Slippverktøy Barcoding-baserte enkelt celle Transcriptomics av voksen pattedyr vev

* These authors contributed equally
Biology
 

Summary

Denne protokollen beskriver generelle prosesser og kvalitetskontroll sjekker nødvendig for sunn voksen pattedyr enkeltceller forberedte slippverktøy-basert, høy gjennomstrømming enkeltcelle RNA-Seq forberedelser. Sekvensering parametere, tilbys Les justering og nedstrøms encellede bioinformatic analyse også.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Stratton, J. A., Sinha, S., Shin, W., Labit, E., Chu, T. H., Shah, P. T., Midha, R., Biernaskie, J. Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues. J. Vis. Exp. (143), e58709, doi:10.3791/58709 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Analyse av enkeltcelle genuttrykk over tusen individuelle celler innenfor en vev eller microenvironment er et verdifullt verktøy for å identifisere celle komposisjon, diskriminering av funksjonelle stater og molekylære baner underliggende observert vev funksjoner og dyrenes atferd. Imidlertid kan isolering av intakt, sunn enkeltceller fra voksen pattedyr vev for påfølgende nedstrøms enkeltcelle molekylær analyse være utfordrende. Denne protokollen beskriver generelle prosesser og kvalitetskontroll sjekker nødvendig for å få høy kvalitet voksen enkeltcelle preparater fra nervesystemet eller hud som aktivert påfølgende upartiske enkeltcelle RNA sekvensering og analyse. Retningslinjer for nedstrøms bioinformatic analyse tilbys også.

Introduction

Med utviklingen av høy gjennomstrømning enkeltcelle teknologi1,2 og fremskritt i brukervennlig Bioinformatikk verktøy over de siste tiår3, et nytt felt av høyoppløselige gene expression analyse har dukket opp- encellede RNA sekvensering (scRNA-Seq). Studiet av enkeltcelle genuttrykk ble først utviklet identifisere heterogenitet innenfor definerte celle populasjoner, som i stilk celler og kreftceller, eller identifisere sjeldne bestander av celler4,5, som var uoppnåelig med tradisjonelle bulk RNA sekvensering teknikker. Bioinformatic verktøy har aktivert identifikasjon av romanen Sub-populasjoner (Seurat)2, visualisering av celler langs en psuedotime plass (Monocle)6, definisjonen av aktive signalnettverk nettverk i eller mellom populasjoner ( NATURSKJØNNE)7, prediksjon av enkelt-celler i en kunstig 3D-rom (Seurat og mer)8. Med disse nye og spennende analyser tilgjengelig for det vitenskapelige samfunnet, er scRNA-Seq raskt bli den nye tilnærmingen til gene expression analyse.

Til tross for det store potensialet i scRNA-Seq, kan teknisk skillsets kreves for å produsere ren dataset og nøyaktig tolke resultatene være utfordrende for nykommere. En grunnleggende, men omfattende protokoll, fra isolering av enkeltceller fra hele primære vev visualisering og presentasjon av data for publisering her presenteres (figur 1). Først kan isolering av sunn enkeltceller anses utfordrende, ulike vev variere i deres grad av følsomhet for enzymatisk fordøyelsen og påfølgende mekanisk dissosiasjon. Denne protokollen gir følgende isolasjon og identifiserer viktige kvalitetskontroll sjekkpunkter gjennom hele prosessen. Andre, forstå kompatibilitet og krav mellom enkeltcelle teknologi og neste generasjons sekvensering kan være forvirrende. Denne protokollen gir retningslinjer for å implementere en brukervennlig, slippverktøy-baserte encellede barcoding plattform og utføre sekvensering. Endelig er programmering en viktig forutsetning for å analysere encellede transcriptomic datasett. Denne protokollen gir ressurser i å komme i gang med programmeringsspråket R og gir veiledning om implementering av to populære scRNA-Seq-R pakker. Sammen, veileder denne protokollen nykommere i utføre scRNA-Seq analyse for å få klar, interpretable resultater. Denne protokollen kan justeres til de fleste vev i musen, og viktigst kan bli endret for bruk med andre organismer, inkludert menneskelig vev. Justeringer avhengig av vev og brukeren vil være nødvendig.

Det er flere hensyn å huske på når du følger denne protokollen; inkludert 1) etter alle kvalitetskontroll retningslinjer i trinn 1 og 2 av denne protokollen anbefales å sikre en levedyktig enkeltcelle suspensjon av alle celler i utvalget rundt samtidig sikre nøyaktige totalt antall celletall (sammenfattet i figur 2 ). Når dette er oppnådd, og hvis alle optimalisert forholdene er fulgt, kvalitetskontroll trinnene kan drop (å spare tid - bevarer RNA kvalitet og redusere celle tap). Bekrefter vellykket isolering av høy levedyktighet enkeltceller fra vevet rundt er svært anbefaler før noen nedstrøms behandling. 2) siden noen celletyper er mer følsomme enn andre stress, kan overdreven dissosiasjon teknikker utilsiktet bias befolkningen, derfor confounding nedstrøms. Mild dissosiasjon uten unødvendige mobilnettet klipping og fordøyelsen er avgjørende for å oppnå høy mobilnettet avkastning og en nøyaktig gjengivelse av vev komposisjon. Skjær krefter oppstå under føden, FACS og rørets trinnene. 3) som med RNA arbeid, er det best å innføre som lite ekstra RNase i prøven som mulig under forberedelse. Dette vil hjelpe opprettholde høy kvalitet RNA. Bruke ribonuclease hemmer løsninger med skylling ren verktøy og utstyr som ikke er RNase-fri men unngå DEPC-behandlet produkter. 4) utføre forberedelser så raskt som mulig. Dette vil hjelpe opprettholde høy kvalitet RNA og redusere celledød. Avhengig av vev disseksjon lengde og dyr tall, Vurder å starte flere disseksjoner/forberedelser samtidig. 5) forberede celler på is når mulig å opprettholde høy kvalitet RNA, redusere celledød og langsom celle signalnettverk og transcriptional aktivitet. Riktignok iskald behandling er ideell for de fleste celletyper, gir noen celletyper (f.eks, nøytrofile) bedre når behandlet ved romtemperatur. 6) unngå kalsium, magnesium, EDTA og DEPC-behandlet produkter under cellen forberedelse.

Protocol

Alle protokoller beskrevet her er i samsvar med og godkjent av University of Calgary's Animal Care komiteen.

