 후 상당한 식 로그-비율 및 p-값 14 miRNAs의 목록, 모든 소프트웨어에 의해 매핑된 했다. 우리 미르 대상 필터 및 핵심 분석, 농축 경로 분석을 포함 하는 수행. 그러나, 같은 분석을 14 miRNAs 대상과 자신 miRNAs 하지 것으로 예측 하는 유전자를 고려 하십시오. 결과 섹션 목록 출력 같은: 정식 경로, 질병 및 기능, 유전자 차동 표현된 miRNAs, 생리 적 시스템 개발, 레 귤 레이 터, 및 네트워크 (표 4)의 대상. 경로 시각화 miRNAs와 분자 (그림 3)의 유전자에 관련 된 정보로 연결 되는 클릭 가능한 노드로 표시 됩니다 네트워크 탭 아래 표시 됩니다. 기능 분석 소프트웨어의 장점은 높은-품질 미르 관련 연구 결과, 모두 실험적으로 검증 되 고 예측 상호 작용을 포함 하 여 이다. 기능 분석 소프트웨어 데이터베이스 포함: 실험적으로 검증 된 예측에 관한 mRNA 상호 작용 데이터베이스23,24, 낮은 자신감 상호 작용 (예를 들어, 제외 된 예측된 예측에 관한 mRNA 상호 작용 데이터베이스 대상 검색)25, 실험적으로 검증 된 인간, 쥐, 및 마우스 예측에 관한 mRNA 상호 작용 데이터베이스 (예: miRecords)26및 문학 연구 결과 (예:, 예측에 관한 관련 연구 결과 수동으로 게시 된 문학에서 큐레이터 의해 과학 전문가). 효율성과 미르 식과 연결 된 경로 분석 하는 생물 정보학 도구의 유용성을 비교 하는 다른 학문이 소프트웨어27의 효과 확인 합니다. 전반적으로, 계산 방법 비용, 적은 시간이 걸리는, 고 분자 방법으로 쉽게 확인 될 수 있습니다. 지속적인 성장 및 생물 의학 데이터의 축적, 생물 정보학 방법을 생물학 및 질병 과정의 메커니즘을 중재 하는 miRNA의 발견에서 점점 더 강력한 될 것입니다.

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Disclosures

저자 들은 아무 경쟁 관심사를 선언 합니다.

Acknowledgments

이 연구는 NIH K01HL133520 (PS) 및 K12HD055882 (PS)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. 저자는 오존 노출 실험을 가진 원조에 대 한 박사 조 안 나 Floros를 감사합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice The Jackson Laboratory 000664 8 weeks old
UltraPure Water Thermo Fisher Scientific 10813012
Sterile plastic pipette Fisher Scientific 13-711-25 Capacity: 1.7 mL
Frosted Microscope Slides Thermo Fisher Scientific 2951TS
Light microscope Microscope World MW3-H5 10x and 20x objective
Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP Henry Schein Animal Health 55853 90 mg/kg. Controlled drug.
Xylazine Sterile Solution Lloyd Laboratories 139-236 10 mg/kg. Controlled Drug.
Ethanol Fisher Scientific BP2818100 Dilute to 70% ethanol with water.
21 G gauge needle BD Biosciences 305165
Syringe Fisher Scientific 329654 1 mL
Operating Scissors World Precision Instruments 501221, 504613 14 cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip
Tweezer Kit World Precision Instruments 504616
Spectrum Bessman Tissue Pulverizers Fisher Scientific 08-418-1 Capacity: 10 to 50 mg
RNase-free Microfuge Tubes Thermo Fisher Scientific AM12400 1.5 mL
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596026
Direct-zol RNA MiniPrep Plus Zymo Research R2071
NanoDrop Thermo Fisher Scientific ND-ONE-W
miScript II RT kit Qiagen 218161
Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array Qiagen MIMM-105Z
Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes Thermo Fisher Scientific AM12225 for 20 μL reactions
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control Qiagen 219610
Microsoft Excel Microsoft Corporation https://office.microsoft.com/excel/
Ingenuity Pathway Analysis Qiagen https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/
R Software The R Foundation https://www.r-project.org/
Thermal cycler or chilling/heating block General Lab Supplier
Microcentrifuge General Lab Supplier
Real-time PCR cycler General Lab Supplier
Multichannel pipettor General Lab Supplier
RNA wash buffer Zymo Research R1003-3-48 48 mL
DNA digestion buffer Zymo Research E1010-1-4 4 mL
RNA pre-wash buffer Zymo Research R1020-2-25 25 mL
Ultraviolet ozone analyzer Teledyne API Model T400 http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400
Mass flow controllers Sierra Instruments Inc Flobox 951/954 http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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