通过转版免疫沉淀和质谱测定,在HIV-1复制过程中核子因子的识别

Immunology and Infection

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Summary

在这里,我们描述了在质谱中存在HIV-1复制的Rev免疫沉淀。所述方法可用于识别艾滋病毒-1感染周期中涉及的核素因子,并适用于其他疾病模型,用于对研究不足的途径进行表征。

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Arizala, J. A., Chomchan, P., Li, H., Moore, R., Ge, H., Ouellet, D. L., Rossi, J. J. Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (148), e59329, doi:10.3791/59329 (2019).

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Abstract

HIV-1感染周期需要病毒蛋白与宿主因子相互作用,以促进病毒复制、包装和释放。感染周期进一步要求形成具有HIV-1 RNA的病毒/宿主蛋白复合物,以调节拼接和使核细胞质迁移。HIV-1 Rev蛋白通过具有非电子cis作用靶点-Rev响应元件(RRE)的多面化实现HIV-1 mRNA的核出口。富精素图案(ARM)的COOH-总站内存在核定位信号(NoLS),允许在核素中积累Rev/RRE复合物。除了调解与mRNA无关的核出口和拼接外,还推测核因子通过各种其他功能支持HIV-1的传染周期。在存在HIV-1复制的质谱中,我们描述了一种野生型(WT)Rev的免疫沉淀方法,与Rev核苷酸突变(删除和单点Rev-NoLS突变)相比。与核细胞质迁移相关的核核素因子(核细胞因子B23和核素C23)以及细胞拼接因子,在Rev-NoLS突变存在时失去与Rev的相互作用。各种其他核因子,如snoRNA C/D盒58,被识别失去与Rev突变的相互作用,但他们在HIV-1复制周期的功能仍然未知。这里介绍的结果表明,这种方法用于识别维持HIV-1感染周期的病毒/宿主核素因子。该方法中使用的概念适用于需要描述研究不足的通路的其他病毒和疾病模型。

Introduction

核细胞被假定为病毒复制所需的各种细胞宿主和病毒因子的相互作用场。核细胞是一个复杂的结构,分为三个不同的隔间:纤维室,密集的纤维室和粒状隔间。HIV-1 Rev 蛋白专门在粒状隔间内进行本地化;但是,此本地化模式的原因未知。在 NoLS 序列中存在单点突变(Rev 突变 4、5 和 6)的情况下,Rev 保持核苷酸模式,并且以前曾证明可以挽救 HIV-1HXB2复制,但与 WT Rev 1 相比,效率降低.所有单点突变都无法维持HIV-1NL4-3感染周期。在NoLS序列中存在多个单点突变(Rev-NoLS突变2和9)时,已观察到Rev分散在整个细胞核和细胞质,并且未能挽救HIV-1HXB2复制1。此蛋白质组学研究的目标是破译与 Rev 介导的 HIV-1 感染途径有关的核细胞因子和非核细胞因子。Rev 免疫沉淀条件通过与核蛋白 B23 磷蛋白的相互作用进行优化,该蛋白先前已被证明在存在核突变时与 Rev 失去交互作用。

过去,对细胞因子进行了广泛的研究;然而,这是在没有病毒发病机制的情况下完成的。在这项研究中,通过HIV-1复制过程中的Rev相互作用,一种蛋白质是核磷蛋白B23,也称为核对霉素(NPM)、核糖核酸或NO38(两栖动物2、3)、4.B23表示为三种同种体(NPM1、NPM2和NPM3)-核素/核质核伴生家族的所有成员5、6。NPM1分子伴菜功能在核小体的适当组装,在染色质高阶结构7,8参与的蛋白质/核酸复合物的形成,以及防止聚集和通过N端核心域(残留物1-120)错误折叠目标蛋白9。NPM1功能通过核细胞核和细胞质10、11、内转录间隔序列中前核糖体RNA的处理,扩展到核糖体成因12,13,并逮捕核蛋白聚合期间核细胞组装14,15。NPM1与抑制凋亡16和肿瘤抑制剂ARF 17、18和p5319致稳定有关,揭示了其作为致癌因子和肿瘤抑制器的双重作用。NPM1参与基因组稳定性、中位复制和转录的细胞活动。NPM1在细胞周期相间的核糖核酸中,在线虫期间沿染色体边缘,在线虫发生结束时在核细胞体(PNB)中发现。NPM2和NPM3的研究不如NPM1,在恶性肿瘤20期间,NPM1的表达水平发生了改变。

NPM1被记录在各种核/核细胞质穿梭中,通过内部NES和NLS9,21,并以前曾报告推动HIV-1 Tat和Rev蛋白的核进口。在B23结合域-β-乳酸酶融合蛋白的存在下,Tat在细胞质内错位,失去转活活性;这表明Tat对B232有很强的亲和力。另一项研究在缺乏含有RRE的mRNA的情况下建立了Rev/B23稳定复合物。在RRE mRNA的存在下,Rev与B23分离,优选与HIV RRE结合,导致B232的位移。在亚核水平上,Tat转能和B23HIV mRNA的转用交换过程在哪里发生,目前不得而知。两种蛋白质都假定通过B23相互作用同时进入核素。预期其他宿主细胞蛋白参与HIV核蛋白通路。本蛋白质组学调查中描述的方法将有助于阐明在HIV-1发病机制过程中涉及的核细胞因子与宿主细胞因子的相互作用。

蛋白质组学研究是通过表达Rev NoLS单点突变(M4、M5和M6)和HIV-1HXB2生产的多种精氨酸替代(M2和M9)开始的。在此模型中,一个HeLa细胞系可稳稳地表达Rev缺陷HIV-1HXB2(HLfB)转染WT Rev和Rev核糖核细胞突变,这些突变在3'末端含有标志标记。WT Rev 的存在将允许病毒复制发生在 HLfB 培养,与不挽救 Rev 缺乏 (M2 和 M9) 的 Rev-NoLS 突变相比,或允许病毒复制发生,但效率不如 WT Rev (M4、M5 和 M6)1。细胞莱沙在病毒增殖后48小时后在Rev表达的情况下被收集,并在免疫沉淀后使用针对Rev/B23相互作用优化的莱沙缓冲液进行免疫沉淀。介绍了使用不同盐浓度的莱沙缓冲液优化,并在银色或库马西染色SDS-PAGE凝胶中比较和分析HIV-1 Rev的蛋白质洗脱方法。第一种蛋白质组学方法涉及通过串联质谱直接分析来自表达的WT Rev、M2、M6和M9的洗脱样品。第二种方法将WT Rev、M4、M5和M6的改性与第一种方法进行比较。与WT Rev相比,对Rev-NoLS突变的肽亲和力进行了分析,并显示了蛋白质识别概率。这些方法揭示了在HIV-1复制期间参与HIV-1 mRNA传输和与Rev拼接的潜在因素(核核和非核苷酸)。总体而言,所述细胞溶解、IP和洗脱条件适用于感兴趣的病毒蛋白,用于了解激活和调节感染途径的宿主细胞因子。这也适用于研究各种疾病模型的持久性所需的细胞宿主因素。在此蛋白质组学模型中,HIV-1 Rev IP 针对 B23 相互作用进行了优化,以阐明与核细胞质穿梭活动和 HIV-1 mRNA 结合有关的核苷酸因子。此外,可以开发与HLfB细胞系类似的细胞系,以稳稳地表达缺乏关键蛋白质的传染病模型,以研究感兴趣的感染途径。

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Protocol

1. 细胞培养

  1. 在Dulbeco的改性Eagle介质(DMEM)中保持HLfB,辅以10%胎儿牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺和1mM丙酸钠,在组织培养处理的100毫米板中。在加湿的培养箱中保持细胞培养在37°C,提供5%CO2。通过汇入细胞密度为1 x 106细胞/mL。
  2. 丢弃细胞培养基。用 10 mL 的 1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 轻轻冲洗细胞。在不破坏细胞层的情况下取出并丢弃 1x PBS。
  3. 向细胞中加入2 mL的1x胰蛋白酶-EDTA溶液。将盘子摇动以覆盖单层,并在加湿室内37°C孵育5分钟。
  4. 用手掌用力敲打盘子的侧面,以分离细胞。在 8 mL 的新鲜培养培养剂中重新悬浮分离的细胞。以 400 x g旋转单元格 5 分钟。
  5. 在不破坏细胞颗粒的情况下丢弃培养基。在10 mL的新鲜培养基培养基中重新悬浮细胞颗粒。在组织培养处理的100毫米板内,用9 mL的新鲜培养培养剂对浓缩细胞进行1mL的亚培养。
    注:对于每个Rev-NoLS突变,3x 100 mm HLfB或HeLa培养板将产生足够的蛋白质莱沙,用于西部印斑分析和质谱。为 WT Rev 正控制和负控制添加额外的板。亚培养细胞体积需要使用不同的细胞类型进行优化。

2. HIV-1复制期间Rev-NoLS-3'标志突变的表达

  1. 将HLfB细胞培养培养增长到2 x 106细胞/mL的细胞密度。为每个100毫米板制备4mL的磷酸钙-DNA悬浮液,如下所示。
    1. 将两个 15 mL 管标记为 1 和 2。将 2 mL 的 2 x HBS(0.05 M HEPES、0.28 M NaCl 和 1.5 mM Na2HPO4 [pH 7.12]) 添加到管 1 中。将 TE 79/10(1 mM Tris-HCl 和 0.1 mM EDTA [pH 7.9])添加到管 2 中。TE 79/10 的体积为 1.760 mL - DNA 的体积。
    2. 加入20μg的质粒,含有Rev-NoLs-3'flag感兴趣的突变到管2,并通过重新悬浮混合其内容。将 240 μL 的 2 M CaCl2添加到管 2 中,并通过重新悬浮再次混合。
    3. 将管 2 的混合物转移到管 1 滴,轻轻混合。让悬浮液在室温下坐30分钟。涡流降水。
  2. 将 1 mL 的悬架滴落添加到每个 3 细胞培养基中,100 mm 板同时轻轻旋转介质。将板返回到培养箱,将转染混合物离开6小时。用10mL的新鲜培养培养剂替换转染混合物,孵育细胞42小时。

3. 病毒蛋白莱沙的收集

  1. 丢弃细胞介质 48 h 转染后。将每个 100 毫米板放在冰床上。为每个 Rev-NoLS 突变样本标注 15 mL 管,并将管放在冰上。
  2. 用 10 mL 的预冷 1x PBS 轻轻冲洗细胞,而不会破坏细胞层。丢弃 1x PBS。将3 mL的解毒缓冲液(50 mM Tris-HCl [pH 8.0]、137 mM NaCl 和 1% X-100 洗涤剂 [参见材料表])添加到每个 100 mm 的板中。
  3. 使用细胞刮刀破坏细胞层。倾斜板,轻轻刮擦,将细胞聚集到池中。使用 1,000 μL 微移液器收集细胞液化液,并将预标记的 15 mL 管中三个 100 mm 板中的每个细胞莱沙混合。
  4. 在冰上孵育细胞解毒15分钟,每5分钟涡旋一次。将细胞解毒在15,000 x g下,5分钟。
  5. 收集蛋白质上清液,而不会破坏细胞碎片颗粒并将其转移到另一个无菌的 15 mL 管中。使用布拉德福德方法获得病毒蛋白酸酶浓度(见第4节)。
  6. 保存输入样本(20 μg)的等分,用于西方免疫球形分析。将2倍样品缓冲液(20%甘油、0.02%溴酚蓝、125 mM Tris-Cl [pH 6.8]、5% SDS 和 10% 2-mercaptoto 乙醇)添加到最终体积中。在95°C下煮沸10分钟,并将输入样品储存在-20°C。

4. 布拉德福德测定

注:在生成蛋白质标准曲线之前,从 100x BSA 库存制备 10x 牛血清白蛋白 (BSA)。

  1. 将水加入微离心管,用于以下空白和标准:空白 = 800 μL;标准 1 = 2 毫克/升,798 μL;标准 2 = 4 毫克/升,796 μL;标准 3 = 6 毫克/升,794 μL;标准 4 = 8 毫克/升,792 μL;标准 5 = 10 mg/mL,790 μL. Aliquote 10x BSA 分为以下指定标准:标准 1 = 2 μL;标准 2 = 4 μL;标准 3 = 6 μL;标准 4 = 8 μL;标准 5 = 10 μL。
  2. 通过将 795 μL 的水与 5 μL 的蛋白质样品混合制备蛋白质样品。在每个空白、标准和蛋白质样品中加入 200 μL 的蛋白质测定染料试剂(参见材料表)。将样品短暂涡旋,用于均匀的混合物,并在室温(18-20°C)下孵育5分钟。
  3. 将空白、标准和蛋白质样品转移到比色皿中。测量 595 nm 的 OD 蛋白质浓度。

5. Rev-NoLS-3'标志的共免疫性

  1. 用500μL的解毒缓冲液冲洗25μL的M2亲和凝胶珠(见材料表),用蛋白酶抑制剂鸡尾酒处理。为每个突变样本和控制冲洗更多的亲和凝胶珠。
    注:为两种凝胶(50 μL)准备足够的M2亲和凝胶珠- 一个用于西方免疫蛋白分析,另一个用于蛋白质染色和质谱。
  2. 在 4°C 下以 820 x g旋转 2 分钟。拆下上清液。再冲洗 2 次。
  3. 将病毒蛋白酸酶(总体积的5 mL中的1mg/mL)加入预冲洗的M2亲和珠中。使用莱沙缓冲器调整总体积。
  4. 孵育反应3小时,在4°C下旋转。将 M2 亲和珠/病毒蛋白酸度在 820 x g下离心 1 分钟。
  5. 收集上清液并保存IP后样品(20μg)的等分,用于西方免疫球体分析。测量 IP 后莱沙酸的蛋白质浓度。收集20 μg进行西免疫印迹。
  6. 将 2 倍采样缓冲区添加到最终卷。在 95°C 下煮沸 10 分钟,并将 IP 后样品储存在 -20°C。
  7. 用750 μL的变热缓冲液冲洗M2珠,并在4°C下在旋转器上清洗珠子5分钟。以820 x g将M2珠离心机,并丢弃上清液。
  8. 在 4°C 的旋转器上重复步骤 5.7,再在旋转器上再进行两次,等待 5 分钟。第三次洗涤后,使用长凝胶加载尖端从 M2 珠子/共 IP 复合物中取出任何掉线缓冲液的痕迹。
    注:在去除任何微量的莱沙缓冲液之前,用平钳夹住凝胶加载尖端的末端。这将防止 M2 磁珠的中断和接收。
  9. 在 55 μL 的 2 倍加载缓冲液中重新悬浮 M2 珠子。将样品在95°C下煮10分钟。
  10. 将 25 μL 的渗出液放在两个单独的 SDS-PAGE 凝胶上(一种用于西方免疫镀乳的凝胶,另一种用于 Coomassie 染色)。

6. SDS-PAGE凝胶的制备

  1. 在 50 mL 管中混合以下试剂(最终体积为 40 mL,足够四种凝胶):4.16 mL 超纯水,15 mL 40% 丙烯酰胺:双环酰胺 (29:1),10 mL 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8),400 μL 10% SDS,400 μL 10% 过硫酸铵,40 μL 的 TEMED。
  2. 通过多次反转 50 mL 管混合解胶。将溶解凝胶混合物移入预先清洁的西方凝胶装置中(四个凝胶 - 三个用于西方免疫镀金,一个用于Coomassie/银染色)。
  3. 轻轻移液足够的水,以覆盖凝胶混合物的顶层。允许溶解凝胶聚合。
  4. 从溶解凝胶中倒入水层,使用精细的任务雨刷器(参见材料表)吸收任何多余的水。
  5. 将以下试剂混合在50 mL管中(最终体积为20 mL,足够四种凝胶):11.88 mL 超纯水,2.5 mL 40% 丙烯酰胺:双环酰胺(29:1),5.2 mL 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8),200 μL 10% SDS,200 μL 10% 过硫酸铵,20 μL 的 TEMED。
  6. 通过多次反转 50 mL 管来混合堆叠凝胶。将堆叠凝胶混合物移至设备顶部的溶解凝胶上方。
  7. 将含有适当数量的通道的凝胶盒式梳子放入堆叠凝胶中。使用精细的任务雨刷器吸收凝胶混合物的任何溢出物(参见材料表)。允许堆叠凝胶完全聚合。
  8. 用 1x 西式运行缓冲液(5x 浓度:250 mM Tris-Cl [pH 8.3]、1.92 M 甘氨酸、0.5% SDS 和 10 mM EDTA) 来淹没西方凝胶装置。
  9. 从堆叠凝胶中轻轻拉出凝胶盒式梳子。允许 1x 西运行缓冲区填充装井。在加载样品之前,使用注射器用1倍的西式运行缓冲液冲洗每个井。
  10. 将西药样品加载到每个相应的凝胶中(输入样品、共免疫沉淀样品和IP后样品)。加载西方凝胶蛋白标记物。
  11. 将Coomassie/银染色的共免疫沉淀样品装入另一个凝胶中。加载西方凝胶蛋白标记物。
  12. 将正在运行的凝胶装置连接到电源,以 100 V V 运行凝胶,直到加载染料到达溶解凝胶。将电压增加到 140 V,直到加载染料到达溶解凝胶的底部。

7. 西印移

  1. 拆解西式凝胶装置。切片并丢弃堆叠凝胶,使溶解凝胶完好无损。
  2. 轻轻地将溶解凝胶转移到一个干净的托盘,里面装满了西洋转移缓冲液(25 mM Tris,194 mM 甘氨酸,0.005% SDS,20% 甲醇),浸泡15分钟。
  3. 组装凝胶转移装置,如下所示。
    1. 将三个 PVDF 转移膜和六块滤纸(参见材料表)切成溶解凝胶的大小。
    2. 将PVDF膜浸泡在甲醇中5分钟,将其水合5分钟,将PVDF膜置于西移缓冲液中,直到随时使用。
    3. 将凝胶盒放入玻璃烤盘中,部分装有西端转移缓冲器,底部为黑色一侧。
    4. 将用西移缓冲液浸泡在凝胶盒的黑色一侧。
    5. 在西侧转移缓冲器中湿一片滤纸,并将其放在泡沫垫的顶部。将溶解凝胶放在滤纸顶部。
      注:将溶解凝胶置于正确的加载方向,以转移到PVDF膜上。
    6. 将一个PVDF转移膜放在溶解凝胶的顶部。用西端转移缓冲液润湿一片滤纸,并将其放在PVDF转移膜的顶部。
    7. 将另一个浸有西移缓冲液的泡沫垫放在滤纸顶部。小心地将凝胶支架盒的白色侧折叠在浸泡的泡沫垫顶部。把盒紧锁好。
    8. 将凝胶盒放入传输装置电极组件中。对剩余的每个溶解凝胶重复步骤 7.3.4-7.3.8。
    9. 用西移缓冲器填充传输装置罐。将搅拌杆放入设备罐中。
    10. 将设备罐放在搅拌板的顶部。将搅拌设置调整到 5-6,确保搅拌棒没有卡住或击中凝胶支架盒。
    11. 将凝胶传输装置连接到电源,并在 4°C 下以 100 V 传输凝胶 1 小时。

8. 免疫免疫

  1. 取出凝胶盒盒,将黑色一侧放在干净的玻璃烘烤盘上。打开盒式磁带并小心地丢弃泡沫垫和滤纸。标记 PVDF 膜的一角,以确定正确的加载方向。保持膜湿润。
    注:PVDF膜可以风干并储存在干净、密封的容器中。通过重复步骤 7.3.2 对膜进行补水。
  2. 将膜放入100 mL的阻隔溶液中(5%牛奶、1x TBS 和 0.1% 补间 20)。在室温(18-20°C)下轻轻摇动1小时,将膜堵塞。
  3. 切过25 kDa蛋白质标记物上方的膜。将含有大于25 kDa的蛋白质带的膜顶部部分放入含有B23小鼠单克隆IgG 1(1:500稀释)的阻断溶液中。挡过夜,在4°C下摇动。
  4. 将膜的底部,含有小于25 kDa的蛋白质带,在阻断溶液中含有M2小鼠单克隆IgG 1(1:1,000稀释,见材料表)。挡过夜,在4°C下摇动。
  5. 在摇动平台上用25 mL的西洗溶液(1x TBS,0.1%补间20)将膜洗涤10分钟。
  6. 在气温下在阻隔溶液中孵育山羊抗小鼠IgG 1-HRP(1:5,000稀释)的膜。在摇动平台上用25 mL的西洗溶液将膜洗涤3倍10分钟。
  7. 制备化学发光西印基板。使用 p1000 微移液器将基板添加到膜中。
  8. 在化学发光西印基板中开发每个膜 5 分钟,从基板中取出膜。使用精细的任务刮水器吸收多余的基板(参见材料表)。
  9. 将膜放入贴在盒内的清洁板保护器中。将盒式磁带放入暗室,将一张胶片放入盒式磁带中。将盒卡锁定到位并孵育 5-15 分钟。将胶片从盒中取出并展开。

9. 库马西染色

  1. 拆解西式凝胶装置。切片并丢弃堆叠凝胶,使溶解凝胶完好无损。轻轻地将溶解凝胶转移到一个装满25 mL超纯水的清洁托盘中。
  2. 在摇动平台上孵育凝胶15分钟。使用柔和的摇动,防止溶解凝胶破裂。丢弃超纯水,再重复洗涤步骤 2 倍。
    注:如果SDS气泡在洗涤步骤后仍然存在,凝胶可以在超纯水中过夜。残留 SDS 可导致凝胶的背景染色。
  3. 通过反转瓶子混合库马西染色试剂(参见材料表)。将100 mL的Coomassie染色试剂放入溶解凝胶中,在摇动平台上孵育凝胶1小时。丢弃Coomassie染色试剂,在摇台上将凝胶浸在去离子水中15分钟。
  4. 丢弃去离子水。再重复洗涤步骤 2 次。继续清洗凝胶,直到观察到蛋白质带的所需分辨率。

10. 银染色

  1. 拆解西式凝胶装置。切片并丢弃堆叠凝胶,使溶解凝胶完好无损。轻轻地将溶解凝胶转移到一个装满25 mL超纯水的清洁托盘中。
  2. 在摇动平台上孵育凝胶15分钟。使用柔和的摇动,防止溶解凝胶破裂。丢弃超纯水,再重复洗涤步骤 2 倍。
    注:如果SDS气泡在洗涤步骤后仍然存在,凝胶可以在超纯水中过夜。残留 SDS 可导致凝胶的背景染色。
  3. 在室温下将凝胶固定在30%乙醇:10%醋酸溶液(6:3:1水:乙醇:醋酸)中过夜。在室温下将凝胶在10%乙醇溶液中清洗5分钟。更换乙醇溶液,再清洗5分钟。
  4. 将一部分银染色敏化剂与 500 部分超纯水(50 μL 的敏化剂与 25 mL 的超纯水)混合,从 Pierce 银染色套件制备敏化剂工作溶液。在敏化剂工作溶液中孵育溶解凝胶1分钟,在超纯水中清洗凝胶1分钟,更换水,再次清洗凝胶1分钟。
  5. 通过将单部分银染色增强剂与 50 件银污渍混合(500 μL 增强剂和 25 mL 的银污渍)制备染色工作溶液。在染色液中孵育凝胶30分钟。
  6. 通过将 1 部分银染色增强剂与 50 件银污剂(500 μL 的增强剂和 25 mL 的显影剂)混合,为开发人员准备工作解决方案。准备5%醋酸溶液作为停止溶液。用超纯水清洗凝胶1分钟,更换水,再清洗凝胶1分钟。
  7. 用显影剂工作溶液更换水并孵育,直到所需的蛋白质带强度解决(5 分钟)。将开发人员工作解决方案替换为停止解决方案,孵育 10 分钟。

11. 凝血凝胶减少、烷基化和消化库马西染色凝胶带

  1. 使用干净的剃刀刀片从凝胶中切割凝胶带。将每个凝胶带切成大约 5 mm 的立方体,并将其放入干净的 0.5 mL 微离心管中。
  2. 将凝胶片覆盖在1:1醋酸铵中,在室温下浇水15分钟。丢弃上清液。重复此步骤。
  3. 在真空离心机中干燥凝胶片 5 分钟。在100 mM碳酸氢铵中覆盖10mM二硫二硫酮醇的干燥凝胶片,并在56°C下孵育1小时,从而减少蛋白质。
  4. 移掉任何上清液。将蛋白质用100 mM碘乙酰胺覆盖在水中的凝胶片中,在黑暗中室温下孵育1小时,从而将蛋白质分化。
  5. 移掉上清液,缩小凝胶片,用醋酸酯覆盖,在室温下轻轻摇动15分钟。 移液器关闭上清液,用100 mM碳酸氢铵覆盖并摇动凝胶片。在室温下轻轻15分钟。
  6. 重复步骤 11.5。在真空离心机中干燥凝胶片 5 分钟。
  7. 用50纳克/μL测序级改性胰蛋白酶(见材料表)在100 mM碳酸氢铵中覆盖凝胶片。让凝胶膨胀5分钟;然后,移液掉掉任何剩余的溶液。用100 mM碳酸氢铵覆盖凝胶片,使其完全重新膨胀,增加额外的100 mM碳酸氢铵,使凝胶片完全覆盖。
  8. 在37°C下孵育凝胶片过夜。在水中加入10%的甲酸体积的1/10,停止反应。从每个管子收集上清液。
  9. 将凝胶片用1%的甲酸覆盖在60%的醋酸中,用轻轻的摇动孵育15分钟。
  10. 在真空离心机中,将组合的超生物体积减小到 20 μL 以下,同时注意避免完全干燥上生子。加入1%的甲酸,使总体积回到20μL。

12. 液相色谱/质谱法

注:使用配备超HPLC、纳米喷雾源和柱的质谱仪对样品进行分析(见材料表)。溶剂A和B分别在水中和乙酰乙酸中为0.1%。

  1. 将消化的蛋白质加载到高回收聚丙烯自动进样小瓶中。将小瓶加载到 UPLC 系统的样品管理器中。
  2. 为每个样品注入 6 μL。使用 99% 溶剂 A/1% 溶剂 B,以 8 μL/min 将每个样品加载到纳米的陷印柱上 1.5 分钟。
  3. 在30分钟内将肽引入质谱仪,其线性梯度从溶剂B的3%到35%,随后在4分钟内将溶剂B的35%至50%梯度,在1分钟内将溶剂B的50%至90%梯度,保持90%的醋酸酯3分钟;然后在 5 分钟内将 %B 降低到 3%。
  4. 以分辨率(20,000 分辨率)模式获取正子轮廓质量规格数据。以每 0.6 s 一次扫描的速度获取 100 到 2,000 Da 的数据。 通过交替扫描,不发生碰撞能量,以提升碰撞能量进行扫描,从而在 MSE模式下获取数据。
  5. 对于升高的碰撞能量,将陷阱单元中的碰撞能量从 15 V 提升到 40 V。使用溶剂 A 的空白注入获取数据文件,使用每对样品之间的相同采集方法来控制结转。

13. 质谱数据分析

  1. 将质谱结果文件复制到运行定量和定性蛋白质组学研究平台的计算机(例如,蛋白质Lynx全球服务器)。数据分析占用大量 CPU,应在单独的高性能数据分析计算机上执行。
  2. 为数据创建新项目。创建一个表示自动进样板的新微点子板。将样品分配到微点子板中与自动进样器中的位置相同的位置。
  3. 分配每个样品处理参数。使用的参数是自动色谱峰宽度和MSTOF分辨率;低能量阈值,100计数;高能量阈值,5 计数;强度阈值,500 计数。
  4. 分配每个示例工作流参数。使用的参数是数据库,连接人类瑞士Prot和HIV,具有相反的序列;自动肽和片段容从;最小片段子子匹配每肽,3;最小片段子子匹配每蛋白质,7;每蛋白质的最小肽匹配,1;初级消化试剂,胰蛋白酶;错过的裂解,1;固定改性试剂,碳水化合物甲基C;可变改性剂试剂,氧化M;错误发现率,100。
  5. 选择示例并选择"处理最新原始数据"。搜索完成后,选择示例并选择"将数据导出到支架(版本 3)。打开支架,创建一个新文件,并使用前体ion定量将从蛋白质组学平台导出的每个文件作为新的生物样本导入。
  6. 导入所有文件后,继续"加载和分析数据"屏幕。使用 LFDR 评分和标准实验范围的蛋白质分组选择用于搜索和导入数据的相同数据库。将显示选项设置为蛋白质识别概率,将蛋白质阈值设置为 20%,将最小肽数设置为 1,在分析过程中将肽阈值设置为 0%。

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Representative Results

与WT Rev.WT Rev-3'标志和pcDNA-标志相比,Rev-NoLS单点和多点精氨酸突变与各种亚细胞定位模式相对应,在与细胞宿主因子相互作用的能力方面进行了检查在HLfB文化中表达向量。蛋白质复合物从总细胞赖沙处理,并沾染银染色试剂。Rev-NoLS-3'标志在三种不同的液化缓冲条件下可检测到(约18 kDa),其中含有图1中不同浓度的NaCl(137 mM、200 mM和300 mM)。B23在含低盐浓度(137 mM,通道2⁄4)的莱沙缓冲液中可检测到(37 kDa),在含有200 mM NaCl的解液缓冲液中几乎无法检测到,在含有高盐浓度(300 mM NaCl)的解液缓冲液中检测不到。在图2中,WT Rev-3'标志、Rev-NoLS M1-3'标志和pcDNA标志向量在HLfB文化中表示。蛋白质复合物是从两个莱沙缓冲条件(137 mM 和 200 mM NaCl)制备的总细胞内结物中加工的。M2小鼠单克隆IgG1用于检测来自细胞泄漏物的Rev-3'标志表达。B23 检测在含有 137 mM NaCl 的莱沙缓冲液中是最佳的,具有 WT Rev-3'标志(输入和 + 标志-Rev IP),但与 Rev-NoLS M1-3'标志失去亲和力。B23 与 WT Rev-3'flag 的亲和力降低,在含有 200 mM NaCl 的莱沙缓冲液中盐浓度较高。pcDNA阴性对照未产生输入中的非特异性免疫检测和所有莱沙缓冲条件α-标志-Rev IP。

在图 3中,针对 Rev-NoLS-3'标志 IP 优化了洗脱条件。WT Rev-3'标志和 pcDNA标志矢量在 HLfB 文化中表示。蛋白质复合物从总细胞解液中处理,并使用三种不同的条件洗脱,以消除轻和重链背景(25和50 kDa) - 在37°C下2倍样品加载缓冲液15分钟,在95°C下2x样品加载缓冲液3分钟,3x标志肽e 在4°C下30分钟。 Rev NoLS-3'标志(±18 kDa)在2倍样品加载缓冲液中通过沸腾洗脱后最可检测到。B23(+37 kDa)在两种条件下被检测 - 37 °C在2x样品加载缓冲液中孵育15分钟,95°C孵育在2x样品加载缓冲液中孵育3分钟。

M2(定位中的核/核,艾滋病毒-1HXB2生产中的非功能性),M6(形态中的核,HIV-1HXB2生产的功能),和M9(分散在细胞质/细胞核中,在病毒生产中无功能)在 HLfB 文化中表达。蛋白质复合物从总细胞赖沙处理,在2x样品加载缓冲液中通过95°C孵育洗脱3分钟,并在银染色试剂中解决(图4)。WT 修订版在 IP 标志反应后可检测到。Rev-NoLS M2、M6 和 M9 也可在 18 kDa 处检测到。在37kDa标记处观察到与B23蛋白对应的带。在与WT Rev、M2、M6、M9和pcDNA阴性背景对照的IP反应对应的每个通道中进一步观察到蛋白质复合物。通过免疫检测对β-标志-Rev和B23的蛋白质泄漏物进行了分析。大量的 WT Rev 和中等级别的 M6 被表示(+标志输入),并在标志 IP(α-标志-Rev IP,图 5 )后可检测到。M2和M9在20μg蛋白质酸酶输入中表达得不高,但从5mg蛋白莱酸(5mg)的标记IP后,在低强度下可检测到。pcDNA阴性对照在输入和α-标志-Rev IP中未产生非特异性免疫检测。在 IP 标志反应 (B23 共 IP) 后观察到 B23 与 WT Rev 的亲和力。B23亲和力与M2(两个单点突变R48,50G)和M6(单点突变R50G)稍有观察。在Rev-NoLS中存在三个单点突变M9(R46,48,50G)时,B23亲和力丧失。

免疫沉淀WT Rev和Rev-NoLS-3'flag突变(4、5、6和8)的总赖沙液经过处理,用Coomassie试剂染色,并与BSA序列稀释(右面板)相比可视化。Rev-NoLS-3'标志在18 kDa存在和不存在突变的情况下可检测到(12.5-25 μg)(图6)。WT Rev-3'flag 的 IP 反应处理的蛋白质复合物、核苷酸局部 Rev-NoLS-3'标志突变(M4、M5 和 M6)和阴性对照 pcDNA标志在 SDS-PAGE 凝胶中与库马西试剂染色(图 7)。WT Rev(WT1 和 WT2)在 IP 标志反应 18 kDa 后可检测到。在HLfB和IP标志反应中表达后,Rev-NoLS突变略有可检测到。pcDNA阴性对照在 18 kDa 时未产生非特异性背景。

通过串联质谱法对WT Rev-3'flag、M2、M6、M9和阴性对照pcDNA-标志(如图4所示)制备的免疫沉淀性莱萨分酸进行了分析。显示蛋白质识别概率(以百分比表示),用于比较每种核苷酸-本地化 Rev-NoLS 突变与 WT Rev (表 1 )的蛋白质相互作用。细胞蛋白,其中一些是核细胞在定位模式(核糖异构体,真核翻译起始因子48,snoRNA C/D盒58B,和核黄体明B23),被确定为WT Rev的直接/间接结合伙伴。因子失去对M2(两个单点突变R48,50G)、M6(单点突变R50G)和M9(三个单点突变R46,48,50G)的结合亲和力,类似于pcDNA阴性对照。图6中Coomassie染色凝胶的每个通道都经过串联质谱处理(表2)。使用蛋白质识别概率(以百分比表示)分析和显示与Rev-NoLS突变的肽亲和力。各种细胞蛋白,其中一些是固原模式中的核糖核酸(核素C23、核黄霉素B23和核小体组装蛋白),被确定为WT Rev的直接/间接蛋白质结合因子。标识为与 M4、M5 和 M6 绑定。运输因子 ARHGEF1(罗鸟核苷酸交换因子 1)和 TBC1D24(TCB1 域系列,成员 24)在存在 Rev-NoLS 突变时失去亲和力。另外观察到合成因子 hnRNPC(异质核核蛋白 C)和 PNN(Pinin、脱糖相关蛋白)与 WT Rev 结合,后者与 Rev 单点核苷酸突变失去相互作用。

Figure 1
图 1:在HIV-1生产期间,优化Rev-3'flag共IP的细胞莱沙条件。WT Rev-NoLS-3'标志和负对照 pcDNA-flag IP 条件在利沙缓冲液中的三种不同的 NaCl 浓度(137 mM、200 mM 和 300 mM)中进行了优化。通过银染色观察到,137 mM NaCl 是 Rev 免疫沉淀和 B23 结合的最佳盐浓度。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图 2:在HIV-1生产过程中,优化Rev-3'flag共IP和B23免疫检测的莱沙条件。WT Rev-NoLS-3'标志、M1-3'标志和负对照pcDNA-标志IP条件在莱沙缓冲液中的两种不同的NaCl浓度(137 mM和200 mM)中进行了优化。通过免疫检测观察到,137 mM NaCl 是 Rev 免疫沉淀和 B23 结合的最佳盐浓度。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图 3:在HIV-1生产过程中优化Rev-3'flag共IP洗脱,通过银染色可视化。蛋白质复合物是从WT Rev-3'flag和pcDNA标志IP期间制备的总细胞内合物中处理的。测试了三种不同的洗脱条件 - 在 37°C 下 2x 样品加载缓冲液 15 分钟,2x 样品加载缓冲液在 95°C 下加载缓冲液 3 分钟,在 4°C 下 3x 标记肽 30 分钟。WT Rev 的最佳洗脱条件发生在 37°C 的 2x 样品加载缓冲液中 15 分钟孵育期之后,在 95°C 下 2x 样品加载缓冲液中的 3 分钟潜伏期之后。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图 4:在HIV-1生产期间,Rev-3'flag突变2、6和9的免疫沉淀。与WT Rev、M2(R48,50G)、M6(R50G)、M9(R46,48,50G)和负对照pcDNA标志直接/间接结合的蛋白质复合物在HIV-1复制存在的情况下显示在银色SDS-PAGE凝胶中。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图 5:在HIV-1生产期间,针对B23免疫检测的突变2、6和9的Rev-3'flag共IP。通过免疫检测对图4中WT Rev、M2、M6、M9和阴性对照pcDNA-标志制备的蛋白质泄漏和IP反应进行进一步分析。观察WT Rev和突变表达,以及与B23核质蛋白的相互作用。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图 6: 在标志 IP 反应后,Rev-NoLS 突变 4、5、6 和 8 的量化. 使用BSA串行稀释法测量了HLfB表达WT Rev和核介定化M4(R46G)、M5(R48G)、M6(R50G)、M8(+RQ)和阴性对照pcDNA标志的IP反应,用于蛋白质浓度。每个样品的蛋白质浓度为12.5-25μg。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 7
图 7:在HIV-1生产期间,核苷酸局部Rev-NoLS突变4、5和6的免疫沉淀。显示含有WT Rev(1和2)、M4、M5和M6的免疫沉淀蛋白复合物的库马西染色SDS-PAGE凝胶。请点击此处查看此图的较大版本。

识别的蛋白质 分子量 WT 修订版 M2 M6 M9
信号识别粒子14kDa(同源性阿卢RNA结合蛋白) 15 千瓦达 95% 0 0 0
核糖体蛋白S3A 30 千瓦 95% 0 0 0
真核翻译启动因子4B 69 千克达 95% 0 0 0
核糖体蛋白L31 14 千达 91% 0 0 0
核糖体蛋白L12 18 千克达 93% 0 0 0
核糖体蛋白L22 15 千瓦达 91% 0 0 0
小核核糖核酸,C/D盒 58B 15 千瓦达 87% 0 0 0
锌指,CCHC域包含11 185 千瓦达 87% 0 0 0
actin 结合 LIM 蛋白 1 79 千达 79% 0 0 0
核糖体蛋白S13 17 千瓦达 78% 0 0 0
核对霉素(核磷蛋白B23,核糖核蛋白) 33 千达 73% 0 0 0

表1:在HIV-1生产期间与WT Rev相互作用的细胞宿主因素的识别。通过串联质谱直接分析WT Rev、M2、M6和M9制备的蛋白质改性。直接/间接绑定到 WT Rev 与 M2、M6 和 M9 的蛋白质相互作用按蛋白质识别概率(百分比)进行汇总。

识别的蛋白质 分子量 M4 M5 M6 WT pCDNA
聚(A)结合蛋白,细胞质1 61 千瓦达 98% 0 100% 100% 0
热休克 70kDa 蛋白质 1B 70 千瓦 100% 100% 100% 100% 0
核糖体蛋白L7 29 千瓦达 91% 0 100% 100% 0
组蛋白簇 1, H1e 22 千达 0 0 100% 100% 0
核糖体蛋白L4 48 千克达 95% 0 100% 100% 0
核糖体蛋白L13 24 千达 99% 0 100% 100% 0
补充组1,q亚组分结合蛋白 31 千克达 100% 100% 100% 100% 0
Y 盒结合蛋白 1 36 千达 0 0 100% 100% 0
核小体组装蛋白1类似1 45 千瓦达 0 0 0 100% 0
核糖体蛋白L8 28 千克达 89% 36% 100% 100% 0
核糖体蛋白L18 22 千达 27% 0 100% 100% 0
热休克 70kDa 蛋白质 8 71 千瓦达 5% 99% 100% 100% 0
核糖体蛋白L19 23 千瓦达 10% 0 81% 100% 0
核糖体蛋白L27 16 千达 92% 0 100% 100% 0
核糖体蛋白L7a 30 千瓦 0 0 100% 100% 0
核糖体蛋白L24 18 千克达 0 0 100% 99% 0
图布林,贝塔I类 50 千瓦 92% 69% 100% 100% 0
核糖体蛋白L6 33 千达 0 0 100% 100% 0
热休克 70kDa 蛋白质 9 (莫林) 74 千达 33% 99% 100% 100% 0
核糖体蛋白S2 31 千克达 87% 0 100% 100% 0
病例蛋白激酶2,α1多肽 45 千瓦达 0 0 50% 100% 0
核糖体蛋白L14 23 千瓦达 0 0 81% 100% 0
核糖体蛋白, 大, P0 34 千达 0 0 100% 100% 0
组蛋白簇 1, H1b 23 千瓦达 0 0 73% 100% 0
热休克 70kDa 蛋白 5 (葡萄糖调节蛋白) 72 千达 99% 0 100% 100% 0
核糖体蛋白S4,X链接 30 千瓦 0 0 100% 100% 0
核糖体蛋白S20 13 千达 98% 94% 99% 99% 0
核糖体蛋白L28 16 千达 0 0 100% 99% 0
核糖体蛋白S14 16 千达 0 0 100% 100% 0
核糖体蛋白S3A 30 千瓦 0 0 100% 100% 0
核糖体蛋白L21 19 千瓦达 0 0 100% 100% 0
锌指CCCH型,抗病毒1 101 千达 0 0 97% 100% 0
组蛋白簇 1, H1c 21 千瓦达 0 0 0 98% 0
核糖体蛋白L36 12 千达 0 0 100% 100% 0
核糖体蛋白S18 18 千克达 90% 0 100% 100% 0
凋亡调节器 1 40 千瓦达 42% 88% 34% 0 0
核糖体蛋白L17 21 千瓦达 0 0 100% 100% 0
核糖体蛋白S26 13 千达 91% 0 99% 98% 0
核糖体蛋白L32 18 千克达 0 0 48% 100% 0
核糖体蛋白L35 15 千瓦达 0 0 97% 100% 0
核糖体蛋白L29 18 千克达 0 0 57% 94% 0
核糖体蛋白S9 23 千瓦达 0 0 100% 100% 0
异质核核核核核核蛋白H1(H) 51 千瓦达 98% 0 100% 100% 0
核糖体蛋白S8 22 千达 0 0 78% 100% 0
核糖体蛋白L10 25 千瓦时 0 0 100% 100% 0
核糖体蛋白L23a 18 千克达 0 0 68% 100% 0
核糖体蛋白S6 29 千瓦达 0 0 100% 100% 0
核糖体蛋白L31 14 千达 0 0 95% 100% 0
核糖体蛋白S13 17 千瓦达 0 0 100% 99% 0
核糖体蛋白L10a 25 千瓦时 45% 0 81% 100% 0
聚(A)结合蛋白,细胞质4(诱导形式) 70 千瓦 0 0 100% 100% 0
跨膜 emp24 蛋白质传输域包含 1 25 千瓦时 0 0 0 100% 0
EBNA1 结合蛋白 2 35 千瓦达 0 0 69% 100% 0
保存螺旋环-螺旋无所不在的激酶 85 千达 74% 92% 65% 83% 0
核糖体蛋白L12 18 千克达 0 0 57% 100% 0
核糖体蛋白S24 15 千瓦达 0 0 100% 100% 0
冷休克域蛋白A 40 千瓦达 0 0 0 100% 0
核糖体蛋白L27a 17 千瓦达 0 0 89% 99% 0
异质核核核核核核蛋白F 46 千达 0 0 99% 99% 0
核糖体蛋白L11 20 千瓦 0 0 99% 100% 0
核糖体蛋白L26样1 17 千瓦达 0 0 100% 100% 0
病例蛋白激酶2,α质质多肽 41 千瓦达 0 0 0 100% 0
图布林, 阿尔法 1a 50 千瓦 33% 0 100% 0 0
核糖体蛋白L3 46 千达 0 0 66k 94% 0
线粒体核糖体蛋白L15 33 千达 0 0 100% 99% 0
核素 77 千达 0 0 25% 100% 0
线粒体核糖体蛋白S21 11 千瓦达 0 0 93% 94% 0
KRR1,小型亚单位(SSU)过程组分,同源(酵母) 44 千达 89% 0 76% 99% 0
线粒体核糖体蛋白S7 28 千克达 0 0 0 100% 0
氯化物通道,核苷酸敏感,1A 22 千达 0 0 97% 66k 0
环林 B3 158 千瓦 0 0 67% 49% 0
瓜宁核苷酸结合蛋白样3(核苷酸) 61 千瓦达 0 0 99% 98% 0
线粒体核糖体蛋白S23 22 千达 0 0 100% 50% 0
线粒体核糖体蛋白S22 41 千瓦达 0 0 0 99% 0
核对霉素(核磷蛋白B23,核糖核蛋白) 33 千达 0 0 52% 97% 0
核糖体蛋白S19 16 千达 0 0 0 99% 0
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 36 千达 0 0 100% 0 0
组蛋白簇 1, H2bg 14 千达 0 0 53% 72% 0
核糖体蛋白S23 16 千达 0 0 68% 0 0
罗鸟核苷酸交换因子(全球环境基金) 1 104 千达 0 0 0 94% 0
死亡相关蛋白 3 46 千达 0 0 87% 87% 0
线粒体核糖体蛋白S6 14 千达 0 0 52% 84% 0
核糖体蛋白L39 6 千克达 0 0 0 87% 0
线粒体核糖体蛋白S28 21 千瓦达 0 0 85% 99% 0
组蛋白簇 1, H4h 11 千瓦达 0 0 0 93% 0
线粒体核糖体蛋白L43 23 千瓦达 0 0 0 97% 0
核糖体蛋白S15 17 千瓦达 0 0 0 85% 0
核糖体蛋白S12 15 千瓦达 0 0 68% 39% 0
核糖体蛋白L35a 13 千达 0 0 0 96% 0
线粒体核糖体蛋白L38 45 千瓦达 0 0 42% 98% 0
线粒体核糖体蛋白S14 15 千瓦达 0 0 45% 76% 0
磷酸二酯酶5A,cGMP特异性 95 千瓦达 14% 0 0 72% 0
核糖体蛋白L15 24 千达 0 0 0 56% 0
异质核核核核核蛋白C(C1/C2) 22 千达 0 0 0 100% 0
线粒体核糖体蛋白S16 11 千瓦达 0 0 0 92% 0
核糖体蛋白S15a 15 千瓦达 0 0 0 91% 0
纽雷克斯林 2 185 千瓦达 0 50% 0 0 0
自闭症易感性候选者2 139 千瓦达 0 0 46% 0 0
线粒体核糖体蛋白L17 20 千瓦 0 0 0 92% 0
拼接因子 3a,亚单元 1,120kDa 89 千达 0 0 56% 89% 0
拉核苷酸蛋白域家族,成员 1 116 千达 0 0 65% 66% 0
莱普列坎式 2 62 千达 0 0 0 68% 0
核糖体蛋白L18a 21 千瓦达 0 0 0 86% 0
核糖体蛋白L23 15 千瓦达 0 0 60% 47% 0
跨膜 emp24 蛋白质传输域包含 9 27 千瓦达 0 0 0 78% 0
信号识别粒子 72kDa 75 千达 0 0 0 100% 0
叶酸, 半乳苷结合, 可溶性, 3 26 千达 0 71% 28% 0 0
线粒体核糖体蛋白L1 37 千瓦达 0 0 0 69% 0
H1 组蛋白家族,成员 X 22 千达 0 0 0 96% 0
酪蛋白激酶2,β多肽 25 千瓦时 0 0 0 89% 0
溶质载体系列 4,碳酸氢钠联运机,成员 7 118 千达 82% 0 0 0 0
WD 重复域 13 54 千达 0 81% 0 0 0
转录伸长因子 A (SII), 3 17 千瓦达 0 0 0 38% 0
核糖体蛋白S16 16 千达 0 0 75% 0 0
SP140核体蛋白 92 千达 0 0 0 64% 0
奥托费林 227 千瓦达 62% 0 0 0 0
戈尔吉运输 1B 15 千瓦达 0 0 0 33% 0
线粒体核糖体蛋白S34 26 千达 0 0 0 33% 0
核糖体蛋白L30 13 千达 0 0 0 49% 0
actin 结合 LIM 蛋白 1 96 千达 0 0 0 43% 0
瓜宁核苷酸结合蛋白样2(核苷酸) 84 千达 40% 0 0 0 0
高密度脂蛋白结合蛋白 141 千达 0 0 34% 0 0
腺苷脱阿米宁酶,RNA特异性,B2 81 千达 0 0 28% 0 0
西他汀 E/M 17 千瓦达 0 27% 0 0 0
锌指蛋白 786 80 千达 0 0 23% 0 0
普莱克斯特林同源学域,家庭 B,成员 1 145 千瓦达 0 0 0 95% 0
蛋白磷酸酶甲基酯酶1 44 千达 0 0 94% 0 0
janus激酶和微管相互作用蛋白2 95 千瓦达 0 0 0 94% 0
信号识别粒子 68kDa 67 千瓦达 0 0 0 93% 0
TBC1 域系列,成员 24 63 千达 0 0 0 89% 0
线粒体核糖体蛋白L27 16 千达 0 0 0 89% 0
线粒体核糖体蛋白L2 24 千达 0 0 0 88% 0
线粒体核糖体蛋白S2 33 千达 0 0 0 87% 0
五角肽重复域 3 79 千达 0 0 0 84% 0
核糖体蛋白,大,P2 12 千达 0 0 0 76% 0
IMP(肌苷5'-单磷酸盐)脱氢酶2 56 千达 0 0 76% 0 0
图布林, 贝塔 4B 类 IVb 50 千瓦 0 0 76% 0 0
线粒体核糖体蛋白L23 19 千瓦达 0 0 0 74% 0
线粒体核糖体蛋白S31 45 千瓦达 0 0 0 74% 0
加其塞-3-O-磺酸转移酶1 49 千克达 74% 0 0 0 0
变异性抑制器 4-20 同源 1 (果蝇) 99 千瓦达 0 72% 0 0 0
线粒体核糖体蛋白S25 20 千瓦 0 0 0 70% 0
包含 1 的核糖体 L1 域 55 千达 0 0 0 70% 0
序列相似性 110,成员 D 29 千瓦达 69% 0 0 0 0
核糖体蛋白L36a样 12 千达 0 0 0 66% 0
小脑 4 前体 22 千达 0 0 0 64% 0
N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸盐转移酶、α和β亚单位 144 千达 64% 0 0 0 0
RAD51 同源 B (S. cerevisae) 38 千克达 0 0 0 64% 0
转录伸长调节器 1 124 千达 63% 0 0 0 0
家用盒 A1 15 千瓦达 0 0 0 62% 0
磷脂转移蛋白 49 千克达 0 0 0 62% 0
Rho GTPase 激活蛋白 33 137 千瓦达 0 0 54% 0 0
线粒体核糖体蛋白S18B 29 千瓦达 0 0 0 52% 0
内质性视明氨基肽酶2 106 千达 51% 0 0 0 0
三方主题包含28 89 千达 0 50% 0 0 0
不成熟的结肠癌成绩单1 24 千达 0 0 0 50% 0
AT 丰富的交互式域 1A(类似 SWI) 242 千瓦达 0 0 49% 0 0
线粒体核糖体蛋白S17 15 千瓦达 0 0 0 48% 0
pinin, 脱毛相关蛋白 82 千达 0 0 0 48% 0
蛋白磷酸酶,Mg2+/Mn2+依赖性,1G 59 千达 0 0 0 45% 0
G 补丁域和安基林重复 1 39 千瓦达 45% 0 0 0 0
线粒体核糖体蛋白L3 39 千瓦达 0 0 0 44% 0
萌芽不受抑制的苯二甲苯3同源(酵母) 37 千瓦达 0 44% 0 0 0
WD 和四元一元肽重复 1 76 千达 0 0 0 44% 0
蛋白质二硫化物异构酶家族 A,成员 2 58 千达 0 0 0 42% 0
卡兹林,佩里拉金相互作用蛋白 86 千达 0 41% 0 0 0
线圈螺旋线圈线圈-螺旋-螺旋域,包含 2 16 千达 0 0 40% 0 0
热休克蛋白 90kDa α (细胞),A 类成员 1 85 千达 0 0 40% 0 0
视网膜炎色素瘤GTPase调节器 83 千达 0 0 40% 0 0
CTD(卡博蒂终端领域,RNA聚合酶II,多肽A)
磷酸酶,亚单位1
104 千达 0 39% 0 0 0
线粒体核糖体蛋白L37 48 千克达 0 0 0 39% 0
C2CD2 类似 76 千达 0 38% 0 0 0
DnaJ (Hsp40) 同源形,亚家族 C,成员 6 106 千达 0 0 38% 0 0
线粒体核糖体蛋白L51 15 千瓦达 0 0 0 38% 0
比斯汀样 50 千瓦 0 0 0 38% 0
亨廷顿相关蛋白1 76 千达 0 0 0 37% 0
锌指蛋白 263 77 千达 0 36% 0 0 0
细胞分裂周期和凋亡调节器 1 133 千瓦达 0 0 34% 0 0
蛋白质酪氨酸磷酸酶,非受体类型13
(APO-1/CD95 (Fas) 相关磷酸酶)
256 千瓦达 0 0 34% 0 0
包含 2 的 KRAB-A 域 56 千达 0 0 0 31% 0
激活信号硬币积分器 1 复杂子单元 2 28 千克达 0 0 0 31% 0
中索蛋白 76kDa 74 千达 0 30% 0 0 0
聚合酶 (RNA) III (DNA 定向) 多肽 C (62kD) 61 千瓦达 0 0 0 30% 0
5-羟基三甲胺(血清素)受体6 47 千克达 0 0 0 29% 0
T细胞受体α连接 56 2 千克达 0 26% 0 0 0
细胞分裂1样的染色体的双定向 330 千达 0 0 0 25% 0
Ras 关联和 DIL 域 114 千达 0 0 25% 0 0
WD 重复域 66 130 千瓦达 0 0 0 24% 0
染色体 6 开放读取框架 25 13 千达 0 0 22% 0 0
跨膜蛋白 177 34 千达 0 0 0 21% 0
神经前体细胞表达,发育下调节4样 101 千达 0 20% 0 0 0

表2:在HIV-1生产期间,与核苷酸局部转版Rev突变4、5和6复合的细胞宿主因子的识别。图6中沾染的Coomassie SDS-PAGE凝胶经过串联质谱处理。WT Rev 与核苷酸突变 M4、M5 和 M6 的蛋白质相互作用结果按蛋白质识别概率(百分比)进行汇总。

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Discussion

对在HIV-1存在的情况下比较Rev-NoLS突变和WT Rev的质谱分析,以了解病毒复制周期中涉及的核因子。这将确定病毒感染所需的核苷酸成分。核卵石B23对Rev-NoLS具有很高的亲和力,在Rev3的核粒定位和Rev绑定HIV mRNA 22的核细胞质迁移中具有功能。B23与Rev-NoLS突变的亲和力,其中含有单个或多个精氨酸替代物,在病毒产生过程中通过Rev-3'flag的免疫沉淀进行评估(图2;WT 和突变 M2、M6 和 M9)。B23与单点Rev-NoLS突变M4、M5和M6的亲和力以前在HIV-1复制的存在下被检查过。在以前的研究中,M4、M5和M6的IP洗叶液被接受西方免疫印迹,其抗体与Rev和B23亲和力1的β-标志特异性结合。在 Rev 单点突变的背景下,B23 结合亲和力显著降低。在HIV复制期间,B23与WT Rev保持亲和力。Rev-NoLS内诱导的单点突变预计将降低与其他细胞宿主因子的结合亲和力,促进HIV mRNA结合和运输。此模型中的 Rev-NoLS 单点和多点突变废除了核细胞因子 B23 与 Rev 的亲和力,表明核细胞质穿梭和 HIV mRNA 传输中断。核苷酸因子(核素C23和核小体组装蛋白1)、运输因子(ARHGEF1和TCB1D24)和拼接因子(hnRNPC和PNN)通过与Rev蛋白复合物相互作用,参与HIV-1感染周期。表1表2揭示了各种其他细胞因子,包括核核素和非核糖核酸,这些细胞因子可能通过Rev.核苷酸因子-snoRNA C/D盒58参与HIV-1复制周期,与snoRNA有牵连加工、鼻RNA输送到核细胞和核糖核酸RNA的2'-O-甲基化——被鉴定出来,但这种蛋白质在HIV-1复制周期中的功能仍不得而知。目前正在研究这些细胞因子在HIV-1感染周期中的具体作用。

这里介绍的结果表明,这种方法用于识别维持HIV-1感染周期的病毒/宿主核素因子。使用这种方法可以确定参与其他疾病模型的病毒/宿主核因子。此外,一个核苷酸因子可能涉及各种疾病模型中的多功能作用。例如,B23与其他病毒感染模型的核苷酸病毒蛋白、病毒组装、封盖、复制和延迟的传输有关。B23的特点是与细胞因子的NoLS相互作用,用于核细胞质迁移 - p120生长因子(氨基酸40-57)23和C23预rRNA处理器(氨基酸540-628)24。B23也被记录与人类T细胞淋巴病毒(HTLV-1)蛋白质Rex(氨基酸1-22)25,HIV-1 Tat(氨基酸49-57)2,和HIV-1Rev(氨基酸37-47)26。日本脑炎病毒(JEV)基因组编码核苷酸-局部核心蛋白,通过该核心蛋白,氨基酸Gly42和Pro43在JEV感染期间与B23的N端区域相互作用,导致病毒核心蛋白/B23被运输到核27。乙型肝炎病毒(HBV)的单链RNA基因组部分由双链DNA组成,该DNA编码核蛋白。HBV核心蛋白与核素和B23在核素28中结合;B23通过与核心蛋白N端域的相互作用在HBV组件中得到证明。具体来说,B23氨基酸259-294与HBV核心蛋白的N端域结合,允许病毒包扎29。负感、单链RNA D病毒(HDV)以两种同种形式表达HDVAg抗原;小等形有助于RNA复制,而大等形有助于病毒组装。RNA复制发生在核细胞内,需要B23与HDVAg30、31的相互作用。HDV 感染导致 B23 的调节,B23 主要与小型 HDVAg 等形相互作用,较少与大 HDVAg 等形体相互作用。相互作用通过小型HDVAg NLS域进行,B23通过该域结合并实现核积累。在将HDV结合位点删除到B23后,RNA复制受损。HDVAg与B23和核素在核素中共同发生。核素被发现具有转录性能作为抑制器32,揭示核细胞作为调节HDV复制的隔间。B23还涉及卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)基因组的延迟。KSHV潜伏蛋白-v-环素- 与主机CDK6激酶,磷酸化B23在Thr199,促进B23与延迟相关的核抗原33相互作用。延迟相关核抗原作用,以防止病毒性溶质复制。B23 的耗尽导致 KSHV 重新激活,揭示了 B23 作为 KSHV 延迟的调节器。HIV-1复制周期中的B23功能在Tat和Rev的核细胞质迁移活性中具有特征,B23在HIV感染期间是否诱导延迟尚不得而知。B23参与HIV-1的复制、封盖和组装目前不得而知。

将这种方法适应其他疾病模型将需要付出大量的努力和时间,以适当的细胞系表达缺乏蛋白质的传染性骨干。这种缺乏Rev的HIV-1HXB2主干的优点是能够检查Rev-NoLS突变,在HIV-1复制周期中涉及的全部病毒主干、病毒传染性因素和宿主因素。其他研究已经检查了在缺乏完整的HIV-1传染系统的情况下的核子病毒功能。对传染病和疾病途径的彻底表征必须包括支持疾病自然进展的代表性环境。进行了两种不同类型的分析,并比较了识别核因子的能力。表1列出了由于对蛋白质改性酯进行直接质谱分析而仍与WT Rev绑定的因素。这一分析得出了HIV-1 Rev的几个已知因素。第二种方法产生了与Rev蛋白复合体结合的各种已知和潜在因素,但缺乏表1中先前识别的以下蛋白质:信号识别粒子14kDa,真核翻译启动因子4B,核糖体蛋白L22,小核糖核酸RNAC/D盒58B,锌指CCHC域含有11。最终,该协议中为质谱分析选择的优越方法涉及从SDS-PAGE凝胶中提取肽。第一种直接方法包括2x样品缓冲液中的无溴酚蓝;2x样品缓冲液的剩余成分可能干扰完全的胰蛋白酶处理,并可能产生不完全处理的肽进行质谱分析。第二种间接方法能够从SDS-PAGE的潜在污染物中纯化胰蛋白酶处理的肽。

此处描述的质谱制备方法可用于确定治疗干预措施,通过针对 Rev 来根除 HIV-1 感染。主导负活动,并用于停止 Rev 函数。Rev 功能抑制的主要负特征如下:Rev/RRE 绑定相关性;通过使用转子突变体进行多面化,使核苷酸WT Rev重新定位;与HIV-1 mRNA传输和拼接中涉及的关键细胞因子的亲和力丧失。可以检查涉及 Rev-NoLS 突变与 WT Rev 的共表达的 Rev-NoLS 突变的转修订多面处理。该模型中的主要负突变预期会随着WT Rev的多面化,并将核苷酸模式移向细胞核和细胞质,从而导致Rev功能抑制。质谱法可用于确定与HIV-1 mRNA拼接和运输有关的关键细胞因子的丢失。识别与WT Rev的缺失相互作用,由于与显性阴性Rev-NoLS突变的共显表达,将揭示与HIV-1发病机制中核特定途径的介入。或者,可以研究在Rev-NoLS突变背景下产生的病毒HIV-1NL4-3颗粒,以控制所有包装的细胞因子。病毒颗粒中包装的细胞和病毒因子可通过质谱法进一步识别。这将揭示病毒颗粒中核苷酸因子的存在,以及已识别的核素因子在病毒感染中的作用。所述方法适用于其他病毒和疾病模型,用于识别和鉴定和研究不足的路径。这将允许制定治疗干预措施,治疗疾病,这些疾病可用的治疗有限。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者感谢芭芭拉·费尔伯博士和乔治·帕夫拉基斯博士为国家卫生研究院(NIH)艾滋病研究和参考试剂项目、国家过敏和传染病研究所提供的HLfB粘附性培养疾病(NIAID),NIH。作者还承认NIH、格兰特AI042552和AI029329提供的财务来源。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Fisher Chemical A38S-212
Acetonitrile Fisher Chemical A955-500
Acrylamide:Bisacrylamide BioRad 1610158
Ammonium bicarbonate Fisher Chemical A643-500
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich 7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gel Sigma-Aldrich A2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG Sigma-Aldrich F3165
BioMax MS film Carestream 8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL Bio-Rad 5000006
B23 mouse monoclonal IgG Santa Cruz Biotechnologies sc-47725
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carnation non-fat powdered milk Nestle N/A
Cell scraper ThermoFisher Scientific 179693PK
C18IonKey nanoTile column Waters 186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishes Fisher Scientific 08-772-22
Dithiothreitol Thermo Scientific J1539714
1 x DPBS Corning 21-030-CVRS
ECL Estern blotting substrate Pierce 32106
Ethanol, 200 proof Fisher Chemical A409-4
FBS Gibco 16000044
Formic Acid Fisher Chemical A117-50
GelCode blue stain reagent ThermoFisher 24590
Glycerol Fisher Chemical 56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz Biotechnologies sc-2005
Iodoacetamide ACROS Organics 122270050
KimWipe delicate task wiper Kimberly Clark Professional 34120
L-glutamine Gibco 25030081
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
NanoAcuity UPLC Waters N/A
Pierce Silver Stain Kit Thermo Scientific 24600df
15-mL Polypropylene conical tube Falcon 352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo Scientific 26616
Protease inhibitor cocktail Roche 4693132001
Purified BSA New England Biolabs B9001
PVDF  Western blotting membrane Roche 3010040001
Sodium Pyruvate Gibco 11360070
10 x TBS Fisher Bioreagents BP2471500
TEMED BioRad 1610880edu
Triton X-100 detergent solution BioRad 1610407
Trizaic source Waters N/A
trypsin-EDTA Corning 25-051-CIS
Tween 20 BioRad 1706531
Synapt G2 mass spectrometer Waters N/A
Whatman filter paper Tisch Scientific 10427813

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