1. dissociating vev (dag 1)

  1. Euthanize mus med en overdose av natrium pentobarbital (IP, 50 mg/kg) eller som hensiktsmessig henhold dyreetikk protokollen. Deretter Fjern uønsket hårvekst fra rygg og ben av musen og etanol-sterilisere regionen disseksjon.
  2. Dissekere vev eller microenvironment rundt. Denne protokollen bruker vi hud og nerve vev for å demonstrere generalizability av slippverktøy barcoding-baserte enkeltcelle transcriptomics etter voksen vev dissosiasjon.
    1. Den sciatic nerven, bruk detaljert protokollen på Stratton et al. 9. kort kutt huden fra bakben regionen tilbake/bena på musen. Gjør et snitt langs låret med sterilt skalpell blad. Bruke fine tang og saks til å avdekke og fjerne sciatic nerve.
    2. For tilbake huden, bruk detaljert protokollen på Biernaskie et al. 10. kort, dissekere dorsal tilbake huden ved å lage snitt fra skulder til skulder, over rumpen og ned baksiden fine tang og saks. Kutt huden i tynne skiver (0,5 cm tykkelse) med et sterilt skalpell blad.
  3. Vask vev 2 ganger med iskald HBSS, og fjerne uønskede bindevev, fett innskudd eller rusk under dissecting mikroskop.
    1. For huden dermis bare, flyte skiver i dispase (5 mg/mL, 5 U/mL) i HBSS i 30-40 minutter på 37 ° C. Kirurgisk skille overhuden fra huden. Forkaste overhuden eller ytterligere distansere bruker trypsin hvis interessepunkter.
  4. Hakke utvalg i 1-2 mm biter med en bakteriefri skalpell blad og satt i fersk tint 2 mg/mL kaldt collagenase-IV enzym (2 mg/mL, 125 CDU/mg, i F12 media).
    1. Nerve, bruke ~ 500 µL per 2 x sciatic nerver. Bruke ~ 8 mL per 1 x musen tilbake hud huden.
      Merk: Vev bør være fullstendig neddykket i collagenase-IV løsningen. Det er viktig at alle fordøyelsen enzymer håndteres, lagret og forberedt riktig. Hvis enzymer blir liggende i romtemperatur over lengre tid, vil encellede isolasjon krever overdreven mekanisk føden og redusere celle levedyktighet. Collagenase-IV kan også gjøres i celle kultur medier der cellen levedyktighet er mest optimale. Men dette kan endre enzym aktivitet eller transcriptional signatur så bør optimeres av brukeren.
  5. Inkuber eksemplet i enzymet i et 37 ° C bad for 30 min med mild risting hvert 10 min. En shaker på 37 ° C er også et egnet alternativ.
  6. Triturate med en P1000 hindre 20 – 30 ganger på 30 min etter enzym tillegg.
  7. Gjenta føden enhver 30 min til løsning vises skyet og biter av vev er hovedsakelig avstand.
    NOTE Sikre full løslate av celler (figur 2b, 2 c). For å bekrefte fullstendige versjonen, plate celler med Nuc Blue (2 dråper per 1 mL) og etter 20 min, se under mikroskop for å sikre alle kjerner er tilknyttet enkeltceller i stedet for rusk. Det er viktig å sjekke graden av cellen utgivelse i en gitt eksperiment for hver vev type eller tilstand. I fibrotiske vev (dvs., kronisk personskade) eller uskadet voksen vev, vil utgivelsen av celler variere dramatisk fra akutt skade eller embryonale vev. Dette er spesielt viktig fordi enkelte celletyper er mindre sannsynlig å løsne fra vev enn andre, dermed fortrinnsvis utenom disse cellene fra nedstrøms.
    1. For nerve, distansere vev for 0,5-1,5 timer totalt. For huden, distansere vev i 2 timer totalt (siste time med inkubering, legge DNase (1 mg/mL) hud utvalg).
  8. Filtrere to ganger med en 40 µm filter. Skyll filteret med iskald 1% BSA/HBSS.
  9. Sentrifuge 260 x g i 8 min. Deretter fjerne nedbryting.
    1. Resuspend celle pellet i HBSS som inneholder 1% BSA bruker en bred-fødte tips, og plasser på is. Rørets volumet er basert på vev volum (800 mg våt vekt for hud = 800 µL volum, 10 mg våt vekt for nerver = 100 µL volum).
    2. Eventuelt starter med lav rørets volum og justere etter behov basert på gjennomstrømning (hendelser per sekund) på FACS sorter. Den mest effektive form tettheten (Maksimer mange celler samlet inn under minimalizing tid) samlinger er 3000-7000 hendelser/sekund.
  10. Hvis bruker levedyktighet fargestoff, ta ut en subaliquot for en unstained kvinne kontroll. Deretter legger 1:15,000 levedyktighet fargestoff (lager: 20 000 nM/µL) utvalg (1,3 nM/µL siste konsentrasjon) bruker en bred-fødte tips for å redusere klipping.
    Merk: Det er viktig å sjekke for graden av celledød innenfor en gitt eksperiment for hver vev type eller tilstand. Noen celletyper i en prøve er mer sannsynlig å dø enn andre, dermed blir fortrinnsvis utelukket fra nedstrøms.
    1. Inkuber utvalg med levedyktighet fargestoff i 5-10 min på isen i mørket. Deretter legge 4 mL iskald 1% BSA/HBSS utvalg. Sentrifuge 260 x g i 8 min å fjerne overflødig levedyktighet fargestoff. Behandle subaliquot med ingen levedyktighet fargestoff unstained kvinne kontroll på samme måte.

2. isolere levedyktig og friske celler (dag 1)

  1. Kontroller at funksjonen FACS følger riktig fluorescens aktivert celle sortering (FACS) parametere.
    1. Forberede FACS maskinen på forhånd for å sikre at den er klar når den endelige sentrifugen i trinn 1 er fullført, og sikre at samlingen rommet holdes kaldt med isblokker.
    2. Bruk følgende parametere: Flow rate: 1.0 (tilsvarer omtrent 10 µL/min); Filter: 1,5 ND; Munnstykke størrelse: 100 µm; Fremover scatter: 80-180 V (endre etter behov for å skille størrelse av hendelser); Siden scatter: 150-220 V (endre etter behov for å skille detaljnivå/form av hendelser); Laser: 100-400 V (endre etter behov for å skille levedyktighet fargestoff positiv vs negative hendelser og sjekk denne mot ingen levedyktighet fargestoff kontroll); Gates: Endre som nødvendig å sikre alle celler samlet. Se figur 2d-2 g.
      Merk: FACS parametere er svært avhengig av celletyper og sorterer ansatt, og derfor må optimaliseres av brukeren.
  2. Forberede 15 mL smale bunn rør med 8 mL iskald 1% BSA/HBSS for eksempel samlinger. Statisk inni rør og overflatespenning kan påvirke samling effektivitet. Invertere rør før samlinger å sikre grensesnitt mellom overflaten av væske og innsiden av røret er fuktig.
    Merk: Hvis arbeider med svært lav celle tall, justere liten samling fartøyet etter behov.
  3. Når alle celler er samlet, sentrifuge eksempel på 260 x g i 8 min.
    Merk: Før sentrifugering, legge til 1% BSA/HBSS til vask/push celler ned fra siden overflaten og Inverter/blanding røret umiddelbart etter FACS.
  4. Resuspend celle pellet i 1% BSA/HBSS og holde på is. Det maksimale volumet per prøve som er kompatibel med trinn 3 behandling er 33.8 µL, så pass på at siste celle fortynning/rørets volum er riktig å få ideelle celle nummer i 33.8 µL. Andre fortynning media alternativer for dette trinnet (og alle tidligere fortynninger i 1% BSA/HBSS) inkluderer DMEM, og opp til 40% serum, men unngå kalsium, magnesium eller EDTA inneholder reagenser.
    1. La celler på is for en minimal tidsperiode. Ideelt skal medarbeider forberede alt utstyr og reagenser følgende trinn (trinn 3) i siste trinnene i trinn 2.
  5. Cellen forberedelse kritiske sjekker
    1. Kontrollere beregninger av cellen tallene fra FACS. Avhengig vev dissosiasjon kan lengder, rusk og celler være svært like i størrelse og form. Dermed, med mindre en fluorescerende reporter brukes, FACS kan ikke utelate alle rusk. Det anbefales at en endelig celletall etter FACS samling er utført for å forstå hvilken prosentandel av hendelser (avhengig av FACS) er faktisk celler for en gitt forberedelse (figur 2 g). Utfør celletall bruker en hemocytometer eller automatisert celle teller (gjenta to ganger) og beregne prosentandelen levedyktige cellers som representeres av de totale samlet etter FACS maskin.
    2. Validere celle forberedelse. Validere at ingen store partikler (> 100 µm) finnes som de kan tette utstyr i nedstrøms trinn. Utilstrekkelig fjerning av rusk kan risikere tilstopping encellede microfluidic chip. Plate gjenværende celler med Nuc blå (som over) for å sikre at ingen store løsmasser fragmentene er. Dette vil også tillate for bekreftelse at cellene er entall (dvs.ikke henger sammen) gir tillit at nedstrøms enkeltcelle genetisk analyse representerer enkeltceller i stedet for flere celler.
    3. Bestemme cellen tallene sekvensen: det er et stort utvalg av voksen vev-avledet cellen tallene per prøve som kan lastes inn i systemet med opptil 8 prøver som kan kjøres samtidig. Forfatterne har lastet noe fra 500-50.000 celler per prøve og fikk god scRNA-Seq datasett. Mer diskusjon om passende celle tall laste kan finnes under diskusjon. Det endelige resultatet av sekvensert celle tall avhenger sterkt kvaliteten på enkelt-celler isolert. Lasting 10.000 voksen vev-avledet celler kan returnere overalt fra 1000 til 4000 sekvensert celler (10-40% avkastning). Hvis interessert i sekvensering høyt tall (~ 10 000 celler, det maksimale antallet anbefales for dette systemet), vil lasting 25 000-100.000 celler være nødvendig.

3. perle (Gel perle i emulsjon) generasjon og Barcoding (dag 1)

Merk: Trinn 3-6 i denne protokollen er utformet for å brukes sammen med de vanligste microdroplet-baserte encellede plattformen, produsert av 10 X Genomics. Detaljerte veiledninger for trinn 3 og 4 er skissert i produsentens protokollen (se krom enkeltcelle 3 protokollen)11,12 og må følges i forbindelse med denne protokollen. For best resultat, må trinn 3 være fullført umiddelbart etter dissosiasjon (trinn 1) og celle isolasjon (trinn 2) på dag 1 i denne protokollen.

  1. Forberede chip i henhold til produsentens protokollen 11,12. Denne microdroplet-baserte encellede plattformen bruker teknologi som prøver ~ 750.000 strekkoder separat indeksere hver celle transcriptome. Dette oppnås ved å partisjonere celler i Gel perle i emulsjoner (edelstener) hvor generert cDNA dele en felles strekkode. Under GEM generasjonen, celler leveres slik at fleste (90-99%) generert GEMs inneholder ingen celler, mens resten, for det meste, inneholder en enkelt celle.
    1. Plassere brikken i chip holderen.
    2. Klargjør celle master blandingen på is.
    3. Legge til 50% glyserol ubrukte brønner og legge til 90 µL av cellen master mix vel 1, 90 µL av gel perler til vel 2 og 270 µL partisjonering olje vel 3.
    4. Dekk chip med pakningen.
  2. Laste chip og kjøres i en enkeltcelle kontroller.
    1. Løs ut skuffen, plassere brikken i skuffen, trekke skuffen og trykk Play. En enkeltcelle 3 gel perle i en perle inkluderer primere som inneholder en delvis Illumina R1 sekvens (Les 1 sekvensering primer), en 16 nukleotider (nt) 10 x Barcode, en 10 nt unike molekylær identifikator (UMI) og poly-dT primer serie. Under kjøringen, er gel perler i kontrolleren utgitt og blandet med cellen lysate og master mix.
    2. Samle 100 µL av prøven og plass i et PCR-rør.
    3. Sted PCR rør pre-set PCR maskin og kjøre PCR ifølge kit. Etter inkubasjon GEMs inkluderer full lengde, barcoded cDNA fra poly-adenylated mRNA.
  3. Etter kjøre, plasserer du på 20 ° C over natten for opptil 1 uke før forrige til neste trinn.

4. opprydning, forsterkning, bibliotek konstruksjon og biblioteket kvantifisering (dag 2 og utover)

Merk: Detaljert retningslinjer for trinn 4 er skissert i produsentens protokollen 11,12, og må følges i forbindelse med denne protokollen.

  1. Bruk silane magnetiske perler fjerne restene biokjemiske reagenser/primere fra GEM reaksjonsblandingen.
  2. Forsterke full lengde, barcoded cDNA å generere tilstrekkelig masse for biblioteket konstruksjon.
  3. Vurdere DNA avkastning. Før biblioteket konstruksjon, vurdere DNA avkastning av prøven. Dette angir hvor mange sykluser å bruke i nedstrøms PCR trinn (eksempel indeks PCR under bibliotek bygging). Avhengig av et gitt utvalg, som kan variere avhengig av aktivisering stater (f.ekskontroll vs skadet, osv.), celle type, og cellen avkastning RNA innhold, kan hvor anbefalte syklus endres.
    1. For sekvensering ~ 3000 vev-avledet celler (irrelevant for aktivisering stater), forfatterne har funnet at 14 sykluser (eksempler: ~ 10-100 ng DNA) er standard.
    2. Bruke en Bioanalyzer for DNA-analyse. Referere til brukeren Guide13.
  4. Fragment utvalg og velge størrelsen på DNA. Før biblioteket konstruksjon, kan du bruke enzymatisk fragmentering og størrelse utvalg protokoller for å få riktig cDNA amplicon størrelse.
  5. Forberede prøven biblioteket konstruksjon. Mens R1 (Les 1 primer sekvens) legges til molekylene under GEM inkubasjon; P5, P7 (et eksempel index), og R2 (Les 2 primer sekvens) legges under bibliotek bygging.
  6. Vurdere DNA avkastning. De fleste sekvensering fasiliteter kreve innlevering av endelig biblioteker med DNA avkastning og kvalitet informasjon. Derfor kjøre bioanalyzer etter hele protokollen og før transport til sekvensering anlegget.
  7. Lagre prøver-80 ° c for opptil 2 måneder.
  8. Før sekvensering, kvantifisere prøver ved en DNA kvantifisering kit. Dette kan gjøres på sekvensering anlegget.

