Pasient-avledet Orthotopic Xenograft modeller for Human Urotelialt Cell kreft og tykktarmskreft tumor vekst og spontan metastasering

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokollen beskriver generering av pasient-avledet orthotopic xenograft modeller av intra-vesically instilling høyverdig urotelialt celle kreftceller eller intra-rektalt injisere tykk kreftceller i ikke-overvektige diabetiker/alvorlig kombinert immunsvikt (NOD/SCID) mus for primær tumor vekst og spontan metastaser under påvirkning av lymfeknuter stromal celler, som etterligner progresjon av menneskelige metastatisk sykdommer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Moret, R., Hellmers, L., Zhang, X., Gills, J., Hite, N., Klinger, A., Maresh, G. A., Canter, D., Bardot, S., Margolin, D. A., Li, L. Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. J. Vis. Exp. (147), e59223, doi:10.3791/59223 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kreftpasienter har dårlig prognoser når lymfe node (LN) engasjement er tilstede i både høyverdig urotelialt celle kreft (HG-UCC) av blæren og tykktarmskreft (CRC). Mer enn 50% av pasientene med muskel-invasiv UCC, til tross for helbredende terapi for klinisk lokalisert sykdom, vil utvikle metastaser og dø innen 5 år, og metastatisk CRC er en ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall i USA. Xenograft modeller som konsekvent etterligner UCC og CRC metastasering sett hos pasienter er nødvendig. Denne studien har som mål å generere pasient-avledet orthotopic xenograft (PDOX) modeller av UCC og CRC for primær tumor vekst og spontan metastaser under påvirkning av LN stromal celler etterligne progresjon av menneskelig metastatisk sykdommer for narkotika screening. Fresh UCC og CRC svulster ble innhentet fra samtykket pasienter gjennomgår reseksjon for HG-UCC og tykk adenokarsinom, henholdsvis. Co-inokulert med LN stromal celle (LNSC) analoge HK celler, luciferase-merkede UCC celler var intra-vesically (IB) innpodet i kvinnelige ikke-overvektige diabetiker/alvorlig kombinert immunsvikt (NOD/SCID) mus, og CRC celler var intra-rektalt (IR) injisert i mannlige NOD/SCID mus. Tumor vekst og metastasering ble overvåket ukentlig ved hjelp av bioluminesens Imaging (BLI). Ved offer, primære svulster og mus organer ble høstet, veid, og formalin for Hematoksylin og Eosin og immunhistokjemi farging. I vår unike PDOX modeller, xenograft svulster ligne pasienten pre-implantation svulster. I nærvær av HK celler, begge modellene har høy tumor implantation priser målt ved BLI og tumor vekter, 83,3% for UCC og 96,9% for CRC, og høy fjernt organ metastasering priser (33,3% oppdaget lever eller lunge metastasering for UCC og 53,1% for CRC). I tillegg har begge modellene null dødelighet fra prosedyren. Vi har etablert unike, reproduserbar PDOX modeller for menneskelig HG-UCC og CRC, som gir mulighet for tumor dannelse, vekst, og metastasering studier. Med disse modellene kan testing av nye terapeutiske stoffer utføres effektivt og på en klinisk mimetisk måte.

Introduction

Det har blitt vist at lymfeknuter (ln) metastasering er en dårlig Prognostisk indikator i mange solide organ ondartet, inkludert høyverdig urotelialt celle kreft (UCC) av blæren og tykktarmskreft (CRC)1,2. Over halvparten av pasientene med muskel-invasiv UCC (MIUCC), til tross for helbredende terapi for klinisk lokalisert sykdom, vil utvikle metastaser og dø innen 5 år. Metastatisk CRC er en ledende årsak til kreft-relaterte dødsfall i USA.

Anslagsvis 81 190 nye pasienter og 17 240 Cancer spesifikke dødsfall forventes å forekomme i 2018 i USA på grunn av UCC av blæren3,4. Mens pasientene vil overveiende (70%) tilstede med ikke-muskel invasiv sykdom, 30% vil ha MIUCC5. Til tross for helbredende terapi (radikal cystectomy [RC] med eller uten systemisk kjemoterapi) for klinisk lokalisert sykdom, vil halvparten av pasientene med MIUCC av blæren fortsatt utvikle metastaser og dø innen 5 år3. Det finnes involvering av lymfeknuter i ca. 20% − 25% av pasientene som har gjennomgått RC6,7,8. Fem års overlevelsesrate hos LN-positive pasienter er mindre enn 35%, selv etter RC, noe som tyder LN-engasjement som en avgjørende negativ indikasjon på prognosen hos pasienter med UCC.

Tykktarmskreft er den tredje vanligste kreftdiagnosen hos både menn og kvinner i USA. Pasienten utfall i stor grad avhengig av tumor egenskaper og tumor mikromiljøet, slik som dybden av invasjonen, LN engasjement, og fjernt organ metastaser. Selv om dødeligheten i CRC redusert i det siste tiåret på grunn av screening og effektive operasjoner, er det anslått at nesten 50% av CRC pasienter vil utvikle metastaser eller tilbakevendende sykdom9.

Små dyremodeller gir en rask, reproduserbar og redigerbart plattform for å studere tumorprogresjon og ulike metastatisk mønstre. Det er for tiden ingen beskrevet xenograft modeller som konsekvent etterligner CRC og UCC metastasering sett hos pasienter. Den primære ruten for kreft Fjern metastasering er via lymfatisk spredning. Ny forskning tyder på at LNs gi svulster med en unik mikromiljøet, og er ikke bare rett og slett stasjonære mål der kreftceller midlertidig pass, men også spille en viktig rolle ved å samhandle med kreftceller i metastatisk prosess. Faktisk, våre studier oppdaget at i tillegg til å utdanne og fremme tumorprogresjon og metastaser, LN stromal mikromiljøet er også ansvarlig for resistens i CRC10,11. Vår Lab nylig bekreftet tumorigene effekter av ln stromal celler (LNSCs) på CRC og UCCs bruker pasient-avledet orthotopic xenograft (PDOX) mus modeller12,13.

Utvikle PDOX modeller gir en viktig plattform for translational Cancer Research14,15. Ved å opprettholde de viktigste histologic og genetiske egenskapene til deres donor tumor, PDOX modeller forbli stabile på tvers av passasjer og gjøre gode plattformer for translational Cancer Research12,15. PDOX modeller blir brukt for prekliniske narkotika evaluering, biomarkør identifisering, og prekliniske evaluering av personlig medisin strategier som muliggjør prediksjon av kliniske utfall. Foreløpig er det ingen beskrevet xenograft modeller som betrakter viktigheten av LN engasjement og er i stand til konsekvent gjengivelse primære tumor og fjernt organ metastasering i CRC og UCC. I denne studien beskriver vi utviklingen av PDOX-modeller i NOD/SCID-mus med reproduksjon av metastatisk CRC-og UCC-sykdommer med LNSC-involvering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle metoder beskrevet i disse dyre studiene ble gjennomført under godkjente retningslinjer for institusjonelle Animal Care og bruk Committee of Ochsner Health system og i samsvar med dyre forskning retningslinjer. Alle pasient svulster for denne studien ble samlet inn fra samtykket pasienter gjennomgår kreft reseksjon operasjoner i samsvar med Ochsner Health system undersøkende Review Board og etiske standarder for den institusjonelle komité for Human Eksperimentering. Board-sertifisert patologer på Ochsner Health system bestemt patologisk diagnoser av pasienten prøver basert på mikroskopiske trekk ved tumorceller, deres histologiske type, og klassetrinn.

Merk: følgende protokoll beskriver fremgangsmåten for to separate xenograft modeller, en UCC modell via electrocauterization av blæren veggen for å innpode UCC celler og en intrarectal injeksjon av CRC celler for studier i en CRC-modell. Alle trinnene for å forberede og overvåke eksperimentene er identiske for begge modellene, mens avsnittene 7 og 8 spesifikt beskriver fremgangsmåten for henholdsvis UCC-drypping og CRC-injeksjon.

1. dyrking cellelinjer

  1. Vokse HK celler i komplett RPMI-1640 medium supplert med 10% fosterets storfe serum, 2 nM glutamin, 100 U/mL penicillin G, og 100 mg/mL Streptomycin ved 37 ° c i en 5% CO2 fuktet inkubator.
    Merk: HK cellene er normale menneskelige follikulær dendrittiske celler og kan dyrkes og utvides for ≤ 15 passasjer in vitro16.
  2. For å forberede for et eksperiment, trypsinize cellene.
    1. Fjern Media og tilsett 2 mL 1% Trypsin i Hank ' s balanserte saltløsning (HBSS) til celler. Plasser cellene tilbake i 5% CO2 fuktet inkubator ved 37 ° c i 4 min.
    2. Samle celler fra fatet til et 15 mL rør ved hjelp av en håndholdt Pipet hjelpemiddel med en 10 mL serologisk Pipet vedlagt. Tilsett 8 mL komplett RPMI-1640 medium.
    3. Kombiner 40 μL av celler og 40 μL av trypan blå i en enkelt brønn på en 96 brønn plate. Tilsett 10 μL av blandingen til en hemocytometer og telle levende celler. Tilsett 1 000 000 celler i 25 mL komplett RPMI-1640 medium til en 150 mm steril vev kultur-behandlet parabolen å fortsette å vokse cellene.
      Merk: HK celle suspensjon utarbeidet i dette trinnet må brukes innen en time å blande med tumorceller for injeksjon.

2. prøvetaking av pasientprøver

  1. Samle UCC svulster fra samtykket pasienten 15 (BlCaPt15, pT3b N1 M0) og 37 (BlCaPt37, pT3b pN0 M0) ved reseksjon kirurgi.
  2. Samle CRC svulster fra samtykket pasienten 155 (CoCaPt155, T1 N0 M0) og 302 (CoCaPt302, T1 N0 M0) ved reseksjon kirurgi.

3. utvidelse av pasientens tumor

  1. Samle svulster ved kirurgi i kaldt sterilt McCoy ' s medium som inneholder penicillin G (500 U/mL) og Streptomycin (500 mg/mL).
  2. Implantat svulster direkte inn i venstre og høyre flanke av 6 − 8 ukers gamle kvinnelige NOD/SCID mus.
    1. Mekanisk hakke vev i små biter (~ 1 mm3) ved hjelp av små kirurgiske saks.
    2. Implantat vev subkutant til venstre og høyre flanke ved hjelp av 13 G benmarg aspirasjon biopsi nåler.
      Merk: implantatet et total volum på 8 mm3 delt jevnt på begge sider av flanken.

4. merking og berikelse av luciferase merket svulster

  1. Mål tumor vekst bi-ukentlig ved hjelp av en digital tykkelse.
  2. Ved 1 cm i diameter, overfører svulst. Injiser direkte i tumor med en enkelt dose av Luc/rødt fluorescerende protein (RFP)-lentivirus (50 μL/tumor, 1:30 fortynning fra konsentrert høy titer lentivirus lager) ved hjelp av en 1 cc sprøyte med en 27 G nål.
    Merk: pasienten tumor vanligvis når 1 cm i diameter i 1 − 2 måneder. Men, vekstraten er ekstremt variabel og basert på en rekke faktorer, inkludert tumor karakter og type.
  3. Dataskjerm svulst ukentlige av Puerto Mosquito tenkelig (BLI) inne bo dyrene.
    1. Veie musene. Injiser bevisst mus med 150 mg/kg luciferin intraperitonealt og vent 5 min for underlaget å sirkulere i musen kroppen.
    2. Bedøve musen med 2,5% isoflurane i 100% oksygen, 1 L/min i en induksjon kammer.
    3. Sted musen opp på mage inne en BLI tenkelig apparat med isoflurane flyter og image. Ta sekvensielle bilder for å bekrefte tilstedeværelsen av Luc/RFP positive tumor regioner (False-farge bio-selvlysende bilde). Retur musen å bur etter tenkelig er fullstendig.

5. Velg riktig del av tumor for enzymatisk fordøyelse

  1. På dagen for UCC eller CRC prosedyre, bilde mus med luciferase merket svulst som i trinn 4.3.1 − 4.3.3.
    Merk: hvor lang tid for subkutan svulst til å vokse avhenger av hastigheten på tumor vekst og det planlagte antall dyr som skal injiseres i eksperimentet.
  2. Harvest svulst fra mus flanken og bilde.
    1. Euthanize musen ved CO2 inhalasjon etter bildebehandling. Plasser musen i CO2 Chamber, slå på gass på 1,4 L/min til åndedretts arrest og la virke i 3 min. Følg dette med cervical forvridning.
    2. Rengjør huden med 70% etanol. Tent huden direkte over tumor. Med kirurgisk saks lage et lite snitt i huden. Skill huden fra tumor med saks.
    3. Fjern tumor og plasser i en steril Petri-parabolen. Bilde hele parabolen i en tenkelig maskin.
  3. Bruk steril saks eller skalpell å skille luciferase-negative seksjoner fra luciferase positive seksjoner i svulsten og re-image.
  4. Gjenta til bare de fleste svært positive tumor brikker igjen.

6. enzymatisk fordøyelse av tumor

  1. Under laminær Flow hette, hakke luciferase positive tumor brikker (trinn 5,4) i den minste mulige brikker ved hjelp av sterile kirurgiske saks og sette dem inn i en steril 50 mL konisk rør.
    Merk: hakking svulsten til de minste mulige brikkene vil gi flere individuelle celler.
  2. Klargjør sammendrags løsning ved å tilsette 10 mL kollagenase IV (1,5 mg/mL), 80 μL av Hyaluronidase (20 mg/mL) og 160 μL av deoxyribonuclease I (0,1 mg/mL) til 40 mL HBSS. Mix løsning av invertere.
  3. Tilsett 35 − 40 mL av sammendrags oppløsningen for å finhakket svulst. Ruge ved 37 ° c med kontinuerlig rotasjon for 2 timer.
    Merk: kraftig riste rør periodevis gjennom inkubasjons å hindre tumor vev fra klumper.
  4. Filtrer hele fordøyelsen gjennom steril 100 μm celle sil etterfulgt av en 40 μm celle sil for å fjerne rusk. Lagre flyten gjennom og kast rusk.
  5. Vask friplassene ved å tilsette 20 mL HBSS og sentrifuge ved 329 x g i 5 min. aspirer supernatanten og resuspend pellet i 30 ml HBSS.
  6. Kombiner 10 μL av celle løsning og 90 μL av trypan blå i en enkelt brønn av en 96 brønn plate. Telle levende celler ved hjelp av en hemacytometer.
  7. Overfør 1 x 104 til 1 x 106 tumorceller per mus til et sterilt 15 ml konisk rør. Legg til 3 x 105 hk celler fra trinn 1.2.3 per mus, til samme rør med tumorceller.
    Merk: Bruk sterilt 50 mL konisk rør hvis det totale volumet overstiger 15 mL. Beregn alltid flere doser for flere dyr per studie gruppe for å gjøre rede for væsketap under sprøytebruk. Hvis for eksempel en gruppe inneholder 5 mus, må du lage nok celler til 6 eller 7 mus.
  8. Sentrifuger på 329 x g i 5 min. forkaste supernatanten enten ved aspirating eller pipettering.
  9. Resuspend celler i 50 μL per mus for UCC modell eller 10 μL per mus for CRC-modell i komplett RPMI Media. Hold celle oppheng på isen til klar til bruk.

7. UCC mus modell

  1. Utarbeidelse av mus for prosedyre
    1. Skaffe seks-å åtte-uke gamle kvinner NOD/SCID musen. Barbere nedre ryggen av musen ved hjelp av hårfjerning krem. Bedøve musen i en induksjon kammer med isoflurane (2,5% i 100% oksygen, 1 L/min).
    2. Når bedøvet, plasserer musen i liggende posisjon med sin snute i en isoflurane nese kjegle og nakne tilbake fast jordet på en dispersive elektrode.
      Merk: musen er helt bedøvet hvis ikke reagerer på tå knipe.
  2. Innpode UCC celler forberedt i trinn 6,9 til blæren ved hjelp av en angiocatheter (figur 1Aa, AB).
    1. Sett opp en monopolar elektrokautering maskin og satt til en effekt på 4 W. smør en 24 G steril angiocatheter med smøring gelé og sette inn gjennom urinrøret av den kvinnelige musen.
      Merk: lett motstand kan merkes. Trykk forsiktig forover eller fjern angiocatheter og gjenta. Ikke Tving. Hvis kateteret bøyes på oppføring, sett inn en steril ledevaier (se 7.2.2) halvveis inn i kateteret for å gi stabilitet.
    2. Sett helt inn 0,025 "fast kjerne rettleder ledning 1 mm forbi enden av angiocatheter.
      Merk: ledningen er merket med tape før prosedyren for å indikere 1 mm stoppe punkt og sikre konsistens.
    3. Hold monopolar pinnen til føringstråden for 1 s, som tillater elektrisk irritasjon av blæren mucosa.
    4. Fest en frisk steril angiocatheter til 1 cc luer-Lok sprøyte og trekk opp 200 μL av innsamlede celler fra trinn 6,9.
      Merk: minst 100 μL går tapt fra angiocatheter til sprøyten. Kompensere for tap volum ved beregning av volum av celle suspensjon nødvendig.
    5. Fjern ledevaieren og angiocatheter fra mus urinrøret. Sett inn angiocatheter med sprøyte av celler festet i urinrøret.
      Merk: avansement bør være enklere enn før.
    6. Innpode 50 μL av celler til mus blære. Vent noen sekunder før du fjerner angiocatheter slik at cellene kan følge blæreveggen.
      Merk: celler forblir i blæren og utvikle seg til en primær svulst.
  3. Fjern musen fra isoflurane nese kjegle og jording pad. Observer musen for 1 h følgende prosedyre. Se etter tegn på nød, dvs. bøyd tilbake, anstrengt pust, etc.

8. CRC mus modell

  1. Bedøve seks-til-åtte-ukers gammel mannlig NIKK/SCID mus med isoflurane (2,5% i 100% oksygen, 1 L/min) i induksjon kammeret. Bekreft sedasjon med en tå klype.
  2. Plasser anesthetized musen i liggende posisjon under et dissekere mikroskop, og pass på å sikre deres snute til en isoflurane nosecone og for å sikre sine foran lemmer med tape for stabilitet.
    Merk: loupes kan brukes i stedet for et dissekere mikroskop. Et lite objekt kan brukes til å forbedre synlighet og vinkel når plassert under bunnen av halen, heve anus. Vanligvis er små deler av gasbind rullet inn i en sylinderform av 1-tommers diameter.
  3. Dilate den analkanalen med buet smurt sløv-tippet tang for å avdekke den svingete Anal og rektal mucosa. Fjern avføring.
  4. Bruk en steril 30 G avtagbar nål på en 50 μL glass sprøyte for å injisere 10 μL av tumor og HK celler (fra trinn 6,9) inn i den fjerne bakre rektal submukosa 1 til 2 mm over analkanalen. Skråkanten av nålen skal dekkes av slimhinnen. Vær forsiktig så du ikke går inn i bekkenhulen.
  5. Fjern musen fra isoflurane nese kjegle. Observer musen for 1 h følgende prosedyre. Se etter tegn på nød, dvs. bøyd tilbake, anstrengt pust, etc.

9. Puerto Mosquito avbildning

  1. Overvåk den primære tumor, leveren, og lunge metastatisk byrde ukentlig ved hjelp av en Puerto Mosquito Imaging system for luciferase aktivitet.
    1. Skaff deg en mus fra UCC eller CRC eksperiment og veie. Injiser 150 mg/kg luciferin intraperitonealt og vent 5 min for underlaget å sirkulere i musen kroppen.
    2. Bedøve mus med 2,5% isoflurane i 100% oksygen, 1 L/min i induksjon kammeret.
    3. Plasser musen i BLI Imaging maskin med nese fast i nosecone. Når utsette for bildet, sørg for at området av interesse står overfor kameraet. For UCC og CRC-injeksjon skal ventrale IDen være vendt mot kameraet for hvert bilde. Bilde mus i liggende posisjon.

10. høsting organer og svulst

  1. Når den primære tumor luminescence stråleglans når 1 x 1011 fotoner eller hvis mus viser tegn på nød (dvs. vekttap, bøyd tilbake, harde/anstrengt pust, etc.), euthanize mus av co2 inhalasjon (som i trinn 5.2.1) etter luciferin injeksjon og hele kroppen Imaging.
  2. Fjern lever og lunge, plasser i en Petri parabol og bilde for å identifisere eventuelle metastaser. Fjern tumor, veier og bilde. Fix organer og tumor i 10% nøytral bufret formalin for 48 h ved omgivelsestemperatur.
    Merk: Rengjør/tørk saks og tang mellom hvert organ for å unngå overføring av vev.

11. histologiske evaluering

  1. Bygg inn formalin fast vev i parafin og skjær vevet på 5 μm tykkelse på en mikrotomen for hematoksylin og eosin (H & E) og immunhistokjemiske (IHC) farging.
    Merk: alle H & E flekker av parafin lysbilder ble gjort i patologi laboratorium i Ochsner Health system, og alle IHC farging i denne utredningen ble utført i et forskningslaboratorium av Ochsner Health system etter høy temperatur antigen henting ved hjelp av Ki67 og cytokeratin 20 antistoffer, etterfulgt av biotinylated sekundær antistoff og avidin-biotin-peroksidase komplekser i henhold til produsentens anvisninger13,17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I UCC PDOX-modellen var UCC-pasientens BlCaPt15-eller BlCaPt37-celler intra-vesically (IB) innpodet i nærvær av HK-celler til kvinnelig NOD/SCID-mus blære (figur 1a). Tjuefem av tretti (83,3%) dyr generert primære svulster og vist tid avhengig primære tumor vekst basert på ukentlig bli (figur 1B, C og tabell 1). Tilsvarende, i CRC PDOX modellen, 31 av 32 (96,9%) mus vokste primære tumor når intra-rektalt (IR) injisert med pasientens CoCaPt155 eller CoCaPt302 celler pluss HK celler (figur 1d-F og tabell 1). Avhengig av pasientens svulst, hadde mus tumorveksten en annen ventetid periode, noe som reflekterer forskjellen i pasientens kliniske egenskaper (figur 1C, F).

I både IB og IR-modeller, tumor celle injeksjon ikke bare generert orthotopic primære svulster (figur 2a, B, blå piler), men mange mus testet også utviklet lever og/eller lunge metastaser. I 10 av 30 (33,3%) og 17 av 32 (53,1%) mus innpodet med UCC celler og CRC celler med HK celler, henholdsvis, vi oppdaget fjernt organ metastasering via ex vivo BLI (figur 2a,B og tabell 1).

For å bekrefte lignende vev morfologi, ble H & E og IHC farging utført sammenligne xenotransplantater og primære pasient svulster. Histopatologi av pasient blære kreft ble opprettholdt i xenotransplantater fra BlCaPt15 og BlCaPt37 (figur 3a). Resultatene viser xenograft tumor tilsvarende muskel invasiv vekstmønster av pasientens primære svulster. Antistoff spesifikke for menneskelig celle spredning markør Ki67 ble brukt i IHC. Ki67 positive kjernefysiske flekker indikerer svært proliferativ, raskt voksende menneskelige tumorceller. Fargeresultatene fra xenotransplantater var de samme som for de opprinnelige kirurgiske biopsier. Tilsvarende, i IR-modellen, H & E flekker indikerer likheten av arkitektur mellom xenotransplantater og pasient svulster av både CoCaPt155 og CoCaPt302. IHC ved bruk av antistoff mot cytokeratin 20 viste også lignende tumor vekstmønster i begge PDOX-modellene (figur 3b). Dermed vår PDOX modellen sammenfattet UCC og CRC pasient klinisk progresjon.

Figure 1
Figur 1: ORTHOTOPIC UCC og CRC-mus modeller. (A-C) Intra-vesicle (IB) drypping av UCC celler i musen blæren13. (AA) En angiocatheter ble satt inn i blæren av en kvinnelig NOD/SCID mus og en elektrokautering sjokk ble påført blæren veggen via en guide wire. (AB) Luciferase merket UCC tumorceller, BlCaPt15 (2 x 104 celler), eller BlCaPt37 (5 x 105 celler) med tillegg av 3 x 105 ln stromal hk celler, ble innpodet inn i Nod/SCID musen blæren gjennom angiocatheter. (D-F) Intra-rektal (IR) injeksjon av CRC celler i submucosal vev laget av mus rektum17. (D) analkanalen ble utvidet med smurt Butt-tippet tang for å gi tilgang til den foranstående Anal og rektal mucosa og en 30 G nål ble satt inn i den ytre bakre rektal submukosa 1 − 2 mm over analkanalen til skråkant ble dekket før injeksjonen finner sted. Luciferase merket CRC tumorceller, CoCaPt155 (5 x 105 celler), eller CoCaPt302 (1 x 104 celler) med tillegg av 3 x 105 hk celler ble injisert. Tumor byrden ble overvåket og kvantifisert via Puerto Mosquito Imaging (BLI; B og E). Tumor vekst av luciferase merket UCC eller CRC celler ble overvåket Kinetically via BLI og analysert ved hjelp av bildeanalyse programvare (C og F). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: PDOX-modeller produserer spontane, fjerntliggende orgel metastaser. Representative mus (øverste paneler) fra samme eksperimenter som i figur 1, for eksempel, innpodet intra-vesically med LUCIFERASE merkede UCC tumorceller, BlCaPt15 eller BlCaPt37 celler med hk celler (A) eller intra-REKTALT med luciferase merket CRC svulst celler, CoCaPt155 eller CoCaPt302 celler med HK celler (B) vises. Gule piler angir muse blære (A). Bilder tatt på tidspunktet for offeret indikerer orthotopic tumor formasjon (blå piler). Lever, lunge og tumor (midtre paneler) samlet på obduksjon og deres ex vivo BLI (nederst paneler) viste musen lever og lunge metastasering samt tumor med luciferase aktivitet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Xenograft svulster ligne pasienten pre-implantat svulster. Parafin innebygd tumor vev fra pasienten tumor eller svulster samlet inn fra mus i samme eksperimenter som i figur 1 ble delt og farget av H & E (a og B) eller IHC med antistoffer mot humant Ki67 (a) eller cytokeratin 20 (CK20; B). den brune fargen indikerer positiv farging. H & E flekker viser tumor reir dissekere i glatt muskelbunter (A). Fotografier ble tatt ved hjelp av et digitalt deconvoluting mikroskop og analysert med et bildeanalyse programvare. Vektstenger: 100 μm. Alle bilder ble tatt i original forstørrelse av 200 ×. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tumor implantat (%) Lunge/lever-metastasering (%) Dødelighet (%)
UCC, n = 30 83,3 33,3 0
CRC, n = 32 96,9 53,1 0

Tabell 1: oppsummering av tumor dannelse, metastasering og dødelighet i IB-og IR-modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metastatisk sykdom er ansvarlig for de fleste kreft pasient dødelighet. I pre-kliniske terapeutiske tester, er det avgjørende å etablere musemodeller som nærmest etterligne menneskelig tumor vekst med spontane fjernt organ metastaser. Bruke murine modeller med implantert pasient tumor avledet kreftceller (xenotransplantater) gir en bedre forståelse av tumor biologi og prediktiv biomarkører samt testing og prediksjon av antineoplastiske effekter av romanen terapi18. Mange modeller har blitt brukt til å vise UCC og CRC metastaser i murine eksperimenter, slik som intravenøs hale vene injeksjoner viser evnen til å produsere lungesykdom19 eller subkutan implantation av tumorceller eller tumor fragmenter i flanken for lokaliserte tumor vekst20,21. Ett laboratorium tidligere rapportert en blære kreft murine modell ved hjelp av saltsyre behandlinger for å kunne fremme tumor opptak22. Mens disse metodene produserer pålitelig lokal vekst og kan demonstrere noen metastatisk virksomhet, har de ikke spesifikt ligne den naturlige utviklingen av kreft utviklet hos mennesker og ikke bruke metastatisk mekanisme sett hos pasienter18, 23på. Andre murine modeller ble rapportert å etterligne tumor vekst ved å injisere tumorceller direkte inn i organer som leveren eller mesenterium, men de bar risiko for tumor celle lekkasje og ikke produsere betydelige metastaser.

Vi har tidligere demonstrert sammenhengen mellom kreftcelle innhold i den primære tumor og LN engasjement24 og rollen til kreftcelle/ln stromal interaksjon i løpet av primær tumorprogresjon til metastatisk sykdom10 , 12 flere , 17. innlemme vårt tidligere arbeid på påvirkning av ln stromal mikromiljøet i metastatisk progresjon, etablerte vi orthotopic modeller (spesielt PDOX modeller) som etterligner den naturlige løpet av metastatisk formidling, er teknisk reproduserbar, bevare heterogenitet av opprinnelige pasientens svulster, og generere konsistent primær tumor og metastatisk resultater12,13,17. Ved hjelp av tumor-forsterke effekter av LN stromal mikromiljøet er viktig fordi det gir en lignende svulst mikromiljøet i menneskelige UCC og CRC, utvikler alle trinnene i metastatisk Cascade, reduserer kreftcelle nummer som kreves i muse modellen som minimerer antall xenograft passasjer, og resulterer i en pålitelig modell som tett etterligner tumor vekst og metastaser i menneskelig.

Vi har etablert en unik metode for IB elektro-stimulering ved hjelp av co-drypping av HK celler som produserer en pålitelig modell for å utvikle MIUCC. Vår modell etterligner den naturlige løpet av UCC progresjon av tumor implantation begynnelsen i mucosa, fører inn i muskelen, så metastasizing til lungene13.

Våre resultater viser også at IR-modellen er trygg, reproduserbar og vellykket. Den orthotopic CRC Mouse modellen har primær tumor vekst og spontan Fjern metastasering12,17. IR prosedyren er rask, lett å lære, teknisk lett å utføre, og ikke for stressende på dyrene. IB og IR-gruppene hadde null dødelighet (tabell 1) i den postoperative perioden før endelig bli-måling. Imidlertid krever teknikken praksis. Hvis intrarectal injeksjon er vellykket, bør det være en synlig "boble" som former som væsken er innført i rektal submukosa og vil resultere i primær tumor vekst som til slutt vil bli håndgripelig som vist i figur 1. Hvis svulsten er injisert for dypt inn i bekkenhulen, vil det være fristilt til tykktarmen og vokser svært store for å fylle bekkenet, noen ganger forårsaker obstruksjon. Hvis injeksjonen er for grunt eller ikke inn i rektal submucosal lag i det hele tatt, vil det lekke ut resulterer i redusert eller fraværende primære tumor byrde.

Vi har etablert unike, reproduserbar PDOX modeller for menneskelig HG-UCC og CRC. Disse modellene tillater tumor dannelse og metastasering studier. Vi kan nå bruke disse modellene som den primære metoden for å fortsette å studere LN stromal mikromiljøet og dens interaksjon med pasientens primære svulster. Disse modellene vil også tillate oss å undersøke behandlinger som forstyrrer den Pro-tumorigene effekter av LNSC på primære svulst. Med disse modellene, testing av romanen terapeutiske stoffer kan utføres effektivt og i klinisk-mimetisk manerer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Denne studien ble delvis støttet av Ochsner translational Medicine Research Initiative Grant 2014. Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Forfatterne takker Brian Reuter, Danielle Bertoni, Peter Miller, og Shannon McChesney som bidro til å initiere disse studiene for deres utmerkede teknisk støtte. Forfatterne takker også Heather Green Matrana, Margaret Variano, Sunil Talwar, og Maria Latsis for assistanse i samtykkende pasienter og gi tumor prøver.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Avidin-biotin-peroxidase Vector Labs Inc PK-6100
Biotinylated secondary antibody Vector Labs Inc BA-1000
Collagenase IV (1.5 mg/mL) Worthington Biochemical Corporation LS004189
Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL) Sigma D4263
D-Luciferin (150 mg/kg) Perkin Elmer 122796
Formalin (10% neutral buffered) Leica 46129
glutamine (2 nM) Fisher Scientific 35050061
Hair Removal Cream Church & Dwight Co., Inc 1 (800) 248-8820
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) Fisher Scientific SH30016.02
Hyaluronidase (20 mg/mL) Sigma H3884
Isoflurane Henry Schein Animal Health 108333
Luc/RFP-lentivirus From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018).
McCoy’s medium Life Technologies 110862
penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL) Fisher Scientific 15140-122
RPMI-1640 Medium American Type Culture Collection 110636
Trypan Blue Sigma T6146
Trypsin/EDTA Life Technologies 15400-054
Name Company Catalog Number Comments
Gas
100% Oxygen Airgas Inc OX USP200
100% CO2 Airgas Inc CD USPE
Name Company Catalog Number Comments
Mice
6-8 week old NOD/SCID Mice (male) Jackson Lab 001303
6-8 week old NOD/SCID Mice (female) Jackson Lab 001303
Name Company Catalog Number Comments
Immunohistochemistry
Hematoxylin Sigma GHS232
Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody Thermo Scientific RM-9106-S
Name Company Catalog Number Comments
Tools
40 µm cell strainer Fisher Scientific 08-771-1
100 µm cell strainer Fisher Scientific 08-771-19
15 mL Conical Tube Sarstedt 11799
50 mL Conical tube Sarstedt 15762
150 mm Tissue Culture Dish USA Scientific Inc CC7682-3614
96 Well plate USA Scientific Inc CC7682-7596
Forceps Symmetry Surgical Inc 06-0011
Surgical scissors Symmetry Surgical Inc 02-2011
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
5% CO2 humidified incubator Thermo Scientific 3110
Bioluminescent (BLI) Imaging Machine Perkin Elmer CLS136334
BLI Imaging Machine Software Perkin Elmer CLS136334
Centrifuge Beckman 366830
Deconvoluting Microscope Intelligent Imaging Innovations Marianas
Deconvoluting Microscope Imaging Software Intelligent Imaging Innovations +1 (303) 607-9429 x1
Digital caliper Fowler Tools and Instruments 54-115-330
Dissecting microscope Precision Instruments LLC (504) 228-0076
Electrosurgical generator ValleyLab FORCE1C20
Isoflurane Induction Chamber Perkin Elmer 119038
Microtome American Optical Corporation 829
Pipet Aid Fisher Healthcare 13-681-15E
Serological pipet (10 mL) Sarstedt 86.1254.001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sundlisaeter, E., et al. Lymphangiogenesis in colorectal cancer--prognostic and therapeutic aspects. International Journal of Cancer. Journal international du cancer. 121, 1401-1409 (2007).
  2. Gout, S., Huot, J. Role of cancer microenvironment in metastasis: focus on colon cancer. Cancer Microenvironment. 1, 69-83 (2008).
  3. National Cancer Institute. SEER Stat Fact Sheets: Bladder Cancer. Available from: http://seer.cancer.gov/statfacts/html/urinb.html (2018).
  4. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 68, 7-30 (2018).
  5. Hautmann, R. E., de Petriconi, R. C., Pfeiffer, C., Volkmer, B. G. Radical cystectomy for urothelial carcinoma of the bladder without neoadjuvant or adjuvant therapy: long-term results in 1100 patients. European Urology. 61, 1039-1047 (2012).
  6. Stein, J. P., et al. Radical cystectomy in the treatment of invasive bladder cancer: long-term results in 1,054 patients. Journal of Clinical Oncology. 19, 666-675 (2001).
  7. Lerner, S. P., et al. The rationale for en bloc pelvic lymph node dissection for bladder cancer patients with nodal metastases: long-term results. The Journal of Urology. 149, discussion 764-755 758-764 (1993).
  8. Poulsen, A. L., Horn, T., Steven, K. Radical cystectomy: extending the limits of pelvic lymph node dissection improves survival for patients with bladder cancer confined to the bladder wall. The Journal of Urology. 160, 2015-2019 (2020).
  9. National Cancer Institute. SEER Stat Fact Sheets: Colon and Rectum Cancer. Available from: http://seer.cancer.gov/statfacts/html/colorect.html (2017).
  10. Margolin, D. A., et al. Lymph node stromal cells enhance drug-resistant colon cancer cell tumor formation through SDF-1alpha/CXCR4 paracrine signaling. Neoplasia. 13, 874-886 (2011).
  11. Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12, 468-476 (2010).
  12. Margolin, D. A., et al. The critical roles of tumor-initiating cells and the lymph node stromal microenvironment in human colorectal cancer extranodal metastasis using a unique humanized orthotopic mouse model. FASEB Journal. 29, 3571-3581 (2015).
  13. Gills, J., et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729 (2018).
  14. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
  15. Hiroshima, Y., et al. Patient-derived mouse models of cancer need to be orthotopic in order to evaluate targeted anti-metastatic therapy. Oncotarget. 7, 71696-71702 (2016).
  16. Kim, H. S., Zhang, X., Klyushnenkova, E., Choi, Y. S. Stimulation of germinal center B lymphocyte proliferation by an FDC-like cell line, HK. The Journal of Immunology. 155, 1101-1109 (1995).
  17. Hite, N., et al. An Optimal Orthotopic Mouse Model for Human Colorectal Cancer Primary Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Diseases of the Colon and Rectum. 61, 698-705 (2018).
  18. Jager, W., et al. Ultrasound-guided intramural inoculation of orthotopic bladder cancer xenografts: a novel high-precision approach. PloS One. 8, e59536 (2013).
  19. Schirner, M., et al. Integrin alpha5beta1: a potent inhibitor of experimental lung metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 16, 427-435 (1998).
  20. Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445, 111-115 (2007).
  21. Todaro, M., et al. Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4. Cell Stem Cell. 1, 389-402 (2007).
  22. Lee, J. S., et al. Tumor establishment features of orthotopic murine bladder cancer models. Korean Journal of Urology. 53, 396-400 (2012).
  23. Hadaschik, B. A., et al. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
  24. Silinsky, J., et al. CD 133+ and CXCR4+ colon cancer cells as a marker for lymph node metastasis. The Journal of Surgical Research. 185, 113-118 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics