Zebrafish 애벌레에 음식 감염에 대 한 차량으로 Protozoan Paramecium caudatum 를 사용 하 여

Immunology and Infection
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Summary

Zebrafish (Danio rerio) 널리 사용 된 척추 동물 모델 미생물 식민과 병에 대 한 되 고 있다. 이 프로토콜 zebrafish 애벌레에 식품을 매개로 감염에 대 한 차량으로 Paramecium caudatum protozoan의 사용을 설명합니다. P. caudatum 쉽게 박테리아를 유입 하 고 애벌레 zebrafish 자연 먹이 행동에 의해 촬영 얻을.

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Flores, E., Thompson, L., Sirisaengtaksin, N., Nguyen, A. T., Ballard, A., Krachler, A. M. Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (143), e58949, doi:10.3791/58949 (2019).

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Abstract

그들의 투명성, 유전 추적성 및 유지 보수의 용이성, zebrafish (Danio rerio) 전염병은 널리 사용 되는 척추 모델 되고있다. 애벌레 zebrafish 자연스럽 게 단 세포 protozoan Paramecium caudatum에 먹이. 이 프로토콜 애벌레 zebrafish의 식품을 매개로 감염을 위한 차량으로 P. caudatum 의 사용을 설명합니다. P. caudatum internalize 다양 한 박테리아와 세균성 세포는 몇 시간 동안 실행 가능한 유지. Zebrafish P. caudatum에 다음 먹이, 세균성 부하 foregut paramecium 차량 소화 시에 출시 하 고 박테리아는 창 자를 식민지. 프로토콜은 paramecia와 먹이로 paramecia 유지 보수, 박테리아, 로드 세균성 저하 및 복용량, 물론 zebrafish의 감염에 대 한 자세한 설명이 포함 되어 있습니다. 음식을 매개로 감염의이 방법 사용의 장점은 밀접 하 게 인간의 질병에서 감염의 모드를 모방, 침수 프로토콜에 비해 보다 강력한 식민지로 연결을 다양 한 병원 균의 연구를 수 있습니다. Zebrafish 모델에서 식품을 매개로 감염 호스트, 호스트 병원 체 상호 작용, 및 pathogenicity 세균 부담, 지역화, 배포 및 사망률 등의 세균성 유전자 발현을 조사 하기 위해 사용할 수 있습니다.

Introduction

Zebrafish 공유 형태학 상으로 그리고 기능적으로 granulocytic 계보 (예: 호 중구), monocyte/대 식 세포와 같은 세포, 수용 체 통행세 같이, 프로 염증 성 cytokines 그리고 항균 펩 티 드1 포함 한 포유류와 기능 보존 . Zebrafish에 장로 6 일 게시물 수정 (dpf)에 완벽 하 게 개발 되 고 형태학 및 기능 보존 장 상피 세포에 있는 보존된 transcriptional 규칙 등 포유류 위장와 함께 보여줍니다. 2. 이것은 제 브라 장내 미생물 식민과 병에 대 한 우수한 모델. 다양 한 장의 미생물 enterohemorrhagic3 대장균, 비 브리 오 cholerae4,5, 살 모 넬 라 enterica6, zebrafish 모델에서 공부는 zebrafish microbiota7,8, 그리고9장의 면역 probiotics의 역할. 뚜렷한 zebrafish 모델의 장점은 그것 혼합된 미생물 인구3, 의 맥락에서 미생물 행동의 조사를 수 있는 내 생 microbiota를 방해 하지 않고 많은 미생물에 의해 식민지는 6. 목욕 침수, zebrafish 세균성 정지 시간10의 특정 금액에 대 한 인 큐베이 팅에 의해 위장 식민과 질병의 대부분 zebrafish 모델 미생물의 관리에 의존 하는 현재. 그러나,이 어려운 관리, 박테리아의 정확한 복용량을 결정 하 고 특히 비 병원 성 박테리아와 일부 미생물과 제한 된 식민지에 이르게. 또한, 세균 현 탁 액은 구강11를 통해 물고기를 관리 하지만 이것이 기술적으로 도전적이 고 더 오래 된 애벌레 및 성인 물고기.

이 프로토콜 zebrafish 애벌레의 위장 요로에 미생물의 식품을 매개로 배달 차량으로 단 세포 protozoan Paramecium caudatum 의 사용을 설명합니다. Paramecia 간편 하 고 저렴 한 유지 하 고 미생물, 조류, 곰 팡이, 박테리아, 그들은 ciliated 구두 홈12,13,14을 통해 내 면화 등의 다양 한에 먹이의 할 수 있다. 일단 내 면, 박테리아는 그들에서 개최 되는 결국 시 어 지 다 하 고 목차 몇 시간15시간 프레임 저하는. 애벌레 zebrafish paramecia 자연 먹이로 빨리 후에 부 화, 약16, 온도 따라 3-4 dpf 캡처하고 높은 효율으로 그들을 차지 합니다. 먹이 붙 잡음의 과정 검색에서 평균 1.2 s에17, 잡으려고 하 고 캡처된 paramecia zebrafish foregut에 소화 신속 하 게 내 면된 가능한 박테리아는 창 자3에 출시 되는. 그 결과, paramecia zebrafish의 위장 요로에 박테리아의 높은 하 고 일관 된 복용량을 제공 하는 빠르고 쉬운 방법으로 사용할 수 있습니다. 배달 된 박테리아 중 mCherry 같은 형광 단백질을 표현 하는, 여기에 설명 된 대로 변형 될 수 있다 또는 그들은 유전으로 다루기 힘든 박테리아의 경우 미리 내에서 시각화 수 있도록 형광 염료와 스테인드 수는 위장 요 로입니다.

이 프로토콜에 설명 합니다 enteropathogenic 대장균 의 식품을 매개로 전달 (enterohemorrhagic E. 콜라 [EHEC] 및 부착 침략 대장균 [AIEC]), 그리고 ssp. 살 모 넬 라 enterica Typhimurium. 병원 성 대장균S. typhimurium 전송 통해 분 변-구강 경로18,19, 그리고 획득 을 통해 오염 된 음식, 고기, 야채, 유제품 등을 수 있습니다. P. caudatum 를 사용 하 여 차량으로, 대장균S. typhimurium 성공적으로 식민지 화 paramecium 차량 공동 보육의 30-60 분 이내 zebrafish 애벌레. 달성된 세균성 부담 충분히 강력한 시각화 식민 조직 homogenates를 도금 하 여 부담을 결정 하는.

Protocol

Zebrafish 관리, 번 식, 그리고 여기에 설명 된 실험 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드를 따라 하 고 텍사스 대학 보건 과학 센터, 프로토콜의 기관 동물 복지 위원회에 의해 승인 되었습니다. 숫자 AWC-16-0127입니다.

1. 성장 및 Paramecia 의 유지 보수

  1. 소스 Zebrafish 국제 리소스 센터 (ZIRC) 등에서 라이브 paramecia 문화를 가져옵니다.
  2. Paramecia 문화, 1에서 resuspended는 대장균 MG1655 문화 (광학 밀도 OD600 1.0-2.0)의 1 mL의 1 mL을 추가 라이브 성장 문화에서 x E3 (0.29 g/L NaCl, KCl, 13 mg/L 44 mg/L CaCl2, 81 mg/L MgSO4 0.48 g/L HEPES, pH 7.0, 살 균), 그리고 1의 8 mL 10ml 조직 배양 플라스 크로 x E3. 가볍게 소용돌이 22 ° c.에 저장
  3. 문화를 유지 하려면 2 주마다 10를 포함 하는 신선한 1 x E3 매체의 9 mL와 10 mL 조직 배양 플라스 크에 paramecia 문화의 1 mL 통로8 CFU/mL 대장균 MG1655 1에 resuspended의 x E3.

2. 세균성 복용량 Zebrafish에 관리의 결정

  1. Paramecium 내에서 세균 반감기를 결정
    참고: 아래 설명 된 대로 paramecia 내의 박테리아의 반감기 도금 paramecium에서 복구 가능한 대장균 에 의해 결정 됩니다.
    1. 박테리아 (OD600 1.0) 22 ° C에서 paramecia와의 2 h 인큐베이션, 다음 paramecia와 50 mL 원뿔 튜브로 세균성 공동 문화를 결합, E3, 그리고 수 x 1와 paramecia 세척 (아래 단계에서 설명 하는 대로 밀리 리터 당 paramecia의 수 3.2.7 고 3.2.8)입니다.
    2. Paramecia의 수를 세 후 paramecia 및 세균성 공동 문화 (6 h 사후 노출)에 대 한 매시간 50 µ L을 제거 하 고 신선한 1.5 mL 튜브에 각 샘플을 추가 합니다.
    3. 1% 비 계면 활성 제의 장소 950 µ L ( 재료의 표참조) 인산 염에 버퍼링 (PBS) 염 1.5 mL 튜브와 1 분은 paramecia을 lyse 소용돌이의 각. 수행 하는 1시 10분 희석 액 (900 µ L 즉, 100 µ L)으로 살 균 PBS를 사용 하 여 각 샘플의 희석.
    4. 선택적 접시에 각 희석의 100 µ L 플레이트 (파운드 tet 매체: 30 µ g/mL 항생물질, 1 g/L NaCl, 0.5 g/L 효 모 추출 물, 1 g/L tryptone)와 16 h 37 ° C에서 품 어. 다음 날, 계산 하 고 계산만 분리 되 고 명료한 개인적인 식민지에 의해 접시 (콜로 니 형성 단위, CFUs)에 세균성 식민지의 수를 기록 합니다. 30-300 CFU 주는 희석으로 접시를 식별 합니다.
    5. 희석을 결정 요소 사용. 예를 들어 1 µ L 세균성 문화의 살 균 PBS의 99 mL와 혼합 하는 경우이 1: 100 (0.01) 희석입니다. 이 번호는 희석에서 CFU의 수 있을 것입니다. 원래 샘플의 CFU를 결정 하기 위해 모든 시간 지점에 대 한 아래, 계산을 수행:
      Equation 1
    6. 계산 가능한 대장균수를 그래프/paramecium에 해당 하는 시간 노출 단계 3.3.1 계산 paramecia 농도 사용 하 여 게시 하 고 paramecia (그림 1) 내 반감기를 결정 합니다.
    7. CFU를 사용 하 여 계산 하 고 그래프의 paramecia 농도 단계 3.3.1에서에서 계산을 사용 하 여 x 축에 시간 게시물 보육 대 y paramecium 당 가능한 대장균 수 수 각 시간 지점에 대 한 계산. paramecia 내 반감기를 결정 합니다.
  2. 세균성 세균성 하프 라이프에서 투약 하 고 먹이 속도 결정 합니다.
    참고: 세균성 복용량을 결정 하는 paramecia 안에 박테리아의 반감기와 paramecia에 zebrafish의 먹이 비율 고려 되어야 해야 (단계 3.4 참조).
    1. 다음 수식을 사용 하 여 paramecia 내의 세균성 감퇴를 결정.
      (1)Equation 2
      N0 paramecia 당 박테리아의 초기 수량 2 h 부 화 후가 Nt는 시간 t 후 나머지 수량, τ 후 실행 가능한 박테리아의 수는 절반으로, 시간 이며 k는 붕괴 상수.
    2. 저하 실험에서 붕괴 상수 k 세균 하프 라이프를 사용 하 여 결정 (즉, 시간 후 실행 가능한 박테리아/paramecium의 금액은 절반 가까이 떨어졌다).
      (2)Equation 3
      하프 라이프의 결정에 대 한 용어 Equation 4
      (3) Equation 5 또는
      (4)Equation 6
      참고: 그림 1을 바탕으로, paramecia에 대장균 의 반감기는 약 2.3 h 이다. 따라서, 수식 (4), 감퇴 율, k를 사용 하 여, 대장균 은:
      (5)Equation 7
    3. Zebrafish 애벌레에 의해 촬영 가능한 박테리아 (Nt)의 복용량을 찾을 반감기 실험에서 감퇴 율 (k)를 결정 후 먹이 시간 (t), (P)은 먹이 속도 또는 시간 당 한 물고기에 의해 먹 히는 paramecia의 수:
      (6) Equation 8 또는
      (7)Equation 9
      참고: 그림 1, 2 h 인큐베이션 (t) 후 paramecia (N0) 당 박테리아의 초기 수량 790 CFU입니다. 영화 1그림 2, 먹이 속도 (P) 1539입니다.
    4. 이러한 값을 사용 하 여 방정식 (7)에, 다음으로 2 시간 보육 제 브라에서 세균성 복용량을 계산:
      (8)Equation 10

3. 음식을 통한 감염 Zebrafish의

  1. Paramecia와 박테리아를 품 어.
    1. Paramecia 및 대장균 MG1655의 공동 문화 감염 전에 밤을 준비 합니다. E3 미디어의 8 mL, 지속적인 paramecia 문화의 1 mL 및 대장균 MG1655 문화의 1 mL (OD600 = 1.0) 1에서 resuspended T25 조직 배양 플라스 크에 x E3. 하룻밤 실 온 (RT)에서 플라스 크를 품 어. 각 치료 상태에 대 한 paramecia의 2 개의 플라스 크를 준비 합니다.
    2. 세균성 성장 미디어 접종 (파운드: 1 g/L tryptone 0.5 g/L 효 모 추출 물, 1 g/L NaCl) 박테리아의 전염 성 긴장, 접시에서 개별 세균성 식민지를 선택 하 여 사용 하 여 살 균 접종 루프. 37 ° C에 액체 문화를 품 어 고 하룻밤 분 (rpm) 당 110 회전에서 흔들어 둡니다.
      참고: 개인 보호 장비 (실험실 코트와 장갑)을 착용 해야 하 고 전염 성 요원을 처리할 때 사용 해야 하는 biosafety 수준 2 시설.
    3. 다음 날, 하룻밤 문화의 OD600 을 측정 합니다. 문화 미디어의 11 ml에서 resuspended 때 1의 OD600 달성 하는 데 필요한 볼륨을 계산 합니다.
    4. Paramecia의 g 5 분, 각 플라스 크에 대 한 하나의 볼륨 x 6000에 원심 분리를 통해 단계 3.1.2에서에서 박테리아의 볼륨을 수확. 상쾌한 삭제 하 고 E3 미디어의 1 mL에서 세균 펠 릿 resuspend.
    5. 필요에 따라 사전에 형광 염료와 박테리아 얼룩.
      1. FM 4 64FX 세균성 얼룩 (5 mg/mL 재고 솔루션)의 1 µ L를 추가 합니다. 커버 호 일 photobleaching에서 보호 하 고 회전 이상 끝 RT에서 15 분 동안 품 어 튜브.
      2. 1 세척 하 여 과잉 염료를 제거 x E3: 작은 박테리아 원심 분리를 통해 6000 x g 1.5 분에서 다음 E3 미디어의 1 mL에 펠 릿을 resuspend. 두 번 세척 단계를 반복 합니다.
      3. 수확 스테인드 박테리아 원심 분리를 통해 6000 x g 5 분 삭제에는 상쾌한 고 E3 미디어의 1 mL에서 세균 펠 릿 resuspend.
    6. 신선한 paramecia의 두 개의 플라스 크의 각 세균 정지의 1 mL를 추가 합니다. 2 h RT에서 품 어.
      참고: 얼룩진된 박테리아를 사용 하는 경우 2 시간에 대 한 실시간에 어둠 속에서 품 어.
  2. 워시 박테리아/paramecia 공동 문화입니다.
    1. 50 mL 원뿔 튜브에 paramecia/박테리아 공동 문화의 두 플라스 크의 내용을 결합 합니다. 10 분에 대 한 15 ° C에서 300 x g 에서 원심 분리기 샘플은 원심이이 단계 전에 미리 냉각 있는지 확인 합니다.
    2. E3 상쾌한 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여의 약 10 mL을 제거 하 고 신선한 1의 약 10 mL를 추가할 원뿔 튜브에 x E3.
      참고: 모든 세척 단계 동안 되려고 매우 빠른 상쾌한, 제거는 paramecia 펠 릿에서 수영 하기 시작 것입니다 필수적입니다. 회전 하 고이 단계에서 충분 한 빠른 처리를 위해 한 번에 하나의 튜브에서 상쾌한 제거는 상쾌한에 paramecia의 손실을 방지.
    3. 5 분 약 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 e 3 상쾌한의 제거에 대 한 샘플 원심 분리를 통해 15 ° C에서 300 x g에서 회전 하 고 신선한 1의 약 10 mL를 추가할 원뿔 튜브에 x E3. 이 단계를 두 번 반복 합니다.
    4. 5 분에 대 한 15 ° C에서 300 x g 에서 원심 분리기 샘플 약 10 mL는 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 복용 E3 상쾌한의 제거.
    5. E3 미디어의 나머지 10 mL에 펠 릿을 resuspend 하 고 새로운 1.5 mL microcentrifuge 관으로 현 탁 액의 500 µ L를 전송. Paramecia의 수를 계산 하는 5 분에 대 한 300 x g 에서 centrifuging에 의해 paramecia의 500 µ L를 작은.
    6. 500 µ L 샘플에서 표면에 뜨는 E3의 400 µ L을 제거 합니다. Paramecia의 나머지 100 µ L를 36.5% 포름알데히드 용액의 20 µ L을 추가 하 고 부드럽게 resuspend, 및 22 ° c.에 5 분 동안 품 어
      참고: 이 단계는 세 수 있도록 paramecia를 죽인다.
    7. 피 펫 및 레코드를 사용 하 여 실제 총 볼륨을 측정 합니다. Paramecia 서 스 펜 션 1:1 v/v 0.4 %trypan 블루 솔루션을 희석.
    8. 사용 하 여 셀 또는 hemocytometer 죽은 paramecia/mL의 수를 계산 하.
      참고: 사전 정착 단계 때문에 대부분 paramecia 죽은 시점에서, 하지만이 숫자는 라이브 paramecia 공동 배양 실험에 대 한 수를 반영. 저자가 여기 요인으로 무시 될 수 있다 그래서 세균성 공동 화, 때문에 중요 한 paramecia 죽음을 발견 하지 않았습니다.
  3. 공동 Paramecia 그리고 zebrafish 애벌레를 품 어.
    1. Paramecia의 농도 계산.
      Equation 11
      Equation 12
      참고: 이 계산 단계의 3.2.5 50 mL 원뿔 튜브에 paramecia의 농도 제공합니다.
    2. E 3의 3 mL의 최종 볼륨에서 2 x 105 paramecia/mL의 농도에 필요한 세척된 paramecia의 볼륨을 계산 합니다.
      참고: Paramecia의 농도 최적화는 원하는 세균성 복용량에 따라 조정할 수 있습니다.
    3. 제 브라 paramecia (계산 단계에서의 적절 한 농도 포함 하는 신선한 E3의 3 mL의 총 볼륨으로 6 잘 플레이트의 각 음에 100 mg/l. 전송 10 zebrafish의 최종 농도를 100 mM Tris pH 8.0에서에서 tricaine를 추가 하 여 anesthetize 3.3.2). 그들은 받는 사람 잘 마 취에서 회복 되도록 액체의 최소한에 애벌레를 전송 확인.
    4. 먹이 대 한 최적의 번개 조건 되도록 하루 빛 조건에서 일주 인큐베이터에 2 h 30 ° C에서 품 어.
    5. 워시 zebrafish 전송 물고기는 새로운 잘 포함 3 mL 신선한 E3 때마다 100 mg/L tricaine를 포함 하 여 5 회 이상.
      참고: 세척 단계는 tricaine를 생략 하지 마십시오. 마 취 없이 모바일 애벌레 전송 손상 동물 조 난의 위험이 증가 합니다.
    6. 선택적으로, 준비 zebrafish 이미징 블랙 벽 6 잘 플레이트에서 1% 낮은 용융 agarose의 3 ml에서 zebrafish를 포함 하 여: 낮은 용융 agarose 1xE3에서 구성 하 고 전자 레인지에서가 열. 일단 녹은, 160 mg/mL의 최종 농도에 tricaine를 추가 합니다. 잘린된 젤 팁, 머리는 왼쪽 꼬리에가 로드를 사용 하는 stereomicroscope에서 위치 생선은 오른쪽 (그림 3). Agarose 설정 하려면 5 분 기다립니다 다음 이미징 1 x E3 포함 160 mg/mL tricaine와 함께 포함 된 물고기를 오버레이 합니다.
  4. 먹이 속도 결정 합니다.
    참고: 아니 별도 실험 먹이 속도 결정 하도록 설정 해야 합니다. 오히려,이 해질 수 있다 단계 3.3.4, 아래 설명 된 대로.
    1. 3.3.4 단계 먹이 zebrafish 먹이 캡처의 stereomicroscope 및 캡처 영상 볼.
    2. 점수는 영상. 먹이 캡처 먹이 향해 zebrafish의 눈에 띄는 특징 이다. 비록이 단지 근사 각 공격 한 먹이 캡처 이벤트로 계산 ( 내용참조).
    3. 각각 다른 zebrafish 애벌레 (그림 2)을 나타내는 여러 개의 비디오 클립에서 시간 당 먹이 캡처 이벤트의 평균 개수를 계산 합니다.

Representative Results

Paramecium caudatum 는 쉽게 저장 그들에 박테리아의 넓은 범위를 유입. 세포내 세균 밀도 박테리아 및 공동 문화, 사용 하는 세균 종에 있는 paramecia의 밀도에 따라 달라 집니다. 시간이 지나면서, 그들은 시 어 지 다 및 세균성 저하 ensues. 속도 저하의 사용 하는 모든 종자에 대 한 개별적으로 확인할 수 있다. 병원 성 대장균, 초기 세균 밀도 790 박테리아 /paramecium및 박테리아는 약 2.3 h (그림 1)의 반감기를 가진 타락 한.

Figure 1
그림 1: paramecia에 세균성 하프 라이프의 결정. (A) 다음 2 h 공동 보육의 전염 성 대장균, P. caudatum 와 세척 되었고 박테리아 없이 매체에 전송. 숫자 표시 시간 지점에서 가능한 대장균 의 세포 선택적 agar에 희석 도금에 의해 결정 되었다. 결과 의미의 평균 ± 표준 오차 (SEM, n = 3). Paramecium의 (B) 일반적인 이미지 내 면 밝은 필드 (Bi), 형광 박테리아 (Bii), 박테리아 및 채널 (Biii)를 병합. 눈금 막대 20 μ m =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

또한, zebrafish 먹이 속도, 즉, 어떤 zebrafish에 속도 internalize 공동 보육에 박테리아 로드 paramecia, 공부 했다. 비록 그것은 발견 했다, 애벌레의 개발 가속 30 ° C에서 발생 하 고 동물 먹이 행동 4 dpf에서 표시 애벌레 zebrafish 사냥 하 고 먹이 5 dpf20에서 캡처 시작 합니다. 먹이 행동20 (그림 2A), 눈에 띄는 특성과 먹이 비율의 결정은 가정을 기반으로 각 파업 한 paramecium의 국제화에 이르게이 간주만 수는 근사 ( 내용참조). Zebrafish 애벌레 먹이의 여기 설명 된 관측에 기초를 두어, paramecia 통풍 관 비율은 h (그림 2B) 당 약 1,539 이다.

Figure 2
그림 2: 제 브라 먹이 비율의 결정. (A) 표시는 제 브라 paramecia 형광 박테리아를 들고에 먹이 하는 유 충 (5 dpf) 먹이 비디오에서 스틸 이미지. [초] 시간입니다. 화살표는 눈에 띄는 하는 동안 운동의 주요 축을 나타냅니다. 먹이 속도 (시속 paramecia 섭취), 부 량 (B) n에 따라 = 10 동영상 전체 2 시간 노출 시간 점령. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Paramecia의 국제화, 다음에서 zebrafish 효율적으로 소화 시스템에 전염 성 박테리아를 방출 foregut에 먹이 저하 됩니다. 여기에 설명 된 대로 paramecia 저하 진행 신속 하 게, 그리고 무료 박테리아 먹이의 30 분 이내 창 자에서 검출 될 수 있다. 박테리아 무료 다음 이동은 foregut에서 중반-후부 및 내장 탐지는 먹이 (그림 3)의 시작 후 약 1-2 h. 소장에서 세균 지 종 및 복용량 범위에 따라 여러에서 E. coliS. enterica몇 일. S. enterica localizes 일부 상피 침공 (그림 3D)과 장 거칠어에 주로 상피 (그림 3C)에 호 중구의 침투에 지도.

Figure 3
그림 3: 박테리아와 제 브라의 식민. Zebrafish 5 dpf에 감염 되지 않은 (A) 왼쪽 또는 mCherry (B) 대장균 또는 (C) S. enterica표현으로 식민지. 감염 실험 야생 타입 (AB) 생선이 나 유전자 변형 라인에서 수행할 수 있습니다 (예를 들어, 라인 안내 (MPO::EGFP) 나114 (C)에 표시 된 녹색 형광 neutrophils 표현. 직장 여는 화살표가 표시 됩니다. 전체-마운트 포함된 애벌레 감염 된 살 모 넬 라 enterica 감염에서에서 장 섹션의 (D) 높은 확대. () 블루 Hoechst 핵, (Dii) 보라색 표시 = phalloidin (Diii) 레드 F 걸 표시 = = 살 모 넬 라, (Div) 병합. 눈금 막대 5 μ m를 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Movie 1
영화 1: 먹이 캡처 비디오 푸티지. 이 비디오를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

여기에 설명 된 기본 프로토콜 병원 성 대장균, 최적화 하 고 성공적으로 살 모 넬 라 enterica비 브리 오 cholerae다른 세균 종에 대 한 적응 되었습니다. 다음 목욕 침수, 일부 살 모 넬 라 enterica 긴장 등 일부 anaerobes zebrafish 창 자 식민지 하지 않는 일부 종족에 대 한 식품을 매개로 감염 여기에 설명 된 대로 사용할 수 있습니다 성공적으로 식민지를 설립. 애벌레의 창 자에 높은 세균성 짐이 설정도, microgavage에 비해 식품을 매개로 감염 기술적으로 덜 도전 이며 덜 전문된 장비가 필요 합니다. 그러나, 세균성 종 및 긴장 사용할 수에 대 한 중요 한 매개 변수를 최적화 합니다. 이러한 요소가 포함 박테리아 paramecium 공동 문화 단계에 대 한 박테리아와 paramecium 밀도: paramecia 내의 세균 숫자 낮은 경우에,이 공동 문화 단계에서 세균 밀도 증가 시켜 향상 될 수. 일부 세균성 종 paramecium 호스트 손상 될 수 있습니다 그리고이 현미경 검사 법에 의해 평가 되어야 합니다.

이 프로토콜에서 또 다른 중요 한 요인은 제 브라 먹이 캡처입니다. 먹이 속도 여기에 설명 된 대로 모든 먹이 캡처 한 paramecium의 섭취에 결과 공격 하는 가정에 근거한 다. 물고기 당 paramecia의 높은 밀도 높은 먹이 속도 보장 하는 프로토콜에 사용 됩니다. 그러나, 먹이 캡처 시스템에서 paramecia의 밀도에 따라 달라 집니다 그리고 매우 희석 paramecium 문화에서 먹이 요금 시간21,22당 13-15 paramecia로 낮은 수 있습니다. 한계는 먹이 캡처 속도 또한 조명 조건에 그리고 어둠 속에서 강하게 의존, 캡처 요금은 80% 낮은 조명 조건에서21 와이 해야 고려해 실험을 설정할 때 보다. 먹이에 노출 시간 최적화 식민 확장 될 경우, 고려 보조 노출 배설물을 통해 박테리아에 게 있다. -2 h 먹이 노출-위에서 설명한 조건 하에서이 노출 때문에 박테리아의 소화 관 통과 시간 1 시간 이상 차량에는 박테리아의 농도 배설물에 보다 훨씬 더, 이다. 그러나, 먹이 노출 시간이 크게 증가 하 고,이 중요 한 요소가 될 수 있습니다.

먹이 비 병원 성 대장균 을 포함 하는 paramecia와 다음 zebrafish의 식민지를 포함 하 여이 프로토콜에 적절 한 컨트롤을 포함 한다 MG1655. 여러 개의 세균성 긴장 zebrafish 호스트를 식민지로 그들의 능력에 대 한 비교 하는 경우 그것은 paramecia 내의 그들의 반감기는 여부를 테스트 하는 것이 중요. 세균성 돌연변이, 세포 벽 무결성 또는 산 감지, 타협 포함 paramecia 내의 세균 안정성 손상 시킬 수 있습니다. 이러한 경우, zebrafish 먹이 복용량에 차이 대 한 계정 조정 해야 합니다.

여기에 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 세균성 식민지와 조직 homogenate3, zebrafish 당 CFU 여 뿐만 아니라, 위에서 설명한 대로 zebrafish의 세균성 식민을 이미징 하 여를 포함 하 여 그 결과 조사 하 수 또는 감염 관련 질병 률 및 사망률을 조사. 이상적으로, 세균의 시각화를 위한 mCherry 등 형광 단백질 또는 빨간색 형광 성 단백질 (RFP)를 표현 하는 세균성 긴장 사용 되어야 한다. 이 세균성 인구 성장의 시각화 수 있게 됩니다. 만약 세균성 긴장은 유전자 세공 또는 형광 단백질 식의 사용은 다른 이유로 배제, 박테리아 수 있습니다 얼룩이 질 FM 4-64FX, 같은 형광 염료와 paramecia와 공동 문화 사전. 여기 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 때 paramecia와 공동 문화는 염료의 밝기를 감소 하지 않습니다 고 얼룩진된 박테리아 zebrafish 내장에서 명확 하 게 볼 수 있습니다. 그러나, 염료 zebrafish 호스트 내에서 발생 하는 중요 한 세균 확산 해야 시간이 지남에 희석 될 것입니다. 두 경우 모두, 레드-형광 박테리아는 녹색 형광 박테리아에 바람직 조직 autofluorescence 빨강 채널에 보다 녹색으로 높은 될 수 있기 때문.

이 프로토콜에 대 한 적용할 수 있습니다 발견 되었습니다 에어로빅 microaerophilic 세균성 종. 이 실험적으로 시험 될 남아 있지만 포자와 균 종, 먹이 대 한 적응 수 있습니다.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리는 원고에 중요 한 읽기 및 의견에 대 한 Krachler 그룹의 구성원에 게 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 UT 시스템 스타 상, BBSRC, NIH (R01AI132354)에 의해 투자 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paramecium caudatum, live Carolina 131554 no not store growing cultures below room temperature
0.4% Trypan Blue Solution  Sigma T8154-20ML liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture; prepared in 0.81% sodium chloride and 0.06% potassium phosphate, dibasic
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma 276855-100ML store in a solvent safety cabinet
Escherichia coli, MG1655 ATCC ATCC 700926 can be replaced by any other non-pathogenic E. coli strain
FM 4-64FX stain Thermo Fisher F34653 aliquot and store frozen
Formaldehyde Sigma F8775-4X25ML
LB Broth Sigma L3397-1KG
Phosphate buffered saline tablets Thermo Fisher 18912014
Tetracycline Sigma 87128-25G toxic, irritant
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) Sigma E10521-10G
Triton X-100 Sigma X100-100ML
Trypan Blue Solution, 0.4% Sigma 93595-50ML
UltraPure Low Melting Point Agarose Thermo Fisher 16520050
hemocytometer or cell counter any
stereomicroscope any
table-top centrifuge
microwave
rotator wheel
heated shaking incubator
aquatics facilities
breeding tanks

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References

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