5. biblioteket sekvensering (dag 3 og utover)

Merk: Encellede transcriptome barcoding plattformen brukes i denne protokollen genererer Illumina-forenlig sammenkoblet-end biblioteker begynner og slutter med P5 og P7 sekvenser. Selv om minimum dybde for å løse celle-type identitet kan være så få som 10 000-50.000 leser/mobiltelefon15,16, er ~ 100.000 leser/mobiltelefon anbefalt som en optimal kostnad-dekning trade-off for voksne i vivo celler (holde i tankene noen celle typer eller minimal aktivert celle stater vil nå metning på 30.000-50,000 leser/mobiltelefon).

  1. Transport cDNA bibliotekene på tørris til et sekvensering utstyrt med en passende Illumina sequencer.
  2. Oppgi følgende informasjon til sekvensering anlegget:
    1. Gi eksempel detaljer: prøve indeks-IDer som tilsvarer hvert bibliotek; Art; genomic databasen for montering (dvs.GRCm38 for musen); electropherogram viser fragment størrelser fra bioanalyzer (mellom 200 og 9000 bp); cDNA konsentrasjonen (ng/µL) og total biblioteket konsentrasjon (totalt Dekkeevnen varierer fra 200-1400 ng); volum (µL) for eksempel.
    2. Gi sekvensering forespørsler: kvantifisere prøver ved en DNA kvantifisering kit; kort/indekstype (TruSeq DNA); skivetype (Eppendorf twin.tec, Full skjørt - anbefalt for DNA); sekvensering teknologi/bibliotek (10 x, full sekvensering instruksjoner og syklusen anbefalinger)17.
  3. Kjøre grunne sekvensering (valgfritt): studier analysere flere biologiske prøver vil ha nytte av å samle eksempler (samling) for å generere en enkel genet-strekkode matrise som inneholder data fra alle prøvene. For å minimere satsvise effekter mellom eksempler Når pooling, bør lese dybden mellom forskjellige biblioteker standardiseres. For dette, er et nøyaktig anslag av enkelt celle tall nødvendig. MiSeq sequenceren vil tillate grunne sekvensering og en kostnadseffektiv, praktisk måte å få nøyaktig celle beregninger.
    Merk: En løpe med et MiSeq SR50 sequencer gir tilstrekkelig dekning for å nøyaktig beregne omtrent 20.000 celler. Dette løpet vil omtrentlig antall UMI gjenopprettet for hver unik strekkode. I figur 3a, hodet for et eksempel (Sample 1.6) utgang (CSV) vises, viser strekkoder og dens tilsvarende UMI teller som trygt tilordnet leser.
    1. Ta kontakt med en bioinformatician å bli kjent med R programmeringsspråk. Se DataCamp guider for mer informasjon18.
    2. Vurdere rådata fra sequenceren med angitte R skriptet som en mal19. Rådata refererer til antall UMIs som er tilordnet hver unike strekkode. Skriptet leser en CSV-fil der den første kolonnen er en liste over strekkoder og den andre kolonnen er dens tilsvarende UMI teller. Dette skriptet vil gi et komplott (figur 3b) og anslått antall barcoded celler i hver prøve. Justere skriptet slik at det innskrevne antallet UMI teller for et gitt utvalg er en tredjedel av den første bratte slipp. I figur 3bfaller dette albue rundt 225 UMIs tilsvarer 3,480 barcoded celler.
    3. Sammenlignes med full-dybde sekvensering med HiSeq (der 3,516 celler ble sekvensert, Figur 3 c), grunne sekvensering estimater spådd 3,480 celler.
  4. Bruk celle utvinning tilnærmelser (fra trinn 5.3) eller bruk utvinning diagrammet funnet i produsentens protokollen20 planlegge lane distribusjon for dypere sekvensering. Hvert utvalg burde få sammenlignbare dekning, så hvis grunne sekvensering avslører at det er forskjellig antall celler i hver prøve (som ofte er tilfelle) deretter lane distribusjon skal beregnes tilsvarende. En HiSeq flyt celle (som består av 8 baner) kan sekvens opptil 2,4 milliarder egendefinerte sammenkoblede slutten leser. Eksempel flyt celle oppsett vises i figur 3d.

6. behandling lese filer

Merk: Sekvensering en enkeltcelle 3' bibliotek bruke denne protokollen genererer rådata i binær base ringer (BCL) format. Den cellen Ranger pakken brukes til å generere tekst-basert FASTQ filer fra BCL filer, utføre genomisk og transcriptomic justeringer, gene teller, demultiplexing og aggregering av prøver. I denne delen vises de viktigste trinnene som lar brukerne laste ned BCL rådata fra en sekvensering anlegg og generere filtrerte gen-strekkode matriser klar for nedstrøms bioinformatikk.

  1. Bruke en sentralisert server for å kjøre programmet. BCL filer, FASTQ filer og de fleste av de nedstrøms bioinformatikk behandling krever betydelig prosessorkraft.
  2. Last ned alle lese råfiler på serveren (eller FASTQ filer hvis de er tilgjengelige).
    1. Ta kontakt med administratoren for å sette opp en konto på en sentralisert server eller klyngen, og å bli kjent med Unix21.
    2. Bruk en hente kommandoen for serverens operativsystem laste ned alle filene fra sekvensering innretningen server.
      1. De fleste sekvensering anlegg gir en kommando for å laste ned filer fra en sikker vei som kan kjøres fra kommandolinjen (se eksempel nedenfor).
      2. Erstatte det "< brukernavnet >" og "< passord >" plassholdere i kommandolinjen med legitimasjonen som oppgis.
        wget - O - "https://your_sequencing_facilitys_server.com/path_to_raw_read_files/ - no-cookies-no-sjekk-sertifikat - post data ' j_username = brukernavn & j_password = passord ' | wget--no-cookies-no-sjekk-sertifikat - post data ' j_username = brukernavn & j_password = passord "- ci -
    3. Hvis bare en absolutt bane til filer gis (dvs. https://your_sequencing_facilitys_server.com/path_to_raw_read_files/), setter du inn denne banen i en hente kommando.
  3. Unzip filene: Hvis lastet ned filer slutten med filtypen ".gz", det har blitt komprimert ved hjelp av kommandoen "gzip". For å pakke, pakke Kjør kommando i kommandolinjen (se eksempel nedenfor).
    gunzip raw_read_files.gz
  4. Last ned den nyeste versjonen av cellen Ranger på serveren som en selvstendig .tar22.
    1. Kritisk: Før nedlasting, sikre Linux-systemet oppfyller minimumskravene23. Kontroller minimum 8 kjerner Intel prosessor med 64 GB RAM og 1 TB diskplass.
      Merk: Cellen Ranger gir forhåndsbygde menneskelige og gnager referanse transcriptomes. Disse kan endres cellranger mkref kommandoen for å oppdage gener som GFP24.
  5. Generere FASTQ filer fra sequencer's base samtale filer (BCLs) kommandoen cellranger mkfastq.
    Merk: Programmet vil justere lese rådata (fra FASTQ-filer) til en referanse genomet og generere gen-celle matriser for nedstrøms. Den bruker STAR aligner som utfører skjøting-aware justering av til en referanse genom. Bare trygt tilordnet leser (dvs., leser kompatibel med en ett gen merknad) brukes for UMI opptelling.
    1. For eksempel bruke kommandoen cellranger mkfastq:
      cellranger mkfastq - id = sample_name \
      -Kjør = / sti/til/sample \
      -csv=csv_file_containing_lane_sample_index.csv
  6. Kjør cellranger teller på FASTQ filer generert ved hjelp av mkfastq å generere encellede genet teller.
    1. For eksempel bruke kommandoen cellranger antall:
      cellranger teller - id = sample_name \
      -transcriptome = refdata-cellranger-mm10-1.2.0 \
      -fastqs = / absolutt/sti/til/fastq/files \
      -prøven = same_sample_name_supplied_to_cellranger_mkfastq \
      -localcores = 30
  7. Flere bibliotek aggregasjon (valgfritt): kombinere prøver, basseng cellranger antall utganger med cellranger aggr. Dette resulterer i en enkelt gen-strekkode matrise som inneholder data samlet fra flere biblioteker. Eksempel cellranger aggr kommandere:
    cellranger aggr - id = sample_name \
    -csv = csv_with_libraryID_ & _path_to_molecule_h5.csv \
    -Normaliser = tilordnet
    Merk: Biblioteker kan samles med normalisering moduser (tilordnet, rå, ingen). Tilordnet er anbefalt som det underutvalg høyere dyptgående biblioteker til alle biblioteker har lik sekvensering dybde25.
  8. For umiddelbar visualisering/analyse av data, kan du importere .cloupe utdatafilen (generert cellranger teller eller cellranger aggr) til 10 x Loupe cellen nettleser26.

7. avansert analyse av scRNA-Seq datasett

Merk: En komplett scRNA-Seq verktøy database kan finnes på scRNA-verktøy3,27. Nedenfor er et rammeverk for unsupervised cellen klynging bruker Seurat2 og pseudotemporal bestilling bruker Monocle6. Selv om mye av dette arbeidet kan gjøres på en lokal datamaskin, anta det fulgte skritt at beregningen skal fullføres bruker en institusjonell server.

  1. Last ned den nyeste versjonen av Miniconda på serverkonto ved hjelp av Linux plattform28.
  2. Installere den nyeste versjonen av R bruke conda29.
  3. Tegne inn dataene med angitte Seurat R skriptet som en mal30.
    Merk: Seurat er en R-baserte verktøykasse som muliggjør kvalitetskontroller, klynger, differensial gene expression analyse, markør genet ID, dimensionality reduksjon og visualisering av scRNA-Seq data. En omfattende beskrivelse av Seurat koding og opplæring finner Satija Lab nettsted31.
  4. Tegne inn dataene med angitte Monocle R skriptet som en mal32.
    Merk: Monocle er en annen R-baserte verktøykasse som muliggjør visualisering av uttrykket endringer over pseudotime og identifiserer gener underliggende celle skjebne beslutninger. En omfattende beskrivelse av Monocle koding og opplæring finner på Monocle nettsted33.
  5. R-pakker som kBET kan brukes til å teste og rette satsvise effekter som resultat av pooling datasett34.

8. NCBI'S GEO og SRA innsendinger

Merk: Siden enkel tilgang til rå sekvensering filer sikre reproduserbarhet og reanalysis, accessioned brev til offentlig tilgjengelig dokumentutkastsamlinger er anbefalt eller nødvendig før manuskriptet innlevering. National Center for bioteknologi informasjon (NCBI) Gene Expression Omnibus (geografisk) og sekvens lese arkiv (SRA) er offentlig tilgjengelige data repositories for høy gjennomstrømming sekvensering data35,36.

  1. Registrer deg for NCBI'S GEO innsenderen konto37.
  2. Komplett GEO innlevering som inkluderer tre komponenter samlet i en-mappen (tittelen som GEO avsenderen brukernavn): 1) metadataoppføring (ett regneark per prosjekt innlevering); 2) rådata filer; 3) behandlet datafiler.
    1. Laste ned og fullføre Metadata regneark38. Følgende offentlige GEO innlevering kan brukes som en guide (GSE100320)39. Plassere regnearket i katalogen.
    2. Sted rå datafiler generert fra cellranger antall skript for alle biblioteker i katalogen.
    3. Sted behandlet datafiler (filtrert barcodes.tsv, genes.tsv og matrix.mtx) generert fra cellranger antall skript for alle biblioteker i katalogen.
  3. Bruk GEO innsenderens FTP legitimasjon til å overføre katalogen som inneholder alle tre komponentene. For Linux/Unix-brukere: ncftp, lftp, ftp, sftp og ncftpput kan brukes.
  4. Varsle GEO for alle overføringer38.

Representative Results

Repertoaret av åpen kildekode-pakker som er utformet til å analysere scRNA-Seq datasett har økt dramatisk40 med fleste av disse pakkene R-baserte språk3. Her, representant resultater med to av disse pakkene presenteres: vurdere unsupervised gruppering av enkelt cellene basert på genuttrykk og bestilling enkeltceller langs en bane for å løse celle heterogenitet og dekonstruere biologisk prosesser.

Figur 4 illustrerer bruken av Seurat for pre-prosessering kvalitetskontroller og nedstrøms bioinformatikk analyse. Først er filtrering og fjerning av avvikende celler fra analyse avgjørende for kvalitet kontroll. Dette ble gjort ved hjelp av fiolin (figur 4a) og scatter tomter (figur 4b) å visualisere prosentandelen av mitokondrie gener, antall gener (nGene) og antall UMI (nUMI) til å identifisere celle doublets og outliers. En celle med en klar avvikende antall gener, UMI eller prosentandel av mitokondrie gener ble fjernet Seurat's FilterCells funksjonen. Siden Seurat bruker viktigste komponenten (PC) analyse score til klynger cellene, bestemme statistisk signifikant PCs å inkludere er et kritisk punkt. Albue tomter (Figur 4 c) ble brukt for PC utvalg, i hvilken PC utover platået "standardavvik av PC" aksen ble utelatt. Oppløsningen for klynging ble også manipulert demonstrere at antallet klynger kan endres, fra 0,4 (lav oppløsning fører til færre celle klynger, Figur 4 d) til 4 (høy oppløsning fører til høyere celle klynger, figur 4e ). På lav oppløsning er det sannsynlig at hver sektorgruppe representerer en definert celle type, mens med høy oppløsning kan dette også representere subtyper eller overgangsreglene stater av cellen innbyggere. I dette tilfellet, ble innstillinger for lav oppløsning klyngen brukt for ytterligere analysere uttrykk heatmaps (funksjonen Seurat's DoHeatmap) for å identifisere de mest uttrykt genene i en gitt klynge (figur 4f). I dette tilfellet ble mest uttrykt genene identifisert ved å vurdere differensial uttrykk i en gitt klynge mot alle andre klynger kombinert, viser at hver sektorgruppe var unikt representert av definerte gener. I tillegg kan individuelle kandidat gener visualiseres på tSNE tomter funksjonen Seurat's FeaturePlot (Figur 4 g). Dette tillot tyde om det var klynger som representerte makrofager. Bruker FeaturePlot, fant vi at begge klynge 2 og 4 var uttrykke Cd68 - en pan-macrophage markør.

Monocle pakken ble brukt for bekrefter celle klynger identifisert i Seurat og bygge celle baner eller pseudotemporal bestilling, til recapitulate biologiske prosesser (figur 5). Pseudotemporal bestilling kan brukes for prøver der encellede uttrykket profiler forventes å følge en biologisk tid kurs. Cellene kan bestilles langs en pseudotemporal kontinuum løse mellomliggende tilstander, bifurkasjonen rundt to alternative celle skjebne, og identifisere genet signaturer underliggende oppkjøpet av hver skjebne. For det første, lik Seurats filtrering, dårlig kvalitet celler ble fjernet slik at fordelingen av mRNA over alle cellene var Logg normal og falt mellom øvre og nedre grense som er identifisert i figur 5a. Deretter bruker Monocle's newCellTypeHierarchy funksjonen, enkeltceller ble klassifisert og telles bruker kjente avstamning markør gener (figur 5b, 5 c). For eksempel ble celler uttrykke PDGF reseptor alfa eller Fibroblast bestemt Protein 1 tilordnet til celle Type #1 å lage vilkår for å definere fibroblaster. Deretter ble denne befolkningen (celle Type #1) vurdert dechiffrere fibroblast baner. Dette gjør ble Monocles differensial GeneTest funksjonen benyttet, som sammenlignet cellene representerer ekstreme statene i befolkningen og fant differensial gener for bestilling av gjenværende celler i befolkningen (figur 5 d). Ved å bruke mangfoldige undervisningsformer (en type ikke-lineære dimensionality reduksjon) i alle celler, ble en koordinat langs en pseudotemporal sti tilordnet. Denne banen ble deretter visualisert av cellen staten (figur 5e) og pseudotime (figur 5f).

Figure 1
Figur 1: flytdiagram. Skritt fra hele dyr forberedelse til å analysere enkelt celle RNA-Seq datasett å sende siste datasett til et offentlig tilgjengelig register. Gel perler i emulsjon (edelstener) se perler med barcoded oligonucleotides som kapsler inn tusenvis av enkeltceller. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: opprette levedyktig enkeltcelle suspensjon fra nervevev. (a) tegneserie oversikt over kvalitetskontroller. (b) celler og rusk cellene fremdeles innlemmet i rusk (røde piler). (c) celler fra rusk (røde piler). (d) cellen aisolering av FACS. P0: rusk brøkdel; P1: cellen som brøkdel; P3: utelukkelse av duplets; P4: levedyktighet fargestoff (Sytox Orange) negative brøkdel. (e) ingen levedyktighet fargestoff kontroll. (f) bilde av P0 brøkdel representerer isolert rusk. (g) bilde av P4 brøkdel representerer isolert levedyktige cellers (røde piler). (b) (c) (f) og (g) hadde kjernefysiske fargestoff lagt til 20 minutter før bildebehandling. Skala barer: 80 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: grunne sekvenser predikerer antall gjenopprettede celler i 10 X behandlet prøver. (a) et eksempel (Sample 1.6) på MiSeq-generert csv celle strekkoder og dens tilsvarende UMI teller som trygt tilordnet leser. (b) strekkode rang tomten for eksempel 1.6 viser en betydelig nedgang i UMI teller som en funksjon av cellen strekkoder. Stiplet og solid linjene representerer cut-off mellom celler og bakgrunn som bestemmes av visuell inspeksjon. (c) cellen strekkoder observert bruker celle Ranger rørledning innlegg-HiSeq avslører grunne sekvensering tilnærmes nøyaktig antall celler for eksempel 1.6. (d) et eksempel på en flyt-celle oppsett basert på grunt sekvensering avledet celle estimater. For eksempel 1.6, siden grunne sekvensering spådd 3480 celler, 1,17 baner ble tildelt slik > 100.000 leser per celle sekvensering dekning i HiSeq. Merk: Alle baner må legge til 100%. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: kvalitetskontroll og bioinformatikk av encellede RNA-Seq datasett med Seurat R pakken. (a) tomter kvalitetskontroll beregninger som antall gener, antall unike molekylær identifikatorer (UMIs) og andelen utskrifter tilordning til mitokondrie genomet. (b) prøve genet tomter oppdage celler med avvikende mitokondrie utskrifter og UMIs. (c) prøve albue plott brukes for ad hoc fastsettelse av statistisk signifikant PCer. Stiplet og dot stiplede linjene representerer cut-off der en klar "albue" blir tydelig i diagrammet. PC dimensjoner før denne albue inkluderes i nedstrøms. (d, e) Grafbasert celle klynger visualisert på to forskjellige oppløsninger i en lav-dimensjonale rommet ved hjelp av en tSNE tomt. (f) øverste merket gener (gul) for hver klynge visualisert på et uttrykk heatmap Seurat's DoHeatmap funksjonen. (g) visualisere markør uttrykk for, for eksempel Cd68 genet som representerer makrofager (lilla) Seurat's FeaturePlot funksjonen. Dette tyder på at klyngen 2 og 4 (i panelet d) av dataset representerer makrofager. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: kategorisering og bestilling langs peudotemporal bane med monokkel toolkit. (a) inspisere fordelingen av mRNA (avledet fra UMI teller) i alle celler i et utvalg. Bare celler med mRNA mellom 0 - ~ 20.000 ble brukt til nedstrøms. (b, c) Tilordne og teller celletyper basert på kjente lineage celle markører. For eksempel celler uttrykke PDGF reseptor alfa eller Fibroblast bestemt Protein 1 ble tilordnet celle Type #1 representerer pan-fibroblaster Monocle's newCellTypeHierarchy funksjonen. Antall forskjellige celletyper kan visualiseres som et sektordiagram (b) og som en tabell (c). (d) med cellen Type #1 (fibroblaster) eksempel genene brukes for bestilling av celler kan visualiseres ved hjelp av et spredningsdiagram som demonstrerer genet spredning vs mener uttrykk. Rød kurven viser cut-off for gener brukes for bestilling beregnes bety-variansen modellen Monocle's estimateDispersions funksjonen. Gener som oppfyller denne cutoff ble brukt for nedstrøms pseudotime bestilling. (e, f) Visualisering av cellen baner i en redusert to-dimensjonale rommet farget ved celle "State" (e) og Monocle tilordnet "Pseudotime" (f). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Denne protokollen demonstrerer hvordan riktig utarbeidelse av enkeltceller kan avdekke den transcriptional heterogeniteten av enkeltceller og diskriminere funksjonelle stater eller unike mobilnettet identiteter innenfor en vev. Protokollen krever ikke fluorescerende reporter proteiner eller transgene verktøy og kan brukes på isolasjon av enkeltceller fra ulike vev inkludert de fra mennesker; holde i tankene hvert vev er unik, og denne protokollen krever en viss justering/ombygging.

Allsidig og svært dynamisk transcriptional programmene i celler har understreket verdien av én celle genomics. Bortsett fra isolere høykvalitets RNA, et kritisk eksempel forberedelse skritt nødvendig for høykvalitets datasett er å sikre at celler helt frigjøres fra vev, og at cellene er sunn og intakt. Dette er relativt rett frem for å samle celler som er lett utgitt, som sirkulerende celler eller i vev celler beholdes der løst, som lymfoid vev. Men dette kan være utfordrende for andre voksen vev, på grunn av høyt utviklet mobilnettet arkitektur som spenner over store avstander, rundt ekstracellulær matrix og ofte stive cellen cytoskjelett proteiner involvert i vedlikehold cellestruktur. Selv med riktig dissosiasjon teknikker for den fulle versjonen av celler er det mulig at strenge og ofte lang behandling kreves ville endre mRNA kvalitet og celle integritet. I tillegg påvirke til høye temperaturer brukes for enzym-assistert dissosiasjon også transcriptional signaturer29,30. Hensikten med protokollen er å presentere kvalitetskontroll sjekker, bruker vev som myelinated voksen nerve og ekstracellulær matrix-rik voksen huden, for å demonstrere hvordan optimalisering kan hjelpe for å overvinne disse hindringene.

En viktig faktor når du utformer en scRNA-Seq eksperiment er valget av sekvensering dybde. Sekvensering kan være svært multiplekset og lese dybde kan variere fra å være svært lav bruker Drop-Seq2 til opp til 5 millioner leser/mobiltelefon14 bruke en full lengde RNA-Seq som Smart-Seq. De fleste scRNA-Seq eksperimenter kan oppdage moderat til høy uttrykk utskrifter med sekvensering så lavt som 10 000 leser/mobiltelefon, hvilke er vanligvis nok for celle type klassifisering41,42. Grunne sekvensering dybden er av verdi å lagre sekvensering kostnader når prøver å finne sjeldne celle populasjoner over komplekse vev hvor tusenvis av celler kanskje behøves å trygt tilskrive sjeldne populasjoner. Men grunne dybden sekvensering er ikke tilstrekkelig når detaljert informasjon om genuttrykk og prosesser knyttet til subtile transcriptional signaturer er nødvendig. Det er foreløpig anslått at det store flertallet av gener i en celle er oppdaget med 500.000 leser/mobiltelefon, men dette kan variere avhengig av protokollen og vev skriver43,44. Mens full transkripsjon omgår behovet for montering og kan derfor oppdage roman eller sjeldne skjøte varianter, begrenser sekvensering kostnader ofte skalering slike tilnærminger for å undersøke tusenvis av celler som består av en kompleks vev system. Derimot merket 3 encellede biblioteker som de som er beskrevet i denne protokollen vanligvis har lavere kompleksitet og krever grunnere sekvensering. Det er viktig å merke seg at biblioteker generert ved hjelp av beskrevet protokollen kan være sekvensielt på en av fem støttes sequencere: 1) NovaSeq, 2) HiSeq 3000/4000, 3) HiSeq 2500 rask kjøre og høy produksjon, 4) NextSeq 500/550 og 5) MiSeq.

En alternativ tilnærming til enkeltcelle RNA-Seq, som reduserer behovet for sarte vevet og håndtering ennå vedlikeholder noen av fordelene med enkeltcelle RNA-Seq, er analysen av RNA fra enkelt kjerner45. Denne tilnærmingen kan raskere behandling reduserer RNA fornedrelse, og flere ekstrem måler å sikre tilstrekkelig utgaven av kjerner, og dermed sannsynligvis gir en mer trygg fangst av transcriptional profiler som representerer alle celler innenfor en gitt vev. Dette, selvfølgelig, bare gi en del av transcriptional aktivitet stede i en gitt celle, dermed avhengig av hva eksperimentelle mål er rundt denne tilnærmingen kan eller ikke kan være riktig.

Foruten komplett karakterisering av mobilnettet identiteter innenfor en gitt vev er en av de mest verdifulle analysene for scRNA-Seq datasett vurdering av mellomliggende transcriptional tilstander over 'definerte' celle populasjoner. Disse mellomliggende tilstander kan gi innsikt i avstamning relasjonene mellom celler i identifiserte befolkninger, som ikke var mulig med tradisjonelle bulk RNA-Seq tilnærminger. Flere scRNA-Seq bioinformatic verktøy er nå utviklet for å klargjøre dette. Slike verktøy kan vurdere prosessene involvert i, for eksempel kreftceller overgang til en kreftfremkallende/metastatisk tilstand, stamceller modning i ulike terminal skjebne eller immunceller skytteltrafikk mellom aktive og quiescent. Subtile transcriptome forskjeller i celler kan også være indikativ av avstamning biases, nylig utviklede bioinformatic verktøy som FateID, kan antyde47. Siden forskjellene mellom overgang celler kan være vanskelig å fastslå gitt transcriptional forskjellene kan være subtile, dypere sekvensering kan være nødvendig46. Heldigvis kan dekning av en lav sekvensert bibliotek økes hvis interessert i utprøvende datasettet ytterligere ved å kjøre biblioteket på nytt med en annen flyt celle.

Samlet gir denne protokollen en lett-å-adapt arbeidsflyt som gjør det mulig å transcriptionally profil hundrevis til tusenvis av enkelt-celler i et eksperiment. Den endelige kvaliteten på scRNA-Seq dataset er avhengig av optimalisert cellen aisolering, flowcytometri, cDNA biblioteket generasjon og tolkning av rå gen-strekkode matriser. Dette gir denne protokollen en omfattende oversikt over alle viktige trinn som kan enkelt endres for å aktivere studier av ulike vev.

Disclosures

Ingen avsløringer

Acknowledgements

Vi erkjenner støttepersonale på UCDNA tjenester anlegget og Animal Care anlegg personalet på University of Calgary. Vi takker Matt Workentine bioinformatics underhold og Jens Durruthy hans kundestøtte. Dette arbeidet ble finansiert av en CIHR grant (RM og JB), en CIHR ny etterforsker tildeling JB, og en Alberta barns helse Research Institute fellesskap (js).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Products
RNAse out Biosciences 786-70
Pentobarbital sodium Euthanyl 50mg/kg
HBSS Gibco 14175-095
Dispase 5U/ml StemCell Technologies 7913 5 mg/ml
Collagenase-4 125 CDU/mg Sigma-Aldrich C5138 2 mg/ml
DNAse Sigma-Aldrich DN25 10mg/ml
BSA Sigma-Aldrich A7906
15 ml Narrow bottom tube VWR® High-Performance Centrifuge Tubes VWR 89039-666
Sytox Orange Viability Dye Molecular Probes 11320972 1.3 nM/µl
Nuc Blue Live ReadyProbes Invitrogen R37605
Agilent 2100 Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents Agilent 5067-4626
Kapa DNA Quantification Kit Kapa Biosystems KK4844
Chromium Single Cell 3' reagents 10x Genomics
Equipment
BD FACSAria III BD Biosciences
Agilent 2100 Bioanalyzer Platform Agilent
Illumina® HiSeq 4000 Illumina
Illumina® MiSeq SR50 Illumina
10X Controller + accessories 10x Genomics
Software
The Cell Ranger 10x GENOMICS support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/welcome
Loupe Cell Browser 10x GENOMICS support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest
R https://anaconda.org/r/r

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shalek, A. K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic paracrine control for cellular variation. Nature. 510, 363-369 (2014).
  2. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161, 1202-1214 (2015).
  3. Zappia, L., Phipson, B., Oshlack, A. Exploring the single-cell RNA-seq analysis landscape with the scRNA-tools database. bioRxiv:206573. (2018).
  4. Dulken, B. W., Leeman, D. S., Boutet, S. C., Hebestreit, K., Brunet, A. Single cell transcriptomic analysis defines heterogeneity and transcriptional dynamics in the adult neural stem cell lineage. Cell Reports. 18, (3), 777-790 (2017).
  5. Llorens-Bobadilla, E., et al. Single-Cell Transcriptomics Reveals a Population of Dormant Neural Stem Cells that Become Activated upon Brain Injury. Cell Stem Cell. 17, (3), 329-340 (2015).
  6. Trapnell, C., et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nature Biotechnology. 32, 381-386 (2014).
  7. Aibar, S., et al. SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering. Nature Methods. 14, 1083-1086 (2017).
  8. Mayer, C., et al. Developmental diversification of cortical inhibitory interneurons. Nature. 555, (7697), 457-462 (2018).
  9. Stratton, J. A., et al. Purification and Characterization of Schwann Cells from Adult Human Skin and Nerve. eNeuro. 4, (3), (2017).
  10. Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nature Protocols. 1, (6), 2803-2812 (2007).
  11. 10X Genomics. User Guides. Available from: https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/ (2018).
  12. 10X Genomics. Chromium Single Cell 3' Training Module. Available from: http://go.10xgenomics.com/training-modules/single-cell-gene-expression (2018).
  13. Agilent. Available from: https://www.agilent.com/en-us/library/usermanuals?N=135 (2018).
  14. Kolodziejczyk, A. A. Single Cell RNA-Sequencing of Pluripotent States Unlocks Modular Transcriptional Variation. Cell Stem Cell. 17, 471-485 (2015).
  15. Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343, 776-779 (2014).
  16. Pollen, A. A., et al. Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex. Nature Biotechnology. 32, 1053-1058 (2014).
  17. 10X Genomics. Sequencing Requirements for Single Cell 3'. Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sequencing/doc/specifications-sequencing-requirements-for-single-cell-3 (2018).
  18. Datacamp. Introduction to R. Available from: https://www.datacamp.com/courses/free-introduction-to-r (2018).
  19. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics#39; Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis. Available from: https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357 (2018).
  20. 10X Genomics. User Guides. Available from: https://www.10xgenomics.com/resources/user-guides/ (2018).
  21. UNIX Tutorial for Beginners. Available from: http://www.ee.surrey.ac.uk/Teaching/Unix/ (2018).
  22. 10X Genomics. Creating a Reference Package with cellranger mkref. Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references (2018).
  23. 10X Genomics. System Requirements. Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/overview/system-requirements (2018).
  24. 10X Genomics. Software Downloads. Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest (2018).
  25. 10X Genomics. Aggregating Multiple Libraries with cellranger aggr. Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/aggregate#depth_normalization (2018).
  26. 10X Genomics. Loupe Cell Browser Gene Expression Tutorial. Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/visualization/latest/tutorial (2018).
  27. scRNA-tools. A table of tools for the analysis of single-cell RNA-seq data. Available from: https://www.scrna-tools.org/ (2018).
  28. Conda. Downloading conda. Available from: https://conda.io/docs/user-guide/install/download.html (2018).
  29. Anaconda. r / packages / r 3.5.1. Available from: https://anaconda.org/r/r (2018).
  30. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis. Available from: https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357 (2018).
  31. Satija Lab. Seurat - Guided Clustering Tutorial. https://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html (2018).
  32. Droplet-based, high-throughput single cell transcriptional analysis of adult mouse tissue using 10X Genomics' Chromium Single Cell 3' (v2) system: From tissue preparation to bioinformatic analysis. Available from: https://figshare.com/s/97b83e649e5eefd01357 (2018).
  33. Monocle. Available from: http://cole-trapnell-lab.github.io/monocle-release/docs/#constructing-single-cell-trajectories (2018).
  34. Github. An R package to test for batch effects in high-dimensional single-cell RNA sequencing data. (2018).
  35. Edgar, R. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nucleic Acids Research. 30, 207-210 (2002).
  36. Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M. The sequence read archive. Nucleic Acids Research. 39, D19-D21 (2011).
  37. NIH. GenBank Submission Portal Wizards. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/account/register/?back_url=/geo/submitter/ (2018).
  38. NIH. Submitting data. Available from: https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/geo/submission/ (2018).
  39. Shah, P. T., et al. Single-Cell Transcriptomics and Fate Mapping of Ependymal Cells Reveals an Absence of Neural Stem Cell Function. Cell. 173, 1045-1057 (2018).
  40. Anon, Method of the Year 2013. Nature Methods. 11, 1 (2013).
  41. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144, 3625-3632 (2017).
  42. Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq. Neuron. 96, 313-329 (2017).
  43. Zeigenhain, C., et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Molecular Cell. 65, (4), 631-643 (2017).
  44. Wu, A. R., et al. Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods. Nature Methods. 11, (1), 41-46 (2014).
  45. Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353, (6302), 925-928 (2016).
  46. Janes, K. A. Single-cell states versus single-cell atlases - two classes of heterogeneity that differ in meaning and method. Current Opinions in Biotechnology. 39, 120-125 (2016).
  47. Herman, J. S., Sagar,, Grün, D. FateID infers cell fate bias in multipotent progenitors from single-cell RNA-seq data. Nature Methods. 15, (5), 379-386 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics