레브 면역 침전 및 질량 분광법을 통한 HIV-1 복제 중 핵균 요인 식별

Immunology and Infection

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Summary

여기에서 우리는 질량 분광법을 위한 HIV-1 복제의 존재에 있는 Rev 면역 침전을 기술합니다. 기재된 방법은 HIV-1 감염 주기에 관여하는 뉴클레올러 인자의 식별을 위해 사용될 수 있으며, 연구되지 않은 경로의 특성화를 위한 다른 질병 모델에 적용가능하다.

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Arizala, J. A., Chomchan, P., Li, H., Moore, R., Ge, H., Ouellet, D. L., Rossi, J. J. Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (148), e59329, doi:10.3791/59329 (2019).

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Abstract

HIV-1 전염주기는 바이러스 복제, 포장 및 방출을 촉진하기 위해 호스트 인자와의 바이러스 성 단백질 상호 작용을 필요로합니다. 전염주기는 더 접합을 통제하고 뉴클레오세포 수송을 가능하게 하기 위하여 HIV-1 RNA를 가진 바이러스성/호스트 단백질 복합체의 대형을 요구합니다. HIV-1 Rev 단백질은 인트로닉 시스-연기 표적-레브 반응 요소(RRE)를 가진 다중 병합을 통해 HIV-1 mRNAs의 핵 수출을 달성한다. 핵국화 신호(NoLS)는 레브 아르기닌이 풍부한 모티프(ARM)의 COOH 말단 내에 존재하며, 핵소체내의 Rev/RRE 복합체의 축적을 허용한다. 핵균 요인은 mRNA 독립적인 핵 수출 및 접합을 중재하는 것 이외에 각종 그밖 기능을 통해 HIV-1 전염주기를 지원하기 위하여 추측됩니다. 우리는 질량 분광법을 위한 HIV-1 복제의 존재에 있는 Rev 뉴클레올라 돌연변이 (삭제 및 단점 Rev-NoLS 돌연변이)에 비교된 야생형 (WT) Rev의 면역 침전 방법을 기술합니다. 뉴클레오세포 인자 (뉴클레오포스민 B23 및 뉴클레오린 C23)뿐만 아니라 세포 접합 인자에 연루된 핵세포 인자는 Rev-NoLS 돌연변이의 존재에서 Rev와의 상호 작용을 잃게된다. snoRNA C/D 상자 58와 같은 각종 그밖 핵포 요인은, Rev 돌연변이와의 상호 작용을 분실하기 위하여 확인됩니다, 그러나 HIV-1 복제 주기에 있는 그들의 기능은 알려지지 않은 남아 있습니다. 여기에 제시된 결과는 HIV-1 전염주기를 유지하는 바이러스성/호스트 뉴클레올라 요인의 확인을 위한 이 접근의 사용을 보여줍니다. 이 접근에 사용된 개념은 연구되지 않은 통로의 특성화를 요구하는 그밖 바이러스성 및 질병 모형에 적용가능합니다.

Introduction

핵약은 바이러스 복제에 필요한 다양한 세포 숙주 및 바이러스 인자의 상호 작용 접지로 가정됩니다. 핵소종은 세 개의 서로 다른 구획으로 세분화된 복잡한 구조입니다: 섬유실, 조밀한 섬유실 및 과립 구획. HIV-1 Rev 단백질은 특히 세분화된 구획 내에서 국소화됩니다. 그러나 이 지역화 패턴에 대한 이유는 알 수 없습니다. NoLS 서열(Rev 돌연변이 4, 5 및 6) 내의 단일 점 돌연변이가 있는 경우, Rev는 뉴클레올러 패턴을 유지하고 이전에 HIV-1HXB2 복제를 구출하는 것으로 나타났지만 WT Rev 1에 비해 효율성이 감소했습니다. . 모든 단점 돌연변이는 HIV-1NL4-3 전염주기를 지탱할 수 없습니다. NoLS 서열(Rev-NoLS 돌연변이 2 및 9) 내에서 다중 단일 점 돌연변이의 존재에서, Rev는 핵 및 세포질 전반에 걸쳐 분산되는 것으로 관찰되었으며HIV-1HXB2 복제 1을 구출할 수 없었다. 이 proteomics 연구 결과의 목표는 Rev 중재한 HIV-1 전염하는 통로에서 관련시킨 비핵구세포 세포 요인 뿐만 아니라 핵을 해독하는 것입니다. 레브 면역 침전 조건은 이전에 뉴클레오체 돌연변이의 존재하에서 Rev와의 상호 작용을 잃는 것으로 나타난 뉴클레올러 B23 인단백질과의 상호작용을 통해 최적화된다.

레브 세포 요인은 광범위하게 과거에 공부하고있다; 그러나, 이것은 바이러스성 병인의 부재에서 행해졌습니다. 특히, HIV-1 복제 시 레브 상호작용을 통한 본 연구에서 특징인 단백질 중 하나는 핵포포스민(NPM), 누마티스민 또는 NO38이라고도 불리는 핵포단백질 B23이며, 양서류 2, 3, 4. B23은 3개의 이소폼(NPM1, NPM2 및 NPM3)-핵공포증/핵샤페론 패밀리의 모든 구성원5,6으로표현된다. NPM1 분자 샤페론은 크로마틴 고차 구조에 관여하는 단백질/핵산 복합체의 형성에서 뉴클레오좀의 적절한조립에서 기능7,8,및 응집 방지 및 N-말단 코어 도메인(잔기 1-120)을 통해 표적 단백질의오실링(잔기 1-120)을 9. NPM1 기능은 핵과 세포질 사이의 프리보솜 입자의 수송을 통해 리보솜 기원으로 확장10,11,내부 전사 스페이서 서열에서 프리보솜 RNA의 처리 도 12,13,리보좀 어셈블리 동안 단백질의 뉴클레오체 응집을 체포14,15. NPM1은 세포자멸(16)의 억제및 종양 억제제 ARF17,18 및 p5319의안정화에 연루되어, 종양발생 인자 및 종양 억제제로서의 이중적 역할을 드러낸다. NPM1은 게놈 안정성, 중심도 복제 및 전사의 세포 활동에 참여한다. NPM1은 유사분열 동안 염색체 주변을 따라 세포 주기 간, 유사분열의 결론에 있는 프리뉴클레오체 체(PNB)에서 발견된다. NPM2 및 NPM3는 악성 20 동안 변경된 발현 수준을 겪는NPM1로 잘 연구되지 않습니다.

NPM1은 내부 NES 및 NLS9,21을 통해 다양한 핵/뉴클레오라단백질의 핵세포질 차단에 문서화되어 있으며 이전에 HIV-1 Tat 및 Rev 단백질의 핵 수입을 유도하는 것으로 보고되었다. B23 결합-도메인-β-갈락토시다아제 융합 단백질의 존재하에서, Tat는 세포질 내의 국소화하고 과활성화 활성을 잃는다; 이것은 B23 2에 대한 Tat의강한 친화력을 보여줍니다. 또 다른 연구는 RRE 함유 mRNA의 부재에 있는 Rev/B23 안정한 복합체를 설치했습니다. RRE mRNA의 존재에서, 레브는 B23로부터 해리되고 바람직하게는 HIV RRE에 결합하여, B2322의변위를 이끌어 내다. 그것은 어디 알 수 없습니다., 핵 수준에서, Tat 트랜스 활성화 및 HIV mRNA에 대 한 B23의 Rev 교환 프로세스가 일어나는. 두 단백질은 B23 상호 작용을 통해 동시에 핵균을 입력하는 가정. HIV 뉴클레올러 경로에서 다른 숙주 세포 단백질의 참여가 예상된다. 이 proteomics 조사에 기술된 방법은 HIV-1 병인성 도중 관련시킨 호스트 세포 요인과 핵소동의 상호 작용을 설명하는 것을 도울 것입니다.

프로테오믹스 조사는 HIV-1HXB2 생산을 위한 Rev NoLS 단점 돌연변이 (M4, M5 및 M6) 및 다중 아르기닌 치환 (M2 및 M9)의 발현을 통해 시작되었다. 이 모델에서, Rev 결핍 HIV-1 HXB2(HLfB)를 안정적으로 발현하는 HeLa 세포주들은 3' 말단에 플래그 태그를 함유하는 WT Rev 및 Rev 뉴클레올라 돌연변이로 형질이 된다. WT Rev의 존재는 레브 결핍(M2 및 M9)을 구출하지 않는 Rev-NoLS 돌연변이에 비해 HLfB 배양물에서 바이러스 복제가 발생하도록 허용하거나, 바이러스 복제가 WTRev(M4, M5 및 M6)만큼 효율적이지는 않지만 발생하도록 허용한다 1. 세포 용해는 Rev 발현의 존재에서 바이러스 증식 후 48 시간 후에 수집되고 Rev/B23 상호작용에 최적화된 용해 완충액으로 면역 침전을 행하였다. 다양한 염 농도를 이용한 용해 완충최적화가 설명되고, HIV-1 Rev에 대한 단백질 용출 방법을 은염색 또는 쿠마시 스테인드 SDS-PAGE 겔로 비교 및 분석한다. 첫번째 proteomics 접근은 탠덤 질량 분광법에 의하여 표현된 WT Rev, M2, M6 및 M9에서 용출된 견본의 직접적인 분석을 관련시킵니다. WT Rev, M4, M5 및 M6의 용출액이 겔 추출 과정을 거치는 제2 접근법은 제1 접근법과 비교된다. 펩티드 친화성은 WT 레브에 비해 Rev-NoLS 돌연변이에 대한 단백질 동정 확률이 표시된다. 이 접근은 HIV-1 mRNA 수송에 참여하고 HIV-1 복제 도중 Rev를 가진 접합하는 잠재적인 요인 (핵소와 비핵볼라)를 밝힙니다. 전반적으로, 기술된 세포 용해, IP 및 용출 조건은 감염경로를 활성화하고 조절하는 숙주 세포 인자의 이해를 위해 관심 있는 바이러스 성 단백질에 적용가능하다. 이것은 또한 다양한 질병 모델의 지속성에 필요한 세포 숙주 인자의 연구에 적용 가능하다. 이 프로테오믹스 모델에서, HIV-1 Rev IP는 B23 상호작용에 최적화되어 핵세포질 차단 활성 및 HIV-1 mRNA 결합에 관여하는 핵세포 인자를 해명한다. 추가적으로, 관심 있는 중요한 단백질을 위한 결핍되는 감염성 질병 모형을 안정적으로 표현하는 세포주는 관심있는 감염통로를 공부하기 위하여 HLfB 세포주와 유사하게, 개발될 수 있습니다.

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Protocol

1. 세포 배양

  1. Dulbecco의 수정된 독수리 배지(DMEM)에 10% 태아 소 혈청(FBS), 2 mML-글루타민, 1 mMM 나트륨 피루브산을 조직 배양 처리된 100 mm 플레이트 내에 보충하여 HLfB를 유지합니다. 5% CO2와 함께 공급되는 가습 된 인큐베이터에서 세포배양을 37 °C로 유지하십시오. 1 x 106 세포 / mL의 세포 밀도로 통로 결합 셀.
  2. 세포 배양 배지를 폐기한다. 1x 인산완식염수린(PBS)의 10 mL로 세포를 부드럽게 헹구십시오. 세포 층을 방해하지 않고 1x PBS를 제거하고 폐기하십시오.
  3. 세포에 1x 트립신-EDTA 용액 2mL를 추가합니다. 접시를 흔들어 단층을 코팅하고 가습 챔버 내에서 37°C에서 5분 동안 배양한다.
  4. 접시의 측면을 손바닥으로 단단히 눌러 세포를 분리합니다. 분리된 세포를 신선한 배양 배지의 8 mL에서 다시 중단합니다. 세포를 400 x g에서 5 분 동안 돌이꿉지 모릅니다.
  5. 세포 펠릿을 방해하지 않고 배양 배지를 폐기한다. 신선한 배양 배지의 10 mL에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 계배양 1 mL의 농축 된 세포의 9 mL의 신선한 배양 배지를 조직 배양 처리 100 mm 플레이트 내에서.
    참고: 각 Rev-NoLS 돌연변이에 대해 3x 100 mm HLfB 또는 HeLa 배양 플레이트는 서부 블롯 분석 및 질량 분석에 충분한 단백질 용해를 생성합니다. WT Rev 포지티브 컨트롤 및 네거티브 컨트롤을 위한 추가 플레이트를 추가합니다. 하위 배양 세포 볼륨은 상이한 세포 유형을 사용하여 최적화를 필요로 합니다.

2. HIV-1 복제 중 Rev-NoLS-3'flag 돌연변이 발현

  1. HLfB 세포 배양을 2 x 106 세포/mL의 세포 밀도로 성장시다. 각 100 mm 플레이트에 대해 4 mL의 칼슘 인산염 DNA 현탁액을 준비한다.
    1. 15mL 튜브 2개를 1과 2로 레이블을 지정합니다. 튜브 1에 2mL의 HBS(0.05M HEPES, 0.28M NaCl 및1.5mM Na2 HPO 4[pH 7.12])를 추가합니다. 튜브 2에 TE 79/10(1mM Tris-HCl 및 0.1 mM EDTA [pH 7.9])를 추가합니다. TE 79/10의 부피는 1.760 mL - DNA의 부피이다.
    2. 20 μg의 플라스미드를 튜브 2에 관심 있는 Rev-NoLs-3'flag 돌연변이를 함유하고 재서스펜션을 통해 그 내용을 혼합한다. 튜브 2에 2M CaCl2의 240 μL을 추가하고 다시 현탁액을 통해 혼합합니다.
    3. 튜브 2의 혼합물을 튜브 1 방울로 옮기고 부드럽게 혼합하십시오. 현탁액을 실온에서 30 분 동안 앉게하십시오.
  2. 각 3세포 배양액에 1 mL의 현탁액을 떨어뜨리면서 100 mm 플레이트를 부드럽게 소용돌이치면서 부전을 가열한다. 플레이트를 인큐베이터로 되돌리고 6시간 동안 형질전환 혼합물을 그대로 두십시오.

3. 바이러스 성 단백질 의 수집 은 리세이트

  1. 세포 매체 48 h 후 변환을 폐기하십시오. 각 100mm 접시를 얼음 위에 놓습니다. 각 Rev-NoLS 돌연변이 샘플에 대해 15 mL 튜브를 라벨하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
  2. 세포 층을 방해하지 않고 미리 냉장 된 1x PBS 10 mL로 세포를 부드럽게 헹구십시오. 1x PBS를 폐기합니다. 프로테아제 억제제 칵테일로 처리한 3 mL의 용해 완충액(50 mM Tris-HCl [pH 8.0], 137 mM NaCl 및 1% X-100 세제[재료 참조])를 각각 100 mm 플레이트에 추가합니다.
  3. 세포 스크레이퍼를 사용하여 세포 층을 방해하십시오. 접시를 기울이고 부드럽게 긁어 풀에 세포를 수집합니다. 1,000 μL 마이크로파이펫을 사용하여 세포 용해액을 수집하고 미리 표지된 15 mL 튜브에서 3개의 100 mm 플레이트 각각에서 세포 용해액을 혼합합니다.
  4. 세포를 얼음에 15 분 동안 배양하고 5 분마다 소용돌이치며 5 분 동안 15,000 x g에서 세포 용해를 원심 분리합니다.
  5. 세포 파편 펠릿을 방해하지 않고 단백질 상류를 수집하고 다른 멸균 15 mL 튜브로 전송합니다. 브래드포드 방법을 사용하여 바이러스 성 단백질 용해 농도를 얻었다 (섹션 4 참조).
  6. 웨스턴 면역블롯 분석을 위한 입력 샘플(20 μg)의 알리쿼트저장. 최종 부피에 2x 샘플 버퍼(글리세롤 20%, 브로모페놀 블루 0.02%, 트리스-Cl[pH 6.8], 5% SDS 및 10% 2-메르캅토에탄올)를 추가합니다. 95°C에서 10분간 끓이고 입력 샘플을 -20°C에 저장합니다.

4. 브래드포드 분석

참고: 단백질 표준 곡선을 생성하기 전에 100x BSA 스톡에서 10x 소 혈청 알부민(BSA)을 준비합니다.

  1. 다음 공백 및 표준에 대한 마이크로 원심 분리튜브내의 알리쿼트 물: 블랭크 = 800 μL; 표준 1 = 2 mg/mL, 798 μL; 표준 2 = 4 mg/mL, 796 μL; 표준 3 = 6 mg/mL, 794 μL; 표준 4 = 8 mg/mL, 792 μL; 표준 5 = 10 mg/mL, 790 μL. 알리쿼트 10x BSA를 다음과 같은 지정된 표준으로: 표준 1 = 2 μL; 표준 2 = 4 μL; 표준 3 = 6 μL; 표준 4 = 8 μL; 표준 5 = 10 μL.
  2. 795 μL의 물을 5 μL의 단백질 샘플과 혼합하여 단백질 샘플의 혼합물을 준비합니다. 단백질 분석 염료 시약 200 μL을 각 빈, 표준 및 단백질 샘플에 추가합니다(재료 참조). 샘플을 균일한 혼합물에 대해 간략하게 소용돌이시키고 실온(18-20°C)에서 5분 동안 배양한다.
  3. 빈, 표준 및 단백질 샘플을 큐벳으로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김. 595 nm의 OD에서 단백질 농도를 측정합니다.

5. 레브-NoLS-3'플래그의 공동 면역 침전

  1. 프로테아제 억제제 칵테일로 처리한 500 μL의 용해 완충제으로 M2 친화성 겔 비드 25 μL을 헹구고(재료 참조). 모든 돌연변이 샘플 및 대조군을 위해 더 많은 친화성 겔 구슬을 헹구는다.
    참고 : 두 젤 (50 μL)에 대한 충분한 M2 친화성 젤 구슬을 준비 - 서양 면역 블롯 분석을위한 하나 및 단백질 염색 및 질량 분석에 대한 다른 하나.
  2. 4 °C에서 2 분 동안 820 x g에서 회전하십시오. 상급체를 제거합니다. 2배 더 헹입니다.
  3. 미리 헹구진 M2 친화 구슬에 바이러스 성 단백질 용해물 (총 부피의 5 mL에서 1 mg / mL)을 추가하십시오. 용해 버퍼를 사용하여 총 볼륨을 조정합니다.
  4. 4 °C에서 회전, 3 시간 동안 반응을 배양. M2 친화성 구슬/바이러스 성 단백질을 820 x g에서 1 분 동안 용해시합니다.
  5. 상복부를 수집하고 서쪽 면역블롯 분석을 위한 사후 IP 샘플(20 μg)의 알리쿼트(aliquot)를 저장합니다. 포스트 IP 용해물의 단백질 농도를 측정합니다. 서양 면역 블롯팅을 위해 20 μg를 수집하십시오.
  6. 최종 볼륨에 2x 샘플 버퍼를 추가합니다. 95°C에서 10분간 끓이고, IP 후 샘플을 -20°C에서 저장한다.
  7. 750 μL의 용해 완충제로 M2 비드를 헹구고 4°C에서 4°C로 회전자 상에서 구슬을 5분 간 세척합니다.
  8. 5.7단계를 반복하여 4°C에서 4°C에서 2회 더 2회 더 5분 동안 세차합니다. 세 번째 세척 후, 긴 젤 로딩 팁을 사용하여 M2 비드 /공동 IP 복합체에서 용해 완충의 흔적을 제거하십시오.
    참고: 용해 버퍼의 미량 제거하기 전에 평평한 핀셋으로 젤 로딩 팁의 끝을 꼬집습니다. 이렇게하면 M2 구슬의 중단 및 섭취를 방지 할 수 있습니다.
  9. 2x 로딩 버퍼의 55 μL에서 M2 비드를 다시 일시 중단합니다. 95°C에서 10분간 시료를 끓입니다.
  10. 25 μL의 용출을 두 개의 별도 SDS-PAGE 젤에 로드합니다 (서양 면역 블롯팅을위한 젤과 쿠마시 염색을위한 젤).

6. SDS-PAGE 젤의 준비

  1. 50 mL 튜브에 다음 시약을 혼합하여 두 개의 15 % SDS -아크릴아미드 분해 젤을 캐스팅 (40 mL의 최종 부피에서, 4 개의 젤에 충분): 초순수 4.16 mL, 40 % 아크릴아미드의 15 mL :비삼크릴라미드 (29:1), 10 mL 의 10 mL (10 mL 의 1.8ML) , 400 μL 의 10% SDS, 400 μL 의 10% 황산 암모늄, 및 TEMED의 40 μL.
  2. 50 mL 튜브를 여러 번 반전시켜 분해 겔을 혼합한다. 미리 세척된 웨스턴 젤 장치(4개의 젤 - 서양 면역 블롯팅을 위한 3개 및 쿠마시/실버 염색을 위한 1개)로 분해겔 혼합물을 피펫.
  3. 젤 혼합물의 상단 층을 덮을 만큼 충분한 물을 부드럽게 피펫. 분해 젤이 중합되도록 한다.
  4. 분해 젤에서 물 층을 붓고, 섬세한 작업 와이퍼 (재료 참조)를 사용하여 여분의 물을 흡수하십시오.
  5. 다음 시약을 50 mL 튜브에 혼합하여 5% SDS-아크릴아미드 스태킹 젤 2개를 주조(최종 부피 20 mL, 4개의 젤에 충분함: 초순수 11.88mL, 40% 아크릴아미드 2.5 mL:비삼크릴라미드 (29:1), 5.2 mL 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) , 10 % SDS의 200 μL, 10 % 황산 암모늄 의 200 μL, TEMED의 20 μL.
  6. 스태킹 겔을 50 mL 튜브를 여러 번 반전시킴으로써 혼합한다. 피펫을 스태킹 겔 혼합물 을 장치의 상부로 분해겔 위에 상기 분해한다.
  7. 적층 젤에 적절한 수의 레인을 포함하는 젤 카세트 빗을 놓습니다. 섬세한 작업 와이퍼를 사용하여 젤 혼합물의 오버플로우를 흡수합니다(재료 참조). 스태킹 젤이 완전히 중합되도록 하십시오.
  8. 1x 서쪽 실행 완충제 (5x 농도로 웨스턴 젤 장치를 홍수 : 250 mM Tris-Cl [pH 8.3], 1.92 M 글리신, 0.5 % SDS, 및 10 mM EDTA).
  9. 스태킹 젤에서 젤 카세트 빗을 부드럽게 당깁니다. 1x 서부 실행 버퍼가 로딩 웰을 채울 수 있도록 합니다. 샘플을 로드하기 전에 주사기를 사용하여 1x 서부 실행 버퍼로 각 웰을 세척합니다.
  10. 각 해당 겔 (입력 샘플, coimmunocipcipitated 샘플 및 사후 IP 샘플)에 서쪽 면역 블롯 샘플을로드합니다. 웨스턴 젤 단백질 마커를 로드합니다.
  11. Coimmunocipitated 샘플을 Coomassie/은 염색을 다른 젤에 로드합니다. 웨스턴 젤 단백질 마커를 로드합니다.
  12. 러닝 젤 장치를 전원에 연결하고 로딩 염료가 분해 겔에 도달할 때까지 100V에서 겔을 실행합니다. 로딩 염료가 분해 젤의 바닥에 도달할 때까지 전압을 140V로 늘립니다.

7. 서부 얼룩 전송

  1. 웨스턴 젤 장치를 분해합니다. 스태킹 젤을 슬라이스하고 버리고 해결 젤을 그대로 둡니다.
  2. 용액 전달 버퍼 (25 mM Tris, 194 mM 글리신, 0.005 % SDS, 20 % 메탄올)로 채워진 깨끗한 트레이에 분해 젤을 부드럽게 옮기고 15 분 동안 담가 둡니다.
  3. 겔 전사 장치를 다음과 같이 조립한다.
    1. 3개의 PVDF 전사 막과 6개의 필터 용지(재료 참조)를 분해 겔 크기로 자릅니다.
    2. PVDF 멤브레인을 메탄올에 5분 간 담그고 물에 5분간 수분을 공급합니다.
    3. 젤 홀더 카세트를 서쪽 전사 완충재로 부분적으로 채워진 유리 베이킹 트레이에 놓고 하단에 검은 면이 있습니다.
    4. 젤 홀더 카세트의 검은 면에 웨스턴 트랜스퍼 버퍼가 적신 폼 패드를 놓습니다.
    5. 필터 용지 한 장을 서쪽 이송 버퍼에 적시고 폼 패드 위에 놓습니다. 결심 젤을 필터 용지 위에 놓습니다.
      참고: 분해 젤을 올바른 로딩 방향으로 배치하여 PVDF 멤브레인으로 옮김을 전달합니다.
    6. 분해 젤 위에 PVDF 전사 막 1개를 놓습니다. 필터 용지 를 서쪽 이송 버퍼로 적시고 PVDF 전달 막 위에 놓습니다.
    7. 필터 용지 위에 서쪽 전사 완충제로 담근 다른 폼 패드를 놓습니다. 젤 홀더 카세트의 흰색 면을 젖은 폼 패드 위에 조심스럽게 접습니다. 카세트를 단단히 잠급습니다.
    8. 겔 홀더 카세트를 전달 장치 전극 어셈블리에 넣습니다. 남은 각 분해 젤에 대해 7.3.4-7.3.8 단계를 반복합니다.
    9. 전사 장치 탱크를 서부 이송 버퍼로 채웁니다. 교반 막대를 장치 탱크에 넣습니다.
    10. 장치 탱크를 교반판 위에 놓습니다. 교반 설정을 5-6으로 조정하여 교반 막대가 붙어 있거나 젤 홀더 카세트에 닿지 않도록 합니다.
    11. 겔 전달 장치를 전원에 연결하고 4°C에서 1시간 동안 100V로 겔을 전달합니다.

8. 면역 블로팅

  1. 젤 홀더 카세트를 제거하고 깨끗한 유리 베이킹 트레이에 검은 면을 내려 놓습니다. 카세트를 열고 폼 패드와 필터 용지를 조심스럽게 버리십시오. PVDF 멤브레인의 모서리를 표시하여 올바른 하중 방향을 식별합니다. 멤브레인을 젖은 상태로 유지하십시오.
    참고 : PVDF 멤브레인은 공기 건조및 깨끗하고 밀봉 된 용기에 보관 할 수 있습니다. 7.3.2단계를 반복하여 멤브레인을 재수화합니다.
  2. 막을 차단 용액 100 mL (5 % 우유, 1 x TBS 및 0.1 % 트웬20)에 놓습니다. 실온 (18-20 °C)에서 1 시간 동안 부드럽게 흔들어 멤브레인을 차단합니다.
  3. 25 kDa 단백질 마커 위의 막을 가로 질러 잘라. B23 마우스 단클론 IgG1 (1:500 희석)을 함유하는 차단 용액에 25 kDa보다 큰 단백질 밴드를 포함하는 멤브레인의 상부를 놓습니다. 4 °C에서 흔들, 하룻밤 블록.
  4. M2 마우스 단클론 IgG1 (1:1,000 희석, 재료 표참조)를 포함하는 차단 용액에 25 kDa보다 작은 단백질 밴드를 포함하는 멤브레인의 하단 부분을 놓습니다. 4 °C에서 흔들, 하룻밤 블록.
  5. 흔들리는 플랫폼에서 웨스턴 워시 용액 (1 x TBS, 0.1 % 트위넨 20)의 25 mL에서 멤브레인 3 x를 10 분 동안 씻으하십시오.
  6. 실온에서 1시간 동안 차단 용액으로희석된 염소 항 마우스 IgG 1-HRP(1:5,000 희석)에서 멤브레인을 배양합니다. 흔들리는 플랫폼에서 웨스턴 워시 용액 25 mL에서 멤브레인을 10 분 동안 3 x 씻어 내주세요.
  7. 화학 발광 웨스턴 블로팅 기판을 준비합니다. p1000 마이크로파이펫을 사용하여 기판을 멤브레인에 추가합니다.
  8. 화학 발광 서쪽 블로팅 기판에서 각 멤브레인을 5 분 동안 개발합니다. 섬세한 작업 와이퍼를 사용하여 과도한 기판을 흡수합니다(재료 참조).
  9. 멤브레인을 카세트 안쪽에 테이프로 붙인 깨끗한 시트 프로텍터에 넣습니다. 카세트를 어두운 방으로 가져가서 필름 한 장을 카세트에 넣습니다. 카세트를 제자리에 고정하고 5-15 분 동안 배양하십시오.

9. 쿠마시 염색

  1. 웨스턴 젤 장치를 분해합니다. 스태킹 젤을 슬라이스하고 버리고 해결 젤을 그대로 둡니다. 25mL의 초순수가 채워진 깨끗한 트레이에 분해젤을 부드럽게 옮긴다.
  2. 15 분 동안 흔들 플랫폼에 젤을 배양. 부드러운 흔들어 서 해결 젤 이 깨지는 것을 방지 합니다. 초순수를 버리고 세탁 단계를 2배 더 반복합니다.
    참고: 세척 단계 이후에 SDS 버블이 남아 있으면 젤을 밤새 초순수로 세척할 수 있습니다. 잔류 SDS는 겔의 높은 배경 염색을 일으킬 수 있습니다.
  3. 병을 뒤집어 쿠마시 얼룩 시약을 섞습니다(재료 참조). 100 mL의 쿠마시 얼룩 시약을 놓고 젤을 분해하는 젤을 덮고 1 시간 동안 흔들 플랫폼에 젤을 배양하고 쿠마시 얼룩 시약을 버리고 흔들 플랫폼에서 탈이온 수로 젤을 15 분 동안 씻습니다.
  4. 탈이온수를 버린다. 세탁 단계를 2배 더 반복합니다. 단백질 밴드의 원하는 분해능이 관찰될 때까지 젤을 계속 세척합니다.

10. 실버 염색

  1. 웨스턴 젤 장치를 분해합니다. 스태킹 젤을 슬라이스하고 버리고 해결 젤을 그대로 둡니다. 25mL의 초순수가 채워진 깨끗한 트레이에 분해젤을 부드럽게 옮긴다.
  2. 15 분 동안 흔들 플랫폼에 젤을 배양. 부드러운 흔들어 서 해결 젤 이 깨지는 것을 방지 합니다. 초순수를 버리고 세탁 단계를 2배 더 반복합니다.
    참고: 세척 단계 이후에 SDS 버블이 남아 있으면 젤을 밤새 초순수로 세척할 수 있습니다. 잔류 SDS는 겔의 높은 배경 염색을 일으킬 수 있습니다.
  3. 젤을 30% 에탄올:10% 아세트산 용액(6:3:1 물:에탄올:아세트산)에 실온에서 밤새 고정합니다. 젤을 실온에서 5분 동안 10% 에탄올 용액으로 세척합니다. 에탄올 용액을 교체하고 또 다른 5 분 동안 씻으소서.
  4. 500부품의 초순수(50 μL+25mL의 초순수감작)와 1부 실버 얼룩 감작제를 혼합하여 피어스 실버 얼룩 키트의 감작 제 작업 용액을 준비합니다. 감작제 작업 용액에 분해 젤을 1 분 동안 배양하십시오. 1 분 동안 초순수로 젤을 씻고 물을 교체하고 젤을 1 분 동안 다시 씻으십시오.
  5. 한 부분의 실버 얼룩 증강인자를 50부분의 실버 얼룩(500 μL+실버 얼룩 25mL)과 혼합하여 얼룩 작업 용액을 준비합니다. 젤을 얼룩 작업 용액에 30 분 동안 배양하십시오.
  6. 1 부분 실버 얼룩 증강 을 혼합 하 여 개발자 작업 솔루션을 준비 50 부분 실버 얼룩 개발자 (500 μL 개발자의 25 mL와 증강의). 스톱 솔루션으로 5% 아세트산 용액을 준비합니다. 젤을 초순수로 1분 간 세척하고, 물을 교체하고, 젤을 1분 간 더 씻습니다.
  7. 원하는 단백질 밴드 강도가 해결될 때까지 물을 개발자 작업 용액으로 교체하고 배양합니다(5분). 개발자 작업 솔루션을 스톱 솔루션으로 교체하고 10분 동안 인큐베이션합니다.

11. 쿠마시 스테인드 젤 밴드의 인젤 환원, 알킬화 및 소화

  1. 깨끗한 면도날을 사용하여 젤 밴드를 젤에서 자른다. 각 젤 밴드를 약 5mm 큐브로 자르고 깨끗한 0.5 mL 미세 원심 분리튜브에 넣습니다.
  2. 100 mM 의 암모늄 중탄산염으로 젤 조각을 1:1 아세토니트릴:15 분 동안 실온에서 물로 덮어 주십시오. 이 단계를 반복합니다.
  3. 진공 원심분리기에서 젤 조각을 5분 간 건조시고 말립니다. 100 mM 의 암모늄 중탄산염에서 10 mM dithiothreitol로 말린 젤 조각을 덮고 56 °C에서 1 시간 동안 배양하여 단백질을 줄입니다.
  4. 어떤 상급 피펫 떨어져. 젤 조각을 100 mM iodoacetamide로 물로 덮고 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 배양하여 단백질을 알킬레이트합니다.
  5. 피펫을 떼어내고 아세토니트릴로 덮고 실온에서 15분 동안 부드럽게 흔들어 젤 조각을 수축시. 실온에서 15분간 부드럽게 드십시오.
  6. 11.5단계를 반복합니다. 진공 원심분리기에서 젤 조각을 5분 간 건조시고 말립니다.
  7. 100 mM 암모늄 중탄산염에서 50 ng/μL 시퀀싱 등급 수정 된 트립신 (재료 참조)으로 젤 조각을 덮습니다. 젤이 5 분 동안 팽창할 수 있도록 하십시오; 남은 용액을 파이펫으로 떼어내게 합니다. 100 mM mM 중탄산염으로 젤 조각을 덮고 완전히 다시 팽창 할 수 있도록, 젤 조각이 완전히 덮여 있도록 추가 100 mM MM 암모늄 중탄산염을 추가합니다.
  8. 37°C에서 밤새 겔 조각을 배양한다. 물에 10 % 포산의 부피의 1/10을 추가하여 반응을 중지하십시오. 각 튜브에서 상급을 수집합니다.
  9. 젤 조각을 60% 아세토니트릴로 1% 포믹산으로 덮고 부드럽게 흔들어서 15분 동안 배양하여 추출합니다.
  10. 진공 원심분리기에서 결합된 초나토트의 부피를 20 μL 미만으로 줄이면서 초자연자가 완전히 건조되지 않도록 주의하십시오. 1% 포믹산을 첨가하여 총 부피를 20 μL로 되돌려 보세요.

12. 액체 크로마토그래피/질량 분석법

참고: 샘플은 울트라 HPLC, 나노 스프레이 소스 및 컬럼이 장착된 질량 분석계를 사용하여 분석하였다(재료 참조). 용매 A와 B는 각각 물과 아세토니트릴에서 0.1% 포르믹산이다.

  1. 소화된 단백질을 고회수 폴리프로필렌 자동 샘플러 바이알에 로드합니다. 바이알을 UPLC 시스템의 샘플 관리자에 로드합니다.
  2. 각 샘플의 6 μL을 주입합니다. 99% 용매 A/1% 용매 B를 사용하여 각 샘플을 나노타일의 트래핑 컬럼에 8 μL/min에서 1.5분 동안 로드합니다.
  3. 펩티드를 30분 이상 용매 B의 3%에서 35%까지 선형 그라데이션으로 질량 분광계로 용해시키고, 4분 이상 용매 B의 35%에서 50%, 1분 이상 용매 B의 50%에서 90%까지 그라데이션을 유지합니다. 그런 다음 %B를 5분 동안 3%로 줄입니다.
  4. 해상도(20,000 분해능) 모드에서 양수 이온 프로파일 질량 값 데이터를 수집합니다. 0.6s마다 1회 스캔한 속도로 100Da에서 2,000Da까지 데이터를 수집합니다.
  5. 높은 충돌 에너지의 경우 트랩 셀의 충돌 에너지를 15V에서 40V로 램프합니다. 용매 A의 빈 주입을 사용하여 데이터 파일을 획득하고 각 샘플 쌍 간에 동일한 수집 방법을 사용하여 이월을 제어합니다.

13. 질량 분석법에 대한 데이터 분석

  1. 질량 분석 결과 파일을 정량적 및 정성적 프로테오믹스 연구 플랫폼(예: ProteinLynx 글로벌 서버)을 실행하는 컴퓨터에 복사합니다. 데이터 분석은 CPU 집약적이며 별도의 고성능 데이터 분석 컴퓨터에서 수행해야 합니다.
  2. 데이터에 대한 새 프로젝트를 만듭니다. 자동 샘플러 플레이트를 나타내는 새 마이크로티터 플레이트를 만듭니다. 마이크로티터 플레이트의 동일한 위치에 샘플을 자동 샘플러의 위치와 할당합니다.
  3. 각 샘플 처리 매개 변수를 할당합니다. 사용할 매개변수는 자동 크로마토그래피 피크 폭 및 MSTOF 해상도입니다. 저에너지 임계값, 100카운트; 상승 된 에너지 임계 값, 5 카운트; 강도 임계값, 500 카운트.
  4. 각 샘플 워크플로 매개 변수를 할당합니다. 사용할 매개 변수는 데이터베이스, 인간 SwissProt 및 HIV를 결합하고 역순으로 정렬합니다. 자동 펩티드 및 단편 내성; 펩티드당 최소 단편 이온 일치, 3; 단백질당 최소 단편 이온 일치, 7; 단백질당 최소 펩티드 성냥, 1; 1 차 다이제스트 시약, 트립신; 놓친 분열, 1; 고정 수식어 시약, 카르바미도메틸 C; 가변 수정제 시약, 산화 M; 거짓 발견 속도, 100.
  5. 샘플을 선택하고 최신 원시 데이터프로세스를 선택합니다. 검색이 완료되면 샘플을 선택하고 스캐폴드로 데이터 내보내기(버전 3)를 선택합니다. 스캐폴드를열고 새 파일을 만들고 프로테오믹스 플랫폼에서 내보낸 각 파일을 전구체 이온 정량을 사용하여 새 바이오 샘플로 가져옵니다.
  6. 모든 파일을 가져온 경우 데이터 로드 및 분석 화면으로 이동합니다. LFDR 점수 매기기 및 표준 실험 전체 단백질 그룹화를 사용하여 검색 및 가져오기 데이터에 사용되는 것과 동일한 데이터베이스를 선택합니다. 단백질 식별 확률,단백질 임계값을 20%로, 최소 펩티드 수를 1로 설정하고, 분석 동안 펩티드 임계값을 0%로 설정합니다.

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Representative Results

Rev-NoLS 단일 및 다중 점 아르기닌 돌연변이, 다양한 세포 국소화 패턴에 대응하는, WT Rev. Rev-3'flag 및 pcDNA-flag에 비해 세포 숙주 인자와 상호 작용하는 능력에서 조사되었다. 벡터는 HLfB 배양체로 발현되었다. 단백질 복합체는 총 세포 포해액에서 처리하고 은 얼룩 시약으로 염색되었습니다. Rev-NoLS-3'flag는 1에서 NaCl(137 mM, 200 mM, 및 300 mM)의 다양한 농도를 포함하는 3가지 상이한 용해 완충 조건에서 검출가능(약 18 kDa)이다. B23은 낮은 염농도(137 mM, 레인 2-4)를 함유하는 라시스 버퍼에서 검출가능(37 kDa), 200 mM NaCl을 함유하는 라시스 버퍼에서 간신히 검출가능하고, 높은 염농도(300 mM NaCl)를 함유하는 라시스 버퍼에서 검출할 수 없었다. 2에서, WT Rev-3'flag, Rev-NoLS M1-3'flag, 및 pcDNA-플래그벡터를 HLfB 배양물에서 발현하였다. 단백질 복합체는 2개의 라시스 완충조건(137 mM 및 200 mM NaCl)으로부터 제조된 총 세포 매해로부터 처리되었다. M2 마우스 단클론 IgG 1은 세포 용해로부터 Rev-3'flag 발현의 검출에 사용되었다. B23 검출은 WT Rev-3'flag(입력 및 α-플래그-Rev IP)를 갖춘 137 mM NaCl을 포함하는 용해 버퍼에서 최적이었지만 Rev-NoLS M1-3'flag와의 친화성을 잃었다. WT Rev-3'flag와의 B23 친화성은 200 mM NaCl을 함유하는 용해 완충액에서 더 높은 염 농도로 감소하였다. pcDNA 음성 대조군은 모든 용해 완충조건의 입력 및 α-플래그-Rev IP에서 비특이적 면역검출을 생성하지 않았다.

용출 조건은 그림3에서 Rev-NoLS-3'flag IP에 최적화되었습니다. WT Rev-3'flag및 p cDNA-플래그 벡터는 HLfB 배양물에서 발현되었다. 단백질 복합체는 총 세포 용해물에서 처리되고 3개의 다른 조건을 사용하여 경혈 배경(25 및 50 kDa)을 박멸하기 위해 용출되었습니다 - 37°C에서 37°C에서 2x 샘플 로딩 버퍼, 95°C에서 2x 시료 로딩 버퍼 3분, 3x 플래그 펩티드 e에서 4°C에서 30분 동안 Rev NoLS-3'flag (~18 kDa)는 2x 샘플 로딩 버퍼에서 끓여서 용출 후 가장 검출가능하였다. B23(~37 kDa)는 2x 시료 로딩 버퍼에서 37°C 인큐베이션을 15분 동안, 2x 시료 로딩 버퍼에서 95°C 인큐베이션을 3분 동안 37°C 인큐베이션하였다.

M2 (국소화핵/핵,HIV-1HXB2 생산에서 비기능성), M6(패턴의 뉴클레올라, HIV-1HXB2 생산에서 기능성), M9(세포질/핵에 분산, 바이러스 생산에서 비기능성) HLfB 문화로 표현됩니다. 단백질 복합체는 총 세포 용해물로부터 처리되었고, 2x 샘플 로딩 버퍼에서 95°C 배양을 통해 3분 동안용출하고, 은 얼룩 시약으로 해결하였다(도 4). WT 레브는 IP 플래그 반응 후에 검출되었다. Rev-NoLS M2, M6 및 M9도 18kDa에서 검출가능했다. B23 단백질에 상응하는 밴드는 37 kDa 마커에서 관찰되었다. 단백질 복합체는 WT Rev, M2, M6, M9 및p cDNA 음성 배경 대조군의 IP 반응에 상응하는 각 레인에서 더 관찰되었다. 단백질 용해액은 α-플래그-레브 및 B23에 대한 면역 검출에 의해 분석되었다. 풍부한 WT Rev 및 중간 수준의 M6를 발현(α-플래그 입력) 플래그 IP 후 검출가능(α-플래그-Rev IP, 5). M2 및 M9는 단백질 용해액 20 μg에서 고도로 발현되지 않았지만 5 mg의 단백질 용해에서 플래그 IP 후 낮은 강도에서 검출가능하였다. pcDNA 음성 대조군입력 및 α-플래그-Rev IP에서 비특이적 면역 검출을 생성하지 않았다. WT 레브와의 B23 친화성은 IP 플래그 반응(B23 co-IP) 후에 관찰되었다. B23 친화도는 M2(2개의 단점 돌연변이 R48,50G) 및 M6(단점 돌연변이 R50G)로 약간 관찰되었다. B23 친화성은 Rev-NoLS 내에서 M9(R46,48,50G)의 3개의 단일 점 돌연변이의 존재에서 손실되었다.

면역 침전된 WT Rev 및 Rev-NoLS-3'flag 돌연변이(4, 5, 6 및 8)로부터의 총 용해액을 처리, 쿠마시 시약으로 염색하고, BSA 직렬 희석물(오른쪽 패널)과 비교하여 시각화하였다. Rev-NoLS-3'flag는 18 kDa에서 돌연변이의 존재 및 부재에서 검출(12.5-25μg)된다(도 6). WT Rev-3'flag의 IP 반응으로부터 처리된 단백질 복합체, 뉴클레오라-국소화 레브-NoLS-3'flag 돌연변이(M4, M5 및 M6) 및 음성 대조군 p cDNA-플래그는 쿠마시 시약으로 염색된 SDS-PAGE 겔에서 가시화되었다(그림7). WT 레브(WT1 및 WT2)는 18 kDa에서 IP 플래그 반응 후 검출가능하였다. Rev-NoLS 돌연변이는 HLfB 및 IP 플래그 반응에서 발현 후 약간 검출가능하였다. pcDNA 음성 대조군은 18 kDa에서 비특이적 배경을 산출하지 않았다.

WT Rev-3'flag, M2, M6, M9 및 음극 대조군 p cDNA-플래그로부터 제조된 면역침전성 용해물(도 4에나타남)을 탠덤 질량 분석법으로 분석하였다. 단백질 식별 확률(백분율)은 WT Rev 대 각 뉴클레올라-국소화 Rev-NoLS 돌연변이와발생하는 단백질 상호작용의 비교를 위해 표시된다(표 1). 세포 단백질, 일부는 국소화 패턴 (리보솜 이소폼, 진핵 번역 개시 인자 48, snoRNA C/D 상자 58B 및 뉴클레오포스민 B23)에서 핵소문자인, WT Rev. 이러한 뉴클레오라의 직접/간접 결합 파트너로 확인되었다. 요인은 M2 (2 개의 단점 돌연변이 R48,50G), M6 (단점 돌연변이 R50G), 및 M9 (3 개의 단점 돌연변이 R46,48,50G)에 대한 결합 친화도를 잃었으며,cDNA 음성 대조군과 유사합니다. 6에서 쿠마시스테인드 겔의 각 레인을 탠덤 질량 분석법으로 처리하였다(표 2). 펩티드 친화성을 Rev-NoLS 돌연변이에 분석하고 단백질 식별 확률(백분율)을 사용하여 표시하였다. 국소화 패턴(뉴클레오린 C23, 뉴클레포포스민 B23 및 뉴클레오좀 어셈블리 단백질)에서 뉴클레올러인 다양한 세포 단백질이 WT Rev. 이러한 핵결자 인자의 직접/간접 단백질 결합 인자로 확인되었습니다. M4, M5 및 M6와 결합하도록 식별됩니다. 수송 인자 ARHGEF1(로구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 1) 및 TBC1D24(TCB1 도메인 패밀리, 부재 24)는 Rev-NoLS 돌연변이의 존재 에서 친화성으로 손실되었다. 접합 인자 hnRNPC (이종 리보핵 단백질 C) 및 PNN (피닌, 데스모솜 관련 단백질)은 Rev 단일 점 핵균 돌연변이와의 상호 작용을 잃은 WT Rev에 결합하기 위해 추가로 관찰되었다.

Figure 1
그림 1 : HIV-1 생산 중 Rev-3'flag 공동 IP에 대한 세포 용해 조건 최적화. WT Rev-NoLS-3'flag 및음극 대조군 p cDNA-플래그 IP 조건은 용해 완충액에서 3가지 NaCl 농도(137 mM, 200 mM, 및 300 mM)에서 최적화되었다. 은 염색을 통해 관찰된 바와 같이, 137 mM NaCl은 레브 면역침전 및 B23 결합에 대한 최적의 염 농도였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2 : HIV-1 생산 중 Rev-3'flag 공동 IP 및 B23 면역 검출을 위한 용해 조건 최적화. WT Rev-NoLS-3'flag, M1-3'flag 및음극 대조군 p cDNA-플래그 IP 조건은 용해 완충액에서 두 가지 NaCl 농도(137 mM 및 200 mM)에서 최적화되었다. 면역 검출을 통해 관찰된 바와 같이, 137 mM NaCl은 레브 면역 침전 및 B23 결합에 대한 최적의 염 농도였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3 : HIV-1 생산 중 Rev-3'flag 공동 IP 용출 최적화, 실버 염색으로 시각화. 단백질 복합체는 WT Rev-3'flag 및 p cDNA-플래그IP 동안 제조된 총 세포 용해물로부터 처리되었다. 3개의 상이한 용출 조건을 시험하였다- 37°C에서 15분 동안 2x 샘플 로딩 버퍼, 95°C에서 의 2x 시료 로딩 버퍼 3분, 30분 동안 4°C에서 3x 기펩티드. WT Rev의 최적 용출 조건은 37°C에서 2x 시료 로딩 버퍼에서 15분 인큐베이션 기간 후 및 95°C에서 2x 시료 로딩 버퍼에서 3분 인큐베이션 기간 후에 발생하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4 : HIV-1 생산 중 Rev-3'flag 돌연변이 2, 6 및 9의 면역 침전. WT Rev, M2 (R48,50G), M6 (R50G), M9 (R46,48,50G) 및 음성 대조군 pcDNA-플래그와 직간접적으로 결합된 단백질 복합체는 은색 염색 된 SDS-PAGE 젤에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5 : HIV-1 생산 동안 B23 면역 검출에 대한 돌연변이 2, 6 및 9의 Rev-3'flag 공동 IP. 4에서 WT Rev, M2, M6, M9 및 음성 대조군 p cDNA-플래그로부터 제조된 단백질 용해 및 IP 반응을 α-플래그-Rev 및 B23에 대한 면역 검출에 의해 추가로 분석하였다. WT 레브 및 돌연변이 발현은 B23 뉴클레오세포 단백질과의 상호작용뿐만 아니라 관찰된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6 : 플래그 IP 반응 후 Rev-NoLS 돌연변이 4, 5, 6 및 8의 정량화 . WT Rev 및 뉴클레올라 국소화 M4(R46G), M5(R48G), M6(R50G), M8(ΔRQ) 및 음성대조군 p cDNA-플래그를 발현하는 HLfB로부터의 IP 반응을 BSA 직렬 희석을 사용하여 단백질 농도를 측정했다. 각 시료에 대해 12.5-25 μg의 단백질 농도를 관찰하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
그림 7 : HIV-1 생산 중 핵세포-국소화 레브-NoLS 돌연변이 4, 5 및 6의 면역 침전. WT 레브(1 및 2), M4, M5 및 M6의 면역침전성 단백질 복합체를 함유하는 쿠마시 스테인드 SDS-PAGE 겔이 도시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

확인된 단백질 분자량 WT 레브 M2 M6 M9
신호 인식 입자 14kDa (상동성 Alu RNA 결합 단백질) 15 kDa 95% 0 0 0
리보소말 단백질 S3A 30 kDa 95% 0 0 0
진핵 번역 개시 인자 4B 69 kDa 95% 0 0 0
리보소말 단백질 L31 14 kDa 91% 0 0 0
리보소말 단백질 L12 18 kDa 93% 0 0 0
리보소말 단백질 L22 15 kDa 91% 0 0 0
작은 뉴클레올라 RNA, C/D 박스 58B 15 kDa 87% 0 0 0
아연 핑거, CCHC 도메인 포함 11 185 kDa 87% 0 0 0
액틴 결합 LIM 단백질 1 79 kDa 79% 0 0 0
리보소말 단백질 S13 17 kDa 78% 0 0 0
뉴클레오포스민 (뉴클레오라 인단백질 B23, 누마트린) 33 kDa 73% 0 0 0

표 1: HIV-1 생산 중에 WT Rev와 상호 작용하는 세포 숙주 인자의 식별. WT Rev, M2, M6 및 M9로부터 제조된 단백질 용루를 탠덤 질량 분석법으로 직접 분석하였다. WT Rev대 M2, M6 및 M9에 직간접적으로 결합되는 단백질 상호작용은 단백질 식별 확률(백분율)으로 요약됩니다.

확인된 단백질 분자량 M4 M5 M6 Wt pCDNA
폴리(A) 결합 단백질, 세포질 1 61 kDa 98% 0 100% 100% 0
열 충격 70kDa 단백질 1B 70 kDa 100% 100% 100% 100% 0
리보소말 단백질 L7 29 kDa 91% 0 100% 100% 0
히스톤 클러스터 1, H1e 22 kDa 0 0 100% 100% 0
리보소말 단백질 L4 48 kDa 95% 0 100% 100% 0
리보소말 단백질 L13 24 kDa 99% 0 100% 100% 0
보체 성분 1, q 하위 구성 요소 결합 단백질 31 kDa 100% 100% 100% 100% 0
Y 박스 결합 단백질 1 36 kDa 0 0 100% 100% 0
뉴클레오좀 조립 단백질 1-like 1 45 kDa 0 0 0 100% 0
리보소말 단백질 L8 28 kDa 89% 36% 100% 100% 0
리보소말 단백질 L18 22 kDa 27% 0 100% 100% 0
열 충격 70kDa 단백질 8 71 kDa 5% 99% 100% 100% 0
리보소말 단백질 L19 23 kDa 10% 0 81% 100% 0
리보소말 단백질 L27 16 kDa 92% 0 100% 100% 0
리보소말 단백질 L7a 30 kDa 0 0 100% 100% 0
리보소말 단백질 L24 18 kDa 0 0 100% 99% 0
튜불린, 베타 클래스 I 50 kDa 92% 69% 100% 100% 0
리보소말 단백질 L6 33 kDa 0 0 100% 100% 0
열 충격 70kDa 단백질 9 (필멸자) 74 kDa 33% 99% 100% 100% 0
리보소말 단백질 S2 31 kDa 87% 0 100% 100% 0
카제인 키나아제 2, 알파 1 폴리펩타이드 45 kDa 0 0 50% 100% 0
리보소말 단백질 L14 23 kDa 0 0 81% 100% 0
리보소말 단백질, 대형, P0 34 kDa 0 0 100% 100% 0
히스톤 클러스터 1, H1b 23 kDa 0 0 73% 100% 0
열 충격 70kDa 단백질 5 (포도당 조절 단백질) 72 kDa 99% 0 100% 100% 0
리보소말 단백질 S4, X-링크 30 kDa 0 0 100% 100% 0
리보소말 단백질 S20 13 kDa 98% 94% 99% 99% 0
리보소말 단백질 L28 16 kDa 0 0 100% 99% 0
리보소말 단백질 S14 16 kDa 0 0 100% 100% 0
리보소말 단백질 S3A 30 kDa 0 0 100% 100% 0
리보소말 단백질 L21 19 kDa 0 0 100% 100% 0
아연 핑거 CCCH 형, 항 바이러스 1 101 kDa 0 0 97% 100% 0
히스톤 클러스터 1, H1c 21 kDa 0 0 0 98% 0
리보소말 단백질 L36 12 kDa 0 0 100% 100% 0
리보소말 단백질 S18 18 kDa 90% 0 100% 100% 0
자멸의 변조기 1 40 kDa 42% 88% 34% 0 0
리보소말 단백질 L17 21 kDa 0 0 100% 100% 0
리보소말 단백질 S26 13 kDa 91% 0 99% 98% 0
리보소말 단백질 L32 18 kDa 0 0 48% 100% 0
리보소말 단백질 L35 15 kDa 0 0 97% 100% 0
리보소말 단백질 L29 18 kDa 0 0 57% 94% 0
리보소말 단백질 S9 23 kDa 0 0 100% 100% 0
이질적인 핵 리보뉴클레오프로테인 H1 (H) 51 kDa 98% 0 100% 100% 0
리보소말 단백질 S8 22 kDa 0 0 78% 100% 0
리보소말 단백질 L10 25 kDa 0 0 100% 100% 0
리보소말 단백질 L23a 18 kDa 0 0 68% 100% 0
리보소말 단백질 S6 29 kDa 0 0 100% 100% 0
리보소말 단백질 L31 14 kDa 0 0 95% 100% 0
리보소말 단백질 S13 17 kDa 0 0 100% 99% 0
리보소말 단백질 L10a 25 kDa 45% 0 81% 100% 0
폴리 (A) 결합 단백질, 세포질 4 (유도성 형태) 70 kDa 0 0 100% 100% 0
1을 포함하는 막 emp24 단백질 수송 도메인 25 kDa 0 0 0 100% 0
EBNA1 결합 단백질 2 35 kDa 0 0 69% 100% 0
보존 된 나선 루프 나선 유비쿼터스 키나아제 85 kDa 74% 92% 65% 83% 0
리보소말 단백질 L12 18 kDa 0 0 57% 100% 0
리보소말 단백질 S24 15 kDa 0 0 100% 100% 0
콜드 쇼크 도메인 단백질 A 40 kDa 0 0 0 100% 0
리보소말 단백질 L27a 17 kDa 0 0 89% 99% 0
이질적인 핵 리보뉴클레오프로테인 F 46 kDa 0 0 99% 99% 0
리보소말 단백질 L11 20 kDa 0 0 99% 100% 0
리보소말 단백질 L26조 1 17 kDa 0 0 100% 100% 0
카제인 키나아제 2, 알파 프라임 폴리펩타이드 41 kDa 0 0 0 100% 0
튜불린, 알파 1a 50 kDa 33% 0 100% 0 0
리보소말 단백질 L3 46 kDa 0 0 86% 94% 0
미토콘드리아 리보소말 단백질 L15 33 kDa 0 0 100% 99% 0
뉴클레오린 77 kDa 0 0 25% 100% 0
미토콘드리아 리보소말 단백질 S21 11 kDa 0 0 93% 94% 0
KRR1, 소형 소단위(SSU) 공정성분, 호모로그(효모) 44 kDa 89% 0 76% 99% 0
미토콘드리아 리보소말 단백질 S7 28 kDa 0 0 0 100% 0
염화물 채널, 뉴클레오티드 민감성, 1A 22 kDa 0 0 97% 86% 0
사이클린 B3 158 kDa 0 0 67% 49% 0
구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질 유사 3 (뉴클레올라) 61 kDa 0 0 99% 98% 0
미토콘드리아 리보소말 단백질 S23 22 kDa 0 0 100% 50% 0
미토콘드리아 리보소말 단백질 S22 41 kDa 0 0 0 99% 0
뉴클레오포스민 (뉴클레오라 인단백질 B23, 누마트린) 33 kDa 0 0 52% 97% 0
리보소말 단백질 S19 16 kDa 0 0 0 99% 0
글리세랄데히드-3-인산염 탈수소효소 36 kDa 0 0 100% 0 0
히스톤 클러스터 1, H2bg 14 kDa 0 0 53% 72% 0
리보소말 단백질 S23 16 kDa 0 0 68% 0 0
로구아닌 뉴클레오티드 교환 인자 (GEF) 1 104 kDa 0 0 0 94% 0
사망 관련 단백질 3 46 kDa 0 0 87% 87% 0
미토콘드리아 리보소말 단백질 S6 14 kDa 0 0 52% 84% 0
리보소말 단백질 L39 6 kDa 0 0 0 87% 0
미토콘드리아 리보소말 단백질 S28 21 kDa 0 0 85% 99% 0
히스톤 클러스터 1, H4h 11 kDa 0 0 0 93% 0
미토콘드리아 리보소말 단백질 L43 23 kDa 0 0 0 97% 0
리보소말 단백질 S15 17 kDa 0 0 0 85% 0
리보소말 단백질 S12 15 kDa 0 0 68% 39% 0
리보소말 단백질 L35a 13 kDa 0 0 0 96% 0
미토콘드리아 리보소말 단백질 L38 45 kDa 0 0 42% 98% 0
미토콘드리아 리보소말 단백질 S14 15 kDa 0 0 45% 76% 0
포스포디에스테라제 5A, cGMP 별 95 kDa 14% 0 0 72% 0
리보소말 단백질 L15 24 kDa 0 0 0 56% 0
이기종 핵 리보뉴클레오프로테인 C (C1/C2) 22 kDa 0 0 0 100% 0
미토콘드리아 리보소말 단백질 S16 11 kDa 0 0 0 92% 0
리보소말 단백질 S15a 15 kDa 0 0 0 91% 0
뉴렉신 2 185 kDa 0 50% 0 0 0
자폐증 감수성 후보 2 139 kDa 0 0 46% 0 0
미토콘드리아 리보소말 단백질 L17 20 kDa 0 0 0 92% 0
스배선 계수 3a, 소단위 1, 120kDa 89 kDa 0 0 56% 89% 0
라 리보뉴클레오프로테인 도메인 패밀리, 회원 1 116 kDa 0 0 65% 66% 0
레프렌과 같은 2 62 kDa 0 0 0 68% 0
리보소말 단백질 L18a 21 kDa 0 0 0 86% 0
리보소말 단백질 L23 15 kDa 0 0 60% 47% 0
9를 포함하는 막 emp24 단백질 수송 도메인 27 kDa 0 0 0 78% 0
신호 인식 입자 72kDa 75 kDa 0 0 0 100% 0
렉틴, 갈락토사이드 바인딩, 용해성, 3 26 kDa 0 71% 28% 0 0
미토콘드리아 리보소말 단백질 L1 37 kDa 0 0 0 69% 0
H1 히스톤 패밀리, 멤버 X 22 kDa 0 0 0 96% 0
카제인 키나아제 2, 베타 폴리펩타이드 25 kDa 0 0 0 89% 0
솔루트 캐리어 패밀리 4, 중탄산나트륨 공동수송기, 멤버 7 118 kDa 82% 0 0 0 0
WD 반복 도메인 13 54 kDa 0 81% 0 0 0
전사 신장 계수 A (SII), 3 17 kDa 0 0 0 38% 0
리보소말 단백질 S16 16 kDa 0 0 75% 0 0
SP140 핵체 단백질 92 kDa 0 0 0 64% 0
오토페린 227 kDa 62% 0 0 0 0
골지 수송 1B 15 kDa 0 0 0 33% 0
미토콘드리아 리보소말 단백질 S34 26 kDa 0 0 0 33% 0
리보소말 단백질 L30 13 kDa 0 0 0 49% 0
액틴 결합 LIM 단백질 1 96 kDa 0 0 0 43% 0
구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질 유사 2 (뉴클레올라) 84 kDa 40% 0 0 0 0
고밀도 지단백 결합 단백질 141 kDa 0 0 34% 0 0
아데노신 데아미나제, RNA 특이적, B2 81 kDa 0 0 28% 0 0
시스타틴 E/M 17 kDa 0 27% 0 0 0
아연 핑거 단백질 786 80 kDa 0 0 23% 0 0
플렉스트린 상동성 도메인, 가족 B, 회원 1 145 kDa 0 0 0 95% 0
단백질 인산염 메틸레스테라아제 1 44 kDa 0 0 94% 0 0
야누스 키나아제 및 미세소관 상호 작용 단백질 2 95 kDa 0 0 0 94% 0
신호 인식 입자 68kDa 67 kDa 0 0 0 93% 0
TBC1 도메인 패밀리, 회원 24 63 kDa 0 0 0 89% 0
미토콘드리아 리보소말 단백질 L27 16 kDa 0 0 0 89% 0
미토콘드리아 리보소말 단백질 L2 24 kDa 0 0 0 88% 0
미토콘드리아 리보소말 단백질 S2 33 kDa 0 0 0 87% 0
펜타리코펩타이드 반복 도메인 3 79 kDa 0 0 0 84% 0
리보소말 단백질, 대형, P2 12 kDa 0 0 0 76% 0
IMP (이노신 5'-모노포스페이트) 탈수소효소 2 56 kDa 0 0 76% 0 0
튜불린, 베타 4B 클래스 IVb 50 kDa 0 0 76% 0 0
미토콘드리아 리보소말 단백질 L23 19 kDa 0 0 0 74% 0
미토콘드리아 리보소말 단백질 S31 45 kDa 0 0 0 74% 0
갈락토제-3-O-설포트랜스퍼라제 1 49 kDa 74% 0 0 0 0
변식 의 억제기 4-20 호모로그 1 (초파리) 99 kDa 0 72% 0 0 0
미토콘드리아 리보소말 단백질 S25 20 kDa 0 0 0 70% 0
리보소말 L1 도메인 1을 포함 55 kDa 0 0 0 70% 0
시퀀스 유사성 110, 멤버 D를 가진 가족 29 kDa 69% 0 0 0 0
리보소말 단백질 L36a조 12 kDa 0 0 0 66% 0
소뇌 4 전구체 22 kDa 0 0 0 64% 0
N-아세틸루코민-1-인산염 트랜스퍼라제, 알파 및 베타 소단위 144 kDa 64% 0 0 0 0
RAD51 호모로그 B (S. 세레비시아) 38 kDa 0 0 0 64% 0
전사 신장 조절기 1 124 kDa 63% 0 0 0 0
홈박스 A1 15 kDa 0 0 0 62% 0
인지질 전달 단백질 49 kDa 0 0 0 62% 0
로 GTPase 활성화 단백질 33 137 kDa 0 0 54% 0 0
미토콘드리아 리보소말 단백질 S18B 29 kDa 0 0 0 52% 0
산막 망막 아미노펩티다아제 2 106 kDa 51% 0 0 0 0
28를 포함하는 삼자 모티프 89 kDa 0 50% 0 0 0
미성숙한 결장 암성 전사록 1 24 kDa 0 0 0 50% 0
AT 리치 인터랙티브 도메인 1A(SWI와 유사) 242 kDa 0 0 49% 0 0
미토콘드리아 리보소말 단백질 S17 15 kDa 0 0 0 48% 0
피닌, 데스모솜 관련 단백질 82 kDa 0 0 0 48% 0
단백질 인산염, Mg2+/Mn2+ 의존성, 1G 59 kDa 0 0 0 45% 0
G 패치 도메인과 앤키린 반복 1 39 kDa 45% 0 0 0 0
미토콘드리아 리보소말 단백질 L3 39 kDa 0 0 0 44% 0
벤지미다졸스 3 호몰로그(효모)에 의한 무단 신진 37 kDa 0 44% 0 0 0
WD 및 테트라트리코피타이드 반복 1 76 kDa 0 0 0 44% 0
단백질 디설파이드 이솜라아제 가족 A, 멤버 2 58 kDa 0 0 0 42% 0
카즈린, 페리플라킨 상호 작용 단백질 86 kDa 0 41% 0 0 0
코일 코일 - 나선 코일 코일 - 코일 - 나선 도메인 포함 2 16 kDa 0 0 40% 0 0
열 충격 단백질 90kDa 알파 (cytosolic), 클래스 A 회원 1 85 kDa 0 0 40% 0 0
망막색소변성 증 GTPase 레귤레이터 83 kDa 0 0 40% 0 0
CTD (카르복시 말단 도메인, RNA 폴리머라제 II, 폴리펩타이드 A)
인산염, 소단위 1
104 kDa 0 39% 0 0 0
미토콘드리아 리보소말 단백질 L37 48 kDa 0 0 0 39% 0
C2CD2-유사 76 kDa 0 38% 0 0 0
DnaJ (Hsp40) 호모로그, 하위 패밀리 C, 멤버 6 106 kDa 0 0 38% 0 0
미토콘드리아 리보소말 단백질 L51 15 kDa 0 0 0 38% 0
비스틴 과 같은 50 kDa 0 0 0 38% 0
헌팅틴 관련 단백질 1 76 kDa 0 0 0 37% 0
아연 핑거 단백질 263 77 kDa 0 36% 0 0 0
세포 분열 주기 및 세포 자멸 조절기 1 133 kDa 0 0 34% 0 0
단백질 티로신 인산염, 비 수용체 유형 13
(APO-1/CD95(Fas)-관련 인산파타스)
256 kDa 0 0 34% 0 0
KRAB-A 도메인 2 56 kDa 0 0 0 31% 0
활성화 신호 cointegrator 1 복잡한 하위 단위 2 28 kDa 0 0 0 31% 0
중추 단백질 76kDa 74 kDa 0 30% 0 0 0
폴리머라제 (RNA) III (DNA 지시) 폴리 펩타이드 C (62kD) 61 kDa 0 0 0 30% 0
5-하이드록시트립타민(세로토닌) 수용체 6 47 kDa 0 0 0 29% 0
T 세포 수용체 알파 접합 56 2 kDa 0 26% 0 0 0
세포 분열에 있는 염색체의 이방향 감각 상실 1 같이 330 kDa 0 0 0 25% 0
Ras 연결 및 DIL 도메인 114 kDa 0 0 25% 0 0
WD 반복 도메인 66 130 kDa 0 0 0 24% 0
염색체 6 오픈 독서 프레임 25 13 kDa 0 0 22% 0 0
막 막 단백질 177 34 kDa 0 0 0 21% 0
신경 전구체 세포 표현, 발달 적으로 아래로 조절 4 같이 101 kDa 0 20% 0 0 0

표 2: HIV-1 생산 동안 뉴클레올라 국소화 레브 돌연변이 4, 5 및 6과 복합된 세포 숙주 인자의 식별. 6에서 쿠마시 스테인드 SDS-PAGE 겔을 탠덤 질량 분석용으로 처리시켰다. WT Rev 대 뉴클레올라 돌연변이M4, M5 및 M6의 단백질 상호작용 결과는 단백질 식별 확률(백분율)으로 요약된다.

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Discussion

HIV-1의 존재 에서 Rev-NoLS 돌연변이 및 WT Rev를 비교한 질량 분광 분석은 바이러스 복제 주기에서 관련시킨 뉴클레오요인을 이해하기 위하여 평가되었다. 이것은 바이러스성 감염에 필요한 핵성분을 확인할 것입니다. 뉴클레올러 B23은 Rev-NoLS에 대한 높은 친화력을 가지며, 레브-바운드 HIV mRNAs22의레브-NoLS 및 뉴클레오라국소화 및 뉴클레오세포국질 수송에서의 기능을 가지고 있다. 단일 또는 다중 아르기닌 치환을 포함하는 Rev-NoLS 돌연변이를 가진 B23의 친화성은, 바이러스성 생산 도중 Rev-3'flag의 면역 침전을 통해 평가되었습니다 (그림2; WT 및 돌연변이 M2, M6, 및 M9). 단일 점 Rev-NoLS 돌연변이 M4, M5 및 M6에 대한 B23 친화성은 HIV-1 복제의 존재 에서 이전에 조사되었다. 이전 연구에서, M4, M5 및 M6의 IP 용루는 Rev 및 B23 친화성1에대한 α-플래그에 특이적인 항체를 가진 서구 면역블롯팅을 실시하였다. Rev 단일 점 돌연변이의 백그라운드에서, B23 결합 친화도는 현저하게 감소되었다. B23은 HIV 복제 동안 WT Rev와 친화성을 유지했습니다. Rev-NoLS 내에서 유도된 단일 점 돌연변이는 HIV mRNA 결합 및 수송을 용이하게 하는 다른 세포 숙주 인자에 대한 결합 친화도를 감소시킬 것으로 예상되었다. 이 모델에서 Rev-NoLS 단일 및 다중 점 돌연변이는 핵소포스민 B23 친화성을 Rev에 폐지하고, 핵세포질 차단 및 HIV mRNA 수송의 중단을 나타낸다. 뉴클레올러 인자 (뉴클레오린 C23 및 뉴클레오솜 조립 단백질 1), 수송 인자 (ARHGEF1 및 TCB1D24), 및 접합 인자 (hnRNPC 및 PNN)가 레브 단백질 복합체와의 상호 작용을 통해 HIV-1 감염 주기에 관여할 가능성이 높습니다. 표 1 2는 다양한 다른 세포 인자, 모두 뉴클레오라 와 비핵포 패턴, 즉 Rev. 뉴클레올라 인자를 통해 HIV-1 복제 주기에 잠재적으로 관여하는- snoRNA C/D 박스 58, snoRNA에 연루된 것을 밝혀냅니다. 처리, 스노RNA 핵종으로의 수송, 및 리보소말 RNA의 2'-O-메틸화-HIV-1 복제 주기에서 이 단백질의 기능은 아직 밝혀지지 않은 것으로 확인되었다. HIV-1 전염주기에 있는 이 세포 요인의 특정 역할은 현재 조사되고 있습니다.

여기에 제시된 결과는 HIV-1 전염주기를 유지하는 바이러스성/호스트 뉴클레올라 요인의 확인을 위한 이 접근의 사용을 보여줍니다. 그밖 질병 모형에서 참가하는 바이러스성/호스트 핵종 요인은 이 접근을 사용하여 확인될 수 있었습니다. 1개의 핵소자 요인이 각종 질병 모형에 있는 다기능 역할을 관련시킬 수 있었다는 것을 더 확률이 높습니다. 예를 들어, B23은 다른 바이러스 성 감염 모델에서 뉴클레오라 바이러스 성 단백질, 바이러스 어셈블리, 캡슐화, 복제 및 대기 시간의 수송에 연루되어 있다. B23은 뉴클레오세포질 수송을 위한 세포 인자의 NoLS와의 상호작용을 특징으로 한다-p120 성장 인자(아미노산 40-57)23 및 C23 pre-rRNA 프로세서(아미노산 540-628)24. B23은 또한 인간 T 세포 림프성 바이러스(HTLV-1) 단백질 렉스(아미노산 1-22)25,HIV-1 Tat(아미노산 49-57)2,HIV-1 레브(아미노산 37-47)와 상호 작용하는 것으로 문서화된다. 일본 뇌염 바이러스 (JEV) 게놈은 아미노산 Gly42와 Pro43이 JEV 감염 도중 B23의 N 말단 지역과 상호 작용하는 뉴클레오라 국소화 핵심 단백질을 암호화하여 바이러스 코어 단백질/B23을 핵27. B형 간염 바이러스 (HBV)의 단 하나 좌초된 RNA 게놈은 핵코어 단백질을 부호 매는 이중 좌초DNA의 부분적으로 구성됩니다. HBV 코어 단백질은 뉴클레오누스28에서뉴클레오린 및 B23과 결합; B23은 핵심 단백질 N-말단 도메인과의 상호작용을 통해 HBV 어셈블리에서 입증되었다. 구체적으로, B23 아미노산 259-294는 바이러스 캡슐화(29)를 허용하도록 HBV 코어단백질의 N-말단 도메인에 결합한다. 음성 감각, 단일 가닥 RNA D 형 간염 바이러스 (HDV) 두 개의 이소 형태로 HDVAg 항원을 표현; RNA 복제에 있는 작은 이소포체 원조, 그리고 큰 이소포름은 바이러스성 집합을 용이하게 합니다. RNA 복제는 핵체 내에서 일어나고 HDVAg30,31와B23 상호 작용을 요구합니다. HDV 감염은 B23의 업레그레드를 일으키며, 이는 주로 작은 HDVAg 이소폼과 상호 작용하며 큰 HDVAg 이소폼과는 더 적게 상호작용합니다. 상호 작용은 B23이 결합하고 핵 축적을 달성하는 작은 HDVAg NLS 도메인을 통해 일어난다. B23에 대한 HDV 결합 부위의 삭제 시, RNA 복제가 손상되었다. HDVAg는 핵에서 B23 및 뉴클레오린과 동국화하는 것으로 나타났다. 뉴클레오닌은 억압자(32)로서 전사특성을 가지고 있는 것으로 밝혀졌으며, HDV 복제의 조절을 위한 구획으로서 핵을 밝혀내다. B23는 또한 카포시의 육종 관련 헤르페스 바이러스 (KSHV) 게놈의 대기 시간에 관여합니다. KSHV 잠재 단백질-v-사이클린-숙주 CDK6 키나아제, Thr199에서 인산화물 B23, 대기 시간 관련 핵 항원(33)과의 B23 상호작용을 용이하게 한다. 대기 시간 관련 핵 항원 바이러스 성 용리 복제를 방지 하기 위해 행동. B23의 고갈은 KSHV 대기 시간의 레귤레이터로 B23을 공개, KSHV 재활성화로 이어집니다. HIV-1 복제 주기에서의 B23 기능은 Tat 및 Rev의 뉴클레오세포질 수송 활성을 특징으로 하며, B23이 HIV 감염 동안 대기 시간을 유도할 수 있는지는 알 수 없다. Hiv-1의 복제, 캡슐화 및 조립에 B23의 참여는 현재 알려지지 않았습니다.

이 방법을 다른 질병 모델에 적응하려면 적절한 세포주에서 발현되는 단백질 결핍 전염성 백본의 생성을 위해 많은 노력과 시간이 필요할 것이다. 이 Rev 결핍 HIV-1HXB2 백본의 장점은 전체 바이러스 성 백본, 바이러스 성 전염성 요인 및 HIV-1 복제 주기에 관여하는 숙주 인자가있는 경우 Rev-NoLS 돌연변이를 검사 할 수있는 능력입니다. 그밖 연구 결과는 가득 차있는 HIV-1 전염하는 시스템의 부재에 있는 Rev 뉴클레올라 기능을 검토했습니다. 전염병 및 질병 경로의 철저한 특성화에는 질병 진행의 자연스러운 과정을 지원하는 대표적인 환경이 포함되어야 합니다. 분석의 2개의 다른 모형은 뉴클레올라 요인을 확인하는 기능에 있는 비교되었습니다. 1은 단백질 용리제의 직접 질량 분석 분석의 결과로 WT Rev에 결합된 상태를 유지한 요인을 나열합니다. 이 분석은 HIV-1 Rev. 이 직접적인 방법은 SDS-PAGE 겔 내에서 분리된 단백질의 추출 및 이러한 단백질의 질량 분석과 관련된 다른 공정과 비교되었다. 이 두 번째 방법은 Rev 단백질 복합체에 결합되어 있지만 1에서 이전에 확인된 다음과 같은 단백질이 결여된 다양한 알려진 잠재적 인자를 산출했습니다: 신호 인식 입자 14 kDa, 진핵 번역 개시 인자 4B, 리보좀 단백질 L22, 작은 뉴클레올라 RNA C/D 박스 58B, 및 11을 함유하는 아연 핑거 CCHC 도메인. 궁극적으로, 이 프로토콜에서 질량 분석 분석을 위해 선택된 우수한 방법은 SDS-PAGE 겔에서 펩티드의 추출을 포함했다. 첫 번째 직접 방법은 브로모페놀 블루없이 용루에 2x 샘플 버퍼를 포함; 2x 샘플 버퍼의 나머지 성분은 완전한 트립신 처리를 방해할 수 있으며 질량 분석 분석을 위해 불완전하게 처리된 펩티드를 산출할 수 있습니다. 두 번째 간접 방법은 SDS-PAGE의 잠재적인 오염 물질로부터 트립신 처리 펩티드를 정화할 수 있었다.

여기에 기술된 질량 분광기 준비 방법은 Rev. 모든 삭제 및 단일 지점 Rev-NoLS 돌연변이를 대상으로 하여 HIV-1 감염을 근절하기 위한 치료 적 개입의 식별을 위해 사용될 수 있었다. 지배적 인 부정적인 활동과 레브 기능의 체포에 활용. Rev 기능 적 체포에 대한 관심의 지배적 인 부정적인 특성은 다음과 같습니다 : Rev / RRE 바인딩 선호도; 레브 돌연변이체와 다중화를 통해 핵균 WT 레브의 재국화; HIV-1 mRNA 수송 및 접합에 관여하는 주요 세포 요인에 대한 친화성 손실. WT Rev를 통한 Rev-NoLS 돌연변이의 공동 발현을 포함하는 레브 다중화는 조사될 수 있었다. 이 모형에 있는 지배적인 음성 돌연변이는 WT Rev로 multimerize및 핵과 세포질쪽으로 핵 패턴을 이동하기 위하여 예상됩니다, Rev 기능적인 체포로 이끌어 냅니다. 질량 분석법은 HIV-1 mRNA 접합 및 수송에 관여하는 중요한 세포 요인의 손실을 확인하기 위하여 이용될 수 있었습니다. 지배적 인 음성 Rev-NoLS 돌연변이와의 공동 발현의 결과로 WT Rev와의 누락 된 상호 작용의 확인은 HIV-1 병인에서 뉴클레오라 특이적 경로의 참여를 밝힐 것입니다. 대안적으로, Rev-NoLS 돌연변이의 배경에서 생성된 바이러스 성 HIV-1NL4-3 입자는 모든 포장된 세포 요인에 대해 조사될 수 있었다. 바이러스 입자 내에 포장된 세포 및 바이러스 인자는 질량 분석법을 통해 추가로 식별될 수 있다. 이것은 바이러스성 입자 내의 핵형성 요인의 존재 및 바이러스성 감염에 있는 확인된 핵소자 요인의 역할을 밝힐 것입니다. 기재된 방법은 연구되지 않은 경로의 식별 및 특성화를 위한 다른 바이러스 및 질병 모델에 적용 가능하다. 이것은 제한된 처리가 유효한 질병에 대하여 치료 내정간섭의 발달을 허용할 것입니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

저자는 국립 보건원 (NIH) 에이즈 연구 및 참조 시약 프로그램, 에이즈의 부서, 알레르기 및 전염성 의 국립 연구소에서 제공하는 HLfB 준수 문화에 대한 박사 바바라 K. 펠버와 박사 조지 N. 파블라키스를 인정 질병 (NIAID), NIH. 저자는 또한 NIH, 그랜트 AI042552 및 AI029329에서 제공하는 금융 소스를 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Fisher Chemical A38S-212
Acetonitrile Fisher Chemical A955-500
Acrylamide:Bisacrylamide BioRad 1610158
Ammonium bicarbonate Fisher Chemical A643-500
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich 7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gel Sigma-Aldrich A2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG Sigma-Aldrich F3165
BioMax MS film Carestream 8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL Bio-Rad 5000006
B23 mouse monoclonal IgG Santa Cruz Biotechnologies sc-47725
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carnation non-fat powdered milk Nestle N/A
Cell scraper ThermoFisher Scientific 179693PK
C18IonKey nanoTile column Waters 186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishes Fisher Scientific 08-772-22
Dithiothreitol Thermo Scientific J1539714
1 x DPBS Corning 21-030-CVRS
ECL Estern blotting substrate Pierce 32106
Ethanol, 200 proof Fisher Chemical A409-4
FBS Gibco 16000044
Formic Acid Fisher Chemical A117-50
GelCode blue stain reagent ThermoFisher 24590
Glycerol Fisher Chemical 56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz Biotechnologies sc-2005
Iodoacetamide ACROS Organics 122270050
KimWipe delicate task wiper Kimberly Clark Professional 34120
L-glutamine Gibco 25030081
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
NanoAcuity UPLC Waters N/A
Pierce Silver Stain Kit Thermo Scientific 24600df
15-mL Polypropylene conical tube Falcon 352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo Scientific 26616
Protease inhibitor cocktail Roche 4693132001
Purified BSA New England Biolabs B9001
PVDF  Western blotting membrane Roche 3010040001
Sodium Pyruvate Gibco 11360070
10 x TBS Fisher Bioreagents BP2471500
TEMED BioRad 1610880edu
Triton X-100 detergent solution BioRad 1610407
Trizaic source Waters N/A
trypsin-EDTA Corning 25-051-CIS
Tween 20 BioRad 1706531
Synapt G2 mass spectrometer Waters N/A
Whatman filter paper Tisch Scientific 10427813

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References

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