Agrobacterium Tumefaciens und Agrobacterium Rhizogenes-vermittelte Umwandlung der Kartoffel und die Promotoraktivität eines Suberin-Gens durch GUS Staining

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Summary

Hier präsentieren wir Ihnen zwei Protokolle, Kartoffelpflanzen zu verwandeln. Die Agrobacterium Tumefaciens Transformation führt zu einer kompletten transgenen Pflanze Agrobacterium Rhizogenes transgenen behaarte Wurzeln in einem Wildtyp-Shooting produziert, die selbst propagiert werden kann. Wir erkennen dann Promotoraktivität von GUS Färbung in den transformierten Wurzeln.

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Fernández-Piñán, S., López, J., Armendariz, I., Boher, P., Figueras, M., Serra, O. Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining. J. Vis. Exp. (145), e59119, doi:10.3791/59119 (2019).

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Abstract

Agrobakterium SP. gehört zu den am häufigsten verwendeten Methoden zu transgene Pflanzen zu erhalten, da es die Fähigkeit hat, zu übertragen und eine eigene T-DNA in das pflanzliche Genom zu integrieren. Hier präsentieren wir Ihnen zwei Transformationssysteme zur (Solanum Tuberosum) Kartoffelpflanzen gentechnisch zu verändern. A. Tumefaciens Transformation Blätter sind infiziert, die transformierten Zellen ausgewählt sind und eine neue komplette transformierte Pflanze regeneriert mit Phytohormonen in 18 Wochen. In A. Rhizogenes Verwandlung Stiele sind durch die Injektion von Bakterien mit einer Nadel infiziert, die neue entstandenen transformierten behaarte Wurzeln werden mit einem roten fluoreszierenden Marker erkannt und die nicht-transformierten Wurzeln entfernt werden. In ca. 5-6 Wochen ist die resultierende Anlage eines Verbundes aus einem Wildtyp-Shooting mit voll entwickelten transformierten behaarte Wurzeln. Um die Biomasse zu erhöhen, können die transformierten behaarte Wurzeln herausgeschnitten und selbst propagiert werden. Wir angewendet beide Agrobakterium -vermittelten Umwandlung Methoden um Wurzeln mit dem Ausdruck der GUS Reportergens angetrieben von einem Suberin biosynthetischen gen Förderer zu erhalten. Die GUS-Färbeverfahren wird zur Verfügung gestellt und ermöglicht es die Zelle Lokalisierung der Projektträger Induktion. Bei beiden Methoden zeigten die transformierten Kartoffel Wurzeln GUS Färbung im suberized Endodermis und Exodermis, und darüber hinaus in A. Rhizogenes verwandelt Wurzeln der GUS-Aktivität auch bei der Entstehung von Seitenwurzeln erkannt wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass A. Rhizogenes ist ein schnell alternative Werkzeug, um die Gene zu studieren, die in Wurzeln zum Ausdruck kommen.

Introduction

Abgesehen von wirtschaftlichem Interesse hat die Erzeugung transgener Pflanzen eine eigene Bedeutung in der Forschung, um die ultimative Funktion von Genen zu demonstrieren und Pflanzenphysiologie und Entwicklung besser zu verstehen. Die am weitesten verbreitete Methode, denn Pflanze DNA-Aufnahme Agrobakterium-vermittelten Transformation. Agrobacterium Tumefaciens ist Krone Galls in das infizierte Gewebe viele Pflanzenarten durch die Einwirkung von seiner Tumor-Induktion (Ti) Plasmid zu generieren. Das Plasmid enthält eine T-DNA Region mit einer Reihe von Genen, die in das pflanzliche Genom integriert werden und induzieren Gewebe Entdifferenzierung1,2. Der Austausch dieser Gene innerhalb der T-DNA durch das Transgen ermöglichte die Generation werksbezogen Modifikationen phänotypische Effekte3zu vermeiden. Um das Transgen in die T-DNA Klonen zu erleichtern, hat die T-DNA Region in eine unabhängige Plasmid bezeichnet eine binäre Plasmid, während der Rest der Gene der Ti-Plasmid herausgeschnitten worden gewesen sein (die Virulenz-Gene, die die T-DNA-Transfer und Einfügung Mechanismen erlauben) in einem Plasmid Helfer platziert. Für Pflanzenbiotechnologieforschung, Transformation von A. Tumefaciens hat mehrere Vorteile: es braucht keine teuren Geräte, erzeugen sowohl stabil und transiente Pflanzentransformation und niedrige Zahlen des Gens Kopien integriert sind die Chromosom4. Die Generation der stabile Transformanten erfordert jedoch für die meisten Pflanzen, aber nicht, Arabidopsis Pflanze Regeneration von einem oder wenigen Zellen mit exogenen Phytohormone, macht diesen Prozess mühsam und zeitaufwendig. A. Rhizogenes ist auch in der Lage, das Pflanzengenom ändern Herstellung behaarte Wurzeln oder zufällige Wurzeln an den Standorten der Infektion durch die Expression von Rol (Wurzel Loci) Genen kodiert in den Wurzel-induzierende (Ri) Plasmid5. Obwohl weniger als A. Tumefaciensstudiert, wird A. Rhizogenes auch verwendet, für den Erhalt der transgenen Wurzeln. In diesem Fall enthält die A. Rhizogenes die original T-DNA in das Plasmid Ri und eine binäre Plasmid mit einer zweiten T-DNA tragen das Transgen. Wenn der Infektionsstelle Stängel oder Hypocotyle ist, kann ein zusammengesetztes Werk mit neuen behaarte transgenen Wurzeln aus Wildtyp-Shootings erhalten. Alternativ können behaarte transformierte Wurzeln autonom in Vitro in Medien mit Kohlenstoff Quelle Eingänge wachsen. Die Verwendung von A. Rhizogenes anstelle von A. Tumefaciens , transgene Gewebe zu produzieren ist Relevanz gewinnt, wenn die Wurzel das Zielorgan, ist weil Pflanze Regeneration nicht erforderlich ist und daher es schneller und weniger kostspielig ist. Frühere Studien zeigten diese Methodik für die phänotypische Charakterisierung der Wurzel bestimmter Gene6,7,8,9angeeignet.

Die Kartoffel (Solanum Tuberosum) ist die viertwichtigste Kulturpflanze der Welt laut der Ernährungs- und Landwirtschaftsorganisation der Vereinten Nationen (FAO) seit die Knolle ernährungsphysiologische Bedeutung für den menschlichen Verzehr als eine gute Quelle für Vitamine und Mineralien. Aus diesem Grund Kartoffel im Rampenlicht der landwirtschaftlichen Biotechnologie gelegt und gilt auch als ein gutes biologisches Modell für genetische und Entwicklungsbiologie10,11Studien. Kartoffel-Transformation trug wesentlich zum Verständnis der molekularen Mechanismen zugrunde liegenden suberized Gewebe durch die Charakterisierung von Genen beteiligt Suberin und Wachs Biosynthese12,13,14 ,15,16,17, Suberin Monomer Transport18 und Transkription Verordnung19. Das Suberin-Feruloyl-Transferase-gen, FHT, ist eines dieser charakterisiert biosynthetischen Gene; die Herunterregulierung gibt Anlass zu einer starken Beeinträchtigung des Schutzes Periderm, die mit einem starken Rückgang der ferulate Ester von Suberin und Wachse in Kartoffel Knollen14korreliert ist. Begleitend in Wurzeln und Samen von Arabidopsis zeigte der Ko von seiner vermeintlichen orthologs (ASFT/RWP1) auch seine Rolle in der Herstellung von Alkyl Ferulates Suberin20,21. In der Kartoffel zeigte die FHT transkriptionelle Reporter-Linie und der FHT-Antikörper bzw., dass die Promotoraktivität und das Protein in der Exodermis, die Endodermis der Phellogen-Derivate und verletzte Gewebe15befinden.

In dieser Arbeit zeigen wir ein Protokoll mit A. Rhizogenes transgenen behaarte Wurzeln produzieren, die in einem Wild-Typ-Shooting gepflegt sind, generiert composite Kartoffelpflanzen oder herausgeschnitten, um autonom in Vitrowachsen. Wir bieten auch das Protokoll mit A. Tumefaciens , um komplette transgenen Kartoffelpflanzen zu erhalten. Als Fallstudie werden A. Rhizogenes und A. Tumefaciens verwandelt mit der gleichen binären Vektor verwendet, um die Wurzeln mit dem FHT -Promotor fahren GUS -Reporter-gen-Expression zu erhalten. Die Ergebnisse sind gemeldet und verglichen.

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Protocol

A. Rhizogenes Umwandlung Protokoll wurde angepasst und modifiziert von Horn Et Al.7 und der Genotyp getestet wurde S. Tuberosum Ssp. Tuberosum (CV Désirée). A. Tumefaciens Umwandlung Protokoll wurde angepasst und geändert von Banerjee Et Al.22 und die Genotypen getestet wurden S. Tuberosum Ssp. Tuberosum (CV Désirée) und S. Tuberosum SSP. Andigena. Die wichtigsten Schritte der beiden Verfahren sind in Abbildung 1 und Abbildung 2, bzw. zusammengefasst.

Hinweis: In allen Phasen des Verfahrens, die Durchführung von in-vitro- Transfers schnell zu tun, und wenn möglich, beibehalten der Teller oder Töpfe geschlossen, somit minimieren Anlage in die Luft, welken und Kontamination zu vermeiden. Anders angegeben, wurden alle Pflanze Inkubationen in Schränken unter den Bedingungen des 12 h von 24 ° C Licht/12 h 20 ° C dunkel und 67 µmol m-1 s-1durchgeführt. Führen Sie anders angegeben, alle Bakterien Manipulation und in-vitro- Pflanzen Transfers unter aseptischen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Haube. Die Medien-Rezepte für Agrobacterium und in-vitro- Pflanzen-Kulturen sind in Tabelle S1vorgesehen.

Vorsicht: Hinterlegen Sie alle gentechnisch veränderten Bakterien und Pflanzen, um die entsprechenden Abfallbehälter.

1. Agrobacterium Kulturen für die Transformation verwendet

Hinweis: Der Stamm für A. Rhizogenes Transformation verwendet wurde die C58C1:Pri15837 (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Inge Broer) und das für die A. Tumefaciens war die GV2260 (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Salomé Prat). A. Rhizogenes wandelte sich mit der binären Vektor PK7GWIWG2_II-RedRoot (VIB-Abteilung der Pflanze Systembiologie an der Universiteit Gent; http://gateway.psb.ugent.be), die eine T-DNA tragen einen Transformation Marker zur Überwachung der behaarte Wurzel enthält Bildung. Um die transformierten Wurzeln von A. Rhizogenes und A. Tumefacienserzeugt zu vergleichen, wurden beide mit binären Vektor pKGWFS7 transformiert enthält eine T-DNA tragen der FHT-Promoter fahren das Reportergen β-Glucoronidase (GUS) und Kanamycin-Resistenz-Gen wie eine auswählbare Markierung15.

  1. Wählen Sie eine Kolonie von Agrobacterium und wachsen sie über Nacht (O/N) in einem 50 mL Zentrifugenröhrchen bei 28 ° C mit Schütteln bei 200 u/min in 5 mL YEB Medium mit Antibiotika (Tabelle S1) ergänzt.
  2. Für A. Tumefaciens Transformation, Messung die optische Dichte, die OD600 sein muss = 0,6-1,0.
    1. Wenn die optische Dichte höher ist, machen eine Subkultur auf OD600 senken = 0,3 mit frischen Medien und warten, bis die Kultur OD600 erreicht = 0,6-1.
  3. Zentrifugieren Sie 1 mL Agrobacterium Kultur bei 3.000 X g in einer Benchtop-Zentrifuge für 10 min bei Raumtemperatur.
  4. Entfernen des Überstands durch pipettieren und Aufschwemmen Zellen in 1 mL frisches YEB Medium ohne Antibiotika. Wiederholen Sie diesen Schritt, um die vollständige Entfernung von Antibiotika zu gewährleisten.
    1. A. Tumefaciens Transformation, in der letzten Wiederfreisetzung hinzufügen der entsprechende YEB Volumen um eine endgültige optische Dichte OD600 zu erhalten = 0,8.
  5. Halten Sie Zellen auf Eis, während der Vorbereitung der Pflanzen infiziert werden.

(2) Pflanzenmaterial für transformation

  1. Machen Sie ein oder zwei Knoten Stamm Stecklinge entweder mit der apikalen oder die Hilfs Knospen von sterilen in Vitro Kartoffelpflanzen (Spenderpflanzen); für 3 bis 4 Wochen (Abbildung 1A und Abbildung 2A) in festen 2MS Medium in Töpfen wachsen.

3. Pflanzen Sie Transformation mit A. Rhizogenes (Abbildung 1)

Hinweis: Dieses Verfahren ermöglicht die Erlangung der transformierten behaarte Wurzeln. Um die Expression des Transgens zu bewerten, braucht man eine Negativkontrolle. Vorbereiten der Negativkontrolle, folgen den Anweisungen, die mit einer A. Rhizogenes Sorte entweder untransformierten oder mit leerer Vektor transformiert, das Markergen Transformation enthält.

  1. Verwenden Sie frische Medien Platten; Alternativ können die Platten bei 4 ° C mit dem Deckel nach oben, dicht mit Klarsichtfolie um Medien Dehydrierung zu vermeiden gehalten werden. Um den quadratischen Medien Platten vorzubereiten, neigen sie ~ 15°, füllen sich mit 40 mL von MS, und ließ sie erstarren. Dies minimiert den Kontakt der Luft Teil der Pflanze mit dem Medium.
  2. Sehr sorgfältig eine Spender-Pflanze aus dem 2MS Medium zum Übertragen einer quadratischen Platte 120 mm x 120 mm
  3. Zu einem Stamm Internodium 3 μL der A. Rhizogenes Kultur mit einer chirurgischen Nadel injiziert, und wiederholen Sie es zweimal pro Pflanze in verschiedenen Internodien wenn möglich.
    Bitte beachten Sie jeder Injektion als unabhängige Transformationsereignis (Abbildung 1 b).
  4. Übertragen Sie sofort die gesamte Anlage auf eine quadratische Platte mit festem MS Medium mit 0,1 mM Acetosyringone ergänzt. Platz für 2 Pflanzen pro Platte.
    Hinweis: Die 1 M Acetosyringone Stammlösung wird in DMSO vorbereitet und kann bei-20 ° c gelagert werden
  5. Die Dichtplatte mit chirurgischen Klebeband und ordnen sie vertikal im Inneren ein Wachstum Schrank für 4 Tage.
  6. Übertragen Sie die Pflanze auf eine neue quadratische Platte mit MS Medium ergänzt mit Cefotaxim Natrium [500 µg/mL], A. Rhizogeneszu töten.
  7. Nach 10-12 Tagen startet behaarte Wurzeln (Abbildung 1,1D) angezeigt werden. Dann, Verbrauchsteuern Sie die native Wurzeln der Pflanze, und übertragen Sie die Anlage auf eine neue quadratische Platte mit MS Medium ergänzt mit Cefotaxim Natrium [500 µg/mL].
    Hinweis: Transformierte behaarte Wurzeln können durch rote Fluoreszenz überprüft werden, wenn Sie einen DsRed Transformation Marker (Abbildung 3D) zu verwenden.
  8. Um ein zusammengesetztes Werk (Abbildung 1E) zu erhalten, lassen Sie die transgenen behaarte Wurzeln wachsen seit ca. 3-4 Wochen in MS Medium ergänzt mit Cefotaxim Natrium [500 μg/mL] (das Medium wechseln jede Woche).
  9. Je nach Verwendungszweck propagieren Sie die transgenen behaarte Wurzeln und den Negativkontrollen wie folgt.
    1. Übertragen Sie die ganze zusammengesetzte Pflanze auf eine Hydrokultur (Tabelle S2) oder Boden-Medium für massive Entwicklung ermöglichen.
    2. Um individuell die transformierten behaarte Wurzeln ausbreiten, mit einem Skalpell schneiden Sie die Wurzeln mit dem Ausdruck des Markers rot fluoreszierende Transformation (DsRed Protein) Wenn sie 4 bis 8 cm lang (Abb. 1E) und übertragen Sie sie in eine Petrischale mit festem Medium Gamborg B5 mit 2 % Saccharose und Cefotaxim Natrium [500 μg/mL] ergänzt. Versiegeln Sie die Platten mit Kunststofflabor Film zu und wachsen sie im Dunkeln bei 20 ° C.
      Hinweis: Die Wurzeln können manipuliert werden, unter einem Stereomikroskop ausgestattet, um die Fluoreszenz unter sterilen Bedingungen erkennen (siehe Tabelle der Materialien).
    3. Für die Erzeugung von Biomasse (z.B. gen Expressionsanalyse) eine 5 cm langen behaarten Wurzel schneiden und in einer 150 mL Erlenmeyerkolben mit 20 mL des flüssigen Mediums Gamborg B5 ergänzt mit 2 % Saccharose und Cefotaxim Natrium [500 µg/mL] zu verbreiten. Für 6 Wochen im Dunkeln bei 20 ° C und 60 u/min wachsen.

Figure 1
Abbildung 1: Timeline zu Kartoffel transgenen behaarte Wurzeln mit A. Rhizogenes. Die kumulative Wochen zu jeder Phase des Transformationsprozesses und die nachfolgenden Schritte, die haarigen Wurzeln wachsen werden angezeigt. Repräsentative Bilder von verschiedenen Phasen dargestellt: die Einleitung des Prozesses mit 3 Wochen altes Baby in-vitro- Pflanzen (A), dann Infektion der Pflanzen durch die Injektion von A. Rhizogenes (B), die Bildung von der proliferativen Gewebe (C, Pfeile) mit aufstrebenden behaarte Wurzeln (D), und die entwickelten behaarte Wurzeln rot fluoreszierende Transformation Marker DsRed (E) zum Ausdruck zu bringen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

4. Pflanzen Sie Transformation mit A. Tumefaciens (Abbildung 2)

Hinweis: Dieses Verfahren ermöglicht die Erlangung der transformierten Pflanzen. Um das Transgen Effekt zu bewerten, braucht man eine Negativkontrolle. Eine Möglichkeit ist, das Verfahren mit einer A. Tumefaciens mit leerer Vektor transformiert zu folgen. Alternativ können die Wildtyp-Pflanzen verwendet werden.

  1. Schneiden Sie und legen Sie ein Blatt aus den 3-4 Wochen alten Pflanzen (Abbildung 2A) in einer Petrischale. Mit einem Skalpell schließen Sie der Blattstiel aus und kürzen Sie quer (1-3 je nach Blattgröße) von der Mitte des Blattes auf die Kanten vermeiden sie abzuschneiden (Abb. 2 b).
  2. Sofort legen Sie das Blatt schwimmt auf 10 mL frisches 2MS flüssige Medien in einer Petrischale mit der abaxial Seite oben und schließen Sie die Platte. Wiederholen Sie der Schritt, die Platz für bis zu 15 Blätter für CV Désirée und 25 Blätter für SSP einNdigena (abhängig von der Blattgröße).
  3. Fügen Sie sofort 80 µL A. Tumefaciens Kultur am OD600 = 0,8 in flüssigen Medien und homogenisieren die Platte manuell für 1 min um die bakterielle Lösung zu verteilen.
  4. Sorgfältig mit Film Abdichtung dichten Sie ab, mit Alufolie decken Sie ab und inkubieren Sie für 2 Tage in einer Kammer bei 24 ° C, die Transformation auftreten zu lassen.
  5. Übertragen Sie die Blätter halten abaxial Seite bis zum CIM Medium (Abb. 2 b) und inkubieren sie für eine Woche im Kabinett ein Wachstum.
    1. Kratzen Sie das CIM-Medium mit der Pinzette, so dass die Blätter auf dem Medium besser untergebracht werden können.
  6. Übertragen Sie die Blätter halten abaxial Seite bis zum SIM-Medium (Abbildung 2) und inkubieren sie in einem Schrank, erfrischend das Medium alle 7-10 Tage, bis die Triebe sind ca. 2 cm hoch Wachstum.
    1. Kratzen Sie SIM-Medium mit der Pinzette, so dass die Blätter vollständig von den Medien umgeben sein können. Wenn die entstandenen Triebe den Deckel erreichen, arbeiten mit hohen Petrischalen (100 x 20 mm, Höhe x Durchmesser).
      Hinweis: Die Hornhaut wird nach 2-3 Wochen in SIM-Medium (Abb. 2D) und die Triebe nach 6-7 Wochen (Abbildung 2E) bilden. Die Triebe gelten als unabhängige Transformation Ereignisse aus, wenn sie von Kallus gebildet aus unabhängigen Wunden entstehen.
  7. Schnitt drei schießt aus jeder Kallus (als das gleiche Transformationsereignis) entstanden (Abb. 2E), Transfer, Kulturflaschen mit MG Medium ergänzt mit Cefotaxim Natrium [250 mg/L] erlauben, Verwurzelung, beschriften Sie die Teilmenge mit einer Reihe und inkubieren Sie in einen Schrank für 3-4 Wochen oder bis die Triebe kräftig (Abb. 2F) Wachstum.
    Hinweis: Wenn die Triebe schneiden, entfernen Sie auch die Hornhaut sonst die Wurzel nicht bilden.
    1. Wiederholen Sie den Schritt so oft wie unabhängige Linien benötigt werden. Bis zu 5 verschiedenen Transformation können Veranstaltungen platziert werden, in einem Kultur-Kolben mit einem Durchmesser von 8 cm, vertrauensvoll zu arbeiten, die die Pflanzen aus verschiedenen Veranstaltungen nicht gemischt werden.
  8. Wählen Sie die kräftigste Pflanze jedes Ereignisses, schneiden Sie die apikale Segment des Shootings mit 3-4 Internodien und legen Sie sie in eine neue Kultur-Kolben mit 2MS Medium mit Cefotaxim Natrium [250 mg/L] ergänzt.
    Hinweis: In 3-6 Wochen wachsen die Pflanzen effizient entwickeln, ein kräftiges Shooting und Wurzeln.
    1. Zurückbringen der Kammer die nicht ausgewählten Triebe bis die ausgewählte Pflanze voll entwickelt hat.
  9. Geschnitten Sie Stamm Segmente aus der Pflanze mit mindestens einem Internodium oder mit der apikalen Knospe und übertragen Sie sie auf neue 2MS Medium mit Cefotaxim [250 mg/L] ergänzt. Inkubieren sie im Kabinett Wachstum.
    1. Replizieren Sie alle 3-4 Wochen um die in-vitro- umgewandelt-Linien zu etablieren.
      Hinweis: Das Cefotaxim Natrium wird in mindestens drei nachfolgenden Überweisungen auf 2MS Medium um sicher zu sein benötigt, A. Tumefacienszu töten; Danach, wenn A. Tumefaciens Überwucherung zu beobachten ist, übertragen Sie die Pflanzen wieder auf 2MS Medien ergänzt mit Cefotaxim Natrium.
  10. Um die Pflanze Phänotyp zu charakterisieren, übertragen Sie Pflanzen in Erde für ihre vollständige Charakterisierung oder Hydrokultur Kultur zur Wurzel Inspektion.
    1. Halten Sie die Knollen im Boden zu propagieren und behalten die etablierten Linien produziert.

Figure 2
Abbildung 2: Timeline zu Kartoffel verwandelt Pflanzen mit A. Tumefaciens. Die kumulative Wochen, jede Phase des Transformationsprozesses und die nachfolgenden Schritte, die Pflanzen wachsen zu erreichen sind gezeigt. Repräsentative Bilder von verschiedenen Phasen dargestellt: die Einleitung des Prozesses mit Blätter aus 3 - Wochen alten in-vitro- Pflanzen (A), die Übertragung der Verwundeten und infizierten Blätter an die CIM-Medien (B), die Blätter bei der Übertragung auf SIM-Medien (C), die Visualisierung der Kallus um die verwundeten Bereiche nach 2-3 Wochen in SIM-Medien (D), die schießen-Bildung nach 9-11 Wochen in SIM-Medien (E) und die Triebe nach MG Medien (F) übertragen werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

5. Hydrokultur

  1. Bereiten Sie die Hoagland Lösung um eine halbe Stärke (0,5 X) (Tabelle S2) in einen 10 L Eimer.
  2. Tauchen Sie eine Aquariumpumpe um Homogenität und ordnungsgemäße Sauerstoffbedingungen beizubehalten.
  3. Bedecken Sie die Wände des Eimers mit Alu-Folie, Wurzeln im Dunkeln wachsen.
  4. Übertragen Sie Vermeidung von Wurzelschäden, in-vitro- Pflanzen auf Hydrokultur.
    Hinweis: Entfernen Sie alle verbleibenden in-vitro- Medium aus Wurzeln, Mikroorganismus Verbreitung während der Inkubation durch Schütteln sorgfältig die Wurzeln in Wasser getaucht zu vermeiden.
  5. Decken Sie die Pflanzen mit transparenter Folie wie ein Gewächshaus, damit ausreichende Akklimatisierung und in der wachsenden Kammer inkubieren.
  6. Machen Sie Löcher in die Folie nach 3 Tagen und entfernen Sie es komplett eine Woche nach.
  7. Ersetzen Sie durch neue Medien alle 10 Tage.

6. GUS histochemische Reporter-gen-Test

Hinweis: In unserem Fall die GUS erfolgte Analyse mit Wurzeln von 2-3 Wochen in Hydrokultur oder in Vitrogewachsen.

  1. Befestigen Sie die Wurzeln mit 90 % gekühlt Aceton (V/V) und inkubieren Sie es 20 Minuten lang auf Eis.
  2. Führen Sie zwei Wäschen mit destilliertem Wasser.
  3. Fügen Sie frische GUS Färbelösung (Tabelle 1) und gelten Vakuum (-70 Pa) für 20 Minuten.
  4. Inkubation bei 37 ° C im Dunkeln zum Schutz der lichtempfindlichen GUS für 4 h oder bis eine blaue Farbe sichtbar ist.
    Hinweis: Das Vorhandensein von Ferri und Ferrocyanid in GUS Lösung minimieren die Diffusion von Reaktionsprodukten und liefern genauere Lokalisierung.
    Achtung: Verwenden Sie eine Abzugshaube und Schutzkleidung beim Umgang mit der giftige Zyanid-Derivate in GUS-Lösung (Kalium Ferricyanid und Kaliumferrocyanid). Das GUS-Substrat und die Entsorgung Material sollte sicher entsorgt werden.
  5. GUS Färbelösung zu entfernen und in entsprechenden Behältern entsorgen.
  6. Führen Sie zwei Wäschen mit Ethanol 70 % (V/V).
  7. Unter dem Hellfeld-Mikroskop beobachten.
    Hinweis: GUS Färbung bleibt für ein paar Wochen relativ stabil. jedoch während der ersten Woche der GUS-Signal ist klar und weniger ins benachbarte Zellen diffundiert. Bei längerer Lagerung das Rohr zu versiegeln und bei 4 ° c lagern

Table 1
Tabelle 1: GUS Färbung Lösung Rezept.

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Representative Results

Agrobacterium rhizogenes -vermittelte Umwandlung der Kartoffel

In diesem Manuskript präsentiert das Schritt für Schritt Verfahren eingerichtet, um transformierte Wurzel mit A. Rhizogenes zu erhalten. Abbildung 1 zeigt eine Übersicht über das Verfahren, das insgesamt rund 5 bis 6 Wochen (von Injektion von A. Rhizogenes dauert , ausgereifte behaarte Wurzeln zu erhalten). Dann kann die Pflanze untersucht werden, als ein Composite (Wildtyp-Shooting, transgenen Root) oder die transgenen behaarte Wurzel Klone herausgeschnitten und autonom in festen Gamborg B5 Medium ergänzt mit 2 % Saccharose angebaut werden können. Alternativ können die behaarten Wurzeln mit den Flüssigmedien Gamborg B5 massiv vermehrt werden. Das Verfahren vorgestellt wurde mit S. Tuberosum spp. Tuberosum (CV Désirée) durchgeführt.

Die Methode, das Verfahren zu überwachen und Kartoffel transgenen behaarte Wurzeln zu erhalten wurde mit einem binären Vektor mit der DsRed als Transformation Marker (PK7GWIWG2_II-RedRoot von VIB-Abteilung der Pflanze Systembiologie an der Universiteit Gent) validiert. Dies erlaubt die Unterscheidung von transgenen behaarte Wurzeln von nicht-transgenen durch die rote Fluoreszenz. Demnach ausgestellt die transformierten behaarte Wurzeln in Abbildung 3 rote Fluoreszenz mit grünem Licht beleuchtet. Die negative-Kontrolle mit der untransformierten Agrobacterium zeigte keine rote Fluoreszenz (Abbildung 3), insgesamt zeigt die Eignung des Markers aus DsRed Transformation, die transgenen behaarte Wurzeln (Abbildung 3D) zu identifizieren. Weitere Umwandlung Marker wie z. B. Antibiotika-Resistenz können verwendet werden, wie von anderen Autoren23,24beschrieben; Allerdings können die Antibiotika in den Medien ein verzögertes Wachstum in transgenen Wurzeln mit dem Marker produzieren.

Figure 3
Abbildung 3: Fluoreszierende transgenen behaarte Wurzeln der Kartoffel (CV Désirée) von A. Rhizogenesumgewandelt. Die haarigen Wurzeln stammen mit einer nicht-transformierten A. Rhizogenes (Stamm C58C1: pRI1583) (A und C) und mit A. Rhizogenes (Stamm C58C1:pRI1583) verwandelt sich das leere Vektor pK7GWIWG2_II-rot-Root tragen ein DsRed Transformation Marker (B und D). Die behaarten Wurzeln sind beide Infektionen (A, B) gegründet, aber rote Fluoreszenz ist nur bei behaarte Wurzeln mit A. Rhizogenes mit dem binären Vektor transformiert. Die Bilder wurden mit einem Stereomikroskop mit einer Lampe und einen bestimmten Filter ausgestattet, um die rote Fluoreszenz sichtbar zu machen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Agrobacterium tumefaciens -vermittelte Umwandlung der Kartoffel

Das zweite Protokoll beschrieben in diesem Manuskript soll erhalten, Schritt für Schritt eine komplette Kartoffelpflanze mit A. Tumefacienstransformiert. Abbildung 2 zeigt einen Überblick über das Verfahren, das insgesamt zwischen 15-18 Wochen (vom Blatt Infektion mit A. Tumefaciens zur Erlangung voll regenerierter Pflanzen dauert). Der zeitaufwendigste Teil des Verfahrens ist die Pflanze Regeneration durch Organogenese. Diese bestimmte Schritt macht diese Methode aufwendiger als die Verwendung von A. Rhizogenes. Das Verfahren wurde mit S. Tuberosum spp. Tuberosum (CV Désirée) und S. Tuberosum SSP. Andigena, das ehemalige sein weniger abhängig von harzenden Bedingungen, Tuberization. induzieren durchgeführt

In A. Tumefaciens-vermittelten Transformation, im Gegensatz zu den A. Rhizogenes -vermittelten Umwandlung, regenerierten Pflanzen sind vollständig transgene Organismen. Jedoch obwohl die transgenen Pflanzen in eine Kanamycin Selektivmedien regeneriert werden, zum Ausdruck bringen nicht alle Positionen effizient des Transgens. Daher ist die Validierung des Transgens Ausdrucks erforderlich.

Vergleich der FHT-Promotoraktivität in Wurzeln erhalten mit A. Tumefaciens und A. rhizogenes

Die oben genannten Verfahren wurden eingesetzt, um die Wurzeln mit dem Ausdruck des GUS -Gens unter den Promotor des FHT -gen zu produzieren. Die komplette verwandelt Pflanzen mit A. Tumefaciens wurden bisher gemeldeten15, verwenden die binären Vektor-pKGWFS7 mit der FHT -Promoter. Nun, dieser binären Vektor verwendet wurde, um produzieren neue transformierte behaarte Wurzeln um das Gewebe zu vergleichen wo ist der Projektträger aktiv und daher behaarte Wurzelsystem als Instrument zur Promotor Aktivierung Studie zu testen.

Abbildung 4 zeigt GUS Färbung in Wurzeln von transgenen Pflanzen erhalten durch A. Tumefaciens (Abbildung 4AB) und transgenen behaarte Wurzeln erhalten durch A. Rhizogenes (Abbildung 4D, E, F), bzw.. Wie ersichtlich, Wurzeln mit A. Tumefaciens transformiert und angebaut in Vitro zeigen blaue Färbung in der Endodermis (Abbildung 4A), einer Zellschicht zwischen der Rinde und der Stele. In mehr entwickelten Wurzeln, die blaue Kennzeichnung ist durchwachsen in die äußere Schicht, die Exodermis (Abbildung 4 b) entspricht. Im transformierten behaarte Wurzeln in Hydrokultur angebaut der GUS-Marker speziell in der Endodermis (Abbildung 4E), bei der Entstehung von Seitenwurzeln (Abbildung 4E), die verwundeten Bereiche (Abbildung 4E befand sich im ) und in der Exodermis (Abb. 4F). Die Wurzeln zeigten kein GUS-Fleck in Negativkontrollen, die beiden haarigen Wurzeln ohne die PromFHT:GUS T-DNA-Kassette oder Wildtyp-Wurzeln waren.

Figure 4
Abbildung 4: Histochemische Beobachtung der transgenen Kartoffeln Wurzeln mit dem Ausdruck der GUS -Reporter-Gens getrieben durch den Promotor des FHT. Die Wurzeln von komplette transgene Pflanzen gewonnen durch A. Tumefaciens (S. Tuberosum SSP. Andigena) Transformation (A-B) zeigen blaue Färbung in der Endodermis (A) und die Exodermis (B). Die transgenen behaarte Wurzeln durch A. Rhizogenes (S. Tuberosum SSP. Tuberosum CV Désirée) Transformation (C-F) anzeigen GUS Färbung in der Endodermis (C und E), in die seitliche Wurzel gewonnen Entstehung (D und E), in der Wundheilung Zone (E) und in der Exodermis (F). Endodermis (EN); Exodermis (EX); Xylem (XL); Primordia der seitliche Wurzel (LR). Der rote Pfeil zeigt den verletzten Bereich. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Tabelle S1: Medien-Rezepte verwendet für wachsende Bakterien und in-vitro- Pflanzen.  Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterladen

Tabelle S2: Halbe Kraft Hoagland-Lösung für den Anbau von Kartoffelpflanzen in Hydrokultur. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterladen

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Discussion

In Kartoffel benutzt die häufigste System stabilere komplette transgene Pflanzen erhalten die Transformation durch Agrobacterium Tumefaciens Stämme, die Organogenese mit exogenen Phytohormone erfordern. Obwohl die Agrobacterium basierte Protokolle hat das Potenzial, T-DNA-Vektor Sequenz25zu integrieren, steht diese Methode immer noch die einfachste und weniger teuer Kartoffelpflanzen zu verwandeln. In letzten Jahren das Interesse an A. Rhizogenes-vermittelten Transformation hat die Aufmerksamkeit der Forscher dafür, dass transgene Wurzeln in kürzere Zeiträume als die Verwendung von A. Tumefacienszu erhalten. A. Rhizogenes bewahrt das Wurzel-induzierende (Ri) Plasmid, das einen Satz von Genen Codierung Enzyme für die Phytohormon Auxin Kontroll- und Cytokinin Biosynthese trägt, und Codierung für26meint. Sobald die Ri T-DNA in die Host genomischer DNA eingesetzt wird, dereguliert das neue hormonelle Gleichgewicht die infizierten Zellen, die Induktion der Bildung von wuchernden Wurzeln, behaarte Wurzeln, entstehen an den Stellen der Infektion27genannt. Wenn ein zusätzliche binären Vektor für die Integration fremden DNS verwendet wird, verleiht die Erhaltung des Plasmids Ri die Möglichkeit um transformierte behaarte Wurzeln ohne Notwendigkeit der Organogenese mit exogen applizierte Phytohormone28zu erhalten. Die haarigen Wurzeln können beibehalten werden können, an das Wildtyp-Shooting eine zusammengesetzte Erzeugungsanlage angeschlossen oder selbst propagierten. Diese Fähigkeit des behaarten Wurzeln selbst propagieren wird ausgebeutet, als ein biologisches System für mengenproduzierenden wertvolle Stoffwechselprodukte oder Fremdeiweiße, Generierung von Interessen in der Pharmazie und sogar Phytosanierung Bereiche (in mehreren behaarte Wurzeln der Pflanzen zu produzieren (siehe Beitrag29,30). Kartoffel (var. Kufri Bahar) infiziert wurden transgene Komplettanlagen mit Wildtyp A. Rhizogenes Stamm, behaarte Wurzeln mit dem Ausdruck der Hepatitis B Oberflächenantigenen (HBsAg)23zu produzieren. Alternativ erhalten Sie eine komplette transgene Pflanze regeneriert von behaarten Wurzeln, aber Kartoffelpflanze und Knollen zeigten deutliche Entwicklung im Vergleich zu den untransformierten Kontrollen. Diese Unterschiede im Erscheinungsbild sind aufgrund der original Ri T-DNA in das Genom31,32integriert.

In dieser Arbeit die Modalitäten zu transgenen stabile behaarte Wurzeln mit A. Rhizogenes und transgene stabile Pflanzen mit A. Tumefaciens werden dargestellt (Abbildung 1 und Abbildung 2). Die voll entwickelten transgenen behaarte Wurzeln wurden in ca. 5-6 Wochen, während transgene Wurzeln mit A. Tumefaciens 15-18 Wochen aufgrund der Organogenese Voraussetzung von transformierten Zellen, und die Auswahl und die Vermehrung von transformierten Pflanzen benötigt. In unseren Händen arbeitet die A. Tumefaciens Transformationsprozedur effizient in S. Tuberosum SSP. Andigena und SSP. Tuberosum (CV Désirée), mit einem gemeldeten Transformationseffizienz rund 35 %22 und 48 % 12, beziehungsweise. Die beschriebene A. Rhizogenes Transformationsprozedur basiert auf dem von Horn7gemeldeten, die zeigten einer hohes (80-100 %) Transformationseffizienz in CV Désirée und andere drei Kartoffel-Sorten (Albatros, Sabina und Saturna).

A. Rhizogenes als alternative Transformation System für Kartoffel funktionelle Studien zu präsentieren und um anzugeben, ob die erste Anwesenheit von Ri T-DNA Anliegen war, verwendeten wir Vektor beider Systeme, Kartoffel Wurzeln mit der gleichen binären zu verwandeln eine T-DNA mit einem Promotor eines Suberin biosynthetischen Gens (FHT) fahren den Ausdruck des GUS -Reporter-Gens enthalten. Histochemische Analyse ergab, dass in A. Tumefaciens Pflanzen verwandelt, die Aktivität des Veranstalters FHT war in den inneren und äußeren suberized Schichten der Wurzeln (Endodermis und Exodermis, beziehungsweise) (Abbildung 4A,B ) und auch im Bereich der Blätter, Stängel und Knolle15verwundete. In A. Rhizogenes verwandelt behaarte Wurzeln wurde die Aktivität auch in Endodermis und Exodermis und im Bereich Verwundeten Wurzel (Abb. 4E) nachgewiesen. Das gleichzeitige Auftreten von Suberin-Promotoraktivität in beide Arten von transformierten Stämmen weist darauf hin, dass die Ri T-DNA integriert ist nicht zum Nachteil der Entwicklungsprozesse, die im Zusammenhang mit Verkorkung mindestens in dieser Wurzel-Gewebe. Im transformierten behaarte Wurzeln erkannt wir auch Aktivität der FHT -Promoter in den Gebieten um die Entstehung von Seitenwurzeln (Abbildung 4,E). Dies stimmt mit der Promotoraktivität berichtet durch andere Gene beteiligt bei der Beförderung von Suberin Monomere wie ABCG11 / WBC1133,34,35,36 oder der Regler StNAC103 19. die Kartoffel Umwandlung von A. Rhizogenes , ein Suberin-gen zu studieren hat bereits berichtet worden vor kurzem37 und auch in diesem Fall behaarte Wurzeln haben, zeigen die Veranstalter-Aktivierung des CYP86A33, eine Fettsäure erlaubt Ω-Hydroxylase. Doch die GUS Färbung in Wurzeln war Bulk quantifiziert mit einem fluorometrischen Assays, damit die Konkretisierung in suberized Gewebe wurde nur vermutet.

Insgesamt verarbeitet diese Ergebnisse nachweislich A. Rhizogenes Transformation ist ein schneller alternative Werkzeug zur typspezifischen Promotor Zellaktivierung von Suberin-Genen in den Wurzeln, zu erforschen, die auf Studien, die auf anderen verlängert werden kann in Wurzeln auftreten. Einig, haben einige andere funktionale genetische Studien erfolgreich mit A. Rhizogenes in Kartoffel, Tomate und Eukalyptus um zu zeigen, die gen-Funktion6,7,8,9, um zu studieren die hormonelle Antwort38,39 oder der Promotor-Aktivität40,41. Jedoch kann diese Strategie noch Einschränkungen, darstellen, besonders wenn streng kontrolliert Entwicklungsprozesse studiert, die von Ri T-DNA oder wenn die gesamte Pflanze oder die Knollen oder andere Organe anders als Wurzeln zu untersuchenden dereguliert werden kann. In diesen Situationen ist das A. Tumefaciens Transformation System noch bevorzugt.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von dem Ministerio de Innovación y Ciencia (AGL2009-13745, FPI Grant, PB), Ministerio de Economía y Competitividad und FEDER Mittel (AGL2012-36725, AGL2015-67495-C2-1-R) und der Universität Girona (Promotionsstipendium an SF und Grant unterstützt. SING11/1). Die Autoren sind dankbar, dass Dr. Inge Broer (Institut für Landnutzung, Universität Rostock, Rostock, Deutschland) und Dr. Salomé Prat (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid, Spanien) für die Bereitstellung der A. Rhizogenes und A. Tumefaciens Belastung, bzw., und Dr. Marçal Soler und Dr. Anna Plasencia für die Hilfe und Unterstützung bei der Einleitung von A. Rhizogenes Transformation Experimente (Toulouse III Universität Paul Sabatier-CNRS, Plant Research Laboratory (LRSV), Kastagnetten eine (Frankreich). Die Autoren danken Sara Gómez (Departament de Biologia, UdG, Girona) für ihre wertvolle Unterstützung bei der Durchführung der Laborarbeit und die Betreuung der Pflanzen, und Ferran Fontdecaba und Carla Sánchez, die unterstützt mit einige der Experimente, während sie dabei waren Ihre endgültige Diplomarbeiten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Acetone

Panreac

1.310.071.21

Acetosyringone

Acros

115540050

Aquarium pump

Prodac

MP350

Autoclave

Ragpa Strelimatic

Bacteriological agar

Lab Conda

1800

BAP

Duchefa

B0904

Beef extract

Lab Conda

1700

Plant growing cabinet

Nuaire

Carbenicillin

Duchefa

C0109

Cefotaxime sodium

Duchefa

C0111

DMSO

Merck

1029310161

Ecotron infors

HT

29378

Ethanol

Merck

1,009,831,011

Falcon tube

Control tecnica

CFT011500

Ferricyanate

Sigma

101001081

Ferrocyanate

Sigma

100979088

Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture

Apiglass

ref16

GA3

Sigma

G7645

Gamborg B5 media

Duchefa

G0210

Gelrite

Duchefa

G1101

Glucosa

Sigma

G5767

Kanamycin

Sigma

K1377

Leukopor tape

BSN Leukopor

BDF47467

Lupe

Wild-Heerbrugg

M420

Magnetic shaker

Agimatic

7000243

MES hydrate

Sigma

M2933-25G

MgSO4

Panreac

131404

Microscope

Olympus

Minufugue centrifugue 5415R

Eppendorf

Murashige and Skoog media

Duchefa

M0254.0050

Na2HPO4

Panreac

131679

NAA

Duchefa

N0903

NaCl

Panreac

131659

NaH2PO4

Sigma

58282

NightSea Stereo

SFA Moonting Adapter

Parafilm

Anorsa

PRFL-001-001

Peptone

Lab Conda

1616

Petri dishes (90 x 14)

Anorsa

200200

pHmetre

Crison

Phytotron

Inkoa

RFTI-R5485

Plant Agar

Duchefa

P1001

Refrigeratot

Liebherr Medline

Rifampicin

Duchefa

R0146

Spectinomycin

Sigma

59007

Spectrophotometer

Shimadzu

Square plates (120 x 120)

Deltalab

200204

Streptomycin

Sigma

S6501

Sucrose

Panreac

131621

Surgical blades

Swann-Morton

201

Surgical needle

NIPRO

015/0204

Triptone

Lab Conda

1612

Triton

Serva

37240

Unimax 1010 shaker

Heidolph

Vacuum

Dinko

x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous)

Biosynth

B-7398

Yeast extract

Lab Conda

1702.00

Zeatin riboside

Sigma

1001042850

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