التدقيق وظيفة مستقبلات النيكوتين أستيل شرائح المخ الماوس عن طريق التحلل الضوئي فلاش الليزر النيكوتين فوتواكتيفاتابل

Neuroscience
 

Summary

تقدم هذه المقالة طريقة لدراسة مستقبلات النيكوتين أستيل (ناتشرس) في الماوس شرائح الدماغ بالنيكوتين أونكاجينج. أونكاجينج النيكوتين عندما يقترن مع تسجيل التصحيح المتزامن المشبك والليزر 2-فوتون الفحص المجهري، يربط وظيفة مستقبلات النيكوتين مع مورفولوجيا الخلوية، توفير فهم أعمق لعلم الأعصاب اتروبين.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Arvin, M. C., Wokosin, D. L., Banala, S., Lavis, L. D., Drenan, R. M. Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine. J. Vis. Exp. (143), e58873, doi:10.3791/58873 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

أستيل (ACh) يعمل من خلال المستقبلات تعدل مجموعة متنوعة من العمليات العصبية، ولكنه قد تم تحديا لربط وظيفة مستقبلات ACh مع موقع سوبسيلولار داخل الخلايا حيث يتم تنفيذ هذه الوظيفة. لدراسة سوبسيلولار موقع مستقبلات ACh النيكوتين (ناتشرس) في أنسجة الدماغ الأصلية، وضعت أسلوب بصري للإفراج عن دقة النيكوتين في مواقع منفصلة بالقرب من أغشية الخلايا العصبية خلال التسجيلات الكهربية. فرضت التصحيح الخلايا العصبية في الدماغ شرائح مليئة بصبغ إلى تصور عن مورفولوجيا أثناء الليزر 2-فوتون الفحص المجهري، والنيكوتين أونكاجينج يتم تنفيذها مع فلاش خفيفة بتركيز شعاع ليزر نانومتر 405 قرب الأغشية الخلوية واحد أو أكثر. يتم قياس الانحرافات الحالية الخلوية، وصورة عالية الدقة ثلاثية الأبعاد (3D) من الخلايا العصبية المسجلة للسماح لمصالحة ردود ناشر مع مورفولوجيا الخلوية. يسمح هذا الأسلوب لتحليل مفصل لناشر التوزيع الوظيفي في الاستعدادات الأنسجة المعقدة، واعدة لتعزيز فهم اتروبين كبيرة.

Introduction

إشارات اتروبين ينظم العديد من عمليات الدماغ، بما في ذلك مراقبة أتينشونال وحركة مداركه، ومكافأة1،2. المخدرات التي تعزز انتقال أستيل (ACh) تستخدم لعلاج ضعف الإدراك المرتبطة بمرض الزهايمر، مما يعني ضمناً بدور هام لأنظمة اتروبين في الإدراك3. يمكن أن يؤدي تحسين فهم المستقبلات اتروبين والدوائر في الدول السليمة والمريضة إلى أفضل النهج العلاجي للعديد من الأمراض/الاضطرابات العصبية.

مستقبلات ACh النيكوتين (ناتشرس) هي عائلة من بوابات يجند أيون قنوات تدفق الاتصالات استجابة لمنظمة العمل ضد الجوع الذاتية أو الخارجية النيكوتين من منتجات التبغ. نظراً لأنهم كانوا من بين مستقبلات الناقل العصبي جداً الأولى أن يكون وصف4، ناشر علم الصيدلة والموقع في ألياف العضلات مفهومة جيدا لمستقبلات العضلات من نوع. وفي المقابل، نسبيا لا يعرف الكثير عن علم الصيدلة وتوزيع سوبسيلولار ناتشرس الأصلية في الدماغ. وتناول هذه الفجوة في المعرفة مؤخرا وضع تحقيق كيميائية رواية التي تسمح للتنشيط السريع وتقييد مكانياً من ناتشرس في أنسجة المخ أثناء التصوير بالهاتف الخلوي وتسجيل الكهربية5. هنا، يتم وصف الخطوات المنهجية الرئيسية التي تشارك في هذا النهج، مع الهدف العام المتمثل في تعزيز القدرة على الاتصال الدالة ناشر مع هيكل الخلايا العصبية.

فوتواكتيفاتابل النيكوتين (Nic السلطة الفلسطينية؛ واسم المادة الكيميائية: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-الأمينية] الكومارين-4-يل] الميثيل-النيكوتين) يمكن أن تكون فوتوليزيد مع ~ 405 نانومتر ومضات الليزر بكفاءة الإفراج عن النيكوتين5،6. قبل أونكاجينج، مستقرة في حل السلطة الفلسطينية-Nic والمعارض أي الميزات الدوائية أو الكيميائية الضوئية غير مرغوب فيه5. بعد التحلل الضوئي، ينشط النيكوتين المفرج عنهم كما هو متوقع ناتشرس ومشتقات أونكاجينج عقاقيري الخاملة5. يتم استخدام ليزر كونتينووسوافي كمصدر الضوء التحلل الضوئي مع قوة إخراج > 1 ميغاواط تقاس في العينة. عند المترجمة، تحفيز الصورة المستهدفة هو جنبا إلى جنب مع القدرة على تحديد موقع الأغشية الخلوية مع الليزر 2-فوتون الفحص المجهري (2PLSM)، واثنين من المزايا الرئيسية لهذا النهج هي الأكمل: سرعة التحلل الضوئي والدقة المكانية.

في معظم النواحي، التحلل الضوئي للسلطة الفلسطينية-Nic متفوقة على وسائل أخرى لإيصال يغاندس ناتشر المستقبلات داخل شرائح المخ. وتشمل هذه النهج حمام التطبيق7 والمخدرات المحلية التسليم عن طريق البخاخ ماصة8. بينما النهج السابق الذي يميل إلى المبالغة التأكيد على الآثار الطويلة الأجل للعقاقير التطبيقية، يمكن أن تعاني هذا النهج الأخير من تقلب في استجابة حركية بين المحاكمات وعبر الخلايا. أيا من هذه النهج البديلة يمكن التمييز على نحو كاف مستقبلات الأنشطة في مختلف المواقع الخلوية من العصبية نفسها. الإفراج عن أوبتوجينيتيكالي المنشط لمنظمة العمل ضد الجوع وقد استخدمت للتحقيق في ناتشرس الأصلية9،،من1011، ولكن لم تثبت ذلك مفيدة لرسم خرائط مواقع ناشر سوبسيلولار. وعلاوة على ذلك، اعتمدت معظم الدراسات استخدام هذا النهج على ماوس بكتيرية صبغي اصطناعي المعدلة وراثيا معربا عن ChR2 مع انتقال اتروبين الشاذ12،،من1314، 15 , 16 , 17.

السلطة الفلسطينية-Nic التحلل الضوئي غير النهج البصرية فقط لدراسة مستقبلات اتروبين. كارباتشول محبوس كان يستخدم لتعيين وظيفيا أنشطة مستقبلات ACh في الخلايا المستزرعة18 والدماغ شرائح19، ولكن لم تكن متاحة تجارياً للدراسات المقارنة أثناء تطوير السلطة الفلسطينية-nic. أ مكررا الروثينيوم (بيبيريديني)--أبلغ النيكوتين معقدة (روبي-النيكوتين) للسماح للنيكوتين أونكاجينج20، لكن التحضيرات التجارية روبي-النيكوتين أثبتت أنها أقل شأنا من السلطة الفلسطينية-Nic في مقارنة وجها لوجه دراسة5. قد يكون من المفيد تكرار مثل هذه التجارب المقارنة غير تجاري، الغاية تنقية روبي-النيكوتين، كما يمكن استيعابه مرئية مجاملة الميزات السلطة الفلسطينية-Nic للدراسات اتروبين. وأخيراً، nAChRs قد أيضا بصريا تحريف باستخدام مزيج من يغاندس صور التحويل ومستقبلات وراثيا21. وهذا النهج مكمل للسلطة الفلسطينية-Nic التحلل الضوئي في أنسجة المخ، مع القدرة/شرط الوراثية استهداف ناشر المعدلة التي ينظر إليها على أنها ميزة وعيب.

وينبغي ملاحظة العديد من المتطلبات الأساسية لهذا النهج. أولاً، يلزم أسلوب تصور مناسب لتحديد بدقة في غشاء الخلايا العصبية. تصوير مع الفحص المجهري التقليدي برنامج التحصين الموسع-الأسفار قد تكون كافية عند دراسة الخلايا المستزرعة، ولكن لتسجيل من الخلايا العصبية في الدماغ شرائح أو أنسجة سميكة الاستعدادات الأخرى، 2PLSM أو مجهرية [كنفوكل] شرط. ثانيا، مطلوب طريقة مناسبة لوضع شعاع الليزر التحلل الضوئي. ويستخدم هذا النهج رأس المزدوج-جلفانومتر المسح الضوئي مع اثنين من المرايا المستقلة س ص للمسح الضوئي النقطية التصوير شعاع ونقطة فوتواكتيفيشن باستخدام أونكاجينج الليزر شعاع22،،من2324. حلول محدودة أخرى، أكثر من الممكن، مثل (1) رأس واحد-جلفانومتر مسح أن يمسح النقطية بدلاً من ذلك التصوير شعاع وشعاع أونكاجينج، أو (2) ببساطة توجيه الحزم أونكاجينج إلى مركز مجال الرؤية مثل أن يوجه الخلية هذا الموقف للتحلل الضوئي فلاش. ثالثا، نظام مطلوب لتسجيل الكهربية المتزامنة إذا كان أحد يرغب في جمع الإشارات الفسيولوجية أثناء التجارب. يمكن تلبية الاحتياجات المذكورة أعلاه مع تقنية تصوير ضوئية-كل مناسبة، كما وصفت ذلك مؤخرا5. ويرد أدناه، بروتوكول مفصلة تصف الخطوات الرئيسية لهذا النهج.

Protocol

الأعمال المتصلة بإعداد شريحة الدماغ تم استعراضها والموافقة عليها بشمال غرب الجامعة رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (بروتوكول #IS00003604).

تنبيه: الليزر المستخدمة للصور-تحفيز نقطة هي الليزر IIIb الطبقة المرئية التي يحتمل أن تسبب ضررا للعيون. يتطلب 2PLSM ليزر (الجرد) "الدرجة الرابعة" بقرب من الأشعة تحت حمراء (> 500 ميغاواط)، مما ينطوي على احتمال التسبب في ضرر جسيم للعيون والحروق حتى في الأنسجة الأخرى. الاحتواء شعاع الليزر السليم، ونظام المتداخلة، بالإضافة إلى ضوابط هندسية وإدارية مطلوبة لضمان التشغيل الأمن لمعدات الليزر. دائماً البحث عن أفراد السلامة المحلية الليزر عندما تعمل بأشعة الليزر.

1. المعايرة والتحقق من Laser(s) أونكاجينج

  1. قياس قوة الليزر لتسليمها إلى العينة.
    1. قم بتشغيل 405 نانومتر الليزر (100 ميغاواط الحد الأقصى من الطاقة مع إشارة التحكم الخامس 5) والسماح للنظام بالليزر الحار لحوالي 10 دقيقة.
      ملاحظة: لا يزال هو أغلقت الليزر (مع 0 الخامس محرك) وليس هناك أي إنتاج الطاقة حتى يتم إرسال الليزر جهد تحكم لتعديل إنتاج الطاقة.
    2. ضع عداد طاقة في الطائرة عينة الأنسجة أو عوضاً عن العدسة مكثف. مركز متر بالنسبة للعدسة الضوئية المسار/الهدف يدوياً.
    3. تعيين المقياس إلى نطاق الطول الموجي الصحيح (400-1100 شمال البحر الأبيض المتوسط). صفر العداد بالاكتئاب على الزر المناسب.
    4. استخدام عناصر تحكم البرمجيات، حدد 100 (بحد أقصى 1000؛ 1000 = 5 الخامس) لقوة الليزر نانومتر 405، الذي يحدد الليزر إلى 10 في المائة من كامل السلطة. إذا رغبت في ذلك، يمكن أيضا تغذية الجهد التحكم الليزر إلى بريريفيو النظام عن طريق فولتاجيريكورد توفير سجل رقمي للأمر إشارة توقيت ومستوى الطاقة.
    5. سجل القراءة من مقياس الطاقة.
    6. حدد 150 (15% 1000 كحد أقصى) لإنتاج الطاقة الليزر 405 نانومتر وسجل في القراءة من مقياس الطاقة. كرر هذا للسلطات الإخراج التالية لجمع منحنى طاقة ليزر: 200، 250، 300، 350، 400، 450، 500، 550، 600، 650، 700، 750، 800، 850، 900، 950، و 1000.
  2. معايرة جالفانوميتيرس ليزر أونكاجينج. تنفيذ الخطوات التالية عندما يكون هناك تغيير للمكونات البصرية للنظام، كلما كان هناك قلق بشأن دقة تحديد المواقع الموضعية، أو بانتظام كل شهر.
    1. تثبيت 60 × غمس المياه مجهر الهدف العدسة التي سيتم استخدامها في فوتوستيموليشن وتجارب التصوير. في اقتناء/تصوير البرنامج، حدد 60 x عدسة الهدف وإعداد التكبير/تصغير بصري 1 (راجع الخطوة 3.1.4.2.).
    2. علامة دائرة شغلها إلى شريحة مجهرية زجاج نظيفة مع علامة حمراء دائمة. ضع الشريحة في مرحلة المجهر، مع علامة تجاه الهدف.
    3. قبل التركيز المجهر في منطقة العلامة الحمراء مع 4 x أو 10 x الهدف. إضافة 1-2 مل من الماء إلى أعلى النقطة العلامة الحمراء/المكان وثم التبديل إلى الهدف 60 x وتغرق الهدف في الماء. وتركز العدسة الهدف في منطقة علامة حمراء رقيقة.
    4. قم بالتبديل إلى المسح الضوئي الليزر 2-فوتون. لمعظم النظم، نقل برج لموقف #1، نقل المنشور ترينوكولار الخروج من مسار الضوء، نقل المرأة مسح الرأس إلى الجبهة، وتعيين الطول الموجي الليزر إلى ~ 900 نانومتر. حدد الخيار مربع 512 × 512 بكسل للمعلمات الحصول على الصورة، وهو العنصر الافتراضي بكسل لروتين المعايرة مرآة التحفيز.
    5. بدء تشغيل نظام المسح الضوئي مع قوة ليزر تصوير أكبر من الحد الأدنى وتهذيب التركيز الموضوعي على طبقة رقيقة من العلامة الحمراء الأسفار. اختر حقل في حقل fluorescence واضح من الحطام والمغلفة بالتساوي مع العلامة.
      ملاحظة: يستخدم برنامج الإعداد في هذا البروتوكول بريريفيو 5.4 اقتناء/التصوير البرمجيات.
    6. فتح الدالة أونكاجينج Galvo المعايرة ضمن القائمة أدوات – المعايرة/المحاذاة للبرنامج. المشي من خلال البرنامج التعليمي حرق البقع لمعايرة المكانية لزوج مرآة جلفانومتر الثانية.
      1. ضمن البرنامج التعليمي حرق البقع ، اختر 405 نانومتر الليزر، وحدد قوة تحفيز ليزر 400 مدة تحفيز السيدة 20 وهذا ينبغي أن تسفر عن الصغيرة (~ 1-5 القطر ميكرومتر) الثقوب في العلامة الحمراء.
        ملاحظة: إعدادات مثل ~ 2-4 ميغاواط و 1-10 مللي ثانية وتستخدم عادة، ولكنها تحدد الإعدادات العينة. السلطة الفلسطينية-Nic صور--تنشيط إعدادات الطاقة من المحتمل أن تكون أقل بكثير من الطاقة المطلوبة خلال المعايرة يجتذ حفرة مرئية في الشريحة العلامة الحمراء. هذا الروتين المعايرة مفيدة لتحديد موقع بقع فوتوستيموليشن ولكن لا ينبغي أن تستخدم لاستنتاج أحجام فوتوستيموليشن المطلقة خلال الاستجابات الفسيولوجية.
      2. حدد تحديث لتنشيط وتحديث الصورة بعد حرق البقعة المركز وانقل مؤشر أحمر جولة لموقع المكان الفعلي. القيام بهذا للبقعة المركز، والبقعة المركز اليمنى، والبقعة المركز السفلي، وأخيراً لشبكة مواقع التسعة (كافة زوايا وحواف زائد وسط الصورة).
        ملاحظة: الوسط واليمين، وأقل من المواقع بقعة تصحيحها تحديد الفولتية جلفانومتر التحفيز لتعريف المركز الحقيقي و X و Y تحجيم العوامل بحيث تتطابق مع زوج مرآة التحفيز على زوج مرآة تصوير. البرنامج سوف مقياس، وتحديث، جميع التجارب ماركبوينتس اللاحقة التي يؤديها في إعدادات التكبير/التصغير مختلفة من التكبير المعايرة المكانية.
    7. اختبار المعايرة بفتح نافذة ماركبوينتس وتفعيل يدوياً المعلمات التحفيز في spot(s) محددة في مجال جديد للعينة. التأكد من تحميل ملف المعايرة الصحيحة، وآخر في إطار ماركبوينتس . تنشيط ميزة ماركبوينتس/مجموعة أو سلسلة ماركبوينتس في spot(s) محددة أو الاستفادة من ميزة لايف/الاجتثاث اليمين/اليسار انقر بالماوس في أي مكان على الصورة أثناء يعيش المسح الضوئي لتطبيق اختبار النبض والتحقق من المعايرة الصحيحة.
      ملاحظة: ينبغي الآن تركزت حرق الليزر بقعة على مؤشر ماركبوينتس تماما.
    8. رصد وتسجيل تفعيل السلطة نبض الليزر والمدة الزمنية بالتنصت على إيقاف الجهد محرك الأقراص في برنامج فولتاجيريكورد (راجع الخطوة 1.1.4). وبالمثل، سجل موقف كل بقعة التحفيز باستخدام إشارة جهد المقاس من إشارات الملاحظات المستمدة من زوج المرايا جلفانومتر صور التحفيز.

2-إعداد فوتواكتيفاتابل النيكوتين (السلطة الفلسطينية-Nic)

  1. استرداد قاسمة للمخدرات فوتواكتيفاتابل المجففة بالتبريد من التخزين.
    ملاحظة: بروتوكول التالية محددة للسلطة الفلسطينية-Nic؛ ضبط حسب الحاجة لغيرها من المخدرات فوتواكتيفاتابل. على الرغم من أن السلطة الفلسطينية-Nic يوضح استقرار استثنائية5، اتخاذ الاحتياطات المعقولة لحمايتها من التعرض للضوء الساطع أثناء إعداد و/أو تجارب. يمكن تحقيق هذا عن طريق العمل ببساطة في ضوء منخفض؛ تقييد للضوء الأحمر المصفاة ليس ضروريا.
  2. أداء التطبيق المحلي للسلطة الفلسطينية-nic.
    1. سحب ميكروبيبيتي زجاج مع قطر افتتاح من 20-40 ميكرومتر مع ساحبة ماصة القابلة لبرمجة.
    2. تصفية ~ 1 مل من تسجيل الحل مع عامل تصفية 0.22 ميكرومتر. ريسوسبيند كمية من السلطة الفلسطينية-Nic في حل التسجيل التي تمت تصفيتها للعائد بتركيز نهائي 2 مم. على سبيل المثال، يحل قاسمة 100 نمول المجففة بالتبريد في 50 ميليلتر من حل التسجيل التي تمت تصفيتها.
      ملاحظة: يمكن الاطلاع على تكوين حل مقترح تسجيل في المنشورات الأخيرة5،6 توظيف السلطة الفلسطينية-Nic التحلل الضوئي.
    3. مرة أخرى--تعبئة ماصة التطبيق المحلي مع ميليلتر 50 مم 2 السلطة الفلسطينية-nic.
    4. تأمين ماصة التطبيق المحلي إلى حامل ماصة التي شنت على ميكرومانيبولاتور. قم بتوصيل حامل ماصة عبر أنابيب مناسبة نظام قذف ضغط قادرة على تطبيق الضغط المنخفض المطرد (1-2 رطل/بوصة مربعة).
    5. باستخدام ميكرومانيبولاتور، مناورة ماصة التطبيق المحلي إلى الحل التسجيل خارج الخلية وموقف نصيحة ماصة أعلى قليلاً من أنسجة المخ الماوس الموقع ~ 50 ميكرومتر من الخلية للفائدة. الرجوع إلى تقرير سابق لبروتوكول مفصل وإعداد شريحة الدماغ الماوس و تسجيلات المشبك التصحيح8.
    6. التحقق من معلمات التطبيق بالضغط بإيجاز (1-2 رطل/بوصة مربعة). ينبغي أن يكون هناك أدنى إلى تشريد لا خلية في الاهتمام. إذا تحدث حركة كبيرة، قم بتغيير موضع ماصة التطبيق المحلي كذلك بعيداً (في الاتجاه الأفقي و/أو المحوري) من الخلية للفائدة.
    7. بعد تحقيق خلية أسرة مستقرة التصحيح المشبك (التفاصيل التي ترد في منشور مسبق8)، قم بتشغيل تطبيق ضغط منخفض (1-2 المبادرة) استخدام رمز التبديل اليدوي مناسب على جهاز الإخراج الضغط. تشبع الأنسجة المحيطة بالخلية مع السلطة الفلسطينية-Nic لمدة 1-2 دقيقة قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
  3. أداء التطبيق حمام (سوبيرفوسيون) للسلطة الفلسطينية-Nic بشريحة الدماغ.
    1. تذوب كمية من السلطة الفلسطينية-Nic في وحدة تخزين تسجيل الحل المناسب للتعميم المستمر تسفر عن تركيز نهائي من 100 ميكرومتر. على سبيل المثال، يحل μmol 1 الكوة إلى 10 مل من محلول تسجيل استخدام أنبوب قياسية 15 مل.
    2. تبدأ إعادة تدوير لحل السلطة الفلسطينية-Nic بمعدل 1.5-2 مل/دقيقة عن طريق فتح التحكم بالانسياب المناسبة في نظام التروية. يحدث التعميم خلال مدة التسجيل. للحفاظ على قيمة المخدرات، التقليل من حجم المغلقة باستخدام أنابيب يبلغ قطرها داخلي الحد أدنى، و/أو بتقصير الطول الإجمالي للأنابيب المستخدمة في نظام التروية.
      ملاحظة: باتخاذ هذه الخطوات، يمكن تخفيض حجم الصوت لإعادة تدوير حمام إلى 5 مل من محلول Nic السلطة الفلسطينية. يمكن غالباً استخدام الحلول Nic السلطة الفلسطينية لمدة سنتين على التوالي تسجيل يوما في الأسبوع نفسه في حالة تخزين محمية من الضوء في 4 درجات مئوية.
    3. أثناء إعادة تدوير، باستمرار فقاعة الحل مع كاربوجين (5% O2، 95% CO2) والحفاظ على درجة حرارة الحمام 32 درجة مئوية.
    4. الاحتفاظ بشريحة الدماغ في تسجيل الحل أثناء العمل مع السلطة الفلسطينية-Nic في ظروف الإضاءة الخافتة.

3-تصوير الخلايا العصبية مع الليزر 2-فوتون الفحص المجهري

  1. تنفيذ التصور الحية للخلية.
    1. تحديد تصور خلية هابينولا الآنسي (محب) استخدام الضوء المنقولة أو التدخل التفاضلية الأشعة تحت الحمراء على النقيض من بصريات (الأشعة تحت الحمراء/DIC) وكاميرا فيديو وإنشاء تسجيل المشبك تصحيح خلية أسرة مستقرة. الإشارة إلى بروتوكول سابق للحصول على تفاصيل حول تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا العصبية في الماوس أعد حدة الدماغ شرائح8.
    2. بعد إنشاء مقاومة العالية (> 1 GΩ) المرفقة بخلية التكوين، ولكن قبل عملية الاقتحام، التبديل الإعداد والبرمجيات وضع المسح بالليزر.
    3. بعد عملية الاقتحام، استخدام المسح الضوئي الليزر للتحقق من أن صبغة تصوير (المخفف بتركيز نهائي من 100-200 ميكرومتر في حل ماصة داخل الخلايا قياسية الموصوفة سابقا8) هو صورة سلبية (بنشر) ملء العصبية. تسمح الصبغة (مثل أليكسا فلور 488 في ضوئي الأخضر أنبوب [PMT] القناة، PMT 2؛ أو أليكسا فلور 568 594 في القناة الحمراء PMT، PMT 1) لملء مقصورات الهاتف الخلوي لمالا يقل عن 20-30 دقيقة قبل محاولة التجارب التي تتطلب التصور أي مقصورات الهاتف الخلوي خارج سوما.
      ملاحظة: المقصورات القاصي (هياكل الجذعية، والعمود الفقري، ومحاور عصبية، إلخ.) قد تحتاج إلى 30-40 دقيقة لملء تماما25.
    4. استخدام البرمجيات وظيفة يعيش المسح الضوئي لتصور العصبية وحجرة سوبسيلولار للفائدة. اختر معلمات التصوير التي تسمح لدقيقة تعيش تصور ميزات الخلايا العصبية. التعامل مع إعدادات مختلفة تؤثر على أو تغيير عرض المرئيات (التباين) والقرار، نسبة (S/N) إشارة إلى الضوضاء، والصورة الإطار شراء الوقت:
      1. لوك آب-الجدول (طرفية المستعملين المحليين). فتح نافذة طرفية باستخدام الرمز المناسب على جانب أي نافذة الصورة. مرة واحدة مفتوحة، وضبط الكلمة طرفية (دقيقة) والحد الأقصى للإعداد (كحد أقصى) القناة صورة معينة لتعزيز التصور للتباين الإشارات التي تظهر على الشاشة. خفض الحد الأقصى لقيمة ~ 1000 (من أصل 4096، كشف 12-بت)، التي سوف تساعد على سحب باهتة إشارات عند البحث أولاً للخلايا، والإشارات، والهيكل.
        ملاحظة: تؤثر هذه الإعدادات فقط على إشارة المعروضة، عدم الكشف عن تسجيل القيم. عادة فقط العين البشرية يمكن جعل من النقيض إلى مستويات الرمادي ~ 5026.
      2. تكبير/تصغير بصري. استخدام عناصر تحكم البرمجيات لتحديد 1 X التكبير البصري واستخدام عناصر التحكم لتحديد المساحة المرغوبة في الأنسجة بالغسل. هذا إعداد التكبير/التصغير غلة ساحة أكبر، تفحص مجال الرؤية، ويرسل أكبر الزوايا الفولتية/المسح الضوئي، إلى مرايا جلفانومتر.
        ملاحظة: التكوين الافتراضي لمجال رؤية 12 ملم × 12 ملم داخل الرأس المسح الضوئي الذي يترجم إلى 12 مم مقسوماً على التكبير موضوعية داخل العينة. ولذلك، 60 × غلة عدسة الهدف الصور الممسوحة ضوئياً من 200 مليميكرون كل جانب في 1 x زوم بصري. مسح أعلى زوم بصري قيم أقل مساحة. هو 2 x التكبير البصري غالباً ما الإعداد الأكثر فائدة لتصور كل من الخلايا العصبية. 4 x يمكن أن تكون مفيدة لتصور جوانب سوبسيلولار من الخلايا العصبية.
      3. عدد من بكسل- لتكملة 1 x زوم بصري، حدد 1024 × 1024 بكسل لكل خط باستخدام عناصر التحكم في البرامج. تعيين العدد من بكسل لكل خط في الصورة الملتقطة والمعروضة لا تفقد التفاصيل الممكنة من العدسة والهدف. استخدام قيم بكسل العملية التالية لعلامة x 60/1.0 الفتحة العددية (غ) الهدف: 1024 × 1024 للتكبير 1 و 512 × 512 لتكبير 2 و 256 × 256 لتكبير 4. يجب أن يكون حجم بكسل نهاية (ميكرومتر ~0.17؛ 12 مم/التكبير/التكبير/بكسل) نصف أو أقل، القرار الجانبية تعرف بعدسة الهدف.
        ملاحظة: دقة وضوح الصورة فقط ويحدد الطول الموجي الليزر ونا موضوعية (0.4 ميكرون قرار من اثنين-فوتون متحمس [2PE] مع 920 شمال البحر الأبيض المتوسط، وهو هدف نا 1.0)27. المعايير للإثارة الكاملة نا، كما هو موضح في العدسة، هو أن كثافة المباريات قطر شعاع الليزر2 1/e (أو "يملأ") التلميذ مدخل (2 × أنبوب العدسة البعد البؤري x NA/التكبير) العدسة الهدف. أنبوب العدسة في النظام المذكور هنا بطول بؤري من 180 ملم.
      4. الوقت يسكن بكسل . استخدام عناصر تحكم البرمجيات لتحديد المايكروثانيه 4 مرة يسكن بكسل، قيمة افتراضية مفيدة.
        ملاحظة: تغيير الوقت يسكن بكسل لا يغير إشارة يعني الكشف عنها؛ يؤثر فقط على بكسل داخل في المتوسط، ويمكن تصور هذه التغيرات من خلال جودة الصورة عبر S/n. دائماً الوقت يسكن بكسل صورة متعددة من 0.4 المايكروثانيه وحدات، ويسكن أكبر مرات كثافة 12-بت-محدودة القيمة لكل بيكسل في الصورة هو متوسط العينات المايكروثانيه 0.4. نظراً لتحسن نسبة S/N كالجذر التربيعي لعدد العينات كل مرة يسكن بكسل (المايكروثانيه 4 يساوي عشر عينات، أو تحسين 3.16-fold في S/N)، يصل إلى التحسن الذي طرأ على نوعية الصورة تناقص الغلة لقيم أكبر بكثير من المايكروثانيه 12.
      5. مسح منطقة الاهتمام (ROI) وتناوب. ضبط زاوية الصورة بالتناوب 0° استخدام عناصر البرامج (أي إجراء قد يلزم، كما هو الإعداد الافتراضي لمعظم نظم التصوير من التناوب 0°). إذا كان يتم وضع العينة في اتجاه "رأسا"، حدد دوران 180° "انعكاس" الصورة.
        ملاحظة: تدوير الصورة، وفي أي زاوية معينة، يمكن أن توفر أفضل تناسب للمنطقة بأكملها من الاهتمام بخلية شغلها. يمكن أن تحقق التناوب أيضا صورة أكثر وضوحاً لمواءمة التغيرات الهيكلية وإجراء التحليل اللاحق. تحديد منطقة لمصلحة داخل الصورة الملتقطة بالماسح الضوئي في وضع تكبير معين (الخطوة 3.1.4.2) يحتفظ عدد البكسل الأصلي (الخطوة 3.1.4.3)، لكن التقييد في العدد الإجمالي للمنطقة وكسل يمكنها زيادة معدل الإطار، توفير تحسين الأزمنة التغييرات إشارة.
      6. الإطار المتوسط. حدد إعداد إطارات 2 باستخدام عناصر تحكم برنامج متوسط بداية إطار.
        ملاحظة: على النقيض من الصورة النهائية (S/N) يحددها الفوتونات الإجمالية المجمعة/الكشف عن داخل بكسل إشارة للصورة. في المتوسط من إطارات الصور متعددة يمكن تحسين نسبة S/N، شرط العينة لا تتحرك أو هو غير المبيضة أثناء التصوير. تظل الإشارة الواردة من مصلحة نفس القيمة خلال الإطار المتوسط بينما يتم تقليل الضوضاء في الصورة بالجذر التربيعي لعدد الإطارات في المتوسط. غالباً ما تتطلب هياكل صغيرة في الصور الفلورية في المتوسط بين الوكالات بكسل، الجمع بين البيكسل داخل الصورة (غالباً ما تسمى رويس)، و/أو الإطار المتوسط. إطار متوسط الزيادات المسح الضوئي الوقت بالعدد من الصور واحد يختار إلى متوسط.
    5. استخدام أدوات مراقبة عمومو التناوب المسح الضوئي، و تكبير/تصغير بصري لتوجيه الموقع عينة أثناء المسح. إذا كان التلاعب المرحلة الحركية اللازمة لموقف العينة، وتجنب أحجام خطوة كبيرة على المحور X و Y و Z لمنع الاصطدامات الهدف/مكثف أو الاهتزازات أو التعرض لأشعة الليزر على الأسطح العاكسة.
  2. جمع كومة Z. باستخدام أداة ض سلسلة ، حدد بدء والتوقف عن الموقف الذي يحتوي على الخلية التي تهم. حدد حجم خطوة (1 ميكرومتر) وثم التتالي الصورة العصبية في كل طائرة Z يحتوي على الخلية.
    ملاحظة: Z-مكدس الحصول على الإعدادات تختلف بين نوع الخلايا العصبية وملء صبغ. ينبغي أن تحدد المعلمات الأمثل لاقتناء Z-المكدس المستقل للمعلمات المستخدمة لتصوير مباشر. يمكن أن يؤديها اقتناء Z-المكدس قبل و/أو بعد تجارب أوبتوفارماكولوجي. إذا كان ذلك ممكناً، إجراء اقتناء Z-المكدس بعد أوبتوفارماكولوجي لتجنب أي ضرر الخلوية التي يتسبب فيها من 2PLSM، والسماح لملء صبغ المثلى من المقصورات الخلوية الصغيرة.

4-ليزر فلاش التحلل خلال التسجيلات الكهربية

ملاحظة: تطبيق 405 نانومتر أو 473 نانومتر الليزر صلاحيات ≥ 1 ميغاواط تنتج فسفورية داخل زجاج العدسات الهدف ومكثف. وعلى ضوء هذا الذي تم إنشاؤه مرتبط مباشرة بقوة الإضاءة الليزر؛ الانبعاث موجودة في windows الطيفية الأخضر والأحمر وإعمار الدولة متحمس في نطاق مرض التصلب العصبي المتعدد. ويعتبر هذه القطع الأثرية التحفيز الخلفية في اختبار جميع العدسات والعدسات الهدف غمس المياه من جميع الشركات المصنعة الكبرى للعدسات والهدف. إنتاج العدسات مكثف كثير فسفورية أعلى من الهدف العدسات. هذا "إشارة" يحفز استخدام الشدات الميكانيكية لحماية الزركونيم PMT فوسفيد (جاسب) زرنيخيد الغاليوم الحساسة أثناء الأحداث صور التحفيز. استخدام مصراع ميكانيكية عادة مغلقة (مغلقة عندما لا نشاط المسح الضوئي) يمثل أفضل حل لحماية تبريد "جاسب بمتس".

  1. لهندسة شعاع الساعة الرملية من نوع فوتوستيموليشن، إزالة أي عدسات التركيز في البصريات مسار الخفيفة التي خلاف ذلك ضيق/انقباض شعاع الليزر لأنه يدخل التلميذ مدخل موضوعي.
  2. باستخدام ماركبوينتس، حدد الإعداد بقعة واحدة.
    ملاحظة: إعدادات الصورة-التحفيز الأخرى (بقع متعددة، وشبكة من البقع، دوامة المسح الضوئي) ممكنة داخل ماركبوينتس. بقعة واحدة من أبسط. أهداف تجريبية والاختلافات البيولوجية قد تتطلب أجواء مختلفة.
  3. تحديث الصورة باستخدام خيار العيش المسح الضوئي للصورة بإيجاز وتحديد موقع منطقة سوبسيلولار للفائدة. دورياً بتحديث الصورة لتحديد أي الانجرافات الصغيرة المحتملة في التركيز.
  4. استخدام عناصر التحكم في البرامج لزيادة التكبير/التصغير البصري (أي، حدد إعداد التكبير/تصغير بصري أعلى من الحالي)، إذا لزم الأمر، تصور الهياكل الصغيرة (أي، العمود الفقري أو dendrites القاصي).
  5. ضع ماركبوينتس واحدة بقعة مرمى متاخم (ميكرو ~0.5) لغشاء الخلية. لا مكان الصور--التحفيز بقعة مباشرة عبر ميزة الهاتف خلوي، كهذا يمكن أن يؤدي إلى د.
  6. تعيين المعلمات من أجل تحفيز الصور باستخدام برامج عناصر التحكم في ماركبوينتس. تنطبق المبادئ التوجيهية البدء على النحو التالي: المدة 1-50 مللي ثانية، 1-4 ميغاواط طاقة الليزر، وإيه وان للمحاكمة.
  7. حدد تشغيل ماركبوينتس الشروع في بروتوكول ماركبوينتس ومراقبة الكهربية الحصول على البيانات في الوقت الحقيقي.
  8. كرر الخطوات من 4.2-4.7 مرات عدة تقييم الاتساق والاستقرار، أو عدم وجودها، استجابة السعة وحركية.

Representative Results

للتحلل من التحفيز، وجرعة التعرض (كثافة والوقت)، وموقع التعرض، وهندسة شعاع المتغيرات الرئيسية. النظام المذكور في هذه المادة قادر على الحزم فوتوستيموليشن مختلفة اثنين، قابل للتعديل عن طريق تحريك عدسة في الخارج من مسار الضوء فوتوستيموليشن قبل الشعاع يدخل النظام جلفانومتر. دون هذه العدسة، يملأ شعاع فوتوستيموليشن التلميذ مدخل من 60 x/NA 1.0 المياه ينخفض [60 س WD] الهدف، المنتجة قرب من-حيود محدودة، بقعة sub-ميكرومتر في المستوى البؤري داخل العينة. وهذا يرتبط مع فوتوستيموليشن الخفيفة مع شكل الساعة الرملية، تمتد أعلى وأسفل بقعة تنسيق متماثل مع المحور البصري. مع عدسة إدراجها في المسار، تركز في التلميذ مدخل العدسة الهدف ضوء الليزر فوتوستيموليشن وثم يخرج كشعاع الشبيهة بقلم رصاص. يمتد هذا الشعاع، التي من المتوقع أن تكون ~ 10 ميكرومتر في القطر هدفا س 60، موحد/عمودياً في جميع أنحاء العينة. في هذا الوضع، سوف تكون شدة الضوء في أي مكان معين داخل بقعة التحفيز ~ 1% كثافة بقعة صغيرة قرب حيود محدودة. وهكذا، أعلى الليزر القوى مطلوبة عادة عند استخدام ~ 10 ميكرون بقعة التحفيز. جميع التجارب التي ذكرت في هذا المقال، استخدمت شعاع الساعة الرملية من نوع فوتوستيموليشن.

يمكن رسم نموذج تسليم السلطة ضد الإعداد الجهد الكهربي للإدخال، وبعد قياس قوة الليزر على العينة باستخدام مقياس طاقة. استخدام هذه الدراسات 60 × الهدف WD مع مسافة عمل من 2 مم، ولكن هو لا المغمورة في المياه لقياسات الطاقة لتجنب الأضرار المحتملة لعنصر كاشف. عندما أهداف مع سرد نا > 0.95 تقاس في الهواء (بدون غمر السائل)، ويمكن أن يكون هناك انعكاس الداخلية مجموع الخسائر في عنصر عدسة الوجه الأمامي بسبب انخفاض مؤشر (الهواء). وفي هذه الحالة، لقياس قوة عينة أكثر دقة (لتصحيح لخسائر الانعكاس الداخلي الكلي)، زيادة القوة المقاسة من 1.0 نا موضوعية (1.0/0.95)2 تقاس في الهواء. ويبين الشكل 1a مؤامرة الإدخال/الإخراج نموذجي ل 405 نانومتر و 473 مرئية نانومتر الليزر التي تدمج الليزر إطلاق النظام في هذه الدراسة. نظم الليزر هذه تعتبر مثالية لمراقبة جرعة التعرض صور-التحفيز للأسباب التالية: (1) ومحسوبة مسبقاً لتوفير إنتاج الطاقة الخطية مباشرة بالنسبة للجهد الكهربي للإدخال (0-5 الخامس)، (2) أنها توفر عملية مصراع صامت (مع لا ليزر الإخراج)، و (3) لديهم السريع، sub-مرض التصلب العصبي المتعدد كثافة نبض مدة المراقبة (0.1 مللي استجابة). عند استخدام صور--تحفيز بقعة مع نظام ليزر/galvo، معايرة روتينية من البقع ماركبوينتس مهمة أساسية. الشكل 1b (اللوحة اليمنى) يوضح نظام الخروج من المعايرة (النقطة المطلوبة لحفز صور لا يؤدي التحفيز دقيقة من هذه النقطة، كما هو مبين بالموقع حرق حفرة)، مع عودة إلى الموضع الدقيق من البقعة بعد معايرة ( الشكل 1b، اللوحة اليمنى).

السلطة الفلسطينية-Nic الفلورسنت متواضعة (الانبعاثات ذروتها في ~ 510 نانومتر)، نستعرض الإثارة الفعالة بين 350-450 نانومتر (1-فوتون الإثارة) أو 700-900 نانومتر (2-فوتون الإثارة)5. لتصور Nic السلطة الفلسطينية أثناء التطبيق المحلي، تم تطبيق السلطة الفلسطينية-Nic (1 ملم) القرب من أنسجة المخ تليها تصوير متزامنة في سياق انتقال مقطعة الضوئية أنسجة الدماغ (1) عن طريق التباين دوت والأسفار (2) المنبعثة من الإثارة (900 نانومتر) من السلطة الفلسطينية-nic. السلطة الفلسطينية-Nic 2PE الأسفار كان يمكن كشفها بسهولة أثناء خروج الضغط من ماصة تطبيق محلي (الشكل 2a). النيكوتين ومونوالكيلكومارين، 7-كاربوكسيميثيلامينو-4-ميثيل الكومارين، هي أهم المنتجات الكيميائية الضوئية من رد فعل السلطة الفلسطينية-Nic التحلل الضوئي5. استخدام نفس إعدادات/المعلمات التي تم استخدامها للسلطة الفلسطينية-Nic التصوير التصوير، تم تصويرها الأنسجة أثناء الولادة من النيكوتين (1 مم) أو 7-كاربوكسيميثيلامينو-4-ميثيل الكومارين (1 مم). تم الكشف عن لا إشارة الفلورسنت (الشكل 2a، الألواح الوسطى والدنيا)، مما يدل على خصوصية نتائج السلطة الفلسطينية-Nic. أخيرا، تم تطبيق السلطة الفلسطينية-Nic داخل أنسجة المخ وتم تصويرها السلطة الفلسطينية-Nic fluorescence الانبعاثات (الشكل 2). هذا النهج يؤكد أن السلطة الفلسطينية-Nic الحالي داخل 100-200 ميكرون من ماصة التطبيق المحلي. وتؤكد هذه البيانات معا، أن فعالية يتم تسليم السلطة الفلسطينية-Nic لانسجة الدماغ عن طريق التطبيق المحلي.

التسجيلات الكهربية مع 2PLSM المتزامن للتصور الهياكل الخلوية يتطلب المحقق لاعتبارات التوازن لكل من مكونات التجربة، وكثيراً ما يتوفر إطار زمني ضيق (~ 20 دقيقة) لصالح نموذج الحصول على البيانات من خلية مصححة. دون النظر في التصور الخلوية، أفضل ممارسة لبدء تسجيل وقت ممكن بعد اقتحام لتسجيل استقرار يميل إلى الانخفاض مع مرور الوقت. بيد عند تصوير شرطا، يجب على اعتبارات الكهربية إتاحة وقت كاف لزيادة تركيز fluorescence في الهياكل الصغيرة/البعيد. ويتمثل ذلك بدراسة تركيز صبغ ملء منحنى28، التي في بعض الأحيان مفيدة لاشتقاق عند التصوير نوع خلية جديدة. ويبين الشكل 3 العديد من الخلايا العصبية مثال تصويرها مداخن Z عن طريق 2PLSM وانهارت في إسقاط أقصى شدتها لأغراض العرض. ويبين الشكل 3 ألف صور عالية الجودة حيث مورفولوجيا الخلايا العصبية ويبدو أن تكون كاملة وهو التقليل من الضوضاء، والحطام لا تتعارض مع التفسير مورفولوجيا الخلوية. ويبين الشكل 3b صور ذات جودة أقل، نظراً لأدنى إشارة إلى خلفية نسبة والحطام كبيرة. غالباً ما يظهر هذا الحطام جيوب كروية من الأسفار مكثفة، الناشئة عن قذف من التصوير صبغ من ماصة التصحيح أثناء اقتراب الخلية. جدير بالذكر أن إدراج 100 ميكرومتر السلطة الفلسطينية-Nic في الحمام (عند تنفيذ تطبيق حمام) يميل إلى خفض نسبة الإشارة إلى الخلفية ويؤدي إلى تباين الصورة دون المستوى الأمثل. 568 فلور أليكسا أو 594 غالباً مفيدة جداً في تجارب التطبيق المحلي كصبغة باحث أو إشارة مرجعية/تطبيع 2PE تطبيع. هو الطول موجي فعالة للإثارة فوتون اثنين من هذه الأصباغ ~ 780 نانومتر27، الذي يسمح بتصور المتزامن للسلطة الفلسطينية-Nic وتحديد المكونات الخلوية. هذا الطول الموجي، ومع ذلك، لا تماما تجنب التحلل الثاني-فوتون للسلطة الفلسطينية-Nic5. 488 فلور أليكسا مفيد في السلطة الفلسطينية-Nic حمام-تطبيق التجارب؛ عندما متحمس مع شمال البحر الأبيض المتوسط إيه ناين زيرو زيرو مناسبة للطول موجي، يمكن تجنب التحلل الثاني-فوتون للسلطة الفلسطينية-Nic5 مع الحفاظ على التصور مناسبة من مقصورات الهاتف الخلوي.

ويبين الشكل 4 بيانات المثال لليزر السلطة الفلسطينية-Nic المترجمة فلاش التحلل الضوئي في الخلايا العصبية محب شرائح المخ. الشكل 4a (لوحات العلوي) يظهر مثال لصورة "مرجع"، وهو القبض على شاشة من الصورة 2PLSM الماضي اتخذت قبل تشغيل بروتوكول ماركبوينتس ، مضافين مع موقع صور--تحفيز بقعة. الشكل 4a (لوحات الصورة السفلي) يوضح طريقة عرض zoomed من الصور--التحفيز بقعة مضافين في مورفولوجيا الخلوية. ويرد الاستجابة الكهربية يرتبط الوقت المطابق للتحلل الضوئي Nic السلطة الفلسطينية في الألواح السفلي من الشكل 4a. الأعمال السابقة أظهرت أن هذه التيارات حساسة لناشر الخصوم5. يبين الشكل 4 باء بيانات تمثيلية من خلايا مختلفة حيث أجرى التحلل الضوئي بقعة واحدة في فاصل زمني أما 1 s أو 10 س. بينما يسمح فاصل s 10 وقت الاسترداد كاف لخط الأساس عقد الحالي، فاصل s 1 أقصر أدت إلى الزيادة التدريجية في عقد الحالي كما شرع البروتوكول. المتزايدة الحالية تشير إلى أن النيكوتين لم يكن ما يكفي من الوقت لنزع فتيل بعيداً عن النظام مع الفاصل الزمني 1 هرتز29. إجراء مثل هذه الاستجابة الزمنية يجب أن تكون تحليلات حيثياته على أي نوع خلية جديدة قيد الدراسة، كما قد تختلف الأعصاب ناتشرس بين أنواع الخلايا.

Figure 1
رقم 1: معايرة الليزر فوتوستيموليشن- () صور--تحفيز الليزر إنتاج الطاقة. السلطة على الطائرة عينة (عن طريق علامة x 60/1.0 نا غمس المياه الهدف) تم قياس ل 405 شمال البحر الأبيض المتوسط وشمال البحر الأبيض المتوسط 473 صور--تحفيز الليزر في تحديد المخرجات المشار إليها. (ب) صور--تحفيز الليزر المعايرة. شاشة التقاط صور تظهر العلاقة المكانية بين بقعة التحفيز الصورة المقصودة وموقع المقابلة التي وقع فيها صور-التحفيز (حرق حفرة) قبل (يسار) وبعد معايرة قيد التشغيل (على اليمين) في ماركبوينتس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: التطبيق المحلي السلطة الفلسطينية-Nic. () "الكشف عن" السلطة الفلسطينية-Nic من محلي ماصة التطبيق. 1 ملم السلطة الفلسطينية-Nic ثانوي التحلل الضوئي أو النيكوتين كانت حله في قام تحميلها في ماصة تطبيق محلي والاستغناء على أنسجة المخ أثناء 2PLSM (900 نانومتر الإثارة) التصوير باستخدام نفس إعدادات التصوير لكل دواء. ليزر المسح دوت التباين انتقال الصورة يظهر الأنسجة/الماصة بينما تم استخدامه كاثود جاسب PMT لالتقاط الانبعاثات الأسفار. (ب) السلطة الفلسطينية-Nic (1 ملم) perfused في أنسجة المخ وتصويرها عن طريق 2PLSM كما هو الحال في () لإظهار انتشار الأفقي للسلطة الفلسطينية-Nic الأسفار مضمن باستخدام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: اقتناء الليزر 2-فوتون مسح الصور مجهرية. () Z 2PLSM الأمثل-المداخن. 2PLSM Z-المكدس أقصى شدتها الإسقاطات مثالان هو مبين للخلايا العصبية محب مع dendrites حل جيد والقليل من الحطام لا التدخل. (ب) دون المستوى الأمثل 2PLSM Z-مكدسات. يتم عرض مثالين 2PLSM Z-المكدس أقصى شدتها إسقاطات لمحب الخلايا العصبية محاطة بالحطام (صبغ طردوا من الماصة أثناء نهج الخلية). هذه الصور أكثر صعوبة تفسير الصور مثل تلك المبينة في (). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: الليزر فلاش التحلل من السلطة الفلسطينية-nic. () المرجع ماركبوينتس الصور والتيارات إلى الداخل أثارت من قبل السلطة الفلسطينية-Nic التحلل الضوئي. لواحد محب العصبية، تظهر الصور مرجع الخام ماركبوينتس صور--تحفيز المحاكمات في مكان واحد خلوية (المشار إليها). لاحظ أن لبعض مواقع الصور-التحفيز (الصورة أقصى اليمين في هذه السلسلة)، هيكل الجذعية في التركيز، لكن ليست سوما وتغصن الدانية. أسفل كل صورة مرجع، يتم رسم الحالي النيكوتين إلى الداخل أونكاجينج--أثارت. (ب) الحوافز بين الفواصل الزمنية للسلطة الفلسطينية-Nic التحلل الضوئي. تظهر تسجيلات أنموذج للخلايا العصبية مهب النيكوتين فيها أونكاجيد مرارا وتكرارا في نفس المكان بيريسوماتيك مع فاصل زمني بين تحفيز 1 s أو 10 س. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

اختيار أسلوب التطبيق/تسليم السلطة الفلسطينية-Nic هو الخطوة الأكثر أهمية في هذه التقنية المترجمة صور-التحفيز. أسلوبي، وتطبيق حمام ونضح المحلية، كل تقدم مزايا متميزة والقيود. الاختيار إلى حد كبير يتأثر مستوى التعبير الفنية ناتشر في الخلية نوع من الفائدة. أنها غالباً ما يفضل استخدام حمام التطبيق عندما تكون مستويات التعبير الفنية العالية، كما يسمح التطبيق حمام لتركيز تحقيق موحدة المحيطة بالخلية مسجل، تيسير تفسير البيانات. تطبيق حمام أيضا يلغي الحاجة إلى ماصة نضح ثانية في الأنسجة، مما يجعل من الأسهل العملية برمتها. ومع ذلك، المركبات تطبيق حمام مكلفة التكاليف أكثر كل تجربة.

عادة، استكشاف الأخطاء وإصلاحها ينطوي على محاولة لفهم لماذا هو تنشيط ناشر لا ينظر التحلل فلاش التالية. عند العمل مع نوع خلية التي لم تدرس سابقا مع السلطة الفلسطينية-Nic، المحقق ينبغي أداء التطبيق نفخة المحلي لمنظمة العمل ضد الجوع أو النيكوتين تحديد ما إذا كانت مستقبلات كافية وظيفيا عن5. وينبغي أن يتم للتحقق من أن النظام قادر على الكشف عن استجابات التحلل الضوئي، تجارب التحكم في الخلايا العصبية هابينولا الآنسي التي تعبر عن كميات كبيرة من مستقبلات30. في هذا المجال الدماغ، والسلطة الفلسطينية-Nic حمام التطبيق الممكن، وهو الأفضل لإجراء التجارب على التحقق من صحة. إلا بعد إجراء هذه التجارب التحقق من الصحة يجب أن واحد الانتقال إلى نوع خلية تدرس. إذا كان قد تم التحقق من صحة النظام التجريبي والردود تبقى صغيرة جداً أو غير قابلة للكشف، فإنه قد يكون هناك مبرر لزيادة تركيز السلطة الفلسطينية-Nic، وزيادة كثافة فلاش أو مدة النبضة، إضافة المغير ناشر اللوستيريك إيجابية لتعزيز ناشر النشاط6، أو مزيج من هذه.

في بعض الأحيان، الردود أونكاجينج كبيرة جداً، مع تنشيط ناشر كبير أدى إلى الجهد غير المباشرة بوابات نا+ قناة التنشيط والتيارات إلى الداخل أونكلامبيد سبب المشبك الفضاء الفقراء. يمكن القضاء على هذه التحف التي تماما تحجب التيارات ناشر إلى الداخل واستحالة تفسير البيانات، بإدراج QX-314 (2 مم) في ماصة التسجيل. قد أيضا القضاء بالحد من تركيز السلطة الفلسطينية-Nic أو بتخفيض كثافة فلاش أو مدة النبضة. في جميع التجارب التي صور الضوء المرئي-التحفيز، يجب توخي الحذر عند اختيار مواقع التحفيز لتجنب التحفيز/التحلل غير مقصودة لأعلى أو أسفل المستوى البؤري المطلوب. بالإضافة إلى ذلك، وعندما ينطبق، قوة الليزر يجب دائماً أن تيتراتيد استخراج الاستجابات الفسيولوجية. من المهم خصوصا أن تكون على علم فوتوستيموليشن محور ع عند العمل مع يغاندس محبوس، يغاندس التي يتم تنشيطها أعلى/أسفل بقعة التنسيق قد لا يزال منتشر والتفاعل مع النظام البيولوجي (أي مستقبلات، ) في إطار الدراسة.

السلطة الفلسطينية-Nic الليزر فلاش التحلل الضوئي قد لا تكون مناسبة لجميع المحققين، كما توجد قيود عديدة. الأول هو التكلفة العالية نسبيا لهيكل مناسب. عند العمل مع شرائح المخ سليمة، أونكاجينج قرب الهياكل الصغيرة-قطر مثل dendrites يتطلب نظام تصور متطورة مثل مجهر 2-فوتون. وبصرف النظر عن التكلفة العالية Ti:sapphire، الانضباطي الليزر نبضات الأشعة تحت الحمراء للمنفذ 2-فوتون مجهرية، نظام مزدوج-جلفانومتر قادر على المواقع بشكل مستقل اثنين من أشعة الليزر كذلك يزيد من تكلفة النظام. يمكن تخفيض تكاليف النظام الكلي باستخدام نظام الصنع إذا كان المحقق لديه ما يكفي من الخبرة والوقت لبناء واستكشاف الأخطاء وإصلاحها، والمحافظة على هذا نظام. القيد ثاني غالباً ما ينطوي على التعبير الفنية ناشر منخفضة، مما يمكن التخفيف جزئيا عن طريق اتخاذ الخطوات كما هو مذكور أعلاه، ولكن هذا قد لا تضمن النجاح. عادة، إذا كان أحد لا يمكن قياس التيارات يجند تفعيلها بعد نفخة-تطبيق يضع، السلطة الفلسطينية-Nic فلاش التحلل تحت المشبك الجهد قد لا تعطي نتائج مقبولة. القيد ثالث ينطوي الجوهرية الأسفار للسلطة الفلسطينية-Nic nic. السلطة الفلسطينية تمتص الضوء ~ 405 نانومتر وتنبعث في مجموعة مماثلة كالبروتينات الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء) أو أليكسا 4885. عندما تتجاوز تركيزات السلطة الفلسطينية-Nic ~ 1 مم، هذه الخاصية الأسفار يمكن جعلها صعبة في نفس الوقت تصور الهياكل العصبية. للتخفيف من هذا، المهم أن تكون قادرة على السيطرة على تدفق السلطة الفلسطينية-Nic من ماصة التروية بسهولة. بشكل دوري، أوقف تدفق السلطة الفلسطينية-Nic للسماح لجزيئات الفلورسنت لنزع فتيل بعيداً. وهذا يسمح بإعادة التصوير من العصبية للتحقق من موقف بقعة من شعاع أونكاجينج. القيد الرابع محتملة أن أذكر ينطوي على استخدام 405 نانومتر الضوء للتحلل الضوئي. أطوال موجية أقصر مثل 405 نانومتر أكثر عرضه للتشتت في الأنسجة المعقدة مثل شريحة الدماغ. وهكذا، في كثافة فلاش معين والمدة، أونكاجينج استجابة ستريك وحركية تسوس قد الأثران تتأثر بعمق التركيز أونكاجينج داخل الشريحة. استنتاجات بشأن الجوانب البيولوجية nAChRs ينبغي أن تراعي هذا تحذير هام.

واستخدمت هذه التقنية فلاش التحلل الضوئي الليزر مترجمة مؤخرا للكشف عن تفاصيل جديدة حول ناشر علم الأعصاب. على سبيل المثال، يعزز التعرض المزمن النيكوتين بيريسوماتيك والدالة ناتشر الجذعية في الخلايا العصبية هابينولا الآنسي5. كما كان يستخدم للمساعدة في توضيح، للمرة الأولى، أن منطقة تيجمينتال البطني غلوتامات الخلايا العصبية تعبر عن ناتشرس الوظيفية في بيريسوماتيك ومقصورات الخلايا الجذعية6. وهناك العديد من إمكانات المستقبل يستخدم هذا الأسلوب والنهج الذي يمكن أن تطبق على أنواع العصبية الرئيسية الأخرى أن من المعروف أن ناتشرس صريحة، مثل الخلايا العصبية الهرمية القشرية31 أو إينتيرنيورونس في قشرة الدماغ32، المخطط33 ، وقرن آمون19. يمكن أيضا الجمع بين هذه التقنية الجينات الصيدلة و/أو ناتشر تحرير34 ترجمة مستقبلات محددة الأنواع الفرعية للأقسام العصبية المختلفة. هذا النهج يمكن تكييفها بسهولة للمركبات الأخرى قفص الكومارين، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر، تلك التي وضعت بالتوازي مع السلطة الفلسطينية-Nic5. أخيرا، السلطة الفلسطينية-Nic فلاش التحلل يوم ستستخدم في حيوان مستيقظا يتصرف لدراسة العمل للنيكوتين في نماذج الرواية الصيدلة السلوكية.

Disclosures

D.L.W. يخدم كمستشار مدفوعة "الفحص المجهري Fluorescence نانو بروكر".

Acknowledgments

يشكر المؤلفون أعضاء المختبر من المحققين الرئيسيين شمال غرب التالية: درينان ريان، دال جيمس سورمير، يفجينيا كوزوروفيتسكيي، وأنيس المقاول. بتأييد هذا العمل لنا الوطنية معاهد للصحة (المعاهد الوطنية للصحة) (منح DA035942 و DA040626 إلى R.M.D.)، ومؤسسة PhRMA (زمالة M.C.A.)، و HHMI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instruments, Consumables, and Miscellaneous Chemicals
Multiclamp 700B Molecular Devices Corp. Patch clamp amplifier
Pneumatic Picopump World Precision Instruments PV820
Micropipette puller Sutter Instrument Co P-97
Temperature Controller Warner Instruments TC-324C
Vibrating blade microtome Leica Biosystems VT1200S
Ultrafree-MC Centrifugal Filter MilliporeSigma UFC30GV0S internal solution filter
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instruments 1B150F-4 patch and local application pipette
(-)-Nicotine hydrogen tartrate salt Glentham GL9693 nicotine salt
7-carboxymethylamino-4-methyl coumarin Janelia Research Campus PA-Nic by-product
1-[7-[bis(carboxymethyl)- amino]coumarin-4-yl]methyl-nicotine Janelia Research Campus PA-Nic
Euthasol (Pentobarbital Sodium and Phenytoin Sodium) Virbac ANADA #200-071
Alexa FluorTM 488 Hydrazide ThermoFisher A10436 green fill dye
Alexa FluorTM 568 Hydrazide ThermoFisher A10437 red fill dye
6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594) Janelia Research Campus red fill dye
QX 314 chloride Tocris 2313 voltage-gated sodium channel blocker
Power Meter  ThorLabs S120C
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals for Solutions
N-Methyl-D-glucamine Sigma M2004
Potassium chloride Sigma P3911
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma S9638
Sodium bicarbonate Sigma S6014
HEPES Sigma H3375
D-(+)-Glucose Sigma G5767
(+)-Sodium L-ascorbate Sigma A4034
Thiourea Sigma T8656
Sodium pyruvate Sigma P2256
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma 230391
Calcium chloride dihydrate Sigma 223506
Sodium chloride Sigma S9625
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma E3889
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt Sigma A9187
Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate Sigma G8877
Name Company Catalog Number Comments
Components of 2-Photon Microscope
 Ultima Laser Scanner for Olympus BX51 Microscope Bruker Nano, Inc. imaging software and galvos
    Imaging X-Y galvanometers Cambridge Technology
        Mai Tai HP1040 Spectra-Physics Tuneable IR laser
            Pockels cell M350-80-02-BK with M302RM Driver Conoptics, Inc. for IR laser attenuation
                Integrating Sphere Photodiode Power Sensor Thorlabs, Inc laser power pick-off photodiode
    Uncaging X-Y galvanometers Cambridge Technology
        Helios 2-Line Laser Launch Bruker Nano, Inc. uncaging laser components
            OBIS LX/LS 405 nm (100 mW) Coherent, Inc.
            OBIS LX/LS 473 nm (75 mW) Coherent, Inc.
            Point-Photoactivation / Fiber Input Module for Limo Sidecar - Uncaging Bruker Nano, Inc.
Name Company Catalog Number Comments
Upright Microscope  Olympus BX51WIF Upright microscope chasis
    Objective: Olympus M Plan FL 10x; NA 0.3 WD 11 mm  Olympus 10x objective
    Objective: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR  Olympus 60x water-dipping objective
    X-Cite 110, four-LED LLG coupled epi-fluorescence light source Excelitas Technologies LED Light Source
        Epi-Fluorescence Filter: ET-GFP (FITC/CY2) for Epi-Turret Chroma Technologies LED Filter for blue light excitation
        Epi-Fluorescence Filter: ET-DsRed (TRITC/CY3) for Epi-Turret Chroma Technologies LED Filter for green light excitation
    B&W CCD camera; Watec, 0.5 in B/W CCD Watec Co., LTD. CCD camera for patch clamp recording
Name Company Catalog Number Comments
External Detectors - Dual Reflected Emission - Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP) Bruker Nano, Inc.
    Multi-alkali side-on PMT Hamamatsu R3896 red channel PMT
        595/50m Chroma Technologies red channel emission filter
            565lpxr Chroma Technologies dichroic beam splitter
    GaAsP end-on PMT Hamamatsu 7422PA-40 green channel PMT
        525/70m Chroma Technologies green channel emission filter
            High-Speed Shutter for Hamamatsu H7422 PMT Vincent Associates / Bruker 517329 PMT shutter mount
Name Company Catalog Number Comments
Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module Bruker Nano, Inc.
    Multi-alkali side-on PMT Hamamatsu R3896 Dodt PMT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, C., et al. Cholinergic tone in ventral tegmental area: Functional organization and behavioral implications. Neurochemistry International. 114, 127-133 (2018).
  2. Sarter, M., Parikh, V., Howe, W. M. Phasic acetylcholine release and the volume transmission hypothesis: time to move on. Nature Reviews Neuroscience. 10, (5), 383-390 (2009).
  3. Coyle, J. T., Price, D. L., DeLong, M. R. Alzheimer's disease: a disorder of cortical cholinergic innervation. Science. 219, (4589), 1184-1190 (1983).
  4. Katz, B., Thesleff, S. A study of the desensitization produced by acetylcholine at the motor end-plate. Journal of Physiology. 138, (1), 63-80 (1957).
  5. Banala, S., et al. Photoactivatable drugs for nicotinic optopharmacology. Nature Methods. 15, (5), 347-350 (2018).
  6. Yan, Y., et al. Nicotinic Cholinergic Receptors in VTA Glutamate Neurons Modulate Excitatory Transmission. Cell Reports. 23, (8), 2236-2244 (2018).
  7. Engle, S. E., Shih, P. Y., McIntosh, J. M., Drenan, R. M. α4α6β2* nicotinic acetylcholine receptor activation on ventral tegmental area dopamine neurons is sufficient to stimulate a depolarizing conductance and enhance surface AMPA receptor function. Molecular Pharmacology. 84, (3), 393-406 (2013).
  8. Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. Local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices. Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  9. Ren, J., et al. Habenula "cholinergic" neurons co-release glutamate and acetylcholine and activate postsynaptic neurons via distinct transmission modes. Neuron. 69, (3), 445-452 (2011).
  10. Koppensteiner, P., Melani, R., Ninan, I. A Cooperative Mechanism Involving Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors and Retrograde Activation of GABAB Receptors in Interpeduncular Nucleus Plasticity. Cell Reports. 20, (5), 1111-1122 (2017).
  11. Zhang, J., et al. Presynaptic Excitation via GABAB Receptors in Habenula Cholinergic Neurons Regulates Fear Memory Expression. Cell. 166, (3), 716-728 (2016).
  12. Chen, E., et al. Altered Baseline and Nicotine-Mediated Behavioral and Cholinergic Profiles in ChAT-Cre Mouse Lines. The Journal of Neuroscience. 38, (9), 2177-2188 (2018).
  13. Nagy, P. M., Aubert, I. Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter increased acetylcholine release in the hippocampus. Neuroscience. 218, 1-11 (2012).
  14. Ting, J. T., Feng, G. Recombineering strategies for developing next generation BAC transgenic tools for optogenetics and beyond. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 111 (2014).
  15. Crittenden, J. R., Lacey, C. J., Lee, T., Bowden, H. A., Graybiel, A. M. Severe drug-induced repetitive behaviors and striatal overexpression of VAChT in ChAT-ChR2-EYFP BAC transgenic mice. Frontiers in Neural Circuits. 8, 57 (2014).
  16. Kolisnyk, B., et al. ChAT-ChR2-EYFP mice have enhanced motor endurance but show deficits in attention and several additional cognitive domains. The Journal of Neuroscience. 33, (25), 10427-10438 (2013).
  17. Nagy, P. M., Aubert, I. Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter enhances dendritic complexity of adult-born hippocampal neurons and improves acquisition of spatial memory during aging. Neurobiology of Aging. 36, (5), 1881-1889 (2015).
  18. Denk, W. Two-photon scanning photochemical microscopy: mapping ligand-gated ion channel distributions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, (14), 6629-6633 (1994).
  19. Khiroug, L., Giniatullin, R., Klein, R. C., Fayuk, D., Yakel, J. L. Functional mapping and Ca2+ regulation of nicotinic acetylcholine receptor channels in rat hippocampal CA1 neurons. The Journal of Neuroscience. 23, (27), 9024-9031 (2003).
  20. Filevich, O., Salierno, M., Etchenique, R. A caged nicotine with nanosecond range kinetics and visible light sensitivity. Journal of Inorganic Biochemistry. 104, (12), 1248-1251 (2010).
  21. Tochitsky, I., et al. Optochemical control of genetically engineered neuronal nicotinic acetylcholine receptors. Nature Chemistry. 4, (2), 105-111 (2012).
  22. Wokosin, D. L., Squirrell, J. M., Eliceiri, K. W., White, J. G. Optical workstation with concurrent, independent multiphoton imaging and experimental laser microbeam capabilities. Review of Scientific Instruments. 74, (1), 193-201 (2003).
  23. Plotkin, J. L., Day, M., Surmeier, D. J. Synaptically driven state transitions in distal dendrites of striatal spiny neurons. Nature Neuroscience. 14, (7), 881-888 (2011).
  24. Galtieri, D. J., Estep, C. M., Wokosin, D. L., Traynelis, S., Surmeier, D. J. Pedunculopontine glutamatergic neurons control spike patterning in substantia nigra dopaminergic neurons. Elife. 6, (2017).
  25. Yasuda, R., et al. Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments. Science STKE. (219), pl5 (2004).
  26. Inoue, S., Spring, K. Video microscopy: The fundamentals. 2 edn, Plenum Press. 163-186 (1997).
  27. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21, (11), 1369-1377 (2003).
  28. Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength ratioing. Biophysical Journal. 78, (5), 2655-2667 (2000).
  29. Wathey, J. C., Nass, M. M., Lester, H. A. Numerical reconstruction of the quantal event at nicotinic synapses. Biophysical Journal. 27, (1), 145-164 (1979).
  30. Shih, P. Y., et al. Differential expression and function of nicotinic acetylcholine receptors in subdivisions of medial habenula. The Journal of Neuroscience. 34, (29), 9789-9802 (2014).
  31. Verhoog, M. B., et al. Layer-specific cholinergic control of human and mouse cortical synaptic plasticity. Nature Communications. 7, 12826 (2016).
  32. Koukouli, F., et al. Nicotine reverses hypofrontality in animal models of addiction and schizophrenia. Nature Medicine. 23, (3), 347-354 (2017).
  33. Xiao, C., et al. Chronic nicotine selectively enhances α4β2* nicotinic acetylcholine receptors in the nigrostriatal dopamine pathway. The Journal of Neuroscience. 29, (40), 12428-12439 (2009).
  34. Peng, C., et al. Gene Editing Vectors for Studying Nicotinic Acetylcholine Receptors in Cholinergic Transmission. European Journal of Neuroscience. (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics