Kvantitativ analyse af cellulære sammensætning i avancerede aterosklerotiske læsioner af glat muskel celle afstamning sporingen mus

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi foreslår en standardiseret protokol for at karakterisere den cellulære sammensætning af sene murine aterosklerotiske læsioner herunder systematiske metoder til animalsk dissektion, væv indlejring, skæring, farvning og analyse af brachiocephalic arterier fra atheroprone glat muskel celle afstamning sporingen mus.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Mahan, S., Liu, M., Baylis, R. A., Gomez, D. Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice. J. Vis. Exp. (144), e59139, doi:10.3791/59139 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Åreforkalkning er stadig den hyppigste årsag til dødsfald på verdensplan, og trods utallige prækliniske undersøgelser beskriver lovende terapeutiske mål, Roman interventioner har forblev undvigende. Dette er sandsynligvis skyldes, dels at en afhængighed af prækliniske forebyggelse modeller undersøge effekten af genetiske manipulationer eller farmakologiske behandlinger på udvikling af åreforkalkning snarere end de etablerede sygdom. Også, resultaterne af disse undersøgelser er ofte forstyrrende på grund af brugen af overfladisk læsion analyser og manglende karakterisering af læsioner cellepopulationer. For at hjælpe med at overvinde disse translationel forhindringer, foreslår vi en øget afhængighed af intervention modeller, der beskæftiger undersøgelse af ændringer i cellulære sammensætning på en enkelt celle niveau af immunfluorescent farvning og konfokal mikroskopi. Til dette formål beskriver vi en protokol for at teste en formodede terapeutisk agens i en murine intervention model herunder en systematisk tilgang til animalsk dissektion, indlejring, skæring, farvning og kvantificering af brachiocephalic arterie læsioner. Derudover den fænotypisk variation af celler i sene aterosklerotiske læsioner beskriver vi betydningen af at bruge celle-specifikke, inducerbar afstamning sporingen mus systemer og hvordan dette kan udnyttes til upartiske karakterisering af aterosklerotiske læsioner cellepopulationer. Sammen, disse strategier kan hjælpe vaskulære biologer at mere præcist model terapeutiske interventioner og analysere aterosklerotisk sygdom og forhåbentlig vil oversætte til en højere sats for succes i kliniske forsøg.

Introduction

Åreforkalkning er den hyppigste årsag til sygelighed og dødelighed på verdensplan ligger bag flertallet af koronar arteriesygdom, perifer arterie sygdomme og slagtilfælde. Sene koronar aterosklerose kan føre til alvorlige komplikationer, herunder Myokardie overtrædelse tegner sig for næsten 16% af verdens befolkning dødelighed1,2. På grund af dens ødelæggende indvirkning på folkesundheden, er der sket betydelige indsats at dechifrere de mekanismer, der driver åreforkalkning progression, samt for at udvikle nye terapeutiske strategier. Endnu, sandsynligheden for godkendelse (LOA) satsen for kliniske forsøg for hjerte-kar-sygdom er blandt de laveste sammenlignet med andre kliniske felter (kun 8,7% for fase I)3. Dette kan forklares i en del af mange hindringer at åreforkalkning udgør for effektive stof udvikling herunder dens næsten allestedsnærværende, klinisk tavs progression og betydelig sygdom heterogenitet. Suboptimal udformningen af prækliniske dyreforsøg kan desuden også være regnskabsmæssigt manglende succes i klinisk oversættelse. Specifikt, mener vi, at det er nødvendigt at gennemføre intervention undersøgelser når det er muligt at undersøge effekten af terapeutiske strategier. Der er også et kritisk behov for at udføre standardiserede procedurer for læsion analyser herunder avancerede karakterisering af sene aterosklerotisk læsion cellulære sammensætning af skæbne kortlægning og fænotyper.

Langt størstedelen af åreforkalkning studier fokusere på modeller af åreforkalkning forebyggelse bestående af narkotika behandling eller gen manipulation (knockout eller knock-in) i sunde unge mus, inden sygdommen indledningen og progression. Disse undersøgelser har afsløret en lang række gener og signalering molekyler, der spiller en rolle i udvikling af åreforkalkning. Men de fleste af disse mål ikke at oversætte til effektive behandlinger i menneskelige. Det er vanskeligt at ekstrapolere den effekt en terapi har på sunde unge mus til ældre patienter med avanceret aterosklerotiske læsioner. Som sådan, giver gennemførelsen af intervention undersøgelser i prækliniske eksperimentelle rørledningen sandsynligvis en mere præcis skildring af relevans og effektivitet af en ny terapeutisk. Ideen er støttet af de påfaldende divergerende virkningerne af hæmme det pro-inflammatoriske cytokine Interleukin-1β (IL-1β), når ansætte en forebyggelse4,5,6 eller intervention strategi7. Forskelle mellem forebyggelse og intervention undersøgelser tyder på, at forskellige cellulære processer forekomme på forskellige faser af udvikling af åreforkalkning og fremhæver, at forebyggende undersøgelser er sandsynligvis utilstrækkelig til at modellere den kliniske scenario tilstrækkeligt.

American Heart Association for nylig offentliggjort en videnskabelig udtalelse beskriver anbefalinger for ordentlig eksperimentelle design, proceduremæssige standardisering, analyse og rapportering af animalske åreforkalkning undersøgelser8. Det fremhæver de fordele og begrænsninger af dominerende teknikker, der anvendes i feltet. For eksempel, er da ansigt Sudan IV farvning af aorta ofte udført som en første udlæsning. Selv om en ansigt Sudan IV farvning af lipid deposition er en velegnet metode til vurdering af globale plaque byrde, er det ude af stand til at skelne debuterende fede streak læsioner fra mere avancerede sene læsioner. Som sådan er er fortolkningen af en ansigt farvning ofte tvetydige og overfladiske9. Omhyggelig analyse af væv tværsnit ved hjælp af morfologiske parametre fartøj, læsion og lumen størrelse og kvantificering af indeks af læsion stabilitet giver en mere præcis forståelse af effekten af et eksperiment.

Endelig, menneskelige histopatologiske undersøgelser har antydet, at cellulære sammensætning er en bedre indikator for brud end læsion størrelse, med læsioner fattige i glatte muskelceller (SMC), rige i makrofager at være mere modtagelige for briste10, 11. Disse observationer blev baseret på farvning for markører klassisk bruges til celle identifikation (dvs. ACTA2 for SMC og LGALS3 eller CD68 til makrofager). Udtryk for disse markører er imidlertid ikke strengt begrænset til en enkelt celletype i aterosklerotiske læsioner på grund af plasticitet af flere slægter herunder SMC, endotelceller og myeloide celler12. Den entydige identifikation af SMC inden for aterosklerotisk læsion var især næsten umuligt indtil det seneste årti på grund af egenskaben for disse celler til dedifferentiate og undertrykke deres slægt-specifikke markørgener (en proces, der er nævnt som fænotypisk switching) i tilskadekomne eller syge fartøjer13. Denne begrænsning i SMC identifikation er omgået ved udviklingen af afstamning sporingen7,14,15,16,17,18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. det består af permanent mærkning SMC og deres afkom for at spore deres skæbne og fænotypiske evolution under åreforkalkning progression ved hjælp af en kombination af udtryk af Cre recombinase drevet af SMC-specifikke initiativtagere (dvs., Myh117,15,17,18,19,20,21,22,23 , 24, Acta225,26 og SM22α14,16) og aktivering af journalister (fx fluorescerende proteiner, β-galactosidase) [gennemgik i Bentzon og Majesky 201827]. I en af de første undersøgelser beskæftiger SMC afstamning sporingen uden for embryogenese indstilling, Speer et al.14 fremlagde beviser for, at SMC kan modulere deres fænotype og transdifferentiate i chondrogenic celler under vaskulære forkalkning ved hjælp af en SM22α Cre R26R LacZ afstamning sporingen model. Selv om disse undersøgelser banebrydende SMC afstamning sporingen, var de delvist tvetydige, idet enhver given ikke-SMC udtrykker SM22α i fastsættelsen af sygdommen vil være mærket af journalisten. Denne begrænsning er blevet omgået af udvikling og brug af tamoxifen-inducerbar Cre ERT/LoxP tillader en tidsmæssig kontrol af celle mærkning. Celle mærkning forekommer udelukkende i tamoxifen levering og vil være begrænset til cellen at udtrykke celle type-specifikke promotor kørsel Cre ERT udtryk samtidig med tamoxifen eksponering, undgå sporing af alternative celletyper aktivering Cre i den indstilling af sygdomsprogression. For afstamning sporingen af SMC i åreforkalkning, tamoxifen-inducerbar Myh11- Cre/ERT2 transgenet forbundet med fluorescerende journalister (eYFP7,15,17,18 , 21, mTmG19,25, konfetti20,22,23 for klonal ekspansion studier) har udvist en bemærkelsesværdig effektiviteten og specificiteten i SMC mærkning og har været brugt til skæbne kort SMC populationer i aterosklerotiske læsioner i nyere undersøgelser. Vigtigere, disse undersøgelser viste, at: 1) 80% af SMC inden for avanceret aterosklerotiske læsioner ikke udtrykke nogen konventionel SMC markører (ACTA2, MYH11) bruges i immunohistological analyse og derfor ville have været fejlidentificerede uden afstamning sporingen 17; 2) delmængder af SMC express markører for alternative celletyper, herunder makrofag markører eller mesenkymale stamceller markører16,17,19; og 3) SMC investere og udfylde den aterosklerotiske læsion af oligoklonale ekspansion og SMC kloner bevarer plasticitet til overgangen til fænotype forskellige populationer20,23. For at opsummere, er det nu klart, at glatte muskelceller præsentere en bemærkelsesværdig fænotypiske mangfoldighed i aterosklerotiske læsioner og kan have gavnlige eller skadelige roller på læsion patogenese afhængigt af arten af deres fænotypiske overgange. Disse opdagelser repræsenterer en bemærkelsesværdig nye terapeutiske avenue til målretning SMC athero-fremme fænotypiske overgange i sene åreforkalkning.

Heri, foreslår vi en standardiseret protokol til at analysere sene murine aterosklerotiske læsioner herunder systematiske metoder til animalsk dissektion, indlejring, skæring, farvning og kvantificering af brachiocephalic arterie læsioner. For at bestemme virkningen af Interleukin-1β hæmning på SMC skæbne og fænotype, brugte vi SMC lineage sporing ApoE- / - mus fodret en vestlig kost for 18 uger før modtager ugentlige injektioner af en anti-IL1β antistof eller isotype-matchede IgG kontrol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyreavl, håndtering og procedurer blev godkendt ved University of Virginia og University of Pittsburgh institutionelle dyrs pleje og brug udvalget.

1. generation af SMC afstamning sporingen mus

  1. Yngle Myh11- Cre/ERT2 hanner28 (Jackson laboratorium; #019079) med R26R-EYFP kvinder (Jackson laboratorium; #006148) til at opnå Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EYFP+/ + hanner.
  2. Yngle Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EYFP+/ + hanner med ApoE- / - hunmus (Jackson laboratorium; #002052). Cross afkommet og vælg af genotypebestemmelse Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EYFP+/ + ApoE- / - mand og R26R-EYFP+/ + ApoE- / - hunmus som endelige opdrættere. Klip hale og udføre genotypebestemmelse på littermates. Alle mandlige mus bør være Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EYFP+/ + ApoE- / - og kan bruges som eksperimentelle mus (fig. 1A).
    Bemærk: Genotypebestemmelse protokoller kan findes på webstedet Jackson laboratorium. Myh11 Cre/ERT2 transgen ligger på Y-kromosomet, udelukker brugen af hunner. Andre afstamning sporingen systemer kan bruges, men dette system er til dato den mest pålidelige afstamning sporingen strategi til skæbne kort SMC i åreforkalkning.

2. glat muskel celle afstamning sporingen mus kost og behandlinger

  1. Har mandlige Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EYFP+/ + ApoE- / - mus modtage en række 1 mg tamoxifen indsprøjtninger fra seks til otte ugens i alder at mærke permanent Myh11+ SMC med YFP og til at spore deres skæbne (figur 1 A).
    1. Varme jordnøddeolie ved 55 ° C.
    2. Tilføje tamoxifen i forvarmet jordnøddeolie til at forberede en opløsning på 10 mg/mL og inkuberes ved 55 ° C indtil fuldstændig opløsning af tamoxifen.
    3. Udføre en intraperitoneal injektion med 0,1 mL af 10 mg/mL tamoxifen løsning for en serie af ti injektioner over to uger.
      Bemærk: Tamoxifen er en biologisk og skal håndteres med omhu.
  2. Fem til syv dage efter den sidste injektion med tamoxifen, erstatte chow kost med højt fedtindhold kost (f.eks., vestlige kost; 42% kcal fra fedt; 0,2% total kolesterol) for en varighed på 18 uger til at give mulighed for udvikling af avancerede aterosklerotiske læsioner, som konsekvent udvikler i flere vaskulære senge herunder aortabuen, aorta rod, brachiocephalic arterie og den abdominale aorta.
  3. 18 uger af højt fedtindhold kost fodring, begynde terapeutisk intervention for den ønskede varighed (figur 1B).
    Bemærk: Som et eksempel, vi udførte ugentlige intraperitoneal injektioner med en anti-IL1β antistof eller en isotype-matchede IgG kontrol mellem 18 og 26 uger af højt fedtindhold kost.
  4. Fjerne mad til hurtig mus til 8 til 16 h før væv høst for at udføre nøjagtige målinger for plasma kolesterol og triglycerid.

3. høst af den Brachiocephalic arterien (BCA)

  1. Animalske eutanasi skal følge Animal Care og brug udvalg (ACUC) krav og regler. Aflive de eksperimentelle mus af CO2 kvælning i ca 5 minutter og kontroller død af tå knivspids.
  2. Vejer musen og indsamle blod.
    1. Veje musen
    2. Spray den ventrale side af musen med 70% Ethanol
    3. Udføre hjerte punktering ved at indsætte en 25G kanyle tilsluttet en 1 mL sprøjte i ventriklen fra venstre side af brysthulen. 0,1 til 1 mL af blodet kan afhentes.
    4. Overføre blodet til et EDTA vakuum rør ved rødmen sprøjten og placere røret på en rocker eller rotator for 10-15 min.
    5. Overføre blod til en 1,5 mL rør og centrifugeres i 10 minutter 250 x g ved 4 ° C. Forsigtigt trække den øverste plasma fase med en pipette og passende tips, og overføre til en ny tube. Opbevares ved-20 ° C forud for måling af kolesterol og triglycerider.
      Bemærk: fuldblod kan bruges til supplerende undersøgelser herunder blodlegemer og andre blodkomponenter, herunder cytokiner eller immun celle profilering.
  3. Gøre et snit på ca 2 cm i huden på midten maven ved hjælp af saks og trække huden til at udsætte i bughulen. Skære bughinden op til brystbenet uden skadelige væv. Gøre to snit på midten aksillær linje gennem brystkassen, være omhyggelig med ikke at beskadige hjerte og lunger.
  4. Løft brystbenet med pincet og skære membran for at delvist udsætte hjertet. Hvis hjertet ikke er let tilgængeligt, skåret væk brystkassen nok til at nå det højre atrium.
  5. Perfuse mus med en tyngdekraft perfusion system (fig. 2A). Installere tyngdekraften perfusion system, således at presset fra perfusion væske er svarer til den gennemsnitlige murine blodtryk (figur 2B). Dette system giver mulighed for sammenhæng i perfusion og begge fastholder fartøj morfologi og flushes rød blodceller.
    Bemærk: Som reference, C57Bl6 mus har en fysiologisk blodtryk mellem 120 mmHg (gennemsnitlige systoliske blodtryk) og 70 mmHg (gennemsnitlige diastoliske blodtryk)29,30. Gennemsnitlige systoliske og diastoliske blodtryk kan variere med musen genetiske baggrund.
    1. Tilslut en 23 eller 25G sommerfugl nål til tyngdekraften perfusion system og køre phosphat bufferet saltvand (PBS) gennem nålen at udvise luft fra rørene. Indsætte nålen ind i venstre hjertekammer og sikre nålen i sted. Brug iris saks, lave et lille snit (< 2 mm) i højre atrium eller opstigende aorta.
    2. Perfuse med 5 mL PBS, derefter 10 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) løsning, derefter 5 mL PBS. Brug både PBS og 4% PFA løsning ved omgivelsestemperatur.
    3. Indsamler væv af interesse (f.eks. lever, lunge, milten) og placere dem i 4% PFA løsning.
  6. Udsætte BCA
    1. Rens hals-området ved at fjerne hud og spytkirtler.
    2. Udføre en skære ned svinekroppens midterlinje brystbenet gennem manubrium ved hjælp af saks. Pas på at saksen bo tæt på bagsiden af brystbenet til at undgå at beskadige Vaskulaturen placeret tæt under brystbenet. Træk begge sider af brystkassen med pincet fuldt åbne brysthulen. Carotiderne bør være delvist synlige.
    3. Rydde op ved at trække muskler og bindevæv og fjerne fedt med fine pincet indtil den rigtige carotis, brachiocephalic arterie subclavia tvedeling og aortabuen er renset og isoleret i den omgivende bindevæv og fedt (figur 2Christensen).
  7. Fjerne BCA
    1. Brug af pincet, få fat i den rigtige carotis under sin bifurkation og foretage en indledende cut ovenfor pincet (figur 2D).
    2. Stadig holder carotis, gøre et andet snit gennem subclavia arteria. De sidste to nedskæringer er gennem aortabuen på begge sider af den brachiocephalic arterien (figur 2D).
    3. Indsamle andre kardiovaskulære væv af interesse (f.eks. abdominal aorta, overlegne del af hjertet indeholder aorta roden).
    4. Anbring BCA og andre væv i 4% PFA natten over ved stuetemperatur.
      Bemærk: Fiksering tid bør holdes konsekvent i hele undersøgelsen.

4. væv forarbejdning og skæring

  1. Fjern væv fra 4% PFA og sted i en mærket væv kassette (fig. 3A). Brug skum puder i kassetten for at sikre, at vævet bevarer sin orientering og forbliver i kassette gennem behandlingstrin (fig. 3B). Lukke kassetter og fordybe i 70% ethanol indtil væv behandling (24 til 72 timer).
    1. Proces BCA og andre væv indsamlet for histologiske og immunfluorescent farvning som følger (eksempel på rutinemæssig overnight procedure ved hjælp af en processor med vakuum penetration): 10% neutral buffered formalin i 30 min. ved stuetemperatur (2 x), 75% ethanol for 60 min. ved 30 ° C (1 x), 90% ethanol for 60 min. ved 30 ° C (1 x), 95% ethanol for 60 min. ved 30 ° C (1 x), 100% ethanol for 60 min. ved 30 ° C (3 x), xylen for 60 min. ved 30 ° C (3 x) og paraffin voks til 80 min. ved 62 ° C (3 x).
  2. Integrere BCA lodret, med aortabuen tættest på blok ansigt (figur 3C).
  3. Skære igennem paraffin blok på en Rotationsmikrotom (10 µm tykkelse) indtil nå den indlejrede væv.
  4. Når vævet er synlige, undersøge et afsnit under et mikroskop for at fastslå holdning. Hvis aortabuen er stadig synlige, fjerne op til ti 10 µm afsnit ad gangen, undersøger et afsnit på hvert interval.
  5. Når aortabuen har blevet sectioned gennem og brachiocephalic arterien er synlige, justere retningen af blok til at placere væv helt vinkelret på mikrotomen blade.
  6. Skære BCA på en snittykkelse på 10 µm. På det tidspunkt, er alle dele indsamlet seriefremstillede med tre sektioner pr. slide. Indsamle indtil nå subclavia tvedeling (figur 3D).
    Bemærk: Det er vigtigt at skære BCA på en snittykkelse på 10 µm for efterfølgende z-stakken Konfokal billede erhvervelse og enkelt celle optælling. Denne tykkelse vil tillade den strenge og ikke han stiftede vurdering af association mellem en enkelt kerne og cytoplasmatisk eller membran farvning selv dybden af tværsnittet.

5. immunfluorescent farvning

Bemærk: En fuldstændig karakterisering af aterosklerotiske læsioner omfatter vurdering af morfologiske parametre og indeks af plaque stabilitet eller ustabilitet og cellulære sammensætning, det ikke vil være i fokus i denne protokol. Læsion morfologi, kollagen indhold og intraplaque blødning kan analyseres ved Movat7,17, PicroSirius rød 7,31, Ter119 farvning 7,18, henholdsvis. Her vil vi beskrive protokollen til at analysere den cellulære sammensætning af læsioner.

  1. Glassene inkuberes i følgende løsninger ved stuetemperatur under et kemisk hood: xylen til 5 min. (2 x), 100% ethanol i 5 min (2 x), 95% ethanol i 5 min (2 x), 70% ethanol for 5 min (2 x) og deioniseret vand H2O (diH2O) i 5 min (2 x).
  2. Inkuber dias i antigen hentning løsning efter fabrikantens anvisninger.
    1. Med citronsyre baseret antigen demaskering løsning (Se Tabel af materialer), 3 mL af opløsning i 320 mL diH2O. sted fortyndes dias i en farvnings-reservoir og udfyldning til toppen med rede antigen hentning løsning.
    2. Udfylde alle tomme pladser i dias rack med tomme dias til at sikre, at selv varme. Dække beholder med låg til den antigen hentning opløsning i kog uden fordampning.
    3. Varme dias i en mikrobølgeovn i 20 min. på ca 675-700 watt. Kontroller nedsænket dias regelmæssigt og erstat fordampede væske med diH2O sådan, at sektioner forbliver i demaskering løsning på alle tidspunkter.
    4. Tillad dias til at køle ned i opløsning i 1 time ved stuetemperatur.
  3. 6 g fisk hud gelatine (FSG) i 1 L PBS opløses. PBS/FSG bruges som vaske buffer. Forberede en blokerende løsning af 10% normal serum i PBS/FSG.
    Bemærk: Fisk hud gelatine bruges i forberedelsen af de blokerende buffer. FSG indeholder ikke serum proteiner, der kan krydsreagere med pattedyr antistoffer, minimere baggrundsstøj. Men andre blokering mulighed bør foretrukne med biotin detektionssystemer som FSG indeholder endogent biotin. Typen af normale serum anvendes er baseret på den sekundær antistof anvendes. Når æslet sekundære antistoffer bruges, skal normal hest serum vælges for blokering og antistof fortyndinger.
  4. Inkuber dias i PBS for 5 min ved stuetemperatur. Cirkel væv sektioner med en hydrofobe pen. Dække sektioner med den blokerende buffer PBS/FSG/normal serum i 1 time ved stuetemperatur. Forberede den primære antistof løsning i PBS/FSG/normal serum under dette trin, mens blokerer for væv.
  5. Inkuber med primære antistoffer fortyndes i PBS/FSG/normal serum natten over ved 4 ° C i et fugtigt kammer. Én sektion pr. slide bør sættes i varmeskab med en blanding af IgG kontrol antistoffer i den samme koncentration som de primære antistoffer til kontrol for primære antistof specificitet.
  6. Vaske dias som følger ved stuetemperatur: PBS/FSG for 5 min (3 x), derefter PBS for 5 min. (1 x).
  7. Der inkuberes med fluorophore-konjugeret sekundære antistoffer (Se Tabel af materialer) og diamidino-2-phenylindole (DAPI) i kernen counterstaining fortyndes i PBS/FSG/normal serum i 1 time ved stuetemperatur. Beskytte dias fra lys.
  8. Vask dias, som beskrevet i trin 5.6.
  9. Montere dias ved hjælp af montering medier egner sig til fluorescens (Se Tabel af materialer).

6. konfokalmikroskopi

Bemærk: Brugen af en Konfokal mikroskop og z-stakken erhvervelsen er kritisk for encellede optælling.

  1. Indstille erhvervelse parametre skal anvendes i hele undersøgelsen: billede opløsning (1024 x 1024 eller 2048 x 2048 pixels); Optiske sti og antallet af kanaler, som er en funktion af kombinationen af sekundære antistoffer valgt; scanning hastighed (anbefalet scanning hastighed: 7-8); og differential interferens kontrast (DIC) kanal.
  2. Ved hjælp af sektioner farves med primære antistoffer og IgG kontrol, indstille detektor følsomhed, laser power og forskydning for hver enkelt kanal. Kontrolelementet IgG bruges til at minimere baggrund signal.
  3. Angiv den øvre og nedre holdninger til z-stakken erhvervelsen. Forudbestemme tykkelse og antal stakke at erhverve. Disse parametre skal være konsekvent i hele undersøgelsen.
    Bemærk: Vi anbefaler imaging 8 til 10 stakke af 1 µm tykkelse. Ophold sammenhængende i antallet stakke afbildet i hele undersøgelsen.
  4. Billede væv sektioner farves med primære antistoffer og IgG kontrol for alle kanaler herunder DIC.
  5. Label mindst ét billede med en skalalinjen for billede kalibrering under enkelt celle optælling.

7. enkelt celle tælle

  1. Installere og åbne ImageJ. Hvis det er nødvendigt, download Plugins i afsnittet Download > Input/Output af ImageJ website hen til lukke op billedfil genereret afhængigt af formatet for de billeder, der er genereret af en Konfokal mikroskop.
  2. Åbne billedfilen i ImageJ.
  3. Kalibrere billedet med en reference skala bar ved hjælp af billedet genereres i 6.6.
  4. Afgrænse området, hvor enkelt celle tælle udføres ved hjælp af DIC kanal (figur 4).
    Bemærk: Én region kan være afgrænset ad gangen. Afhængigt af de eksperimentelle spørgsmål, enkelt celle optælling kan udføres i området hele læsion (Se 7.3.1) og/eller i en sublocation af læsion. For eksempel, er undersøgelse af området fibrøst cap (Se 7.3.2) særlig relevant, da dets cellulære sammensætning er et vigtigt indeks af læsion tilbøjelighed til at briste.
    1. Afgrænse området læsion ved at følge grænsen lumen (figur 4A, hvide pile) og indre elastisk lamina (figur 4A; gule pile) synlig på billedet for DIC.
    2. For analyse af området fibrøst cap, bestemme grænsen Fjern af 30 µm fra lumen og spore grænsen ( fig. 4B-D).
      Bemærk: Området fibrøst cap er klassisk defineret som regionen beriget med ACTA2 + celler og kollagen underlaying lumen (fig. 4B). Berigelse i ACTA2 + celle og kollagen spiller en afgørende rolle i læsion stabilitet. Tidligere undersøgelser har konstateret, at ACTA2 + celle rige fibrøst cap område gennemsnit en tykkelse på 30 µm fra lumen i SMC-lineage sporing ApoE- / - mus fodret en fedtrig kost for 18 til 26 uger (fig. 4C). Omhyggelig karakterisering af virkningerne af genetisk manipulation eller farmakologiske behandling på fiberholdigt cap område cellulære sammensætning er således bemærkelsesværdigt relevante.
  5. Åbn panelet Kanaler værktøjer (billede > farve > kanal værktøjer) og pseudo farve de forskellige farvning kanaler (figur 5A; boks 1).
  6. Flette farvekanalerne (billede > farve > Flet farver) (figur 5A, rubrik 2). Alle kanaler skal være synlig på det samme billede (figur 5B). Tænde og slukke enkelte farvekanaler ved hjælp af panelet Kanal værktøjer (figur 5A; boks 1).
  7. Konfigurere værktøjet optælling.
    1. Højreklik på ikonet optælling i værktøjslinjen (figur 5C, boks 1) og vælg Multi-Point værktøj.
    2. Dobbeltklik på den samme ikon for at åbne panelet Værktøj (figur 5C, rubrik 2).
    3. Vælg den type og størrelse af elementer bruges til at tælle celler.
    4. Kontrollere Vis alle.
  8. Tænd DAPI kanal kun i panelet Kanal værktøjer og vælg Counter kanal 0 (figur 5C, boks 3). Klik på enkelte kerner, der vil blive mærket (fx gule prikker i figur 5C-D). Rul z-stakke til at tælle alle kerner farves i det pågældende område. Antallet af hændelser er angivet nedenfor counter kanal i Punkt værktøj panel (figur 5C, boks 4).
  9. Slå en anden farvning kanal (fx eYFP farvning). Vælg Counter kanalen 1. Klik på celler, hvor der er en colocalization mellem DAPI og farvning. For cytoplasmatisk farvning, Marker celler for med farvning omgiver kernen på hele dybden af kernen (tjekke flere z-stacks).
  10. Gentag ved at ændre farvning kombinationer og vælge nye Counter kanaler at tælle cellepopulationer af interesse. Hver prik farve repræsenterer en anden celle population (fig. 5D). Resultaterne kan udtrykkes som antallet af celler til samlede antal DAPI eller antal celler til regionen området.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe- / - mus blev sprøjtet med tamoxifen mellem seks og otte ugens i alder før fodres en høj fedt diæt. På 18 uger af højt fedtindhold kost fodring, blev to grupper af otte mus behandlet ugentligt med enten et monoklonalt muse-antistof, anti-IL-1β eller en isotype-matchede IgG kontrol på 10 mg/kg for 8 uger (figur 1)7. Mus blev ofret og perfunderet med en 4% PFA-PBS løsning. Brachiocephalic arterier var dissekeret, forarbejdet og snit som beskrevet ovenfor (figur 2 og figur 3).

Efter immunfluorescent farvning med antistoffer rettet mod afstamning sporingen reporter (YFP) og fænotypiske markører (ACTA2, LGALS3, RUNX2), en tykkelse på 8-10 µm i BCA tværsnit blev afbildet ved hjælp af en Konfokal mikroskop. Billeder af hver enkelt farvning, DAPI (nukleare farvning) og DIC blev erhvervet. Afgrænsning af regioner af interesse for enkelt celle tælle (læsion, fibrøst cap) blev udført ved hjælp af DIC billeder (figur 4). Enkelt celle tælle for at bestemme overfloden af forskellige SMC-afledte befolkninger blev udført ved hjælp af ImageJ (figur 5).

Vi præsentere to repræsentative immunfluorescent farvning og enkelt optælling vurdering af virkningen af IL-1β hæmning på cellulære sammensætning i avancerede aterosklerotiske læsioner. Først, farvning blev gjort for SMC afstamning sporingen reporter YFP, SMC markør ACTA2 og makrofag markør LGALS3 i tværsnit på to forskellige steder af BCA (480 µm og 780 µm fra aortabuen) (figur 6). Enkelt celle tælle analyse i regionen fibrøst cap i disse tværsnit blev udført, og bemærkelsesværdige forskelle blev fundet i den cellulære sammensætning af fibrøst cap området mellem mus behandlet med anti-IL-1β antistof og mus behandlet med den isotype-matchede IgG kontrol (fig. 6A). Hæmning af IL-1β var forbundet med et fald i YFP + SMC og en stigning i LGALS3 + celler (fig. 6B). Vedrørende fænotyper af SMC populationer, et fald i antallet af YFP + ACTA2 + SMC blev observeret, mens det relative antal af SMC-afledte makrofager (YFP + LGALS3 +) var steget betydeligt på begge BCA lokaliteter (figur 6C).

Endelig, vi undersøgte effekten af IL-1β hæmning på SMC fænotypiske overgangen i chondrogenic celler. Denne fænotypiske overgang er en vigtig drivkraft for vaskulære forkalkning, større indslag af sene åreforkalkning14,32,33. BCA tværsnit blev farvet for SMC afstamning sporingen reporter YFP, osteochondrogenic markøren RUNX2 og makrofag markør LGALS3 (figur 7A). Overflod og oprindelsen af RUNX2 + chondrogenic celler blev karakteriseret inden for området læsion i vores to eksperimentelle grupper. Vi fandt, at hæmning af IL-1β ikke påvirkede det samlede antal RUNX2 + celler inden for læsion, eller andelen af SMC-afledte (YFP + RUNX2 +) og makrofag-afledte (YFP-LGALS3 + RUNX2 +) chondrogenic celler (fig. 7B).

Figure 1
Figur 1 : Intervention undersøgelser i glat muskel celle afstamning sporingen mus. (A) skematisk fremstilling af Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe- / - tamoxifen-inducerbar SMC specifikke afstamning sporingen musemodel. Behandling med tamoxifen inducerer rekombination af R26R-YFP locus og excision af en STOP codon og faste udtryk for YFP af SMC. (B) skematisk af intervention undersøgelser i hvilke Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe- / - mus fodret en vestlig kost for 18 uger blev sprøjtet ugentligt med IL-1β antistof eller en isotype-matchede IgG kontrol antistof i en koncentration på 10 mg / kg i 8 uger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Brachiocephalic arterie dissektion. (A) skematisk af en tyngdekraft drevet perfusion system. Systemet er sat op på en præcis højde giver perfusion på en presset tæt på den gennemsnitlige systoliske blodtryk i mus. Trykket lidt varierer med volumen højde som væske bruges under perfusion mellem højden h1 og h2. (B) ligning for beregning af presset af statisk væsker og bestemmelse af højden til at nå et tryk på perfusion svarende til den C57Bl6 mus gennemsnitlige systoliske blodtryk. (C) billeder af den proksimale aorta og forgrening arterier i C57Bl6 mus fodret en chow kost (venstre billedet) og Apoe- / - mus fodret en høj fedt diæt for 26 uger (højre billede). Stjernen angiver tilstedeværelsen af aterosklerotiske læsioner. (D) skematisk af den proksimale aorta og forgrening arterier. Røde pile repræsenterer nedskæringer for isolation af den rigtige carotis og brachiocephalic arterie isolation og tal angiver rækkefølgen af nedskæringerne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Væv behandling, integrering og skæring. (A) fotografi af en indlejring kassette med BCA væv. BCA er placeret på et skum pad. (B) Zoom i af BCA placeret på skum pad. BCA er orienteret med aortabuen tæt på etiketten del af kassetten og carotis rettede lodret. Skalalinjen: 1 cm. (C) skematisk af paraffin blokere efter integrering af den brachiocephalic arterien. (D) skematisk af serie dias med 10 µm tykt seriel sektioner med angivelse af afstanden fra aortabuen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Afgrænsning af aterosklerotiske læsion og fibrøst cap område. (A) repræsentative micrographs af DIC billede aterosklerotisk læsion i brachiocephalic arterie tværsnit fra Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe- / -. Den luminale og indre elastisk lamina grænser er lokaliseret ved hvide og gule pile, henholdsvis (venstre panel). Læsion området er afgrænset af en stiplet linje (højre panel) skala bar: 100 µm. (B) repræsentative micrographs af DIC og ACTA2 farvning. Dobbelt-head pile viser tykkelsen af ACTA2 farvning inden for området underlaying lumen definere området fibrøst cap. (C) kvantificering af subluminal ACTA2+ tykkelse i Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe- / - fodret en fedtrig kost for 18, 21 og 26 uger. Ved hjælp af denne stamme af mus, har den fibrøse cap en gennemsnitlig tykkelse på 25-30 µm i forvejen aterosklerotiske læsioner. Resultaterne udtrykkes som gennemsnit ± SEM. (D) afgrænsning af en fast 30 µm tykt fibrøst cap område til optælling af enkelt celle. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Enkelt celle optælling ved hjælp af ImageJ. Skærmbilleder illustrerer vigtige trin af enkelt celle regner med ImageJ billeder erhvervet af Konfokal mikroskopi. (A) hvert enkelte farvning kanal og individuelle z-stakken er synlige ved rulning c: og z: barer nederst i billedet. Farvning kanaler er pseudo farvet ved hjælp af panelet kanal (1) farvning kanaler (YFP, LGALS3, ACTA2, DAPI for nukleare farvning og DIC) er fusioneret med panelet Flet kanal (2). (B) resultater af kanal fusionerende til YFP, LGALS3, ACTA2, DAPI og DIC. (C) kernen tælle baseret på DAPI farvning bruge optælling ikon (1) og punkt værktøj panel (2). En anden counter kanal bruges til hver celle befolkning (3). Antal hændelser tælles angives nedenfor counter-kanal (4). Hvide rektangel: region udvidet til højre. (D) repræsentativt billede af enkelt celle tælle inden for området fibrøst cap (stiplet linje) til flere cellepopulationer herunder DAPI (gule prikker), YFP+ celler (magenta prikker), YFP-LGALS3+ celler (cyan prikker), YFP+LGALS3+ celler (orange prikker), YFP+ACTA2+ celler (grønne prikker), og YFP-ACTA2+ celler (mørk blå prikker). Hvide rektangel: region udvidet til højre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Karakterisering af effekterne af IL-1β hæmning på området fibrøst cap på to særskilte BCA placeringer af SMC lineage sporing Apoe/mus cellulære sammensætning. (A) BCA cross sektioner på 480 µm og 780 µm fra aortabuen fra mus behandlet med IL-1β antistof eller IgG kontrol som vist i figur 1 var farvet for YFP, LGALS3, og DAPI (nukleare farvning) og afsnittet var afbildet af DIC. Immunfluorescent kanaler blev fusioneret (bund højre paneler). De stiplede linjer afgrænse fibrøst cap regioner. Skalere barer: 100 µm. (B) enkelt celle optælling afslører at hæmning af IL-1β er forbundet med et betydeligt fald i YFP+ celler og en stigning i LGALS3+ celler inden for området fibrøst cap. C) inden for YFP+ celle befolkning, et fald i YFP+ACTA2+ og en stigning i YFP+LGALS3+ populationer er observeret. Resultaterne udtrykkes som gennemsnit ± SEM. statistisk analyse: uparrede flere t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 : Effekt af IL-1β hæmning på antallet af RUNX2 + chondrogenic celler med avancerede aterosklerotiske læsioner. A) BCA tværsnit er farvet for YFP, LGALS3, RUNX2 og DAPI (nukleare farvning), og alle kanaler blev fusioneret (bund paneler). De stiplede linjer at afgrænse området læsion. Skalere barer: 100 µm. B) enkelt celle optælling viser hæmning af IL-1β ikke påvirker det samlede antal RUNX2+ celler inden for læsion eller andelen af RUNX2+ celler fra SMC oprindelse (YFP+RUNX2+; YFP+LGALS3+RUNX2+) og myeloide oprindelse (YFP-LGALS3+RUNX2+). Resultaterne udtrykkes som betyder SEM. statistisk analyse: uparrede flere t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Trods årtiers forskning og tekniske fremskridt i at studere åreforkalkning, har feltet en skuffende historie omsætte videnskabelige resultater til klinisk terapier34,35. Dette fænomen kan forklares tildels ved uoverensstemmelser i dyremodeller, eksperimenterende design og læsion analyser. Heri, beskriver vi en eksperimentel rørledning, som vi brugte til at analysere den cellulære sammensætning i avancerede aterosklerotiske læsioner ved hjælp af afstamning sporingen mus7. Denne metode giver mulighed for en omhyggelig undersøgelse af celle skæbne kortlægning og fænotyper, som er centrale parametre kontrolleret af potentielle mekanismer på spil i avancerede aterosklerotiske læsioner.

SMC-afstamning sporingen musen model er et kraftfuldt værktøj til at spore nøjagtigt den skæbne og fænotypiske modulationer denne afstamning og deres bidrag til åreforkalkning patogenese. Den tamoxifen-inducerbar Cre-loxP system giver mulighed for mærkning af modne vaskulære SMC udtrykker MYH11 forud for indledningen af åreforkalkning. Overbevisende beviser ved hjælp af dette system har vist, at aterosklerotiske plaques er meget plastik og vaskulære SMC kan gennemgå fænotypiske skifter, mister deres kontraktile fænotype og SMC-specifikke markører, prolifererende, overflytning, og selv transdifferentiating til makrofag-lignende celler17,18. I denne protokol, vi viser hvordan afstamning sporingen påvisning og immunfluorescent farvning for markører af interesse kan integreres Bestem netop fænotypiske overgange foretaget af SMC og deres relative hyppighed blandt andre SMC populationer.

Denne metode er meget komplementære med andre undersøgelser, som ofte udføres i feltet. Først, vurdering af aterosklerotiske læsion byrde af en ansigt aorta præparater kombineret med lipid farvning af Sudan IV er udbredt på grund af dens bekvemmelighed og hastighed. Dette er imidlertid en utilstrækkelig foranstaltning af vigtige morfologiske parametre såsom læsion størrelse, lumen størrelse, og fartøjet remodellering. Farvning af en ansigt aorta forberedelse af Sudan IV at visualisere lipid deposition kan bruges til at kvantificere relative læsion område inden for aorta, men det kan give inkonsistente farvning af læsioner, som kun den neutrale lipid komponent er visualiseret mens områder besat af andre bestanddele, såsom ekstracellulære matrix, er normalt oversete8. Desuden en ansigt farvning er ude af stand til at informere om læsion morfologi og kan ikke skelne mellem fede striber og avancerede læsioner. Fartøj morfologi er en vigtig parameter bruges til at vurdere åreforkalkning fase og brud risiko, herunder læsion størrelse, lumen diameter, fartøj remodeling7,36,37. Disse analyser kræver bevarelse af fartøjet morfologi for ordentlig kvantificering. Vigtigere, overlapper protokoller for undersøgelsen af morfologiske parametre høj grad med protokollen detaljeret her. Især afhængige de af brugen af et gravity-drevet vaskulære perfusion system til PBS og Fikseringsvæske perfusion at give større sammenhæng i den pression. Gravity-drevet infiltration system garanterer et konstant flow hastighed og tryk mellem hver uafhængig mus og forhindrer manglende manuel kraft-drevet perfusion mellem uafhængige eksperimenter eller forskere. Tyngdekraften perfusion system bør sættes op til at fremkalde perfusion ved et tryk i nærheden af den gennemsnitlige murine blodtryk (70-120 mmHg). For det andet, vi givet en standardiseret og systematisk metode til integrering og skæring for den brachiocephalic arterien. Ved at definere startsted skæring og kvantificere området læsion på flere steder i hele den brachiocephalic arterien, kan vi begrænse den tilfældige variation, der kommer med begrænsede stikprøver.

Flowcytometri er en anden teknik meget komplementære med immunfluorescent farvning koblet med enkelt celle optælling, der har været meget anvendt i kvantificere cellepopulationer inden for aterosklerotiske læsioner38. Det består af fordøjelsen af musen aorta og mærkning af de frigivne celler med fluorescerende antistoffer. Flowcytometri tilbyder en kvantitativ analyse af de cellulære befolkninger i aorta. Men ligesom alle teknologier, flowcytometri har begrænsninger. Trods tydelig fordel for montering af en bred vifte af samtidige markører, der er en fuldstændig tab af rumlige opløsning, og bliver det uklart, om en celle population er beriget med fibrøst cap eller nekrotisk kernen. Derudover er der en risiko for udvanding effekt da flowcytometri kræver et stort antal celler og ofte ikke fokuserer kun på aterosklerotiske områder. Derfor kan immunofluorescens og flowcytometri bruges i en supplerende måde at give mulighed for både høj dimensionel profilering og læsion lokalisering.

Endelig, protokollen er fokuseret på kvantificering af SMC populationer i BCA avanceret læsion ved hjælp af PARAFORMALDEHYD-fast og paraffin-embedded væv sektioner. Dog kan denne protokol bruges til at undersøge andre vaskulære senge, herunder aorta-roden eller abdominal aorta, to vaskulære område betinget af åreforkalkning udvikling. Systematisk behandling og skæring af aorta-roden har været tidligere godt beskrevet8,39. Som åreforkalkning udvikler sig på forskellige steder og at genetisk manipulation eller terapeutisk intervention kan ikke-homogen måde påvirke disse websteder21, er det vigtigt at undersøge så mange vaskulære senge som muligt at drage præcise konklusioner. Immunfluorescent farvning og enkelt celle optælling kan også udføres ved hjælp af frosne sektioner. Dette kan være nødvendige på grund af uforenelighed af antistoffer med paraffinsnit. Selv om dyrs perfusion og væv indlejring vil afvige fra denne protokol, kan efterforskere følger resten af de eksperimentelle procedurer, der beskrives her.

Afslutningsvis beskrevet teknikkerne her skitse en systematisk tilgang til at analysere læsioner cellepopulationer og fænotyper i sene murine åreforkalkning. Denne protokol kan tjene som en skabelon for at undersøge læsion populationer af immunfluorescent farvning i alle typer af forsøgsdesign herunder tidlige og sene åreforkalkning samt forebyggelse og intervention undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi takker centrum for biologiske Imaging (støttet af NIH 1S10OD019973-01) på University of Pittsburgh for deres bistand. Dette arbejde blev støttet af er understøttet af videnskabelige udvikling Grant 15SDG25860021 fra American Heart Association til D.G. R.A.B. blev støttet af NIH give F30 HL136188.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16% Paraformaldehyde aqueous solution Electron Microscopy Sciences RT 15710 Tissue perfusion and fixation
23G butterfly needle Fisher BD367342
25G needle Fisher 14-821-13D 
A1 Confocal microscope Nikon Confocal microscope
ACTA2-FITC antibody (mouse) Sigma Aldrich F3777 Primary Antibody
Alexa-647 anti goat Invitrogen A-21447 Secondary antibody
Antigen Unmasking solution, Citric acid based Vector Labs H-3300 Antigen retrieval solution
Chow Diet Harlan Teklad TD.7012
Coverslip Fisher 12-544-14 Any 50 x 24 mm cover glass
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 Nucleus fluorescent counterstaining
Donkey Alexa-488 anti-rabbit Invitrogen A-21206 Secondary antibody
Donkey Alexa-555 anti-rat Abcam ab150154 Secondary antibody
DPBS 10X without Calcium and Magnesium Gibco 14200166 PBS for solution dilutions and washes. Dilute to 1x in deionized water
Embedding cassette Fisher 15-182-701D
ETDA vacuum tube Fisher 02-685-2B
Ethanol 200 proof Decon 2701
Foam pad Fisher 22-222-012
Gelatin from cold water fish skin Sigma Aldrich G7765
GFP antibody (goat) abcam ab6673 Primary antibody
goat IgG control Vector Labs I-5000 IgG control
High Fat Diet Harlan Teklad TD.88137
ImageJ NIH Computer program https://imagej.nih.gov/ij/ 
LGALS3 antibody (rat) Cedarlane CL8942AP Primary antibody
LSM700 confocal microscope Zeiss Confocal microscope
Microscope Slides, Superfrost Plus Fisher 12-550-15
Microtome blades Fisher 30-538-35
Mouse IgG control Vector Labs I-2000 IgG control
NIS element imaging software Nikon Imaging software for z-stack image acquisition
Normal Horse serum Sigma Aldrich H1270
Pap Pen Fisher 50-550-221
Peanut oil Sigma P2144
Prolong gold Antifade mountant Invitrogen P36930 Mounting medium 
Rabbit IgG control Vector Labs I-1000 IgG control
Rat IgG control Vector Labs I-4000 IgG control
RUNX2 antibody (rabbit) Abcam ab192256 Primary Antibody
Syringe BD 309628 1 ml syringe
Tamoxifen Sigma T5648
Xylene Fisher X55K-4
Zen imaging software Zeiss Imaging software for z-stack image acquisition

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. GBD DALYs and HALE Collaborators. Global, regional, and national disability-adjusted life-years (DALYs) for 315 diseases and injuries and healthy life expectancy (HALE), 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet. 388, (10053), 1603-1658 (2016).
  2. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2018 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 137, (12), 67-92 (2018).
  3. Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32, (1), 40-51 (2014).
  4. Bhaskar, V., et al. Monoclonal antibodies targeting IL-1 beta reduce biomarkers of atherosclerosis in vitro and inhibit atherosclerotic plaque formation in Apolipoprotein E-deficient mice. Atherosclerosis. 216, (2), 313-320 (2011).
  5. Isoda, K., et al. Lack of interleukin-1 receptor antagonist modulates plaque composition in apolipoprotein E-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24, (6), 1068-1073 (2004).
  6. Kirii, H., et al. Lack of interleukin-1beta decreases the severity of atherosclerosis in ApoE-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 23, (4), 656-660 (2003).
  7. Gomez, D., et al. Interleukin-1β has atheroprotective effects in advanced atherosclerotic lesions of mice. Nature Medicine. 24, 1418-1429 (2018).
  8. Daugherty, A., et al. Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 121, (6), 53-79 (2017).
  9. Baylis, R. A., Gomez, D., Owens, G. K. Shifting the Focus of Preclinical, Murine Atherosclerosis Studies From Prevention to Late-Stage Intervention. Circulation Research. 120, (5), 775-777 (2017).
  10. Kolodgie, F. D., et al. Pathologic assessment of the vulnerable human coronary plaque. Heart. 90, (12), 1385-1391 (2004).
  11. Virmani, R., Kolodgie, F. D., Burke, A. P., Farb, A., Schwartz, S. M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 20, (5), 1262-1275 (2000).
  12. Gomez, D., Owens, G. K. Smooth muscle cell phenotypic switching in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 95, (2), 156-164 (2012).
  13. Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiological Reviews. 84, (3), 767-801 (2004).
  14. Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circulation Research. 104, (6), 733-741 (2009).
  15. Gomez, D., Shankman, L. S., Nguyen, A. T., Owens, G. K. Detection of histone modifications at specific gene loci in single cells in histological sections. Nature Methods. 10, (2), 171-177 (2013).
  16. Feil, S., et al. Transdifferentiation of vascular smooth muscle cells to macrophage-like cells during atherogenesis. Circulation Research. 115, (7), 662-667 (2014).
  17. Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nature Medicine. 21, 628 (2015).
  18. Cherepanova, O. A., et al. Activation of the pluripotency factor OCT4 in smooth muscle cells is atheroprotective. Nature Medicine. 22, 657 (2016).
  19. Albarran-Juarez, J., Kaur, H., Grimm, M., Offermanns, S., Wettschureck, N. Lineage tracing of cells involved in atherosclerosis. Atherosclerosis. 251, 445-453 (2016).
  20. Chappell, J., et al. Extensive Proliferation of a Subset of Differentiated, yet Plastic, Medial Vascular Smooth Muscle Cells Contributes to Neointimal Formation in Mouse Injury and Atherosclerosis Models. Circulation Research. 119, (12), 1313-1323 (2016).
  21. Newman, A. A., et al. Irradiation abolishes smooth muscle investment into vascular lesions in specific vascular beds. JCI Insight. 3, (15), (2018).
  22. Dobnikar, L., et al. Disease-relevant transcriptional signatures identified in individual smooth muscle cells from healthy mouse vessels. Nature Communications. 9, (1), 4567 (2018).
  23. Misra, A., et al. Integrin beta3 regulates clonality and fate of smooth muscle-derived atherosclerotic plaque cells. Nature Communications. 9, (1), 2073 (2018).
  24. Majesky, M. W., et al. Differentiated Smooth Muscle Cells Generate a Subpopulation of Resident Vascular Progenitor Cells in the Adventitia Regulated by Klf4. Circulation Research. 120, (2), 296-311 (2017).
  25. Herring, B. P., Hoggatt, A. M., Burlak, C., Offermanns, S. Previously differentiated medial vascular smooth muscle cells contribute to neointima formation following vascular injury. Vascular Cell. 6, 21 (2014).
  26. Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Science Translational Medicine. 7, (308), (2015).
  27. Bentzon, J. F., Majesky, M. W. Lineage tracking of origin and fate of smooth muscle cells in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 114, (4), 492-500 (2018).
  28. Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nature Medicine. 14, (1), 64-68 (2008).
  29. Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. American Journal of Hypertension. 14, (5), Pt 1 405-408 (2001).
  30. Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286, (6), 2408-2415 (2004).
  31. Durgin, B. G., et al. Smooth muscle cell-specific deletion of Col15a1 unexpectedly leads to impaired development of advanced atherosclerotic lesions. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312, (5), 943-958 (2017).
  32. Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114, (4), 590-600 (2018).
  33. Lin, M. E., et al. Runx2 Deletion in Smooth muscle Cells Inhibits Vascular Osteochondrogenesis and Calcification but not Atherosclerotic Lesion Formation. Cardiovascular Research. (2016).
  34. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving Bioscience Research Reporting: The ARRIVE Guidelines for Reporting Animal Research. PLoS Biology. 8, (6), 1000412 (2010).
  35. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490, (7419), 187-191 (2012).
  36. Nishioka, T., et al. Contribution of inadequate compensatory enlargement to development of human coronary artery stenosis: An in vivo intravascular ultrasound study. Journal of the American College of Cardiology. 27, (7), 1571-1576 (1996).
  37. Pasterkamp, G., et al. Paradoxical Arterial-Wall Shrinkage May Contribute to Luminal Narrowing of Human Atherosclerotic Femoral Arteries. Circulation. 91, (5), 1444-1449 (1995).
  38. Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203, (5), 1273-1282 (2006).
  39. Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative analysis and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus. Journal of Visual Experiments. (82), 50933 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics