Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium rhizogenes-감자의 변환 중재와 거 스 얼룩에 의해 Suberin 유전자의 발기인 활동

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Summary

여기, 우리 감자 식물을 변환 하는 데 두 프로토콜을 제시. Agrobacterium tumefaciens 변환 Agrobacterium rhizogenes 야생 타입 촬영 자체 전파 될 수 있는 유전자 변형 털 뿌리를 생성 하는 동안 완전 한 유전자 변형 식물에 지도 한다. 우리는 다음 변환 된 뿌리에 얼룩이 지 거 스 여 발기인 활동 감지.

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Fernández-Piñán, S., López, J., Armendariz, I., Boher, P., Figueras, M., Serra, O. Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining. J. Vis. Exp. (145), e59119, doi:10.3791/59119 (2019).

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Abstract

Agrobacterium sp. 그것이 능력을 전송 하 고 식물의 게놈으로 통합 하는 그것의 자신의 T-DNA 유전자 변형 식물을 얻기 위해 가장 널리 사용 되는 방법 중 하나입니다. 여기, 선물이 감자 (푸른 풀밭 tuberosum) 식물 유전자 수정 두 변환 시스템. A. tumefaciens 변환에서 잎에 감염 하 고 변환 된 셀이 선택 된 새로운 완전 한 변환된 공장 18 주에 phytohormones를 사용 하 여 다시 생성 됩니다. A. rhizogenes 변환, 줄기에 바늘으로 박테리아를 주입 하 여 감염 하 고 새로운 등장된 변환된 털 뿌리는 빨간색 형광 마커를 사용 하 여 검색 한 변형 비 뿌리 제거 됩니다. 5-6 주, 결과 공장에서는 완전 개발된 변형된 털 뿌리는 야생 타입 촬영의 합성입니다. 바이오 매스를 증가, 변형 된 털이 뿌리는 excised 고 자체 전파 될 수 있습니다. 우리는 그것이 suberin 생 합성 유전자 발기인에 의해 주도 거 스 취재 원 유전자를 표현 하는 뿌리를 모두 Agrobacterium-중재 변환 방법 적용. 거 스 얼룩 절차 제공 되 고 발기인 유도의 셀 지역화를 수 있습니다. 두 방법에서 변형 된 감자 뿌리 거 스 GUS 활동 suberized endodermis와 exodermis, 그리고 또한, A. rhizogenes 변형 뿌리에 얼룩이 지기 옆 뿌리 출현에 감지 했다 보여주었다. 이 결과 A. rhizogenes 뿌리에 표현 되는 유전자 연구를 빨리 대체 도구가 될 수 있습니다 것이 좋습니다.

Introduction

경제 관심, 이외에도 유전자 변형 식물의 발생 유전자의 궁극적인 기능을 설명 하 고 이해 식물 생리학 및 개발 연구에 그것의 자신의 관련성을 있다. 가장 널리 사용 되는 방법 식물 DNA 삽입은 Agrobacterium-변화를 중재. Agrobacterium tumefaciens 그 종양 유도 (Ti) 플라스 미드의 행동에 의해 많은 식물 종의 감염된 조직에 크라운 혹을 생성할 수 있다. 플라스 미드는 식물 게놈에 통합 될 것 이다 조직 dedifferentiation1,2를 유도 하는 유전자의 세트와 함께 T-DNA 영역을 포함 합니다. 이 유전자는 transgene로 T DNA 내에서 교환 특정 공장 수정 피하 phenotypic 효력3의 생성을 허용 했다. Transgene T DNA로 복제를 촉진 하기 위하여 T-DNA 영역 Ti 플라스 미드의 유전자의 나머지 부분 동안 이진 플라스 미드 라는 독립적인 플라스 미드에 excised 되어 있다 (T DNA 전송 및 삽입 메커니즘을 수 있는 독성 유전자) 되었습니다 도우미 플라스 미드에 배치. 식물 생명 공학 연구에 대 한 A. tumefaciens 에 의해 변환 여러 이점이 있다: 그것은 비싼 장치를 필요 하지 않습니다, 안정적이 고 일시적인 공장 변환, 및 복사본에 통합 하는 유전자의 낮은 수를 생성할 수는 염색체4. 그러나, 대부분 식물, 하지만 하지 애기, 에 대 한 안정적인 transformants의 세대에서 단일 또는 외 인 phytohormones, 힘들고 시간이 걸리는이 과정을 만들기를 사용 하 여 몇 가지 셀 공장 재생이 필요 합니다. A. rhizogenes 는 또한 식물 게놈 수정 수 털이 뿌리 또는 감염 사이트 루트 유도 (Ri) 플라스 미드5에 인코딩된 rol (루트 loci) 유전자의 표현 때문에 우발적인 뿌리를 생산. 비록 적은 A. tumefaciens보다 공부, A. rhizogenes 또한 유전자 변형 뿌리를 얻기 위해 사용 됩니다. 이 경우에, A. rhizogenes 는 원래 T-DNA Ri 플라스 미드와 이진 플라스 미드에서 두 번째 T dna는 transgene 운반 포함 되어 있습니다. 감염 사이트 줄기 또는 hypocotyls에 있을 때, 합성 공장 얻어질 수 있다, 새로운 털이 유전자 변형 뿌리 야생 타입 촬영에서 신흥. 또는, 털이 변형 된 뿌리에서 체 외에 탄소 소스 입력 미디어에서 자율적으로 성장할 수 있다. A. rhizogenes A. tumefaciens 유전자 변형 조직을 생산 하는 대신를 사용 하 여 때 루트 대상 기관 공장 재생 필요 하지 않습니다 및 따라서 그것은 빠르고 적은 비용 때문에 관련성을 얻고 있다. 이전 연구는 루트 특정 유전자6,7,,89phenotypic 특성에 대 한 충당이 방법론을 증명 하고있다.

감자 (푸른 풀밭 tuberosum) 이후는 결 절은 되는 비타민의 좋은 소스에 대 한 인간의 소비에 대 한 영양 관련 식품 및 농업 기구의 국제 연합 (FAO)에 따르면 세계에 있는 제 4 가장 중요 한 작물은 그리고 미네랄입니다. 그 이유로, 감자 농업 생명 공학의 스포트라이트에 배치 되었습니다 고도 유전과 발달에 대 한 좋은 생물 학적 모델10,11으로 여겨진다. 감자 전이 유전자의 특성을 통해 기본 suberized 조직 suberin에 관여 하 고 생 합성12,13,14 왁 스 분자 메커니즘의 이해에 크게 기여 ,15,,1617, suberin 단위체 전송18 및 녹음 방송 규칙19. Suberin feruloyl 전이 효소 유전자, FHT, 이러한 특징이 생 합성 유전자; 중 하나입니다. 그것의 downregulation suberin의 ferulate 에스테 르에 강한 감소 및 감자 괴 경14왁 스와 상관 periderm 보호의 강한 손상에 상승을 제공 합니다. 수반, 뿌리와 애기의 씨앗, 그것의 상 상속 orthologue (ASFT/RWP1)의 녹아웃 suberin20,21에서 알 킬 ferulates 생산의 역할 또한 보여주었다. 감자, FHT transcriptional 기자 선 그리고 FHT 항 체를 보였다 각각는 발기인 활동 및 단백질 exodermis, endodermis, phellogen-파생 상품 및 부상된 조직을15.

이 작품에서는, 우리는 야생 타입 촬영에 유지 되는 유전자 변형 털 뿌리를 생산 하기 위해 A. rhizogenes 를 사용 하 여, 복합 감자 식물, 생성 또는 자율적 에 체 외성장에 excised 프로토콜 선발. 우리는 또한 완전 한 유전자 변형 감자 식물을 얻기 위해 A. tumefaciens 를 사용 하 여 프로토콜을 제공 합니다. 사례 연구로 A. rhizogenes , A. tumefaciens 동일한 바이너리 벡터와 변형 거 스 기자 유전자 발현 운전 FHT 발기인과 함께 뿌리를 얻기 위해 사용 됩니다. 결과 보고 하 고 비교.

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Protocol

A. rhizogenes 변환 프로토콜 적응 되었고 경적 외.7 에서 수정 되었고 유전자 테스트 S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. 데지레). A. tumefaciens 변환 프로토콜은 적응 배너 외.22 에서 수정 하 고 테스트 genotypes 했다 S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. 데지레) 및 미 tuberosum ssp. andigena. 두 절차의 주요 단계는 각각 그림 1과 그림 2에요약 됩니다.

참고: 전송 생체 외에서 수행 하는 절차의 모든 단계에서, 그렇게 하 고 가능한 경우, 접시 또는 냄비, 식물 시 들고 및 오염 방지 하기 위해 공기 노출 최소화를 유지 합니다. 모든 공장 외피 캐비닛의 어두운 20 ° C와 67 µmol m-1의 -1의 24 ° C 빛/12 h 12 h의 조건에서 수행 되었다. 층 류 후드에서 무 균 조건에서 모든 박테리아 조작 및 체 외에서 공장 전송을 수행 합니다. Agrobacterium 그리고 생체 외에서 공장 문화에 대 한 모든 미디어 조리법 테이블 s 1에 제공 됩니다.

주의: 모든 유전자 변형된 박테리아와 식물 충당된 폐기물 컨테이너에 입금.

1. Agrobacterium 문화 변화에 대 한 사용

참고: A. rhizogenes 변환에 사용 되는 변형 했다 (친절 하 게 박사 디트로이트 Broer에서 제공) C58C1:Pri15837 그리고 A. tumefaciens 에 대 한 그 (친절 하 게 박사 Salomé 프라 트에 의해 제공 되는) GV2260. A. rhizogenes PK7GWIWG2_II-RedRoot (VIB-지난 신사에서 식물 시스템 생물학 학과; http://gateway.psb.ugent.be) T-DNA 변환 마커를 들고 털이 루트를 모니터링을 포함 하는 바이너리 벡터와 변형 되었다 형성입니다. A. rhizogenes , A. tumefaciens에 의해 생성 된 변형 된 뿌리 비교를 둘 다 들고 운전 β-glucoronidase (거 스) 취재 원 유전자 FHT 발기인 T-DNA를 포함 하는 이진 벡터 pKGWFS7로 변형 되었다 그리고 선택 가능한 마커15대 저항 유전자.

  1. Agrobacterium 의 식민지를 선택 하 고 200 rpm에서 떨고와 28 ° C에서 50 mL 원심 분리기 튜브에서 항생제 (테이블 S1)로 보충 하는 YEB 매체의 5 mL에서 하룻밤 (O/N) 그것을 성장.
  2. A. tumefaciens 변환에 대 한 OD600 는 광학 밀도 측정 = 0.6-1.0.
    1. 광학 밀도 높은 경우 확인 OD600 낮추는 subculture 문화 OD600 에 도달할 때까지 신선한 미디어와 대기 0.3 = 0.6-1 =.
  3. 실 온에서 10 분 동안 벤치 가기 원심 분리기에서 3000 x g 에서 Agrobacterium 문화 1 mL 원심
  4. Pipetting, 여는 상쾌한을 제거 하 고 항생제 없이 신선한 YEB 매체의 1 mL에 셀 resuspend. 항생제의 완전 한 제거를 보장 하기 위해이 단계를 반복 합니다.
    1. A. tumefaciens 변환에 대 한 마지막 물의 resuspension 추가 OD600 의 최종 광학 밀도 얻기 위해 적절 한 YEB 볼륨 0.8 =.
  5. 감염 된 것으로 식물을 준비 하는 동안 얼음에 셀을 계속.

2. 식물 재료 변환에 대 한

  1. 하나 또는 두 개의 노드 줄기 절단 중 하나는 꼭대기 또는 멸 균 시험관에 감자 식물 (기증자 식물);에서 보조 새싹을 포함 하 게 (그림 1A그림 2A) 3 ~ 4 주 동안 그들을 냄비에 단단한 2MS 매체에 성장.

3. A. rhizogenes (그림 1)를 사용 하 여 변환 설치

참고:이 절차는 털이 변형 된 뿌리의 취득 수 있습니다. Transgene 식 평가, 부정적인 컨트롤 필요 하다. 부정적인 제어를 준비 하려면 키 또는 변환 마커 유전자를 포함 하는 빈 벡터와 변형 A. rhizogenes 긴장을 사용 하 여 절차를 따릅니다.

  1. 사용 신선한 미디어 판; 또는, 판 보관할 수 있습니다, 뚜껑 쪽으로 4 ° C에서 미디어 탈수를 피하기 위해 투명 필름으로 단단히 밀봉. 광장 미디어 접시를 준비 하려면 그들에 경사 ~ 15 °, ms, 40 mL로 채우기와 응고 하자. 이 매체를 가진 식물의 공중 부분의 접촉을 최소화 합니다.
  2. 매우 신중 하 게 기증자 공장에서에서 전송 2MS 매체 120 x 120 mm 사각 접시.
  3. A. rhizogenes 문화 수술 바늘을 사용 하 여 한 줄기 위치인 3 μ에 주사 하십시오 하 고 가능 하면 다른 internodes 공장 당 두 번 반복 합니다.
    참고: 독립 변환 이벤트 (그림 1B)로 각 주입을 고려 하십시오.
  4. 전송 즉시 전체 공장 사각형 접시에 0.1 m m acetosyringone와 함께 보충 하는 단단한 MS 매체. 접시 당 2 식물을 수용 합니다.
    참고: 1 M acetosyringone 재고 솔루션 DMSO에 준비 하 고-20 ° c.에 저장 될 수 있다
  5. 외과 테이프를 사용 하 여 접시를 봉인 하 고 4 일 동안 성장 캐비닛 안에 그것을 수직으로 정렬.
  6. A. rhizogenes를 죽 일 cefotaxime 나트륨 [500 µ g/mL] 보충 하는 MS 매체와 새로운 사각형 접시에 공장을 전송.
  7. 10 월 12 일, 후 털 뿌리 (그림 1C,1d)를 표시 하기 시작 합니다. 그리고 식물의 기본 뿌리를 삭제할 cefotaxime 나트륨 [500 µ g/mL] 보충 하는 MS 매체와 새로운 사각형 접시에 공장을 전송 합니다.
    참고: 변환 된 털이 뿌리 DsRed 변환 표식 (그림 3D)를 사용 하는 경우 빨간색 형광에 의해 확인할 수 있습니다.
  8. Cefotaxime 나트륨 [500 μ g/mL] 보충 하는 MS 매체에서 3-4 주 동안 성장 유전자 변형 털 뿌리 게 복합 공장 (그림 1E)를, (매체 매주 변경).
  9. 목적에 따라 다음과 같이 유전자 변형 털 뿌리와 부정적인 컨트롤을 전파 합니다.
    1. 전체 복합 식물 수경 (테이블 S2) 또는 토양 매체에 대규모 개발에 대 한 허용 하는 전송.
    2. 개별적으로 전파 변환된 털 뿌리, 빨간 형광 변환 마커 (DsRed 단백질)을 표현 하는 뿌리를 잘라 메스를 사용 하 여 때 그들은 4-8 cm 긴 (그림 1E) 이며 Gamborg B5 고체 매체와 페 트리 접시에 그들을 전송 2% 자당 및 cefotaxime 나트륨 [500 μ g/mL] 보충. 플라스틱 실험실 영화와 번호판을 봉인 하 고 20 ° c.에 어둠 속에서 그들을 성장합니다
      참고: 뿌리 ( 재료의 표참조) 무 균 조건 하에서 형광을 검출 하는 stereomicroscope에서 조작할 수 있습니다.
    3. 바이오 매스 생산 (즉, 유전자 표정 분석), 5 cm 긴 털이 루트를 잘라내어 2% 자당 및 cefotaxime 나트륨 [500 µ g/mL] 보충 하는 Gamborg B5 액체 매체의 20 mL와 함께 150 mL 삼각 플라스 크에에서 전파. 20 ° C와 60 rpm에서 어둠 속에서 6 주 동안 그것을 성장.

Figure 1
그림 1: 시간 표시 막대 감자 A. rhizogenes를 사용 하 여 유전자 변형 털 뿌리를. 변환 프로세스 및 털이 뿌리 성장 이후 단계의 각 단계에 도달 하는 누적 주 표시 됩니다. 다른 단계의 대표 이미지 표시 됩니다: 3 주 된에서 생체 외에서 사용 하는 프로세스의 개시 A. rhizogenes (B)는 증식의 형성을 주입 하 여 (A), 다음 감염 식물의 식물 신흥 털 뿌리 (D), 조직 (C, 화살표) 그리고 빨간 형광 변환 마커 DsRed (E) 표현 개발된 털이 뿌리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

4. A. tumefaciens (그림 2)를 사용 하 여 변환 설치

참고:이 절차는 변형 된 식물의 취득을 수 있습니다. Transgene의 효과 평가, 부정적인 컨트롤 필요 하다. 빈 벡터와 변형 A. tumefaciens 를 사용 하 여 절차에 따라 하나의 옵션이입니다. 또는, 야생 타입 식물을 사용할 수 있습니다.

  1. 고 페 트리 접시에 3-4 주-오래 된 식물 (그림 2A)에서 잎을 배치. 메스를 사용 하 여는 잎 자루를 제외 고 통과 상처 (잎 크기에 따라 1-3) 잎의 센터에서 그들을 잘라 (그림 2B) 피 가장자리에.
  2. 즉시를 abaxial 면 배양 접시에서 액체 미디어 10 mL 신선한 2MS의에 떠 있는 잎을 배치 하 고 접시를 닫습니다. 최대 15 수용 단계 cv. 데지레에 대 한 나뭇잎과 25 ssp 단풍 (잎 크기)에 따라서ndigena 를 반복 합니다.
  3. 즉시 세600 A. tumefaciens 문화의 80 µ L를 추가 액체 매체에서 0.8 = 고 균질 수동으로 세균 솔루션을 배포 하는 1 분에 대 한 접시.
  4. 신중 하 게 씰링 필름으로 밀봉 하 고 알루미늄 호 일 커버 변환 발생할 수 있도록 24 ° C에서 약 실에 있는 2 일 동안 품 어.
  5. CIM 매체 (그림 2B)까지 abaxial 측면을 유지 하는 잎을 전송 하 고 성장 캐비닛에 1 주 동안 그들을 품 어.
    1. 잎은 미디어에 더 수용 될 수 있도록 핀셋으로 CIM 매체를 다쳤어요.
  6. SIM 매체 (그림 2C)까지 abaxial 측면을 유지 하는 잎을 전송 하 고 성장 캐비닛, 상쾌한 매체는 촬영은 약 2 ㎝ 높이 모든 7-10 일에에서 그들을 품 어.
    1. 잎 미디어에 의해 완전히 둘러싸여 수 있도록 핀셋으로 SIM 매체를 다쳤어요. 등장된 촬영 뚜껑에 도달, 키 큰 접시를 사용 (100 x 20 mm, 높이 x 직경).
      참고:는 굳은 살은 6-7 주 (그림 2E) 후 SIM 매체 (그림 2D)에 촬영 2-3 주 후에 형성할 것 이다. 쏘고 그들은 독립적인 상처에서 형성 하는 굳은 살에서 나타날 때 독립 변환 이벤트로 간주 됩니다.
  7. 3 컷 촬영 각 굳은 살 (동일한 변환 이벤트로 간주)에서 등장 (그림 2E), 전송 MG 매체와 문화 플라스 크를 들 수 있도록 cefotaxime 나트륨 [250 mg/L] 보충 숫자 하위 집합 레이블 응원, 그리고 성장 캐비닛 또는 쏘고 활발 한 (그림 2F) 될 때까지 3-4 주 동안에 품 어.
    참고: 자를 쏘고 때 제거 잘 굳은 살 그렇지 않으면 루트를 형성 하지 것입니다.
    1. 독립적인 라인 필요한 만큼 여러 번 단계를 반복 합니다. 5 다른 변환 최대 이벤트는 다른 이벤트에서 식물 혼합 하지는 전체 신뢰에서 작동 하도록 8 cm의 직경을 가진 문화 플라스 크에 놓일 수 있다.
  8. 각 이벤트의 가장 활발 한 식물을 선택 하 고 3-4 internodes와 촬영의 꼭대기 세그먼트를 잘라 cefotaxime 나트륨 [250 mg/L] 보충 2MS 매체와 새로운 문화 플라스 크에 배치.
    참고: 3-6 주 공장 효율적으로 성장할 것입니다, 활기찬 촬영 및 루트 개발.
    1. 돌려 약 실에 선택 되지 않은 촬영 선택 식물은 완전히 개발 될 때까지.
  9. 하나 이상 있을 또는 꼭대기 꽃 봉 오리와 공장에서 줄기 세그먼트를 잘라내어 새로운 2MS 매체 cefotaxime [250 mg/L] 보충에 그들을 전송. 장 성장에 그들을 품 어.
    1. 생체 외에서 변형 라인 설정 하 매 3-4 주를 복제 합니다.
      참고: cefotaxime 나트륨 필요 2MS 매체에 적어도 3 명의 후속 전송에 확실 하 게 죽 일 A. tumefaciens; 나중에, A. tumefaciens 자라 난 관찰 되는 경우 전송 식물 다시 2MS 미디어 cefotaxime 나트륨 보충.
  10. 식물 형의 특성, 그들의 전체 특성에 대 한 토양 또는 루트 검사에 대 한 수경 법 문화 식물을 전송.
    1. 계속 전파 하 고 설립된 라인을 유지 하는 토양에서 생산 tubers.

Figure 2
그림 2: 감자를 타임 라인 변형 A. tumefaciens를 사용 하 여 식물. 변환 프로세스 및 식물을 성장 하기 위하여 후속 단계의 각 단계에 도달 하는 누적 주 표시 됩니다. 다른 단계의 대표 이미지 묘사 된다: 사용 하 여 프로세스의 개시 3 주 된 생체 외에서 식물 (A)에서 출발, CIM 미디어 (B)를 전송할 때 잎을 나뭇잎 상처와 감염의 전송 SIM 미디어 (C), 2-3 주 후에 SIM 미디어 (D), SIM 미디어 (전자), 9-11 주 후 촬영 형성 및 MG 미디어 (F)을 전송 후 촬영 부상된 영역 주위 굳은 살의 시각화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

5. 수경 문화

  1. 반 힘 교류가 솔루션을 준비 (0.5 x) (테이블 S2) 10 L 물통에.
  2. 적절 한 산소 조건 동질성을 유지 하기 위해 수족관 펌프를 담가.
  3. 어두운 조건에서 뿌리 성장에 알루미늄 호 일 양동이의 벽을 커버.
  4. 루트 손상 방지, 생체 외에서 식물 수경 문화 전송.
    참고: 신중 하 게 물에 뿌리를 흔들어 잠복기 동안 미생물 확산을 피하기 위해 뿌리에서 모든 나머지 체 외에 매체를 제거 합니다.
  5. 적절 한 순응 및 성장 챔버에 품 어 유리 공장 처럼 투명 한 필름으로 식물을 커버.
  6. 3 일 후 영화에서 구멍을 확인 하 고 1 주일 후 완전히 제거.
  7. 10 일 마다 신선한 미디어를 바꿉니다.

6. 거 스 조직화 학적인 취재 원 유전자 분석 결과

참고: 우리의 경우에 거 스 분석 2-3 주 수경 법 또는 체 외에서 성장 뿌리와 수행 되었다.

  1. 냉장 90% 아세톤 (v/v)과 뿌리를 해결 하 고 20 분 동안 얼음에 품 어.
  2. 증류수와 두 빨 래를 수행 합니다.
  3. 신선한 거 스 솔루션 (표 1) 얼룩을 추가 하 고 진공 적용 (-70 Pa) 20 분.
  4. 감광 성 스 4 h 또는 파란 색은 표시 될 때까지 보호 하기 위해 어둠 속에서 37 ° C에서 품 어.
    참고: ferri-및 거 스 솔루션에서 ferrocyanide 반응 제품의 확산을 최소화 하 고 더 정확한 지역화를 제공.
    주의: 연기 후드를 사용 하 고 거 스 솔루션 (칼륨 ferricyanide 그리고 칼륨 ferrocyanide) 독성 시안 화물 파생 상품을 취급할 때 보호복을 착용. 거 스 기판 및 처리 자료 안전 하 게 처분 되어야 한다.
  5. 거 스 솔루션 얼룩을 제거 하 고 적절 한 용기에 그것을 폐기.
  6. 에탄올 70% (v/v) 2 빨 래를 수행 합니다.
  7. 밝은 분야 현미경으로 관찰 합니다.
    참고: 거 스 얼룩은 안정적인 몇 주; 그러나, 첫 주 동안 거 스 신호 분명 하 고 인접 한 셀에는 더 적은 확산. 더 이상 저장소에 대 한 튜브를 봉인 하 고 4 ° c.에 그것을 저장합니다

Table 1
표 1: 거 스 얼룩 솔루션 제조 법입니다.

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Representative Results

Agrobacterium rhizogenes -감자 전이 중재

이 원고에 A. rhizogenes 와 변환된 루트를 설정 하는 단계별 절차를 제공 됩니다. 그림 1 는 전부 (완전 개발된 털 뿌리를 얻기에 A. rhizogenes 의 주입)에서 약 5-6 주 소요 절차의 개요를 제공 합니다. 다음, 식물 합성 (야생 타입 촬영, 유전자 변형 루트) 또는 유전자 변형 털이 루트 클론 excised 고 자율적으로 2% 자당으로 보충 하는 단단한 Gamborg B5 매체에 성장 수로 공부 될 수 있다. 또는, 털 뿌리 수 대규모 전파 액체 Gamborg b 5 미디어를 사용 하 여. 제시 하는 절차 S. tuberosumtuberosum (cv. 데지레)와 함께 실시 되었습니다.

방법 절차를 모니터링 하 고 감자 유전자 변형 털 뿌리를 변환 표식 (지난 신사에서 식물 시스템 생물학의 VIB 부에서 PK7GWIWG2_II-RedRoot)으로 DsRed와 이진 벡터를 사용 하 여 검증 했다. 이 빨간 형광 유전자 변형 비에서 유전자 변형 털 뿌리의 구별 허용. 그에 따라 그림 3 에 변환 된 털이 뿌리 붉은 형광 녹색 빛으로 조명 하는 때 전시. 현상은 Agrobacterium 을 사용 하 여 부정적인 컨트롤 없음 빨간색 형광 (그림 3C), 유전자 변형 털 뿌리 (그림 3D)를 식별 하는 DsRed 변환 마커의 적합성을 나타내는 전체 나타났다. 다른 작가23,24;에 의해 설명 된 대로 항생제 저항 같은 다른 변환 마커를 사용할 수 있습니다. 그러나, 미디어에서 항생제 마커를 포함 하는 유전자 변형 뿌리 성장 지연을 생성할 수 있습니다.

Figure 3
그림 3: 형광 유전자 변형 털의 뿌리 감자 (cv. 데지레) A. rhizogenes에 의해 변형. 털이 뿌리 변형 비 A. rhizogenes 를 사용 하 여 가져온 (C58C1 변형: pRI1583) (A C)과 A. rhizogenes (스트레인 C58C1:pRI1583) 빈 벡터 pK7GWIWG2_II-레드-루트 운반으로 변형 한 DsRed 변환 표식 (BD). 털이 뿌리 두 감염 (A, B)에 형성 된다 하지만 붉은 형광 이진 벡터를 포함 하는 A. rhizogenes 와 함께 변화만 관찰된에 털이 뿌리. 이미지는 빨간색 형광을 시각화 하는 램프와 특정 필터를 장착 한 stereomicroscope와 함께 찍은. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Agrobacterium tumefaciens -감자 전이 중재

이 원고에 설명 된 두 번째 프로토콜 설정 되어 얻을, 단계별, 완전 감자 식물 A. tumefaciens으로 변형. 그림 2 는 모두 (잎 감염 A. tumefaciens 를 완전히 재생성 된 식물을 받는)에서 15-18 주 사이 절차의 개요를 제공 합니다. 절차의 가장 시간이 많이 걸리는 부분은 organogenesis에 의해 식물 재생입니다. 이 특정 단계가이 방법 A. rhizogenes를 사용 하 여 보다 더 힘 드는 게. 절차는 S. tuberosumtuberosum (cv. 데지레)와 미 tuberosum ssp. andigena, tuberization. 을 유도 하기 위해 짧은 조건에 덜 의존 하는 전 실시 되었습니다.

A. tumefaciens에-달리는 A. rhizogenes-중재 변환 변환 중재, 재생성 된 식물은 완전히 유전자 변형 유기 체. 그러나, 유전자 변형 식물 대 선택적 미디어에 생성 됩니다, 비록 모든 라인은 transgene 효율적으로 표현 한다. 따라서, transgene 식의 유효성 검사가 필요 합니다.

뿌리에서 FHT 발기인 활동의 비교 사용 하 여 얻은 A. tumefaciens 그리고 A. rhizogenes

상기 절차는 FHT 유전자의 발기인에서 거 스 유전자를 표현 하는 뿌리를 생산에 적용 했다. 완전 한 변형 A. tumefaciens 를 식물은 이전에 보고 된15, 이진 벡터 pKGWFS7를 사용 하 여 FHT 발기인을 포함. 자,이 이진 벡터 사용 되었습니다 조직 비교 새로운 변형된 털 뿌리를 생산 하는 발기인 활성화 되어 따라서 발기인 활성화를 연구 하는 도구로 서 털이 루트 시스템을 테스트.

그림 4 는 유전자 변형 식물의 뿌리에 얼룩이 지 거 스 A. tumefaciens (그림 4AB) 그리고 A. rhizogenes (그림 4CD, E, F)에 의해 얻은 유전자 변형 털 뿌리에 의해 얻은, 각각. 볼 수 있는 뿌리 A. tumefaciens 를 변형 하 고 성장 생체 외에서 (그림 4A), endodermis 외피는 돌기둥 사이 셀 계층에에서 파란 얼룩이 표시. 더 많은 개발 뿌리, 블루 라벨 exodermis (그림 4B)에 해당 하는 외부 층에서 누 덕 누 덕 이다. 변환 된 털이 수경 법에 성장, 뿌리에 거 스 마커 구체적으로에 위치 했다 (그림 4DE), 옆 뿌리 출현에 endodermis (그림 4CE), 부상된 영역 (그림 4E에 )와 exodermis (그림 4 층)에서. 뿌리 PromFHT:GUS T-DNA 카세트 또는 야생 타입 뿌리 없이 털이 어느 뿌리 했다 부정적인 컨트롤에서 아무 거 스 얼룩을 보여주었다.

Figure 4
그림 4: 조직화 학적인 관찰 FHT의 발기인에 의해 주도 거 스 취재 원 유전자를 표현 하는 유전자 변형 감자 뿌리의. A. tumefaciens (S. tuberosum ssp. andigena) 변환 (A-B) 쇼 블루 얼룩 endodermis (A) 및 exodermis (B)에서 얻은 완전 한 유전자 변형 식물에서 뿌리. A. rhizogenes (S. tuberosum ssp. tuberosum cv. 데지레) 변환 (C F) 표시 얼룩이 지 거 스 (C , E), endodermis 측면 루트에서 얻은 유전자 변형 털이 뿌리 출현 (D E), 상처 치유 영역 (E)와 exodermis (F). Endodermis (EN); Exodermis (전); Xylem (XL); 측면 루트 (LR)의 primordia입니다. 빨간색 화살표는 부 상당한 영역을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

S 1 테이블: 미디어 조리법 사용 성장 박테리아 생체 외에서 식물.  제발이이 표를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

S2 테이블: 감자 식물 수경 법에 성장 위한 절반 힘 교류가 솔루션입니다. 제발이이 표를 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

감자, 안정 되어 있는 완전 한 유전자 변형 식물을 얻기 위해 가장 일반적인 시스템 변환 사용 하 여 organogenesis 외 인 phytohormones를 사용 하 여 필요한 Agrobacterium tumefaciens 종자로. Agrobacterium 기반 프로토콜 비 T DNA 벡터 시퀀스25통합 가능성이 있다, 하지만이 방법론 이며 쉬운 아직 덜 비싼 감자 식물을 변환 하는 데 사용할 수 있습니다. 지난 년 동안, A. rhizogenes에 관심-중재 변환 A. tumefaciens를 사용 하 여 보다 짧은 기간에 유전자 변형 뿌리를 허용에 대 한 연구자의 관심을가지고 있다. A. rhizogenes 는 아직도 phytohormone auxin 제어 및 시 토 키 닌 생 합성을 위한 효소를 암호화 하는 유전자의 집합을 전달 하는 유도 하는 루트 (Ri) 플라스 미드를 유지 하 고26이라는 의견에 대 한 인코딩. Ri T DNA는 호스트 genomic DNA에 삽입 됩니다, 일단 새로운 호르몬 균형 감염27의 지점에서 신흥 털 뿌리 라는 확산 뿌리의 형성을 유도 하는 감염 된 세포를 deregulates. 추가 이진 벡터 외국 DNA를 통합 하는 데 사용 하는 경우 Ri 플라스 미드의 보존 것 적용 phytohormones28를 사용 하 여 organogenesis의 필요 없이 변환 된 털이 뿌리를 얻을 수 있는 가능성을 수 여. 털이 뿌리 합성 식물을 생성 하는 야생 타입 촬영에 첨부 된 유지 될 수 있다 또는 자체 전파 될 수 있습니다. 자체 전파 털 뿌리의이 능력은 부터는 중요 한 대사 산물 또는 조제 학 및 심지어 phytoremediation 지역 (에 관심을 생성 하는 외국 단백질에 대 한 생물 학적 시스템으로 여러 식물 털이 뿌리에서 생산 악용 되 고 검토29,30참조). 감자 (var. Kufri Bahar), 유전자 변형 완전 한 식물 표현 하는 B 형 간염 표면 항 원 (HBsAg)23털 뿌리를 생산 하기 위해 야생 타입 A. rhizogenes 스트레인 감염 되었습니다. 또는, 털이 뿌리에서 생성 완전 한 유전자 변형 식물을 얻을 수 있습니다, 하지만 감자 식물과 tubers 키 컨트롤에 비해 뚜렷한 개발. 이러한 차이 표현 형에 인해 원래 리 T-DNA 게놈31,32통합 있습니다.

이 작품에서 유전자 변형 얻으려면 자세한 절차 A. rhizogenes 를 사용 하 여 털이 뿌리를 안정 하 고 (그림 1그림 2) 유전자 변형 안정적인 식물 A. tumefaciens 를 사용 하 여 표시 됩니다. 완전히 개발 된 유전자 변형 털 뿌리 5-6 주에 가져온, 유전자 변형 뿌리는 동안 변형 된 세포, 그리고 선택과 변형 된 식물의 번 식에서 organogenesis 요구 사항으로 인해 15-18 주 필요 A. tumefaciens 를 사용 하 여. 우리 손에 A. tumefaciens 변환 절차 효율적으로 작동 S. tuberosum ssp. andigena 및 ssp. tuberosum (cv. 데지레)에서 보고 변환 효율 약 3522 와 48% 12, 각각. 설명 A. rhizogenes 변환 프로시저 기반에 경적7에서 보고는 보여주었다 높은 (80-100%) cv. 데지레에에서 변환 효율 그리고 다른 3 개의 감자 재배 (Albatros, 사비 나 Saturna).

감자에 대 한 대체 변환 시스템으로 기능 연구 A. rhizogenes 를 제시 하 고 초기 존재 리 T-DNA의 관심사의 문제 여부, 우리 사용 두 시스템 모두 같은 바이너리와 감자 뿌리를 변환 하는 벡터 거 스 취재 원 유전자의 표정을 운전 suberin 생 합성 유전자 (FHT)의 모터와 T DNA를 포함. 조직화 학적인 분석 공개 A. tumefaciens 변형 식물 FHT 발기인의 활동에에서, 뿌리의 내부 및 외부 suberized 레이어 (endodermis와 exodermis, 각각) (그림 4A,B )과 잎, 줄기 및 괴 경15의 부상된 분야에서 또한. A. rhizogenes 변형 털이 뿌리에서 활동 또한 endodermis 및 exodermis과 부상된 루트 영역 (그림 4E)에서 발견 되었다. 두 가지 유형의 변형 된 뿌리에서 suberin 발기인 활동의 동시 발생 나타냅니다 Ri T DNA 통합이 루트 조직에 적어도 suberization에 관련 된 개발 프로세스에는 영향을 미치지 않습니다. 털이 변형 된 뿌리에서 우리는 또한 옆 뿌리 (그림 4D,E)의 출현을 주변 지역에서 FHT 발기인의 활동 감지. 이 같은 suberin 단위체의 수송에 관여 하는 다른 유전자에 의해 보고 된 발기인 활동 동의 ABCG11 / WBC1133,,3435,36 나는 레 귤 레이 터 StNAC103 19. A. rhizogenes suberin 유전자를 연구 하 여 감자 전이 이미 보고 되었습니다 최근37 그리고 또한 경우 털이 뿌리는 수 CYP86A33, 지방산의 발기인 활성화 Ω-hydroxylase입니다. 그러나, 뿌리에 얼룩이 지 거 스 fluorometric 분석 결과 사용 하 여 계량 하는 대량, 따라서 suberized 조직에 특정 식만 추정 했다.

A. rhizogenes 변환 suberin 관련 유전자 연구 다른에 따라 연장 될 수 있습니다, 뿌리에서의 세포 유형 특정 발기인 활성화를 탐구 하는 더 빠른 대체 도구는 이러한 결과 증거를 처리 하는 모두 뿌리에서 발생 합니다. 계약에 다른 기능 유전자 연구는 유전자 기능6,7,,89, 공부를 보여주는 감자, 토마토와 유칼립투스에 A. rhizogenes 를 사용 하 여 성공 했습니다. 호르몬 응답38,39 또는41발기인 활동40,. 그러나, 엄격 하 게 제어 개발 프로세스를 Ri T-DNA에 의해 또는 전체 공장 또는 괴 경은 다른 장기 뿌리에서 다른 공부 하 고 싶을 때 폐지 될 수 있습니다 공부를 할 때 특히이 전략 여전히 제한 발생할 수 있습니다. 이러한 상황에서 A. tumefaciens 변환 시스템은 여전히 선호.

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Disclosures

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

Acknowledgments

이 작품 정부의 드 Innovación y 많은 (AGL2009-13745, PB FPI 부여), 정부의 드 Economía y Competitividad 페더 (AGL2012-36725, AGL2015-67495-c 2-1-R), 자금 및 지로 나의 대학 (박사 학위 부여 SF, 그랜트를 지원 했다 SING11/1). A. rhizogenes , A. tumefaciens 긴장을 제공 하는 저자는 박사 디트로이트 Broer (토지 이용, 대학 로스 토크, 로스 토크, 독일 연구소) 및 박사 Salomé 프라 트 (센트로 나시오날 드 Biotecnología, 마드리드, 스페인)에 게 감사 각각, 및 박사 Marçal 순간 및 도움말 및 A. rhizogenes 변환 실험 시작에서 받은 지원에 대 한 박사 안 나 플 라 센 시아 (툴루즈 III 폴 Sabatier 대학-CNRS, 식물 연구 실험실 (LRSV), Castanet 돌 루 잔, 프랑스)입니다. 저자는 실험실 작업을 수행 하 고 돌보는 식물, Ferran Fontdecaba 및 지원 칼라 산체스의 일부 실험 하 고 있던 동안에 그녀의 귀중 한 도움에 감사 사라 고메스 (Departament de Biologia, UdG, 지로 나) 그들의 최종 학위 프로젝트입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Acetone

Panreac

1.310.071.21

Acetosyringone

Acros

115540050

Aquarium pump

Prodac

MP350

Autoclave

Ragpa Strelimatic

Bacteriological agar

Lab Conda

1800

BAP

Duchefa

B0904

Beef extract

Lab Conda

1700

Plant growing cabinet

Nuaire

Carbenicillin

Duchefa

C0109

Cefotaxime sodium

Duchefa

C0111

DMSO

Merck

1029310161

Ecotron infors

HT

29378

Ethanol

Merck

1,009,831,011

Falcon tube

Control tecnica

CFT011500

Ferricyanate

Sigma

101001081

Ferrocyanate

Sigma

100979088

Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture

Apiglass

ref16

GA3

Sigma

G7645

Gamborg B5 media

Duchefa

G0210

Gelrite

Duchefa

G1101

Glucosa

Sigma

G5767

Kanamycin

Sigma

K1377

Leukopor tape

BSN Leukopor

BDF47467

Lupe

Wild-Heerbrugg

M420

Magnetic shaker

Agimatic

7000243

MES hydrate

Sigma

M2933-25G

MgSO4

Panreac

131404

Microscope

Olympus

Minufugue centrifugue 5415R

Eppendorf

Murashige and Skoog media

Duchefa

M0254.0050

Na2HPO4

Panreac

131679

NAA

Duchefa

N0903

NaCl

Panreac

131659

NaH2PO4

Sigma

58282

NightSea Stereo

SFA Moonting Adapter

Parafilm

Anorsa

PRFL-001-001

Peptone

Lab Conda

1616

Petri dishes (90 x 14)

Anorsa

200200

pHmetre

Crison

Phytotron

Inkoa

RFTI-R5485

Plant Agar

Duchefa

P1001

Refrigeratot

Liebherr Medline

Rifampicin

Duchefa

R0146

Spectinomycin

Sigma

59007

Spectrophotometer

Shimadzu

Square plates (120 x 120)

Deltalab

200204

Streptomycin

Sigma

S6501

Sucrose

Panreac

131621

Surgical blades

Swann-Morton

201

Surgical needle

NIPRO

015/0204

Triptone

Lab Conda

1612

Triton

Serva

37240

Unimax 1010 shaker

Heidolph

Vacuum

Dinko

x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous)

Biosynth

B-7398

Yeast extract

Lab Conda

1702.00

Zeatin riboside

Sigma

1001042850

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References

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