تحديد العوامل النيوكليولار أثناء النسخ المتماثل لفيروس نقص المناعة البشرية-1 من خلال الترسيب المناعي القس والقياس الطيفي الكتلي

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هنا نقوم بوصف الترسيب المناعي Rev في وجود النسخ المتماثل فيروس نقص المناعة البشرية-1 لقياس الطيف الكتلي. ويمكن استخدام الأساليب الموصوفة لتحديد العوامل النووية التي تنطوي عليها الدورة المعدية لفيروس نقص المناعة البشرية-1، وهي تنطبق على نماذج الأمراض الأخرى لتوصيف المسارات التي لم تدرس بعد.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Arizala, J. A., Chomchan, P., Li, H., Moore, R., Ge, H., Ouellet, D. L., Rossi, J. J. Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (148), e59329, doi:10.3791/59329 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تتطلب الدورة المعدية لفيروس نقص المناعة البشرية-1 تفاعلات البروتين الفيروسي مع العوامل المضيفة لتسهيل النسخ المتماثل الفيروسي، والتعبئة والتغليف، والإفراج. كما تتطلب الدورة المعدية تشكيل مجمعات بروتين فيروسية/مضيفة مع فيروس نقص المناعة البشرية-1 RNA لتنظيم الربط وتمكين النقل النووي. ويحقق بروتين HIV-1 Rev التصدير النووي لـ HIV-1 mRNAs من خلال التعدد مع الأهداف التي تعمل برابطة الدول المستقلة- عنصر الاستجابة للمراجعة. توجد إشارة توطين نيوكليولار (NoLS) داخل فوهة الأذن العضوية للزخرفة الغنية بالارجين (ARM)، مما يسمح بتراكم مجمعات Rev/RRE في النواة. وتكهن تُتكهن العوامل النووية لدعم الدورة المعدية لفيروس نقص المناعة البشرية-1 من خلال وظائف أخرى مختلفة بالإضافة إلى التوسط في التصدير النووي المستقل عن الحمض النووي الريبي والربط. نحن نصف طريقة الترسيب المناعي من النوع البري (WT) Rev بالمقارنة مع الطفرات النووية Rev (الحذف والطفرات Rev-NoLS نقطة واحدة) في وجود النسخ المتماثل فيروس نقص المناعة البشرية-1 لقياس الطيف الكتلي. العوامل النووية المتورطة في النقل النووي (Nucleophosmin B23 وNocleolin C23)، فضلا عن عوامل الربط الخلوية، تفقد التفاعل مع القس في وجود الطفرات Rev-NoLS. تم تحديد مختلف العوامل النووية الأخرى، مثل snoRNA C /D مربع 58، لتفقد التفاعل مع الطفرات Rev، ومع ذلك وظيفتها في دورة النسخ المتماثل فيروس نقص المناعة البشرية-1 لا تزال غير معروفة. وتبين النتائج المعروضة هنا استخدام هذا النهج لتحديد العوامل النووية الفيروسية/المضيفة التي تحافظ على الدورة المعدية لفيروس نقص المناعة البشرية-1. وتنطبق المفاهيم المستخدمة في هذا النهج على النماذج الفيروسية والأمراض الأخرى التي تتطلب توصيف المسارات التي لم تدرس بعد.

Introduction

وتفترض النوى كأرض التفاعل من مختلف المضيف الخلوي والعوامل الفيروسية اللازمة للنسخ المتماثل الفيروسي. النواة هي بنية معقدة مقسمة إلى ثلاث مقصورات مختلفة: مقصورة الفيبريلار، وحجرة الفيبريلر الكثيفة، والمقصورة الحبيبية. يُترجم بروتين HIV-1 Rev على وجه التحديد داخل المقصورات الحبيبية؛ ومع ذلك، السبب في هذا النمط الترجمة غير معروف. في وجود طفرات من نقطة واحدة ضمن تسلسل NoLS (Rev الطفرات 4 و 5 و 6)، يحتفظ Rev بنمط نيوكليولار وقد ثبت في السابق لإنقاذ تكرار فيروس نقص المناعة البشرية-1HXB2، ومع ذلك، مع انخفاض الكفاءة مقارنة WT Rev1 . جميع الطفرات نقطة واحدة غير قادرة على الحفاظ على دورة فيروس نقص المناعة البشرية-1NL4-3 المعدية. في وجود طفرات متعددة من نقطة واحدة ضمن تسلسل NoLS (Rev-NoLS الطفرات 2 و 9)، وقد لوحظ Rev لتفريق في جميع أنحاء النواة والسيتوبلازم ولم يتمكن من إنقاذ فيروس نقص المناعة البشرية-1HXB2 النسخ المتماثل1. والهدف من هذه الدراسة البروتيوميات هو فك النيوكليولار وكذلك العوامل الخلوية nonnucleolar المشاركة في المسار المعدي فيروس نقص المناعة البشرية-1 بوساطة القس. يتم تحسين ظروف الترسيب المناعي القس من خلال التفاعل مع البروتين الفوسفاتي B23 النووي، الذي ثبت سابقا أن تفقد التفاعل مع القس في وجود الطفرات النووية.

وقد درست العوامل الخلوية Rev على نطاق واسع في الماضي; ومع ذلك، وقد تم ذلك في غياب مسببات الأمراض الفيروسية. بروتين واحد، على وجه الخصوص، التي تتميز في هذه الدراسة من خلال التفاعل القس خلال النسخ المتماثل فيروس نقص المناعة البشرية-1 هو البروتين الفوسفاتي النووي B23 - وتسمى أيضا نوكلوفوسمين (NPM)، نومترين، أو NO38 في البرمائيات2،3، 4.وأعرب عن B23 كما isoforms ثلاثة (NPM1، NPM2، و NPM3) - جميع أعضاء nucleophosmin / nucleoplasmin الأسرة النووية مرافقة5،6. وظائف المشاركات الجزيئية NPM1 في التجميع السليم للنيوكليوسومات، في تشكيل البروتين / مجمعات حمض نووي المشاركة في هياكل الكروماتين أعلى ترتيب7،8، وفي منع التجميع و طي البروتينات المستهدفة من خلال المجال الأساسي N-الطرفية (بقايا 1-120)9. وظائف NPM1 يمتد إلى التكوين الريبوسوم من خلال نقل الجسيمات preribosomal بين النواة والسيتوبلازم10،11، وتجهيز الحمض النووي الريبي preribosomal في تسلسل فاصل ة منقولة الداخلية 12،13، والقبض على تجميع النيوكليولار من البروتينات خلال الجمعية ريبوسومال14،15. وتورط NPM1 في تثبيط المبرمج16 وفي تثبيت مثبطي الورم ARF17و18 و P5319، وكشف عن دورها المزدوج كعامل oncogenic ومثبط الورم. NPM1 يشارك في الأنشطة الخلوية لاستقرار الجينوم، والنسخ المتماثل المركز، والنسخ. تم العثور على NPM1 في النوى أثناء دورة الخلية بين المراحل، على طول محيط الكروموسومات أثناء الالمتعدد، وفي الهيئات قبل النوكليار (PNB) في ختام الداء الميتومي. NPM2 و NPM3 ليست مدروسة جيدا كما NPM1، الذي يخضع لمستويات التعبير المتغيرة خلال الأورام الخبيثة20.

تم توثيق NPM1 في اغلاق النيوكليوسيتوبلازمية من مختلف البروتينات النووية / النووية من خلال NES الداخلية وNLS9،21 وكان قد ذكر سابقا لدفع الاستيراد النووي من البروتينات Tat وفيروس نقص المناعة البشرية وRev. في وجود B23 ملزمة المجال-β-galactosidase البروتينات الانصهار، تات يسيء توطين داخل السيتوبلازم ويفقد نشاط التنشيط. وهذا يدل على تقارب قوي من تات لB232. وأنشأت دراسة أخرى مجمعاً مستقراً للنسخة Rev/B23 في غياب التقييمات الإلكترونية المضادة للانبعاثات. في وجود RRE mRNA، ينفصل Rev عن B23 ويربط يفضل أن يكون فيروس نقص المناعة البشرية RRE، مما يؤدي إلى تشريد B2322. ومن غير المعروف أين، على المستوى دون النووي، يتم نقل تات وعملية تبادل Rev من B23 لفيروس نقص المناعة البشرية mRNA. يتم تفترض كل من البروتينات لدخول النوى في وقت واحد من خلال التفاعل B23. ومن المتوقع إشراك البروتينات الخلوية المضيفة الأخرى في مسار النيوكليولار لفيروس نقص المناعة البشرية. الأساليب الموصوفة في هذا التحقيق البروتيوميات سوف تساعد على توضيح التفاعل من النوى مع العوامل الخلوية المضيفة المعنية خلال مرض فيروس نقص المناعة البشرية-1.

وقد بدأ التحقيق في البروتيوميات من خلال التعبير عن الطفرات ذات النقطة الواحدة Rev NoLS (M4 و M5 و M6) وبدائل الأرجينين المتعددة (M2 و M9) لإنتاج فيروس نقص المناعة البشرية-1HXB2. في هذا النموذج، يتم نقل خط خلية HeLa التي تعبر بشكل ملحوظ عن نقص Rev HIV-1HXB2 (HLfB) مع الطفرات النيوكليولار WT Rev وRev التي تحتوي على علامة العلم في نهاية 3'. وسيؤدي وجود WT Rev إلى السماح بحدوث النسخ المتماثل الفيروسي في ثقافة HLfB، بالمقارنة مع طفرات Rev-NoLS التي لا تنقذ نقص Rev (M2 وM9)، أو تسمح بحدوث النسخ المتماثل الفيروسي ولكن ليس بكفاءة مثل WT Rev (M4 وM5 وM6)1. يتم جمع lysate الخلية 48 ح في وقت لاحق بعد الانتشار الفيروسي في وجود التعبير القس وتعرض لمناعة الترسيب مع العازلة lysis الأمثل للتفاعل Rev/B23. يتم وصف تحسين العازلة تحلل باستخدام تركيزات الملح متفاوتة، ويتم مقارنة أساليب الإلتبيلة البروتين لفيروس نقص المناعة البشرية-1 Rev وتحليلها في الفضة الملطخة أو الكوماسي الملون SDS-PAGE هلام. وينطوي النهج البروتيومياتي الأول على التحليل المباشر لعينة من معدل WT Rev وM2 وM6 وM9 بواسطة قياس الطيف الكتلي جنباً إلى جنب. أما النهج الثاني الذي خضعت به الأيلات من WT Rev وM4 وM5 وM6 لعملية استخراج الجل إلى النهج الأول. يتم تحليل تقارب الببتيد إلى الطفرات Rev-NoLS بالمقارنة مع WT Rev وعرض احتمال تحديد البروتين. وتكشف هذه النُهُج عن العوامل المحتملة (النيوكليولار وغير النوكليولار) التي تشارك في نقل فيروس نقص المناعة البشرية-1 من الحمض النووي الريبي والربط مع Rev أثناء تكرار فيروس نقص المناعة البشرية-1. بشكل عام، فإن حالة الانحراف الخلوي، والملكية الفكرية، وelution الموصوفة تنطبق على البروتينات الفيروسية ذات الأهمية لفهم العوامل الخلوية المضيفة التي تنشط وتنظم المسارات المعدية. وهذا ينطبق أيضا على دراسة العوامل المضيفة الخلوية اللازمة لاستمرار نماذج المرض المختلفة. في هذا النموذج البروتيوميات، يتم تحسين فيروس نقص المناعة البشرية-1 Rev IP للتفاعل B23 لتوضيح العوامل النووية المشاركة في نشاط اغلاق النيوكليوسيتوبلازمية وفيروس نقص المناعة البشرية-1 mRNA ملزمة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تطوير خطوط الخلايا التي تعبر بشكل ملحوظ عن نماذج الأمراض المعدية التي تعاني من نقص في البروتينات الرئيسية ذات الأهمية، على غرار خط الخلايا HLfB، لدراسة مسارات الاهتمام المعدية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. خلية ثقافة

  1. الحفاظ على HLfB في دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، 2 MM L-الجلوتامين، و 1 مليون بينوفات الصوديوم داخل الأنسجة المعالجة ثقافة لوحات 100 ملم. الحفاظ على الثقافات الخلية في 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة الموردة مع 5٪ CO2. مرور الخلايا المتجانسة إلى كثافة الخلية من 1 × 106 خلايا / مل.
  2. تجاهل وسائط ثقافة الخلية. شطف بلطف الخلايا مع 10 مل من 1X الفوسفات المخزنة المالحة (PBS). إزالة وتجاهل PBS 1X دون تعطيل طبقة الخلية.
  3. إضافة 2 مل من 1X trypsin-EDTA الحل إلى الخلايا. قم بصخرة الطبق لمعطف الطبقة الأحادية والحضانة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية داخل غرفة رطبة لمدة 5 دقائق.
  4. اضغط بقوة على جانب الطبق مع كف اليد لفصل الخلايا. إعادة تعليق الخلايا المنفصلة في 8 مل من وسائل الإعلام الثقافية الطازجة. تدور الخلايا في 400 × ز لمدة 5 دقائق.
  5. تجاهل وسائل الإعلام الثقافة دون تعطيل بيليه الخلية. إعادة تعليق بيليه الخلية في 10 مل من وسائل الإعلام ثقافة جديدة. الثقافة الفرعية 1 مل من الخلايا المركزة مع 9 مل من وسائل الإعلام ثقافة جديدة داخل الأنسجة الثقافة المعالجة لوحات 100 ملم.
    ملاحظة: لكل طفرة Rev-NoLS، سوف 3X 100 مم HLfB أو لوحات ثقافة HeLa تسفر عن ما يكفي من البروتين lysate لتحليل وصمة عار الغربية والقياس الطيفي الكتلة. أضف لوحات إضافية للتحكم الإيجابي والتحكم السلبي في WT Rev. تتطلب وحدة تخزين الخلايا الفرعية التحسين باستخدام أنواع خلايا مختلفة.

2 - التعبير عن طفرات العلم Rev-NoLS-3 أثناء النسخ المتماثل لفيروس نقص المناعة البشرية-1

  1. قم بزراعة ثقافة الخلية HLfB إلى كثافة خلية من 2 × 106 خلايا/مل. إعداد 4 مل من الكالسيوم الفوسفات الحمض النووي تعليق لكل لوحة 100 ملم على النحو التالي.
    1. تسمية اثنين من أنابيب 15 مل كما 1 و 2. إضافة 2 مل من HBS 2X (0.05 M HEPES, 0.28 M NaCl, و 1.5 m Na2HPO4 [pH 7.12]) إلى أنبوب 1. إضافة TE 79/10 (1 m Tris-HCl و 0.1 m EDTA [درجة الحموضة 7.9]) إلى أنبوب 2. حجم TE 79/10 هو 1.760 مل - حجم الحمض النووي.
    2. إضافة 20 ميكروغرام من بلازميد يحتوي على طفرة Rev-NoLs-3'flag ذات الاهتمام بالأنبوب 2 وخلط محتوياته من خلال إعادة التعليق. إضافة 240 درجة مئوية من 2 M CaCl2 إلى أنبوب 2 ومزيج مرة أخرى من خلال إعادة تعليق.
    3. نقل خليط من أنبوب 2 إلى أنبوب 1 قطرة، خلط بلطف. السماح للتعليق للجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  2. أضف 1 مل من التعليق إلى كل ثقافة من 3 خلايا، لوحات 100 مم أثناء تدوير الوسائط بلطف. ارجع الأطباق إلى الحاضنة واترك خليط التغوط لمدة 6 ح. استبدل خليط التغوط بـ 10 مل من وسائل الإعلام الثقافية الطازجة واحتضن الخلايا لمدة 42 ساعة.

3. جمع البروتين الفيروسي lysate

  1. تجاهل وسائط الخلية 48 ساعة posttransfection. ضع كل طبق 100 مم على سرير من الثلج. تسمية أنابيب 15 مل لكل عينة طفرة Rev-NoLS ووضع الأنابيب على الجليد.
  2. شطف بلطف الخلايا مع 10 مل من PREchilled 1X PBS دون تعطيل طبقة الخلية. تجاهل PBS 1x. إضافة 3 مل من الليسيس العازلة (50 مل تريس-حمض الهيدروكلوريك [درجة الحموضة 8.0]، 137 مل حمض الهيدروكلوريك، و 1٪ X-100 المنظفات [انظر جدولالمواد]، تعامل مع كوكتيل مثبطات البروتياز، إلى كل من لوحات 100 ملم.
  3. استخدم مكشطة خلايا لتعطيل طبقة الخلية. إمالة لوحة وكشط بلطف وجمع الخلايا في بركة. جمع lysate الخلية باستخدام ميكرومازيت 1000 درجة مئوية وخلط lysates الخلية من كل من لوحات 100 ملم الثلاثة في أنبوب 15 مل المسمى مسبقا.
  4. احتضان الخلية lysate على الجليد لمدة 15 دقيقة، دوامة كل 5 دقائق.
  5. جمع supernatant البروتين دون تعطيل بيليه الحطام الخلية ونقلها إلى أنبوب آخر معقمة 15 مل. الحصول على تركيز البروتين الفيروسي باستخدام طريقة برادفورد (انظر القسم 4).
  6. حفظ aliquot من عينة الإدخال (20 ميكروغرام) لتحليل مناعي الغربية. إضافة 2X عينة العازلة (20٪ الجلسرين، 0.02٪ بروموفينول الأزرق، 125 mM تريس-كل [درجة الحموضة 6.8]، 5٪ SDS، و 10٪ 2-mercaptoethanol) إلى المجلد النهائي. تغلي في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وتخزين عينة الإدخال في -20 درجة مئوية.

4. برادفورد ساي

ملاحظة: إعداد 10X الزلال المصل البقري (BSA) من 100x BSA الأسهم قبل توليد منحنيات البروتين القياسية.

  1. Aliquot المياه في أنابيب الطرد المركزي الجزئي للفراغ والمعايير التالية: فارغة = 800 درجة مئوية؛ المعيار 1 = 2 ملغم/مل، 798 درجة مئوية؛ المعيار 2 = 4 ملغم/مل، 796 درجة مئوية؛ المعيار 3 = 6 ملغم/مل، 794 درجة مئوية؛ المعيار 4 = 8 ملغم/مل، 792 درجة مئوية؛ المعيار 5 = 10 ملغم/مل، 790 درجة مئوية من الـ Aliquot 10x BSA في المعايير المعينة التالية: المعيار 1 = 2 ميكرولتر؛ المعيار 2 = 4 ميكرولتر؛ المعيار 3 = 6 ميكرولتر؛ المعيار 4 = 8 ميكرولتر؛ معيار 5 = 10 درجة مئوية.
  2. إعداد خليط من عينات البروتين عن طريق خلط 795 ميكرولتر من الماء مع 5 ميكرولتر من عينات البروتين. إضافة 200 ميكرولتر من البروتين فحص صبغ الكاشف (انظر جدولالمواد) إلى كل عينة فارغة، والقياسية، والبروتين. دوامة العينات لفترة وجيزة لخليط حتى وحضانة في درجة حرارة الغرفة (18-20 درجة مئوية) لمدة 5 دقائق.
  3. نقل فارغة، والمعايير، وعينات البروتين إلى cuvettes. قياس تركيزات البروتين في OD من 595 نانومتر.

5. Coimmunoprecipitation من Rev-NoLS-3'العلم

  1. شطف 25 ميكرولتر من الخرز هلام تقارب M2 (انظر جدولالمواد) مع 500 درجة مئوية من العازلة lysis، تعامل مع كوكتيل مثبطات البروتياز. شطف المزيد من حبات هلام تقارب لكل عينة طفرة والضوابط.
    ملاحظة: إعداد ما يكفي من الخرز هلام تقارب M2 لاثنين من المواد الهلامية (50 درجة مئوية) - واحد لتحليل المناعية الغربية والآخر لتلطيخ البروتين والقياس الطيفي الشامل.
  2. تدور في 820 × ز لمدة 2 دقيقة في 4 درجة مئوية. إزالة supernatant. شطف 2X أكثر.
  3. إضافة lysate البروتين الفيروسي (1 ملغ / مل في 5 مل من الحجم الإجمالي) إلى حبات تقارب M2 شطفها مسبقا. ضبط إجمالي حجم الصوت باستخدام المخزن المؤقت للتخدير.
  4. احتضان رد الفعل لمدة 3 ساعة، وتناوب في 4 درجة مئوية. الطرد المركزي الخرز M2 تقارب / البروتين الفيروسي lysate في 820 × ز لمدة 1 دقيقة.
  5. جمع supernatant وحفظ aliquot من عينة ما بعد IP (20 ميكروغرام) لتحليل المناعية الغربية. قياس تركيز البروتين من lysate ما بعد IP. جمع 20 ميكروغرام للمناعة الغربية.
  6. إضافة المخزن المؤقت نموذج 2 x إلى وحدة التخزين النهائية. تغلي في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وتخزين عينة ما بعد IP في -20 درجة مئوية.
  7. شطف الخرز M2 مع 750 درجة مئوية من العازلة lysis وغسل الخرز على الدوار في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  8. كرر الخطوات 5.7 لمرتين أكثر من ذلك الإذاجة على الدوار في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بعد الغسيل الثالث، قم بإزالة أي آثار للمخزن الاحتياطي للتخدير من مركب الخرز/IP المشترك M2 باستخدام طرف تحميل جل طويل.
    ملاحظة: قرصة نهاية طرف تحميل هلام مع ملاقط مسطحة قبل إزالة أي ة كميات ضئيلة من المخزن المؤقت lysis. وهذا سوف يمنع تعطيل وتحمل الخرز M2.
  9. إعادة تعليق الخرز M2 في 55 درجة مئوية من المخزن المؤقت التحميل 2X. تغلي العينة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  10. قم بتحميل 25 ميكرولتر من الإلوات على جلين منفصلين من SDS-PAGE (جل واحد للمناعة الغربية والآخر لتلطيخ الكوماسي).

6. إعداد المواد الهلامية SDS-PAGE

  1. يلقي اثنين من 15٪ SDS-أكريلاميد حل المواد الهلامية عن طريق خلط الكواشف التالية في أنبوب 50 مل (في حجم نهائي من 40 مل، ما يكفي لأربعة هلام): 4.16 مل من المياه النقية جدا، 15 مل من 40٪ أكريلاميد: بيساكريلاميد (29:1)، 10 مل من 1.5 M تريس-هكل (درجة الحموضة 8.8) ، 400 ميكرولتر من 10٪ SDS، 400 ميكرولتر من 10٪ كبريتات الأمونيوم، و 40 ميكرولتر من TEMED.
  2. خلط هلام حل عن طريق عكس أنبوب 50 مل عدة مرات. ماصة خليط هلام حل في جهاز هلام الغربية precleaned (أربعة هلام - ثلاثة لالمناعية الغربية وواحدة لبقعي / الفضة تلطيخ).
  3. ماصة بلطف ما يكفي من الماء لتغطية الطبقة العليا من خليط هلام. السماح للهلام حل لبلمرة.
  4. صب طبقة الماء من هلام حل، وذلك باستخدام ممسحة مهمة حساسة (انظر جدولالمواد) لاستيعاب أي المياه الزائدة.
  5. يلقي اثنين 5٪ SDS-أكريلاميد التراص هلام عن طريق خلط الكواشف التالية في أنبوب 50 مل (في حجم نهائي من 20 مل، ما يكفي لأربعة هلام): 11.88 مل من المياه فائقة النقي، 2.5 مل من 40٪ أكريلاميد: بيساكريلاميد (29:1)، 5.2 مل من 1.5 M تريس-حمض الهيدروكلوريك (PH 8.8) ، 200 ميكرولتر من 10٪ SDS، 200 ميكرولتر من 10٪ كبريتات الأمونيوم، و 20 ميكرولتر من TEMED.
  6. خلط هلام التراص عن طريق عكس أنبوب 50 مل عدة مرات. ماصة خليط هلام التراص فوق هلام حل إلى الجزء العلوي من الجهاز.
  7. وضع مشط كاسيت هلام تحتوي على العدد المناسب من الممرات في هلام التراص. استيعاب أي تجاوز من خليط هلام باستخدام ممسحة مهمة حساسة (انظر جدولالمواد). السماح هلام التراص لبوليمر تماما.
  8. فيضان جهاز هلام الغربية مع 1X الغربية تشغيل العازلة (تركيز 5X: 250 mM تريس-كل [درجة الحموضة 8.3] ، 1.92 M غليسين ، 0.5 ٪ SDS ، و 10 MM EDTA).
  9. سحب بلطف مشط كاسيت هلام من هلام التراص. السماح للمخزن المؤقت تشغيل الغربية 1X لملء آبار التحميل. مسح كل بئر مع 1X الغربية تشغيل العازلة باستخدام حقنة قبل تحميل العينات.
  10. تحميل عينات مناعي الغربية في كل هلام المقابلة (عينات الإدخال، عينات coimmunoed، وعينات ما بعد IP). تحميل علامات البروتين هلام الغربية.
  11. تحميل عينات coimmunoprecipitated لبقع Coomassie / الفضة في هلام آخر. تحميل علامات البروتين هلام الغربية.
  12. قم بتوصيل جهاز الجل الجاري بمصدر طاقة وقم بتشغيل المواد الهلامية على 100 فولت حتى تصل صبغة التحميل إلى الجل الصافر. زيادة الجهد إلى 140 V حتى صبغالتحميل تصل إلى الجزء السفلي من هلام حل.

7. نقل وصمة عار الغربية

  1. تفكيك جهاز هلام الغربية. شريحة وتجاهل هلام التراص، وترك هلام حل سليمة.
  2. نقل بلطف المواد الهلامية حل إلى صينية نظيفة مليئة العازلة نقل الغربية (25 Mتريس، 194 مل غليسين، 0.005٪ SDS، 20٪ الميثانول) ونقع لهم لمدة 15 دقيقة.
  3. تجميع جهاز نقل هلام على النحو التالي.
    1. قطع ثلاثة أغشية نقل PVDF وست قطع من ورق ة التصفية (انظر جدولالمواد) إلى حجم هلام حل.
    2. نقع غشاء PVDF في الميثانول لمدة 5 دقائق.
    3. ضع يُوضع كاسيت حامل الجل في صينية خبز زجاجية مملوءة جزئيًا بحاجز النقل الغربي، مع الجانب الأسود في الأسفل.
    4. ضع وسادة رغوة غارقة مع العازلة نقل الغربية ضد الجانب الأسود من كاسيت حامل هلام.
    5. الرطب قطعة من ورقة فلتر في العازلة نقل الغربية ووضعها على رأس وسادة رغوة. ضع جل الحل أعلى ورقة الفلتر.
      ملاحظة: ضع هلام الحل في اتجاه التحميل الصحيح ليتم نقلها إلى غشاء PVDF.
    6. وضع غشاء نقل PVDF واحد على رأس هلام حل. بلل قطعة من ورق الفلتر مع المخزن المؤقت لنقل الغربية ووضعها على رأس غشاء نقل PVDF.
    7. ضع وسادة رغوة أخرى غارقة مع العازلة نقل الغربية على رأس ورقة فلتر. أضعاف بعناية الجانب الأبيض من كاسيت حامل هلام على رأس وسادة رغوة غارقة. قفل الكاسيت بإحكام.
    8. ضع جهاز الكاسيت الهلامي في تجميع أقطاب جهاز النقل. كرر الخطوات 7.3.4 إلى 7.3.8 لكل هلام حل المتبقية.
    9. ملء خزان جهاز نقل مع العازلة نقل الغربية. وضع قضيب التحريك في خزان الجهاز.
    10. ضع خزان الجهاز فوق طبق التحريك. ضبط إعداد ضجة إلى 5-6، والتأكد من أن شريط تحريك ليست عالقة أو ضرب أشرطة حامل هلام.
    11. قم بتوصيل جهاز نقل الجل بمصدر طاقة ونقل الجل عند 100 فولت لمدة 1 ساعة عند درجة حرارة 4 درجة مئوية.

8. مناعة

  1. إزالة كاسيت حامل هلام ووضع الجانب الأسود إلى أسفل ضد صينية الخبز الزجاج نظيفة. افتح الدرج وتجاهل بعناية وسادة رغوة وورقة التصفية. وضع علامة على زاوية من غشاء PVDF لتحديد اتجاه التحميل الصحيح. الحفاظ على الغشاء الرطب.
    ملاحظة: يمكن أن يكون غشاء PVDF الهواء المجففة وتخزينها في حاوية نظيفة ومختومة. إعادة ترطيب الغشاء عن طريق تكرار الخطوات 7.3.2.
  2. ضع الغشاء في 100 مل من محلول الحجب (5٪ الحليب، 1X TBS، و 0.1٪ توين 20). سد الغشاء عن طريق هزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة (18-20 درجة مئوية) لمدة 1 ساعة.
  3. قطع عبر الغشاء فوق علامة البروتين 25 كيلودا. ضع الجزء العلوي من الغشاء، الذي يحتوي على نطاقات بروتين أكبر من 25 كيلوداً، في محلول حظر يحتوي على B23 ماوس أحادي النسيلة IgG1 (تخفيف 1:500). كتلة بين عشية وضحاها، هزاز في 4 درجة مئوية.
  4. ضع الجزء السفلي من الغشاء، الذي يحتوي على نطاقات البروتين أصغر من 25 كيلودا، في حل حظر يحتوي على M2 الماوس أحادي النسيلة IgG1 (1:1000 تخفيف، انظر جدول المواد). كتلة بين عشية وضحاها، هزاز في 4 درجة مئوية.
  5. غسل الغشاء 3X لمدة 10 دقائق في 25 مل من محلول الغسيل الغربي (1X TBS، 0.1٪ توين 20) على منصة هزاز.
  6. احتضان الأغشية في الماعز المضادة للماوس IgG1-HRP (1:5000 تخفيف) المخففة في حل حجب لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. غسل الغشاء 3X لمدة 10 دقيقة في 25 مل من محلول الغسيل الغربي على منصة هزاز.
  7. إعداد chemiluminescence الركيزة النشاف الغربية. استخدام p1000 micropipette لإضافة الركيزة إلى الغشاء.
  8. تطوير كل غشاء في chemiluminescence الركيزة النشاف الغربية لمدة 5 دقائق. استيعاب الركيزة الزائدة باستخدام ممسحة مهمة حساسة (انظر جدولالمواد).
  9. وضع الغشاء في حامي ورقة نظيفة مسجلة داخل كاسيت. خذ الكاسيت إلى غرفة مظلمة ووضع ورقة واحدة من الفيلم في الكاسيت. قفل الكاسيت في مكان وحضانة لمدة 5-15 دقيقة.

9. البقع كوماسي

  1. تفكيك جهاز هلام الغربية. شريحة وتجاهل هلام التراص، وترك هلام حل سليمة. نقل بلطف هلام حل إلى صينية نظيفة مليئة 25 مل من الماء النقي جدا.
  2. قم بحضانة الجل على منصة هزازة لمدة 15 دقيقة. تخلص من الماء النقي جدًا وكرر خطوة الغسيل 2x أكثر.
    ملاحظة: إذا بقيت فقاعات SDS بعد خطوات الغسيل، يمكن غسل الجل في الماء النقي للغاية بين عشية وضحاها. SDS المتبقية يمكن أن يسبب تلطيخ خلفية عالية من هلام.
  3. خلط الكاشف وصمة عار Coomassie عن طريق عكس الزجاجة (انظر جدولالمواد). ضع 100 مل من كاشف بقع كوماسي لتغطية الجل الحل واحتضان الجل على منصة هزازة لمدة ساعة واحدة.
  4. تخلص من الماء منزوع الأيونات. كرر خطوة الغسيل 2x أكثر. الاستمرار في غسل الجل حتى يتم ملاحظة القرار المطلوب من العصابات البروتين.

10. الفضة تلطيخ

  1. تفكيك جهاز هلام الغربية. شريحة وتجاهل هلام التراص، وترك هلام حل سليمة. نقل بلطف هلام حل إلى صينية نظيفة مليئة 25 مل من الماء النقي جدا.
  2. قم بحضانة الجل على منصة هزازة لمدة 15 دقيقة. تخلص من الماء النقي جدًا وكرر خطوة الغسيل 2x أكثر.
    ملاحظة: إذا بقيت فقاعات SDS بعد خطوات الغسيل، يمكن غسل الجل في الماء النقي للغاية بين عشية وضحاها. SDS المتبقية يمكن أن يسبب تلطيخ خلفية عالية من هلام.
  3. إصلاح هلام في 30٪ الإيثانول: 10٪ محلول حمض الخليك (6:3:1 المياه: الإيثانول: حمض الخليك) بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. اغسل الجل في محلول إيثانول 10% لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. استبدال محلول الإيثانول وغسل لمدة 5 دقائق أخرى.
  4. إعداد حل العمل الحساس من مجموعة البقع الفضية بيرس عن طريق خلط جزء واحد من الفضة وصمة عار مع 500 أجزاء المياه فائقة النقي (50 درجة مئوية من الحساسية مع 25 مل من المياه فائقة النقي). قم بحضانة الجل المحلول في محلول العمل الحساس لمدة دقيقة واحدة.
  5. إعداد حل العمل وصمة عار عن طريق خلط جزء واحد الفضة وصمة عار محسن مع 50 أجزاء وصمة عار الفضة (500 درجة مئوية من محسن مع 25 مل من وصمة عار الفضة). احتضان هلام في حل العمل وصمة عار لمدة 30 دقيقة.
  6. إعداد المطور حل العمل عن طريق خلط 1 جزء الفضة وصمة عار محسن مع 50 أجزاء الفضة وصمة عار المطور (500 درجة مئوية من محسن مع 25 مل من المطور). إعداد 5٪ محلول حمض الخليك كحل وقف. اغسل الجل بالماء النقي لمدة دقيقة واحدة، واستبدل الماء، واغسل الجل لمدة دقيقة إضافية.
  7. استبدل الماء بمحلول عمل مطور واحتضن حتى يتم حل كثافة النطاق البروتيني المطلوب (5 دقائق). استبدال حل عمل المطور مع وقف الحل وحضانة لمدة 10 دقيقة.

11. في هلام الحد، الألكيلية، والهضم من العصابات هلام الملون Coomassie

  1. قطع عصابات هلام من هلام باستخدام شفرة الحلاقة نظيفة. قطع كل شريط هلام إلى مكعبات 5 ملم تقريبا ووضعها في أنبوب الطرد المركزي دقيقة 0.5 مل نظيفة.
  2. Destain قطع هلام من خلال تغطيتها مع بيكربونات الأمونيوم 100 M في 1:1 acetonitrile: الماء في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. كرر هذه الخطوة.
  3. تجفيف قطع هلام لمدة 5 دقائق في جهاز طرد مركزي فراغ. تقليل البروتينات عن طريق تغطية قطع هلام المجففة مع 10 mm dithiothreitol في 100 MM بيكربونات الأمونيوم واحتضانها لمدة 1 ساعة في 56 درجة مئوية.
  4. ماصة قبالة أي supernatant. الألكيلية البروتينات من خلال تغطية قطع هلام مع 100 mm يودواسيتاميد في الماء واحتضانها لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  5. ماصة قبالة supernatant وتقليص قطع هلام من خلال تغطيتها مع acetonitrile ويهز لهم بلطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. بلطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  6. كرر الخطوة 11.5. تجفيف قطع هلام لمدة 5 دقائق في جهاز طرد مركزي فراغ.
  7. تغطية قطع هلام مع 50 نانوغرام / ميكرولتر تسلسل الصف المعدلة تريبسين (انظر جدولالمواد) في 100 mM بيكربونات الأمونيوم. السماح للهلام تنتفخ لمدة 5 دقائق. ثم، ماصة قبالة أي حل المتبقية. تغطية قطع هلام مع 100 M بيكربونات الأمونيوم والسماح لهم ريسويل تماما، مضيفا إضافية 100 M بيكربونات الأمونيوم حتى يتم تغطية قطع هلام تماما.
  8. احتضان قطع هلام بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. وقف رد الفعل عن طريق إضافة 1/10 من حجم حمض الفورميك 10٪ في الماء. جمع supernatant من كل أنبوب.
  9. استخراج قطع هلام عن طريق تغطيتها مع 1٪ حمض الفورميك في 60٪ acetonitrile وحضانة لهم لمدة 15 دقيقة مع هز لطيف.
  10. تقليل حجم supernatants مجتمعة إلى أقل من 20 درجة مئوية في جهاز طرد مركزي فراغ، مع الحرص على تجنب تجفيف supernatants تماما. إضافة 1٪ حمض الفورميك لجعل الحجم الإجمالي مرة أخرى إلى 20 درجة مئوية.

12- التصوير اللوني السائل/قياس الطيف الكتلي

ملاحظة: تم تحليل العينات باستخدام مطياف كتلة مجهزة بـ HPLC فائقة، ومصدر نانوبخاخ، وعمود (انظر جدولالمواد). المذيبات A و B هي 0.1٪ حمض الفورميك في الماء وacetonitrile، على التوالي.

  1. تحميل البروتينات المهضومة في قارورة البولي بروبلين autosampler عالية الانتعاش. تحميل قارورة في مدير عينة من نظام UPLC.
  2. حقن 6 ميكرولتر من كل عينة. تحميل كل عينة على عمود المحاصرين من nanotile لمدة 1.5 دقيقة في 8 درجة مئوية / دقيقة، وذلك باستخدام 99٪ المذيبات A /1٪ المذيبات B.
  3. Elute الببتيدات في مطياف الكتلة مع التدرج الخطي من 3٪ إلى 35٪ من المذيبات B أكثر من 30 دقيقة، تليها التدرج من 35٪ إلى 50٪ من المذيبات B أكثر من 4 دقائق و 50٪ إلى 90٪ من المذيب B أكثر من 1 دقيقة. ثم خفض ٪ B مرة أخرى إلى 3٪ أكثر من 5 دقيقة.
  4. الحصول على بيانات المواصفات المواصفات الخصائص ية الأيون ية إيجابية في وضع الدقة (20,000 دقة). الحصول على البيانات من 100 إلى 2000 دا بمعدل مسح واحد كل 0.6 ثانية. الحصول على البيانات في وضع MSE عن طريق عمليات المسح بالتناوب مع عدم وجود طاقة الاصطدام والمسح الضوئي مع ارتفاع طاقة الاصطدام.
  5. بالنسبة لطاقة الاصطدام المرتفعة، قم بمنحدر طاقة الاصطدام في خلية الفخ من 15 فولت إلى 40 فولت. الحصول على ملف بيانات باستخدام حقن فارغة من المذيبات A، وذلك باستخدام نفس طريقة اكتساب بين كل زوج من العينات للسيطرة على ترحيل.

13- تحليل البيانات من أجل قياس الطيف الكتلي

  1. نسخ ملفات نتائج قياس الطيف الكتلي إلى الكمبيوتر الذي يقوم بتشغيل منصة أبحاث البروتيوميات الكمية والنوعية (على سبيل المثال، خادم ProteinLynx العالمي). تحليل البيانات كثيف ة وحدة المعالجة المركزية وينبغي أن يتم على كمبيوتر تحليل بيانات منفصل وعالي الأداء.
  2. إنشاء مشروع جديد للبيانات. إنشاء لوحة ميكروتيدر جديدة تمثل لوحة autosampler. تعيين العينات إلى نفس الموضع في لوحة ميكروتيدر كما موضعها في autosampler.
  3. تعيين كل معلمات معالجة نموذج. المعلمات لاستخدام هي عرض الذروة الكروماتوغرافية التلقائي والقرار MSTOF؛ عتبة منخفضة الطاقة، 100 التهم؛ عتبة الطاقة المرتفعة، 5 التهم؛ عتبة الكثافة، 500 التهم.
  4. تعيين كل معلمات سير عمل نموذج. المعلمات التي يمكن استخدامها هي قاعدة البيانات، SwissProt البشرية المتسلسلة وفيروس نقص المناعة البشرية، مع تسلسل عكس؛ الببتيد التلقائي والتسامح جزء. دقيقة أجزاء أيون مباريات لكل ببتيد، 3؛ دقيقة أجزاء أيون مباريات لكل بروتين، 7؛ الحد الأدنى من الببتيد مباريات لكل بروتين، 1؛ كاشف هضمي أساسي، التربسين. غاب انشقاقات، 1؛ الكواشف المعدل الثابتة، كارباميدوميثيل C؛ متغير معدّل الكواشف، الأكسدة M؛ معدل اكتشاف كاذبة، 100.
  5. حدد العينات واختر معالجة أحدث البيانات الخام. عند اكتمال البحث، حدد العينات واختر تصدير البيانات إلى سقالة (الإصدار 3). فتح سقالة،إنشاء ملف جديد، واستيراد كل ملف تصديرها من منصة بروتيومياتك كعينة حيوية جديدة باستخدام الكم أيون السلائف.
  6. عند استيراد كافة الملفات، انتقل إلى شاشة تحميل وتحليل البيانات. حدد نفس قاعدة البيانات المستخدمة للبحث واستيراد البيانات باستخدام سجل LFDR وتجميع البروتين القياسي على نطاق التجربة. تعيين خيارات العرض إلى احتمال تحديد البروتين، وعتبة البروتين إلى 20٪، والحد الأدنى لعدد الببتيدات إلى 1، وعتبة الببتيد إلى 0٪ خلال التحليل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم فحص الطفرات الأرجينين أحادية ومتعددة النقاط، المقابلة لمجموعة متنوعة من أنماط التعريب دون الخلوية، في قدرتها على التفاعل مع عوامل المضيف الخلوية بالمقارنة مع WT Rev. WT Rev-3'flag وpcDNA-flag تم التعبير عن متجه في ثقافة HLfB. تمت معالجة مجمعات البروتين من كامل الليسات الخلية وملطخة بكاشف وصمة عار الفضة. يمكن الكشف عن علم Rev-NoLS-3 (حوالي 18 كيلوداً) في ثلاثة ظروف عازلة مختلفة للإستليس تحتوي على تركيزات مختلفة من حمض الكلس (137 مليمتر و200 مليمتر و300 مليمتر) في الشكل1. B23 كان قابلاً للكشف (37 كيلوداً) في مخزن الليسات الاحتياطي الذي يحتوي على تركيز ملح أقل (137 مليمتر، والممرات 2-4)، وبالكاد يمكن اكتشافه في مخزن الليسات الاحتياطي الذي يحتوي على 200 مل من حمض الكلس، وغير قابل للكشف في المخزن المؤقت للإستليس الذي يحتوي على تركيز ملح عالي (300 مل من حمض اللاكفي). في الشكل2، تم التعبير عن WT Rev-3'flag، Rev-NoLS M1-3'flag، وpcDNA-flagvector في ثقافة HLfB. تمت معالجة مجمعات البروتين من إجمالي الليسات الخلية المعدة من اثنين من الظروف العازلة lysis (137 mM و 200 mM NaCl). تم استخدام M2 الماوس أحادي ة النسيلة IgG1 في الكشف عن التعبير Rev-3'flag من lysates الخلية. كان الكشف B23 الأمثل في المخزن المؤقت lysis التي تحتوي على 137 مل NaCl مع WT Rev-3'flag (الإدخال وα-العلم-Rev IP) ولكن فقدت التقارب مع Rev-NoLS M1-3'العلامة. B23 تقارب مع WT Rev-3'flag انخفض مع تركيز الملح أعلى في العازلة lysis تحتوي على 200 مل NaCl. pcDNA السيطرة السلبية لم تسفر عن الكشف المناعي غير محدد في المدخلات وα-العلم-Rev IP من جميع الظروف العازلة lysis.

تم تحسين شروط Elution للملكية الفكرية Rev-NoLS-3'flag في الشكل 3. تم التعبير عن WT Rev-3'العلم وpcDNA-العلم ناقلات في ثقافة HLfB. تمت معالجة مجمعات البروتين من مجموع lysates الخلية وeluted باستخدام ثلاثة شروط مختلفة للقضاء على خلفية سلسلة خفيفة وثقيلة (25 و 50 كيلودا) - 2X عينة تحميل العازلة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، 2X عينة تحميل العازلة في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، و 3X العلم peptid ه في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. B23 (~ 37 كيلوDa) كان يمكن الكشف عنها في ظل شرطين - 37 درجة مئوية حضانة في 2X عينة تحميل العازلة لمدة 15 دقيقة و 95 درجة مئوية الحضانة في 2X عينة تحميل العازلة لمدة 3 دقائق.

M2 (النووية / النيوكليولار في التوطين، غير وظيفية في إنتاج فيروس نقص المناعة البشرية-1HXB2)، M6 (النيوكليولار في نمط، وظيفية في إنتاج فيروس نقص المناعة البشرية-1HXB2)، وM9 (مشتتة في السيتوبلازم / النواة، غير وظيفية في الإنتاج الفيروسي) كانت عبّر عن في [هلفب] ثقافة. تمت معالجة مجمعات البروتين من إجمالي الليسات الخلية، وeluted من خلال 95 درجة مئوية الحضانة في 2Xعينة تحميل العازلة لمدة 3 دقائق، وحلها في الكاشف وصمة عار الفضة (الشكل 4). WT Rev كان يمكن الكشف عنها بعد رد فعل علم الملكية الفكرية. كما تم الكشف عن Rev-NoLS M2 و M6 و M9 عند 18 كيلوداً. وقد لوحظت نطاقات مطابقة للبروتين B23 عند علامة 37 كيلودا. ولوحظت مجمعات البروتين كذلك في كل حارة المقابلة لتفاعلات الملكية الفكرية من WT Rev، M2، M6، M9، وpcDNA التحكم في الخلفية السلبية. تم تحليل lysates البروتين عن طريق الكشف المناعي لα-العلم-Rev و B23. تم التعبير عن وفرة WT Rev ومستويات معتدلة من M6 (α-العلم المدخلات) ويمكن الكشف عنها بعد العلم IP (α-العلم-Rev IP، الشكل5). لم يتم التعبير عن M2 و M9 بشكل كبير من 20 ميكروغرام من مدخلات lysate البروتين ولكن يمكن الكشف عنها في كثافة منخفضة بعد العلم IP من 5 ملغ من lysate البروتين. pcDNA السيطرة السلبية لم تسفر عن الكشف المناعي غير محدد في المدخلات وα-العلم-Rev IP. وقد لوحظ تقارب B23 مع WT Rev بعد رد فعل علم الملكية الفكرية (B23 co-IP). وقد لوحظ تقارب B23 قليلا مع M2 (اثنين من الطفرات نقطة واحدة R48,50G) و M6 (طفرة نقطة واحدة R50G). فقدت تقارب B23 في وجود ثلاث طفرات نقطة واحدة من M9 (R46,48,50G) داخل Rev-NoLS.

تم تجهيز الليسات الإجمالية من الطفرات WT Rev وRev-NoLS-3'flag (4 و 5 و 6 و 8) ملطخة بكاشف الكوماسي، وتم تصورها بالمقارنة مع التخفيفات التسلسلية BSA (اللوحة اليمنى). Rev-NoLS-3'flag قابل للكشف (12.5-25 ميكروغرام) في وجود وعدم وجود طفرات في18 kDa (الشكل 6). تم تصور مجمعات البروتين التي تمت معالجتها من تفاعلات IP لـ WT Rev-3'flag، والطفرات النيوكليولار المترجمة Rev-NoLS-3'flag (M4 وM5 وM6)، والسيطرة السلبيةpcDNA-flag في المواد الهلامية SDS-PAGE الملطخة بكاشف كوماسي (الشكل 7). WT Rev (WT1 و WT2) كان قابلاً للكشف بعد رد فعل علم الملكية الفكرية عند 18 كيلوداً. كانت طفرات Rev-NoLS قابلة للكشف قليلا ً بعد التعبير في رد فعل علم HLfB وIP. pcDNA السيطرة السلبية لم تسفر عن خلفية غير محددة في 18 كيلودا.

تم تحليل الليسات المناعية المعدة من WT Rev-3'flag، M2، M6، M9، والتحكم السلبي pcDNA-flag (الموضح في الشكل4) بواسطة قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب. يتم عرض احتمال تحديد البروتين (بالنسب المئوية) للمقارنة بين تفاعلات البروتين التي تحدث مع كل طفرة Rev-NoLS المترجمة النيوكليولار مقابل WT Rev (الجدول1). تم تحديد البروتينات الخلوية، وبعضها نيوكليولار في نمط التعريب (isoforms ribosomal، عامل بدء الترجمة eukaryotic 48، snoRNA C/D box 58B، وnucleophosmin B23)، كشركاء مباشرين/غير مباشرين ملزمين لـ WT Rev. العوامل فقدت تقارب ملزم لM2 (اثنين من الطفرات نقطة واحدة R48,50G), M6 (طفرة نقطة واحدة R50G), و M9 (ثلاثة طفرة نقطة واحدة R46,48,50G), مماثلة للتحكم السلبي pcDNA. تمت معالجة كل حارة من الجل الملون في الشكل 6 لقياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب (الجدول2). تم تحليل تقارب الببتيد إلى الطفرات Rev-NoLS وعرض باستخدام احتمال تحديد البروتين (في النسب المئوية). تم تحديد مجموعة متنوعة من البروتينات الخلوية، وبعضها نيوكليولار في نمط التعريب (النوى C23، نوكلوفوسمين B23، وبروتين التجميع النووي)، كعوامل ربط البروتين المباشر / غير المباشر من WT Rev. تم تحديدها لربط مع M4، M5، و M6. وقد فقدت عوامل النقل ARHGEF1 (عامل تبادل النيوكليوتيد اتوين رو جوانين 1) وTBC1D24 (TCB1 المجال الأسرة، عضو 24) في التقارب في وجود الطفرات Rev-NoLS. عوامل الربط hnRNPC (البروتين الريبونووي غير متجانسة C) وPNN (بينين، البروتين المرتبط بdesmosome) لوحظ بالإضافة إلى ذلك لربط WT Rev، الذي فقد التفاعل مع الطفرات النووية من نقطة واحدة Rev.

Figure 1
الشكل 1 تحسين شروط الانحالة الخلوية للإبلاغ عن الملكية الفكرية المشتركة للإبلاغ عن نوع الملكية الفكرية المشترك للمراجعة 3'flag أثناء إنتاج فيروس نقص المناعة البشرية-1. WT Rev-NoLS-3'flag والتحكمالسلبي p cDNA-علم شروط IP تم تحسينها في ثلاثة تركيزات مختلفة NaCl (137 mM, 200 mM, and 300 mM) في المخزن المؤقت lysis. كما لوحظ من خلال تلطيخ الفضة، كان 137 مل NaCl تركيز الملح الأمثل لRev المناعيةالتربة وB23 ملزمة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 تحسين ظروف الانحالة للإبلاغ عن الملكية الفكرية المشتركة وB23 أثناء إنتاج فيروس نقص المناعة البشرية-1: WT Rev-NoLS-3'flag, M1-3'flag, andnegative control p cDNA-flag IP Conditions تم تحسينها في تركيزين مختلفين لـ NaCl (137 mM و 200 mM) في المخزن المؤقت للlysis. كما لوحظ من خلال الكشف المناعي، كان 137 مل NaCl تركيز الملح الأمثل لRev المناعيةالتربوهذاالن وB23 ملزمة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 الاستفادة المثلى من Rev-3'flag co-IP elution أثناء إنتاج فيروس نقص المناعة البشرية-1، تصور هاف-1 تلطيخ الفضة. تمت معالجة مجمعات البروتين من مجموع الليسات الخلية التي أعدت خلال WT Rev-3'flag و pcDNA-علم IP. تم اختبار ثلاثة شروط مختلفة elution - 2X عينة تحميل العازلة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، 2X عينة تحميل المخزن المؤقت في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، و 3X الببتيد العلم في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. حدثت ظروف الإلتبيلالأمثل لـ WT Rev بعد فترة الحضانة لمدة 15 دقيقة في مخزن تحميل العينة 2x عند 37 درجة مئوية وبعد فترة الحضانة لمدة 3 دقائق في المخزن المؤقت لتحميل العينات 2x عند 95 درجة مئوية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 : الترسيب المناعي للطفرات Rev-3'flag 2 و 6 و 9 أثناء إنتاج فيروس نقص المناعة البشرية-1. يتم عرض مجمعات البروتين التي ترتبط بشكل مباشر/ غير مباشر مع WT Rev، M2 (R48,50G)، M6 (R50G)، M9 (R46،48،50G)، والسيطرة السلبية pcDNA-العلم في وجود النسخ المتماثل فيروس نقص المناعة البشرية-1 في هلام SDS-PAGE ملطخة بالفضة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5 : Rev-3'flag co-IP co-IP of mutations 2, 6, and 9 for B23 immunodetection during HIV-1 production. تم تحليل التحلل البروتيني وردود فعل IP المعدة من WT Rev وM2 وM6 وM9 والتحكم السلبي pcDNA-flag في الشكل 4 عن طريق الكشف المناعي لـ α-flag-Rev وB23. ويلاحظ WT Rev والتعبير متحولة، فضلا عن التفاعل مع البروتين النووي B23. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6 القياس الكمي للطفرات Rev-NoLS 4 و 5 و 6 و 8 بعد رد فعل IP العلم: . تم قياس ردود فعل IP من HLfB التي تعبر عن WT Rev والنيوكليولار المترجمة M4 (R46G)، M5 (R48G)، M6 (R50G)، M8 (ΔRQ)، والسيطرة السلبية pcDNA-العلم لتركيز البروتين باستخدام ثنائي اتلاف BSA. ولوحظ تركيز بروتين تعنى بـ 12.5-25 ميكروغرام لكل عينة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7 : الترسيب المناعي من الطفرات النيوكليولار المترجمة Rev-NoLS 4 و 5 و 6 خلال إنتاج فيروس نقص المناعة البشرية-1. يتم عرض جل SDS-PAGE ملطخ بـ Coomassie يحتوي على مجمعات بروتين مناعية من WT Rev (1 و2) وM4 وM5 وM6. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

البروتينات المحددة الوزن الجزيئي WT Rev M2 M6 M9
إشارة الاعتراف الجسيمات 14kDa (متجانسة ألو RNA البروتين ملزمة) 15 كيلودا 95 في المائة صفر صفر صفر
بروتين ريبوسومال S3A 30 كيلودا 95 في المائة صفر صفر صفر
عامل بدء الترجمة eukaryotic 4B 69 كيلودا 95 في المائة صفر صفر صفر
بروتين ريبوسومال L31 14 كيلودا 91 في المائة صفر صفر صفر
بروتين ريبوسومال L12 18 كيلودا 93 في المائة صفر صفر صفر
بروتين ريبوسومال L22 15 كيلودا 91 في المائة صفر صفر صفر
صغيرة نيوكليولار RNA، C / D مربع 58B 15 كيلودا 87 في المائة صفر صفر صفر
الزنك الاصبع، CCHC المجال الذي يحتوي على 11 185 كيلودا 87 في المائة صفر صفر صفر
أكتين بروتين ليم ملزمة 1 79 كيلودا 79 في المائة صفر صفر صفر
بروتين ريبوسومال S13 17 كيلودا 78 في المائة صفر صفر صفر
نوكليوفوسمين (البروتين الفوسفاتي النووي B23، نوماترين) 33 كيلودا 73 في المائة صفر صفر صفر

الجدول 1: تحديد عوامل المضيف الخلوي ة التي تتفاعل مع WT Rev أثناء إنتاج فيروس نقص المناعة البشرية-1. تم تحليل الأوات البروتين المعدة من WT Rev و M2 و M6 و M9 بشكل مباشر عن طريق قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب. يتم تلخيص تفاعلات البروتين التي ترتبط بشكل مباشر/غير مباشر بـ WT Rev مقابل M2 وM6 وM9 حسب احتمال تحديد البروتين (بالنسب المئوية).

البروتينات المحددة الوزن الجزيئي M4 M5 M6 Wt محمد الني
بولي (A) بروتين ملزم، سيتوبلازميك 1 61 كيلودا 98 في المائة صفر 100 في المائة 100 في المائة صفر
صدمة الحرارة 70kDa البروتين 1B 70 كيلودا 100 في المائة 100 في المائة 100 في المائة 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L7 29 كيلودا 91 في المائة صفر 100 في المائة 100 في المائة صفر
[هيستون] مجموعة 1, [ه1] 22 كيلودا صفر صفر 100 في المائة 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L4 48 كيلودا 95 في المائة صفر 100 في المائة 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L13 24 كيلودا 99 في المائة صفر 100 في المائة 100 في المائة صفر
تكملة مكون 1، س البروتين الفرعي ملزمة 31 كيلودا 100 في المائة 100 في المائة 100 في المائة 100 في المائة صفر
Y مربع البروتين ملزمة 1 36 كيلودا صفر صفر 100 في المائة 100 في المائة صفر
النيوكليوسوم تجميع البروتين 1-مثل 1 45 كيلودا صفر صفر صفر 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L8 28 كيلودا 89 في المائة 36 في المائة 100 في المائة 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L18 22 كيلودا 27 في المائة صفر 100 في المائة 100 في المائة صفر
صدمة الحرارة 70kDa البروتين 8 71 كيلودا 5 في المائة 99 في المائة 100 في المائة 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L19 23 كيلودا 10 في المائة صفر 81 في المائة 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L27 16 كيلودا 92 في المائة صفر 100 في المائة 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L7a 30 كيلودا صفر صفر 100 في المائة 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L24 18 كيلودا صفر صفر 100 في المائة 99 في المائة صفر
توبولين، بيتا الفئة الأولى 50 كيلودا 92 في المائة 69 في المائة 100 في المائة 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L6 33 كيلودا صفر صفر 100 في المائة 100 في المائة صفر
صدمة الحرارة 70kDa البروتين 9 (مورتالين) 74 كيلودا 33 في المائة 99 في المائة 100 في المائة 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال S2 31 كيلودا 87 في المائة صفر 100 في المائة 100 في المائة صفر
كيسين كيناز 2، ألفا 1 ببتيد 45 كيلودا صفر صفر 50 في المائة 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L14 23 كيلودا صفر صفر 81 في المائة 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال، كبير، P0 34 كيلودا صفر صفر 100 في المائة 100 في المائة صفر
مجموعة هيستون 1، H1b 23 كيلودا صفر صفر 73 في المائة 100 في المائة صفر
صدمة الحرارة 70kDa البروتين 5 (البروتين الذي ينظم الجلوكوز) 72 كيلودا 99 في المائة صفر 100 في المائة 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال S4، مرتبط بـ X 30 كيلودا صفر صفر 100 في المائة 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال S20 13 كيلودا 98 في المائة 94 في المائة 99 في المائة 99 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L28 16 كيلودا صفر صفر 100 في المائة 99 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال S14 16 كيلودا صفر صفر 100 في المائة 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال S3A 30 كيلودا صفر صفر 100 في المائة 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L21 19 كيلودا صفر صفر 100 في المائة 100 في المائة صفر
الزنك الاصبع CCCH من نوع، المضادة للفيروسات 1 101 كيلودا صفر صفر 97 في المائة 100 في المائة صفر
مجموعة هيستون 1، H1c 21 كيلودا صفر صفر صفر 98 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L36 12 كيلودا صفر صفر 100 في المائة 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال S18 18 كيلودا 90 في المائة صفر 100 في المائة 100 في المائة صفر
المغير من المبرمج 1 40 كيلودا 42 في المائة 88 في المائة 34 في المائة صفر صفر
بروتين ريبوسومال L17 21 كيلودا صفر صفر 100 في المائة 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال S26 13 كيلودا 91 في المائة صفر 99 في المائة 98 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L32 18 كيلودا صفر صفر 48 في المائة 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L35 15 كيلودا صفر صفر 97 في المائة 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L29 18 كيلودا صفر صفر 57 في المائة 94 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال S9 23 كيلودا صفر صفر 100 في المائة 100 في المائة صفر
غير متجانسة الريبونوكليوبروتين H1 (H) 51 كيلودا 98 في المائة صفر 100 في المائة 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال S8 22 كيلودا صفر صفر 78 في المائة 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L10 25 كيلودا صفر صفر 100 في المائة 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L23a 18 كيلودا صفر صفر 68 في المائة 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال S6 29 كيلودا صفر صفر 100 في المائة 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L31 14 كيلودا صفر صفر 95 في المائة 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال S13 17 كيلودا صفر صفر 100 في المائة 99 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L10a 25 كيلودا 45 في المائة صفر 81 في المائة 100 في المائة صفر
بولي (A) بروتين ملزم، السيتوبلازمية 4 (شكل غير قابل للحقن) 70 كيلودا صفر صفر 100 في المائة 100 في المائة صفر
عبر الغشاء emp24 مجال نقل البروتين الذي يحتوي على 1 25 كيلودا صفر صفر صفر 100 في المائة صفر
EBNA1 البروتين ملزمة 2 35 كيلودا صفر صفر 69 في المائة 100 في المائة صفر
حفظ الحلزون حلقة الحلزون في كل مكان كيناز 85 كيلودا 74 في المائة 92 في المائة 65 في المائة 83 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L12 18 كيلودا صفر صفر 57 في المائة 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال S24 15 كيلودا صفر صفر 100 في المائة 100 في المائة صفر
صدمة الباردة المجال البروتين A 40 كيلودا صفر صفر صفر 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L27a 17 كيلودا صفر صفر 89 في المائة 99 في المائة صفر
غير متجانسة الريبونوكليوبروتين F 46 كيلودا صفر صفر 99 في المائة 99 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L11 20 كيلودا صفر صفر 99 في المائة 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L26-like 1 17 كيلودا صفر صفر 100 في المائة 100 في المائة صفر
الكازين كيناز 2، ألفا رئيس ببتيد 41 كيلودا صفر صفر صفر 100 في المائة صفر
توبولين، ألفا 1أ 50 كيلودا 33 في المائة صفر 100 في المائة صفر صفر
بروتين ريبوسومال L3 46 كيلودا صفر صفر 86 في المائة 94 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال الميتوكوندريا L15 33 كيلودا صفر صفر 100 في المائة 99 في المائة صفر
نوكليولين 77 كيلودا صفر صفر 25 في المائة 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال الميتوكوندريا S21 11 كيلودا صفر صفر 93 في المائة 94 في المائة صفر
KRR1، وحدة فرعية صغيرة (SSU) مكون processome، التجانس (الخميرة) 44 كيلودا 89 في المائة صفر 76 في المائة 99 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال الميتوكوندريا S7 28 كيلودا صفر صفر صفر 100 في المائة صفر
قناة كلوريد، حساسة للنيوكليوتيد، 1A 22 كيلودا صفر صفر 97 في المائة 86 في المائة صفر
محمد الدوسري 158 كيلودا صفر صفر 67 في المائة 49 في المائة صفر
الغوانين النيوكليوتيد ملزمة البروتين مثل 3 (النيوكليولار) 61 كيلودا صفر صفر 99 في المائة 98 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال الميتوكوندريا S23 22 كيلودا صفر صفر 100 في المائة 50 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال الميتوكوندريا S22 41 كيلودا صفر صفر صفر 99 في المائة صفر
نوكليوفوسمين (البروتين الفوسفاتي النووي B23، نوماترين) 33 كيلودا صفر صفر 52 في المائة 97 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال S19 16 كيلودا صفر صفر صفر 99 في المائة صفر
غليسيرالدهايد-3-فوسفات ديهيدروجينيز 36 كيلودا صفر صفر 100 في المائة صفر صفر
[هيستون] مجموعة 1, [ه2بغ] 14 كيلودا صفر صفر 53 في المائة 72 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال S23 16 كيلودا صفر صفر 68 في المائة صفر صفر
عامل تبادل النيوكليوتيدات رو غوانين (مرفق البيئة العالمية) 1 104 kDa صفر صفر صفر 94 في المائة صفر
البروتين المرتبط بالموت 3 46 كيلودا صفر صفر 87 في المائة 87 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال الميتوكوندريا S6 14 كيلودا صفر صفر 52 في المائة 84 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L39 6 كيلودا صفر صفر صفر 87 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال الميتوكوندريا S28 21 كيلودا صفر صفر 85 في المائة 99 في المائة صفر
[هيستون] مجموعة 1, [ه4ه] 11 كيلودا صفر صفر صفر 93 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال الميتوكوندريا L43 23 كيلودا صفر صفر صفر 97 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال S15 17 كيلودا صفر صفر صفر 85 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال S12 15 كيلودا صفر صفر 68 في المائة 39 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L35a 13 كيلودا صفر صفر صفر 96 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال الميتوكوندريا L38 45 كيلودا صفر صفر 42 في المائة 98 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال الميتوكوندريا S14 15 كيلودا صفر صفر 45 في المائة 76 في المائة صفر
فوسفوديستريز 5A، محددة cGMP 95 كيلودا 14 في المائة صفر صفر 72 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L15 24 كيلودا صفر صفر صفر 56 في المائة صفر
الريبونوكليوبروتين النووي غير المتجانس C (C1/C2) 22 كيلودا صفر صفر صفر 100 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال الميتوكوندريا S16 11 كيلودا صفر صفر صفر 92 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال S15a 15 كيلودا صفر صفر صفر 91 في المائة صفر
نيوريكسين 2 185 كيلودا صفر 50 في المائة صفر صفر صفر
التوحد حساسية مرشح 2 139 كيلودا صفر صفر 46 في المائة صفر صفر
بروتين ريبوسومال الميتوكوندريا L17 20 كيلودا صفر صفر صفر 92 في المائة صفر
عامل الربط 3a، الوحدة الفرعية 1، 120kDa 89 كيلودا صفر صفر 56 في المائة 89 في المائة صفر
لا ريبونوكليوبروتين المجال الأسرة، عضو 1 116 kDa صفر صفر 65 في المائة 66 في المائة صفر
الجني مثل 2 62 كيلودا صفر صفر صفر 68 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L18a 21 كيلودا صفر صفر صفر 86 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L23 15 كيلودا صفر صفر 60 في المائة 47 في المائة صفر
عبر الغشاء emp24 مجال نقل البروتين التي تحتوي على 9 27 كيلودا صفر صفر صفر 78 في المائة صفر
إشارة التعرف على الجسيمات 72kDa 75 كيلودا صفر صفر صفر 100 في المائة صفر
اللكتين، ملزمة غالاكتوسايد، قابلة للذوبان، 3 26 كيلودا صفر 71 في المائة 28 في المائة صفر صفر
بروتين ريبوسومال الميتوكوندريا L1 37 كيلودا صفر صفر صفر 69 في المائة صفر
[ه1] [هيستون] أسرة, عضوة [إكس] 22 كيلودا صفر صفر صفر 96 في المائة صفر
الكازين كيناز 2، بيتا ببتيد 25 كيلودا صفر صفر صفر 89 في المائة صفر
solute الناقل الأسرة 4، الصوديوم بيكربونات الناقل، عضو 7 118 kDa 82 في المائة صفر صفر صفر صفر
WD تكرار المجال 13 54 كيلودا صفر 81 في المائة صفر صفر صفر
عامل استطالة النسخ A (SII)، 3 17 كيلودا صفر صفر صفر 38 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال S16 16 كيلودا صفر صفر 75 في المائة صفر صفر
SP140 بروتين الجسم النووي 92 كيلودا صفر صفر صفر 64 في المائة صفر
محمد محمد 227 كيلودا 62 في المائة صفر صفر صفر صفر
غولجي النقل 1B 15 كيلودا صفر صفر صفر 33 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال الميتوكوندريا S34 26 كيلودا صفر صفر صفر 33 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال L30 13 كيلودا صفر صفر صفر 49 في المائة صفر
أكتين بروتين ليم ملزمة 1 96 كيلودا صفر صفر صفر 43 في المائة صفر
جوانين النيوكليوتيدات ملزمة البروتين مثل 2 (النيوكليولار) 84 كيلودا 40 في المائة صفر صفر صفر صفر
بروتين البروتين الدهني عالي الكثافة 141 كيلودا صفر صفر 34 في المائة صفر صفر
أدينوسين دياميناس، الحمض النووي الريبي الخاص، B2 81 كيلودا صفر صفر 28 في المائة صفر صفر
سيساتين إي/م 17 كيلودا صفر 27 في المائة صفر صفر صفر
الزنك إصبع البروتين 786 80 كيلودا صفر صفر 23 في المائة صفر صفر
[بليكسترين] [هولوج-ليك] مجال, أسرة [ب], عضوة 1 145 كيلودا صفر صفر صفر 95 في المائة صفر
بروتين فوسفاتيز ميثيل إسترازس 1 44 كيلودا صفر صفر 94 في المائة صفر صفر
يانوس كيناز وميكروتوبول التفاعل البروتين 2 95 كيلودا صفر صفر صفر 94 في المائة صفر
إشارة التعرف على الجسيمات 68kDa 67 كيلودا صفر صفر صفر 93 في المائة صفر
عائلة نطاق TBC1، عضو 24 63 كيلودا صفر صفر صفر 89 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال الميتوكوندريا L27 16 كيلودا صفر صفر صفر 89 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال الميتوكوندريا L2 24 كيلودا صفر صفر صفر 88 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال الميتوكوندريا S2 33 كيلودا صفر صفر صفر 87 في المائة صفر
بيناتاريكوبتيد تكرار المجال 3 79 كيلودا صفر صفر صفر 84 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال، كبير، P2 12 كيلودا صفر صفر صفر 76 في المائة صفر
IMP (إينوسين 5'-أحادي الفوسفات) dehydrogenase 2 56 كيلودا صفر صفر 76 في المائة صفر صفر
توبولين، بيتا 4B فئة IVb 50 كيلودا صفر صفر 76 في المائة صفر صفر
بروتين ريبوسومال الميتوكوندريا L23 19 كيلودا صفر صفر صفر 74 في المائة صفر
بروتين ريبوسومال الميتوكوندريا S31 45 كيلودا صفر صفر صفر 74 في المائة صفر
جالاكتوز-3-O-سلفوترانسفيراز 1 49 كيلودا 74 في المائة صفر صفر صفر صفر
قمع المتغيرات 4-20 التجانس 1 (دروسوفيلا) 99 كيلودا صفر 72 في المائة صفر صفر صفر
بروتين ريبوسومال الميتوكوندريا S25 20 كيلودا صفر صفر صفر 70 في المائة صفر
مجال ريبوسومال L1 الذي يحتوي على 1 55 كيلودا صفر صفر صفر 70 في المائة صفر
الأسرة مع تسلسل التشابه 110، عضو D 29 كيلودا 69 في المائة صفر صفر صفر صفر
بروتين ريبوسومال L36a-مثل 12 كيلودا صفر صفر صفر 66 في المائة صفر
المخيخ 4 السلائف 22 كيلودا صفر صفر صفر 64 في المائة صفر
N-أسيتيل الجلوكوزامين-1-الفوسفات ترانسفيراز، ألفا وبيتا الوحدات الفرعية 144 كيلودا 64 في المائة صفر صفر صفر صفر
RAD51 homolog B (S. cerevisiae) 38 كيلودا صفر صفر صفر 64 في المائة صفر
النسخ استطالة منظم 1 124 كيلودا 63 في المائة صفر صفر صفر صفر
الصفحة الرئيسية A1 15 كيلودا صفر صفر صفر 62 في المائة صفر
بروتين نقل فوسفوليبيد 49 كيلودا صفر صفر صفر 62 في المائة صفر
رو GTPase تنشيط البروتين 33 137 كيلودا صفر صفر 54 في المائة صفر صفر
بروتين ريبوسومال الميتوكوندريا S18B 29 كيلودا صفر صفر صفر 52 في المائة صفر
إندوبلازميك ريتيكولوم أمينوبيبتيداز 2 106 kDa 51 في المائة صفر صفر صفر صفر
عزر ثلاثي يحتوي على 28 89 كيلودا صفر 50 في المائة صفر صفر صفر
غير ناضجة سرطان القولون نسخة 1 24 كيلودا صفر صفر صفر 50 في المائة صفر
AT المجال التفاعلي الغني 1A (SWI-like) 242 كيلودا صفر صفر 49 في المائة صفر صفر
بروتين ريبوسومال الميتوكوندريا S17 15 كيلودا صفر صفر صفر 48 في المائة صفر
بينين، بروتين مرتبط بـ desmosome 82 كيلودا صفر صفر صفر 48 في المائة صفر
بروتين فوسفاتيز، Mg2 +/Mn2+ تعتمد، 1G 59 كيلودا صفر صفر صفر 45 في المائة صفر
G التصحيح المجال وankyrin يكرر 1 39 كيلودا 45 في المائة صفر صفر صفر صفر
بروتين ريبوسومال الميتوكوندريا L3 39 كيلودا صفر صفر صفر 44 في المائة صفر
الناشئة دون تثبيط من قبل البنزميدازول3 المجانسة (الخميرة) 37 كيلودا صفر 44 في المائة صفر صفر صفر
WD ورباعي التاتريكوتيد يكرر 1 76 كيلودا صفر صفر صفر 44 في المائة صفر
بروتين ثنائي كبريتيد isomerase الأسرة A، عضو 2 58 كيلودا صفر صفر صفر 42 في المائة صفر
كازرين، بروتين بيربلاكين المتفاعل 86 كيلودا صفر 41 في المائة صفر صفر صفر
ملفوف لفائف الحلزون، ملفوف لفائف الحلزون المجال الذي يحتوي على 2 16 كيلودا صفر صفر 40 في المائة صفر صفر
بروتين صدمة الحرارة 90kDa ألفا (السيتوسوليتش)، الفئة A عضو 1 85 كيلودا صفر صفر 40 في المائة صفر صفر
إعادة الشبكية الصباغية GTPase المنظم 83 كيلودا صفر صفر 40 في المائة صفر صفر
CTD (مجال كاربوكسي الطرفية، RNA بوليميراز الثاني، الببتيد A)
فوسفاتيز، الوحدة الفرعية 1
104 kDa صفر 39 في المائة صفر صفر صفر
بروتين ريبوسومال الميتوكوندريا L37 48 كيلودا صفر صفر صفر 39 في المائة صفر
C2CD2 مثل 76 كيلودا صفر 38 في المائة صفر صفر صفر
DnaJ (Hsp40) homolog, subfamily C, member 6 106 kDa صفر صفر 38 في المائة صفر صفر
بروتين ريبوسومال الميتوكوندريا L51 15 كيلودا صفر صفر صفر 38 في المائة صفر
قبل أن يكون 50 كيلودا صفر صفر صفر 38 في المائة صفر
البروتين المرتبط بهنتنغتون 1 76 كيلودا صفر صفر صفر 37 في المائة صفر
الزنك إصبع البروتين 263 77 كيلودا صفر 36 في المائة صفر صفر صفر
دورة تقسيم الخلية ومنظم المبرمج 1 133 كيلودا صفر صفر 34 في المائة صفر صفر
بروتين التيروزين الفوسفاتيز، غير مستقبلات نوع 13
(APO-1/CD95 (فاس) المرتبطة الفوسفاتيز)
256 كيلودا صفر صفر 34 في المائة صفر صفر
KRAB-A المجال الذي يحتوي على 2 56 كيلودا صفر صفر صفر 31 في المائة صفر
تنشيط إشارة cointegrator 1 وحدة فرعية معقدة 2 28 كيلودا صفر صفر صفر 31 في المائة صفر
بروتين سنتروسومال 76kDa 74 كيلودا صفر 30 في المائة صفر صفر صفر
بوليميراز (RNA) الثالث (الحمض النووي الموجه) ببتيد C (62kD) 61 كيلودا صفر صفر صفر 30 في المائة صفر
5-هيدروكسيتريبتامين (السيروتونين) مستقبلات 6 47 كيلودا صفر صفر صفر 29 في المائة صفر
T مستقبلات الخلية ألفا الانضمام 56 2 كيلودا صفر 26 في المائة صفر صفر صفر
ثنائية التوجيه من الكروموسومات في انقسام الخلية 1-مثل 330 كيلودا صفر صفر صفر 25 في المائة صفر
اقتران رأس ومجالات DIL 114 kDa صفر صفر 25 في المائة صفر صفر
WD تكرار المجال 66 130 كيلودا صفر صفر صفر 24 في المائة صفر
كروموسوم 6 إطار القراءة المفتوحة 25 13 كيلودا صفر صفر 22 في المائة صفر صفر
بروتين عبر الغشاء 177 34 كيلودا صفر صفر صفر 21 في المائة صفر
أعرب خلية السلائف العصبية، والتنمية أسفل المنظمة 4 مثل 101 كيلودا صفر 20 في المائة صفر صفر صفر

الجدول 2: تحديد العوامل المضيفة الخلوية المعقدة مع الطفرات Rev 4 و 5 و 6 أثناء إنتاج فيروس نقص المناعة البشرية-1. تم تجهيز هلام SDS-PAGE الملون في الشكل 6 لقياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب. يتم تلخيص نتائج تفاعل البروتين من WT Rev مقابل الطفرات النووية M4 و M5 و M6 من خلال احتمال تحديد البروتين (بالنسب المئوية).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم تقييم التحليلات الطيفية الكتلية التي تقارن بين طفرات Rev-NoLS وWT Rev في وجود فيروس نقص المناعة البشرية-1 لفهم العوامل النووية التي تنطوي عليها دورة النسخ المتماثل الفيروسي. وهذا من شأنه أن يحدد المكونات النووية اللازمة للعدوى الفيروسية. Nucleolar B23 لديه تقارب عالية إلى Rev-NoLS ووظائف في توطين النيوكليولار من Rev3 والنقل nucleocytoplasmic من Rev-bound HIV mRNAs22. تم تقييم تقارب B23 مع الطفرات Rev-NoLS، التي تحتوي على بدائل أرجينين واحدة أو متعددة، من خلال الترسيب المناعي من العلم Rev-3 أثناء الإنتاج الفيروسي (الشكل 2; WT والطفرات M2، M6، و M9). B23 تقارب إلى نقطة واحدة Rev-NoLS الطفرات M4، M5، و M6 تم فحصها سابقا في وجود النسخ المتماثل فيروس نقص المناعة البشرية-1. في الدراسة السابقة، تعرضت eluates IP من M4، M5، وM6 إلى مناعة الغربية مع جسم مضاد محدد لα العلم للمراجعة وB23 تقارب1. في خلفية الطفرات Rev نقطة واحدة، تم تخفيض التقارب ملزم B23 بشكل كبير. B23 حافظت على التقارب مع WT Rev أثناء النسخ المتماثل لفيروس نقص المناعة البشرية. وكان من المتوقع أن تؤدي الطفرات ذات النقطة الواحدة التي تحدث داخل Rev-NoLS إلى تقليل التقارب الملزم مع العوامل المضيفة الخلوية الأخرى التي تيسر ربط فيروس نقص المناعة البشرية ونقل الحمض اتّلاف الحمض النووي الريبي. Rev-NoLS الطفرات أحادية ومتعددة النقاط في هذا النموذج ألغت nucleophosmin B23 تقارب إلى Rev، مما يشير إلى انقطاع في اغلاق النيوكليوسيتوبلازمية ونقل فيروس نقص المناعة البشرية mRNA. ومن المرجح أن العوامل النووية (النوى C23 وبروتين التجميع النووي 1)، وعوامل النقل (ARHGEF1 و TCB1D24)، وعوامل الربط (hnRNPC وPNN) تشارك في الدورة المعدية فيروس نقص المناعة البشرية-1 من خلال التفاعل مع مجمعات البروتين Rev. ويبين الجدولان 1 والجدول 2 عوامل خلوية أخرى مختلفة، سواء النيوكليولار أو nonnucleolar في النمط، والتي يحتمل أن تشارك في دورة النسخ المتماثل لفيروس نقص المناعة البشرية-1 من خلال Rev. عامل النيوكليولار - snoRNA C/D box 58، المتورطين في الشنودنا تجهيز، ونقل سنورنا إلى النوى، و2'-O-ميثيليشن من الحمض النووي الريبي - تم تحديد بعد وظيفة هذا البروتين في دورة النسخ المتماثل فيروس نقص المناعة البشرية-1 لا يزال غير معروف. ويجري حاليا التحقيق في الأدوار المحددة لهذه العوامل الخلوية في الدورة المعدية لفيروس نقص المناعة البشرية -1.

وتبين النتائج المعروضة هنا استخدام هذا النهج لتحديد العوامل النووية الفيروسية/المضيفة التي تحافظ على الدورة المعدية لفيروس نقص المناعة البشرية-1. ويمكن تحديد العوامل النووية الفيروسية/المضيفة التي تشارك في نماذج الأمراض الأخرى باستخدام هذا النهج. ومن المرجح كذلك أن ينطوي عامل لنوكليولار واحد على أدوار متعددة الوظائف في مختلف نماذج الأمراض. على سبيل المثال، تم تورط B23 في نقل البروتينات الفيروسية النووية، والتجمع الفيروسي، encapsidation، والنسخ المتماثل، والكمون في النماذج المعدية الفيروسية الأخرى. يتميز B23 في التفاعلات مع NoLS من العوامل الخلوية للنقل النووي - p120 عامل النمو (الأحماض الأمينية 40-57)23 و C23 قبل rRNA المعالج (الأحماض الأمينية 540-628)24. كما تم توثيق B23 للتفاعل مع الفيروس اللمفاوي T-الخلية البشرية (HTLV-1) بروتين ريكس (الأحماض الأمينية 1-22)25، HIV-1 Tat (الأحماض الأمينية 49-57)2، وفيروس نقص المناعة البشرية-1 Rev (الأحماض الأمينية 37-47)26. يُبرّز جينوم فيروس التهاب الدماغ الياباني (JEV) بروتينًا أساسيًا موضعيًا للنيوكليولار، يتفاعل من خلاله الأحماض الأمينية Gly42 وPro43 مع منطقة N-terminal من B23 أثناء عدوى JEV، مما يؤدي إلى نقل البروتين الأساسي الفيروسي/B23 إلى النواة27. يتكون جينوم الحمض النووي الريبي (HBV) الذي تقطعت به السبل من الحمض النووي المزدوج، والذي يرمز إلى البروتين الأساسي النووي. البروتين الأساسي HBV يرتبط مع النوى وB23 في النوى28; وقد تم عرض B23 في تجميع HBV من خلال التفاعل مع البروتين الأساسي N-المجال الطرفية. على وجه التحديد، B23 الأحماض الأمينية 259-294 ربط إلى المجال N-المحطة الطرفية للبروتين الأساسي HBV للسماح encapsidation الفيروسية29. ال [السلبيكل-سنس], [سنغل-تّلف] [رنا] التهاب كبد [د] حمى ([هدف]) عبّر عن [هفغ] مستضدفيفية في اثنان [إيسفورمس]; المساعدات isoform الصغيرة في النسخ المتماثل RNA، وisoform كبيرة يسهل التجميع الفيروسي. يتم النسخ المتماثل RNA داخل النوى ويتطلب التفاعل B23 مع HDVAg30،31. عدوى HDV يسبب upregulation من B23، الذي يتفاعل في الغالب مع isoform HDVAg الصغيرة وأقل مع isoform HDVAg كبيرة. تحدث التفاعلات من خلال مجال HDVAg NLS الصغير، الذي يربط من خلاله B23 ويحقق التراكم النووي. عند حذف موقع ربط HDV إلى B23، تم تعطيل النسخ المتماثل RNA. وقد تبين HDVAg لcolocalize مع B23 ونوكليولن في النوى. تم اكتشاف النوكلين لامتلاك خصائص النسخ كقمع32، وكشف عن النوى كمقصورة لتنظيم النسخ المتماثل HDV. B23 تشارك أيضا في الكمون من المجين فيروس الهربس المرتبطة بساركوما كابوسي (KSHV). KSHV البروتين الكامن - v-cyclin - مع المضيف CDK6 كيناز، الفوسفورB23 في Thr199، وتسهيل التفاعل B23 مع مستضد نووي المرتبطة الكمون33. يعمل المستضد النووي المرتبط بالكمون على منع النسخ المتماثل للليتيك الفيروسي. استنفاد B23 يؤدي إلى إعادة تنشيط KSHV، وكشف B23 كمنظم من الكمون KSHV. تتميز وظيفة B23 في دورة النسخ المتماثل لفيروس نقص المناعة البشرية-1 في نشاط النقل النووي من تات وRev، وليس من المعروف ما إذا كان B23 يمكن أن تحفز الكمون أثناء الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية. مشاركة B23 في النسخ المتماثل، encapsidation، وتجميع فيروس نقص المناعة البشرية-1 غير معروف حاليا.

وسيتطلب تكييف هذه الطريقة مع نماذج الأمراض الأخرى الكثير من الجهد والوقت لتوليد العمود الفقري المعدية التي تعاني من نقص البروتين والمعبر عنها في خطوط الخلايا المناسبة. وميزة هذا العمود الفقري لفيروس نقص المناعة البشرية-1HXB2 الذي يعاني من نقص Rev هو القدرة على فحص طفرات Rev-NoLS في وجود العمود الفقري الفيروسي الكامل، والعوامل المعدية الفيروسية، والعوامل المضيفة المشاركة في دورة النسخ المتماثل لفيروس نقص المناعة البشرية-1. وقد درست دراسات أخرى وظيفة النيوكليولار القس في غياب النظام المعدي الكامل فيروس نقص المناعة البشرية-1. ويجب أن يشمل الوصف الشامل لمسارات الأمراض المعدية والبيئات التمثيلية التي تدعم المسار الطبيعي لتطور المرض. وأُجري نوعان مختلفان من التحليلات وقارنتهما في القدرة على تحديد العوامل النووية. يسرد الجدول 1 العوامل التي ظلت مرتبطة بـ WT Rev نتيجة لتحليل قياس الطيف الكتلي المباشر للبروتين. وقد أسفر هذا التحليل عن عدة عوامل معروفة لفيروس نقص المناعة البشرية-1 Rev. وقد قورنت هذه الطريقة المباشرة بعملية أخرى تنطوي على استخراج البروتين المنفصل داخل المواد الهلامية SDS-PAGE وتحليل قياس الطيف الكتلي لهذه البروتينات. وقد أسفرت هذه الطريقة الثانية عن مجموعة متنوعة من العوامل المعروفة والمحتملة المرتبطة بمركب بروتين Rev ولكنها تفتقر إلى البروتينات التالية التي سبق تحديدها في الجدول1: الجسيمات التعرف على الإشارة 14 كيلودا، بدء الترجمة eukaryotic عامل 4B، بروتين ريبوسومال L22، صغيرة النيوكليولار RNA C / D مربع 58B، والزنك إصبع CCHC المجال الذي يحتوي على 11. وفي نهاية المطاف، فإن الطريقة المتفوقة التي تم اختيارها لتحليل الطيف الكتلي في هذا البروتوكول تنطوي على استخراج الببتيدات من المواد الهلامية SDS-PAGE. وشملت الطريقة المباشرة الأولى 2X عينة العازلة في eluate دون الأزرق بروموفينول; المكونات المتبقية من المخزن المؤقت عينة 2X يمكن أن تتداخل مع العلاج التربسين كاملة ويمكن أن تسفر عن الببتيدات معالجتها بشكل غير كامل لتحليل قياس الطيف الكتلي. وكانت الطريقة غير المباشرة الثانية قادرة على تنقية الببتيدات المعالجة بالتربسين من الملوثات المحتملة من SDS-PAGE.

ويمكن استخدام أساليب إعداد قياس الطيف الكتلي الموصوفة هنا لتحديد التدخلات العلاجية للقضاء على عدوى فيروس نقص المناعة البشرية-1 من خلال استهداف القس. النشاط المهيمن السلبي وتستخدم في القبض على وظيفة القس. الخصائص السلبية المهيمنة التي تهم الاعتقال الوظيفي القس هي التالية: Rev/RRE تقارب ملزم; إعادة توطين النيوكليولار WT Rev من خلال التعدد مع المسوخ القس. فقدان في التقارب إلى العوامل الخلوية الرئيسية المشاركة في نقل فيروس نقص المناعة البشرية-1 mRNA والربط. ويمكن دراسة تعدد التمركز القس الذي ينطوي على التعبير المشترك للطفرات Rev-NoLS مع WT Rev. ومن المتوقع أن تتكاثر الطفرات السلبية المهيمنة في هذا النموذج مع WT Rev وتحول الأنماط النووية نحو النواة والسيتوبلازم، مما يؤدي إلى القبض الوظيفي Rev. ويمكن استخدام قياس الطيف الكتلي لتحديد فقدان العوامل الخلوية الرئيسية التي تنطوي عليها الربط ونقل فيروس نقص المناعة البشرية-1 mRNA. ومن شأن تحديد التفاعلات المفقودة مع WT Rev نتيجة للتعبير المشترك مع طفرات Rev-NoLS السلبية المهيمنة أن يكشف عن مشاركة مسارات خاصة بالنيوكليولار في مسببات الأمراض من فيروس نقص المناعة البشرية-1. بدلا من ذلك، يمكن التحقيق في الجسيمات الفيروسية HIV-1NL4-3 ولدت في خلفية الطفرات Rev-NoLS لجميع العوامل الخلوية المعبأة. ويمكن زيادة تحديد العوامل الخلوية والفيروسية المعبأة داخل الجسيمات الفيروسية من خلال قياس الطيف الكتلي. وهذا من شأنه أن يكشف عن وجود عوامل النيوكليولار داخل الجسيمات الفيروسية ودور العوامل النووية المحددة في العدوى الفيروسية. وتنطبق الأساليب الموصوفة على النماذج الفيروسية والأمراض الأخرى لتحديد وتوصيف المسارات التي لم تدرس بعد. ومن شأن ذلك أن يسمح بتطوير التدخلات العلاجية ضد الأمراض التي تتوفر من خلالها علاجات محدودة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

وينوه المؤلفون بالدكتورة باربرا ك. فيلبر والدكتور جورج ن. بافلاكيس للثقافة الملتصقة بـ HLfB التي يوفرها برنامج المعاهد الوطنية للصحة للبحوث والكاشفات المرجعية، شعبة الإيدز، المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية الأمراض (NIAID)، المعاهد القومية للصحة. ويعترف أصحاب البلاغ أيضاً بالمصادر المالية التي قدمتها المعاهد الوطنية للصحة، والمنح AI042552 وAI029329.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Fisher Chemical A38S-212
Acetonitrile Fisher Chemical A955-500
Acrylamide:Bisacrylamide BioRad 1610158
Ammonium bicarbonate Fisher Chemical A643-500
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich 7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gel Sigma-Aldrich A2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG Sigma-Aldrich F3165
BioMax MS film Carestream 8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL Bio-Rad 5000006
B23 mouse monoclonal IgG Santa Cruz Biotechnologies sc-47725
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carnation non-fat powdered milk Nestle N/A
Cell scraper ThermoFisher Scientific 179693PK
C18IonKey nanoTile column Waters 186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishes Fisher Scientific 08-772-22
Dithiothreitol Thermo Scientific J1539714
1 x DPBS Corning 21-030-CVRS
ECL Estern blotting substrate Pierce 32106
Ethanol, 200 proof Fisher Chemical A409-4
FBS Gibco 16000044
Formic Acid Fisher Chemical A117-50
GelCode blue stain reagent ThermoFisher 24590
Glycerol Fisher Chemical 56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz Biotechnologies sc-2005
Iodoacetamide ACROS Organics 122270050
KimWipe delicate task wiper Kimberly Clark Professional 34120
L-glutamine Gibco 25030081
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
NanoAcuity UPLC Waters N/A
Pierce Silver Stain Kit Thermo Scientific 24600df
15-mL Polypropylene conical tube Falcon 352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo Scientific 26616
Protease inhibitor cocktail Roche 4693132001
Purified BSA New England Biolabs B9001
PVDF  Western blotting membrane Roche 3010040001
Sodium Pyruvate Gibco 11360070
10 x TBS Fisher Bioreagents BP2471500
TEMED BioRad 1610880edu
Triton X-100 detergent solution BioRad 1610407
Trizaic source Waters N/A
trypsin-EDTA Corning 25-051-CIS
Tween 20 BioRad 1706531
Synapt G2 mass spectrometer Waters N/A
Whatman filter paper Tisch Scientific 10427813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arizala, J. A. C., et al. Nucleolar Localization of HIV-1 Rev Is Required, Yet Insufficient for Production of Infectious Viral Particles. AIDS Research and Human Retroviruses. (2018).
  2. Li, Y. P. Protein B23 is an important human factor for the nucleolar localization of the human immunodeficiency virus protein Tat. Journal of Virology. 71, 4098-4102 (1997).
  3. Szebeni, A., et al. Nucleolar protein B23 stimulates nuclear import of the HIV-1 Rev protein and NLS-conjugated albumin. Biochemistry. 36, 3941-3949 (1997).
  4. Truant, R., Cullen, B. R. The arginine-rich domains present in human immunodeficiency virus type 1 Tat and Rev function as direct importin beta-dependent nuclear localization signals. Molecular and Cellular Biology. 19, 1210-1217 (1999).
  5. Eirin-Lopez, J. M., Frehlick, L. J., Ausio, J. Long-term evolution and functional diversification in the members of the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Genetics. 173, 1835-1850 (2006).
  6. Frehlick, L. J., Eirin-Lopez, J. M., Ausio, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. BioEssays. 29, 49-59 (2007).
  7. Okuwaki, M., Matsumoto, K., Tsujimoto, M., Nagata, K. Function of nucleophosmin/B23, a nucleolar acidic protein, as a histone chaperone. FEBS Letters. 506, 272-276 (2001).
  8. Szebeni, A., Olson, M. O. Nucleolar protein B23 has molecular chaperone activities. Protein Science. 8, 905-912 (1999).
  9. Hingorani, K., Szebeni, A., Olson, M. O. Mapping the functional domains of nucleolar protein B23. Journal of Biological Chemistry. 275, 24451-24457 (2000).
  10. Borer, R. A., Lehner, C. F., Eppenberger, H. M., Nigg, E. A. Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm. Cell. 56, 379-390 (1989).
  11. Yun, J. P., et al. Nucleophosmin/B23 is a proliferate shuttle protein associated with nuclear matrix. Journal of Cellular Biochemistry. 90, 1140-1148 (2003).
  12. Savkur, R. S., Olson, M. O. Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA byprotein B23 endoribonuclease. Nucleic Acids Research. 26, 4508-4515 (1998).
  13. Herrera, J. E., Savkur, R., Olson, M. O. The ribonuclease activity of nucleolar protein B23. Nucleic Acids Research. 23, 3974-3979 (1995).
  14. Grisendi, S., et al. Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis. Nature. 437, 147-153 (2005).
  15. Itahana, K., et al. Tumor suppressor ARF degrades B23, a nucleolar protein involved in ribosome biogenesis and cell proliferation. Molecular Cell. 12, 1151-1164 (2003).
  16. Ye, K. Nucleophosmin/B23, a multifunctional protein that can regulate apoptosis. Cancer Biology & Therapy. 4, 918-923 (2005).
  17. Kuo, M. L., den Besten, W., Bertwistle, D., Roussel, M. F., Sherr, C. J. N-terminal polyubiquitination and degradation of the Arf tumor suppressor. Genes & Development. 18, 1862-1874 (2004).
  18. Kuo, M. L., den Besten, W., Thomas, M. C., Sherr, C. J. Arf-induced turnover of the nucleolar nucleophosmin-associated SUMO-2/3 protease Senp3. Cell Cycle. 7, 3378-3387 (2008).
  19. Horn, H. F., Vousden, K. H. Cancer: guarding the guardian. Nature. 427, 110-111 (2004).
  20. Grisendi, S., Mecucci, C., Falini, B., Pandolfi, P. P. Nucleophosmin and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 493-505 (2006).
  21. Dingwall, C., et al. Nucleoplasmin cDNA sequence reveals polyglutamic acid tracts and a cluster of sequences homologous to putative nuclear localization signals. The EMBO Journal. 6, 69-74 (1987).
  22. Fankhauser, C., Izaurralde, E., Adachi, Y., Wingfield, P., Laemmli, U. K. Specific complex of human immunodeficiency virus type 1 rev and nucleolar B23 proteins: dissociation by the Rev response element. Molecular and Cellular Biology. 11, 2567-2575 (1991).
  23. Valdez, B. C., et al. Identification of the nuclear and nucleolar localization signals of the protein p120. Interaction with translocation protein B23. Journal of Biological Chemistry. 269, 23776-23783 (1994).
  24. Li, Y. P., Busch, R. K., Valdez, B. C., Busch, H. C23 interacts with B23, a putative nucleolar-localization-signal-binding protein. European Journal of Biochemistry/FEBS. 237, 153-158 (1996).
  25. Adachi, Y., Copeland, T. D., Hatanaka, M., Oroszlan, S. Nucleolar targeting signal of Rex protein of human T-cell leukemia virus type I specifically binds to nucleolar shuttle protein B-23. Journal of Biological Chemistry. 268, 13930-13934 (1993).
  26. Szebeni, A., Herrera, J. E., Olson, M. O. Interaction of nucleolar protein B23 with peptides related to nuclear localization signals. Biochemistry. 34, 8037-8042 (1995).
  27. Tsuda, Y., et al. Nucleolar protein B23 interacts with Japanese encephalitis virus core protein and participates in viral replication. Microbiology and Immunology. 50, 225-234 (2006).
  28. Ning, B., Shih, C. Nucleolar localization of human hepatitis B virus capsid protein. Journal of Virology. 78, 13653-13668 (2004).
  29. Lee, S. J., Shim, H. Y., Hsieh, A., Min, J. Y., Jung, G. Hepatitis B virus core interacts with the host cell nucleolar protein, nucleophosmin 1. Journal of Microbiology. 47, 746-752 (2009).
  30. Huang, W. H., Yung, B. Y., Syu, W. J., Lee, Y. H. The nucleolar phosphoprotein B23 interacts with hepatitis delta antigens and modulates the hepatitis delta virus RNA replication. Journal of Biological Chemistry. 276, 25166-25175 (2001).
  31. Li, Y. J., Macnaughton, T., Gao, L., Lai, M. M. RNA-templated replication of hepatitis delta virus: genomic and antigenomic RNAs associate with different nuclear bodies. Journal of Virology. 80, 6478-6486 (2006).
  32. Yang, T. H., et al. Purification and characterization of nucleolin and its identification as a transcription repressor. Molecular and Cellular Biology. 14, 6068-6074 (1994).
  33. Sarek, G., et al. Nucleophosmin phosphorylation by v-cyclin-CDK6 controls KSHV latency. PLoS Pathogens. 6, 1000818 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics