Identificatie van Nucleollaire factoren tijdens de HIV-1-replicatie via Rev-immunoprecipitatie en massaspectrometrie

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Hier beschrijven we Rev immunoprecipitatie in de aanwezigheid van HIV-1 replicatie voor massaspectrometrie. De beschreven methoden kunnen worden gebruikt voor de identificatie van nucleollaire factoren die betrokken zijn bij de HIV-1-infectieuze cyclus en zijn van toepassing op andere ziekte modellen voor de karakterisering van onderbestudeerde trajecten.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Arizala, J. A., Chomchan, P., Li, H., Moore, R., Ge, H., Ouellet, D. L., Rossi, J. J. Identification of Nucleolar Factors During HIV-1 Replication Through Rev Immunoprecipitation and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (148), e59329, doi:10.3791/59329 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De HIV-1 infectieuze cyclus vereist virale eiwit interacties met gastheerfactoren om virale replicatie te vergemakkelijken, verpakking, en vrijlating. De infectieuze cyclus verder vereist de vorming van virale/gastheer eiwitcomplexen met HIV-1-RNA te reguleren van de splicing en het inschakelen van nucleocytoplasmorische transport. Het HIV-1 rev-eiwit bereikt de nucleaire export van HIV-1 Mrna's door middel van multimerisatie met intronic CIS-acteer doelen-het Rev Response element (RRE). Een nucleolar lokalisatie signaal (NoLS) bestaat binnen het COOH-eindpunt van de Rev arginine-Rich motief (ARM), waardoor de accumulatie van Rev/RRE complexen in de Nucleolus. Nucleollaire factoren worden gespeculeerd ter ondersteuning van de HIV-1-infectieuze cyclus door middel van verschillende andere functies naast het bemedieren van mRNA-onafhankelijke nucleaire export en splicing. We beschrijven een immunoprecipitatie methode van wild-type (WT) Rev in vergelijking met Rev nucleolar mutaties (deletie en single-point Rev-NoLS mutaties) in de aanwezigheid van HIV-1 replicatie voor massaspectrometrie. Nucleollaire factoren die betrokken zijn bij het nucleocytoplasminezuur transport (nucleophosmin B23 en nucleolin C23), evenals cellulaire splicing factoren, verliezen interactie met Rev in de aanwezigheid van Rev-NoLS mutaties. Verschillende andere nucleollaire factoren, zoals snoRNA C/D Box 58, zijn geïdentificeerd om interactie met Rev-mutaties te verliezen, maar hun functie in de HIV-1-replicatiecyclus blijft onbekend. De hier gepresenteerde resultaten tonen het gebruik van deze aanpak voor de identificatie van virale/host-nucleollaire factoren die de HIV-1-infectieuze cyclus behouden. De begrippen die in deze benadering worden gebruikt, zijn van toepassing op andere virale en ziekte modellen die de karakterisering van onderbestudeerde trajecten vereisen.

Introduction

De Nucleolus wordt gepostuleerd als de interactie grond van verschillende cellulaire host en virale factoren die nodig zijn voor virale replicatie. De Nucleolus is een complexe structuur onderverdeeld in drie verschillende compartimenten: het fibrillar compartiment, het dichte fibrillar compartiment en het granulaire compartiment. Het HIV-1 rev-eiwit lokaliseert specifiek binnen korrelvormige compartimenten; echter, de reden voor dit lokalisatie patroon is onbekend. In aanwezigheid van éénpunts mutaties binnen de NoLS sequentie (Rev mutaties 4, 5 en 6), handhaaft Rev een nucleolar patroon en is eerder aangetoond dat het HIV-1HXB2 replicatie moet redden, maar met een verminderde efficiëntie vergeleken met WT Rev1 . Alle éénpuntmutaties zijn niet in staat om de HIV-1NL4-3 infectieuze cyclus te ondersteunen. In de aanwezigheid van meerdere éénpunts mutaties binnen de NoLS sequentie (Rev-NoLS mutaties 2 en 9), is Rev waargenomen om te dispergeren in de Nucleus en het cytoplasma en heeft het niet kunnen redden van HIV-1HXB2 replicatie1. Het doel van deze proteomica studie is het ontcijferen van nucleollaire en niet-nucleollaire cellulaire factoren die betrokken zijn bij de Rev-mediated HIV-1 infectieuze pathway. Rev immunoprecipitatie voorwaarden worden geoptimaliseerd door interactie met de nucleolar B23 fosfoproteïne, die eerder is aangetoond dat het verliezen van interactie met Rev in de aanwezigheid van nucleollaire mutaties.

Rev cellulaire factoren zijn uitgebreid bestudeerd in het verleden; Dit is echter gebeurd bij afwezigheid van virale pathogenese. Een eiwit, in het bijzonder, dat wordt gekenmerkt in deze studie door middel van Rev interactie tijdens HIV-1 replicatie is de nucleolar fosfoprotein B23-ook wel nucleophosmin (NPM), numatrin, of NO38 in amfibieën2,3, 4. B23 wordt uitgedrukt als drie isovormen (NPM1, NPM2, en NPM3)-alle leden van de nucleophosmin/nucleoplasmin nucleaire chaperonne familie5,6. De NPM1 moleculaire chaperonne functies in de juiste assemblage van nucleosomes, in de vorming van eiwitten/nucleïnezuur complexen die betrokken zijn bij chromatine hogere orde structuren7,8, en in de preventie van aggregatie en het verkeerd vouwen van doel eiwitten via een N-terminaal kern domein (residuen 1-120)9. NPM1 functionaliteit strekt zich uit tot ribosoom Genesis door het transport van preribosomale deeltjes tussen de Nucleus en cytoplasma10,11, de verwerking van preribosomale RNA in de interne getranscribeerde spacer sequentie 12,13, en het arresteren van de nucleollaire aggregatie van eiwitten tijdens de ribosomale assemblage14,15. NPM1 is betrokken bij de remming van apoptosis16 en in de stabilisatie van tumor suppressors ARF17,18 en p5319, onthullen zijn dubbele rol als een oncogene factor en tumor suppressor. NPM1 neemt deel aan de cellulaire activiteiten van genoom stabiliteit, centrosoom replicatie, en transcriptie. NPM1 is gevonden in nucleoli tijdens celcyclus Interphase, langs de chromosomale periferie tijdens mitose, en in prenucleolar lichamen (PNB) aan het einde van de mitose. NPM2 en NPM3 zijn niet zo goed bestudeerd als NPM1, die ondergaat veranderde expressieniveaus tijdens maligniteiten20.

NPM1 is gedocumenteerd in de nucleocytoplasmische pendelen van verschillende nucleaire/nucleollaire eiwitten via een interne NES en nls9,21 en werd eerder gerapporteerd aan de nucleaire import van HIV-1 tat en Rev eiwitten rijden. In aanwezigheid van B23-bindende-Domain-β-galactosidase fusie eiwitten, TAT mislocaliseert binnen het cytoplasma en verliest trans activatie activiteit; Dit toont een sterke affiniteit van TAT voor B232. Een andere studie vestigde een Rev/B23 stabiel complex in de afwezigheid van RRE-bevattende Mrna's. In aanwezigheid van RRE mRNA, Rev dissocieert van B23 en bindt bij voorkeur aan de HIV RRE, wat leidt tot de verplaatsing van B2322. Het is niet bekend waar, op het subnucleaire niveau, TAT trans activatie en de Rev Exchange process van B23 voor HIV mRNA plaatsvinden. Beide eiwitten zijn gepostuleerd om gelijktijdig via B23-interactie de Nucleolus binnen te gaan. De betrokkenheid van andere cellulaire eiwitten van de host in de HIV-nucleollaire pathway wordt verwacht. De in dit Proteomica-onderzoek beschreven methoden zullen helpen om het samenspel van de Nucleolus met gastheer cellulaire factoren die betrokken zijn bij HIV-1-pathogenese te verhelden.

Het Proteomica onderzoek werd geïnitieerd door de uitdrukking van Rev nols single-point mutaties (M4, M5 en M6) en meerdere arginine substituties (m2 en M9) voor HIV-1HXB2 productie. In dit model is een HeLa-cellijn dat stabiel de Rev-deficiënte HIV-1HXB2 (hlfb) UITDRUKT met WT rev en Rev nucleolar mutaties met een flag tag op het 3 ' einde. De aanwezigheid van WT Rev zorgt ervoor dat virale replicatie plaatsvindt in de HLfB-cultuur, in vergelijking met Rev-NoLS-mutaties die geen Rev-deficiëntie (m2 en M9) redden, of toestaan dat virale replicatie plaatsvindt, maar niet zo efficiënt als WT Rev (M4, M5 en M6)1. Het celllysaat wordt 48 h later verzameld na virale proliferatie in aanwezigheid van Rev expressie en onderworpen aan immunoprecipitatie met een lysisbuffer geoptimaliseerd voor rev/B23 interactie. Lysis buffer optimalisatie met behulp van variërende zoutconcentraties wordt beschreven, en eiwit elutie methoden voor HIV-1 rev worden vergeleken en geanalyseerd in zilver gebeitst of Coomassie-gekleurd SDS-PAGE gels. De eerste proteomica-benadering omvat de directe analyse van een geeluteerde steekproef van geuite WT Rev, m2, M6 en M9 door massaspectrometrie met tandem. Een tweede benadering waarbij de eluaten van WT Rev, M4, M5 en M6 een gel-extractieproces onderging, wordt vergeleken met de eerste benadering. Peptide affiniteit met Rev-NoLS mutaties in vergelijking met WT Rev wordt geanalyseerd en de eiwit identificatie waarschijnlijkheid weergegeven. Deze benaderingen onthullen mogelijke factoren (nucleolar en nonnucleolar) die deelnemen aan HIV-1 mRNA transport en splicing met Rev tijdens HIV-1 replicatie. In het algemeen zijn de beschreven cellysis, IP-en elutie-omstandigheden van toepassing op virale eiwitten die van belang zijn voor het begrijpen van cellulaire factoren van de host die infectieuze trajecten activeren en reguleren. Dit is ook van toepassing op de studie van cellulaire gastheerfactoren die nodig zijn voor de persistentie van verschillende ziekte modellen. In dit proteomica-model is HIV-1 rev-IP geoptimaliseerd voor B23-interactie om nucleollaire factoren te verhelden die betrokken zijn bij nucleocytoplasmorische pendelen activiteit en HIV-1 mRNA-binding. Bovendien kunnen cellijnen die stabiel zijn voor infectieuze ziekte modellen die een tekort hebben aan belangrijke eiwitten van belang, worden ontwikkeld, vergelijkbaar met de HLfB-cellijn, om infectieuze trajecten van belang te bestuderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. celcultuur

  1. Handhaaf hlfb in het gemodificeerde eagle's medium (DMEM) van Dulbecco aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mm L-glutamine en 1 mm natrium pyruvaat binnen met weefselcultuur behandelde 100 mm platen. Houd de celculturen bij 37 °C in een bevoficeerde incubator die wordt geleverd met 5% CO2. Passage confluente cellen naar een celdichtheid van 1 x 106 cellen/ml.
  2. Gooi de celkweek media weg. Spoel de cellen voorzichtig af met 10 mL 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder en gooi de 1x PBS weg zonder de cellaag te verstoren.
  3. Voeg 2 mL 1x trypsine-EDTA-oplossing toe aan de cellen. Steen het gerecht om de monolaag te kapen en inincuberen bij 37 °c binnen een bevoficeerde kamer gedurende 5 minuten.
  4. Tik stevig aan de zijkant van de schaal met de Palm van de hand om de cellen los te maken. Respendeer de losgekoppelde cellen in 8 mL verse kweekmedia. Draai de cellen op 400 x g gedurende 5 minuten.
  5. Gooi de kweekmedia weg zonder de celpellet te verstoren. Respendeer de celpellet in 10 mL verse kweekmedia. Subcultuur 1 mL geconcentreerde cellen met 9 mL verse kweekmedia binnen met weefselcultuur behandelde 100 mm platen.
    NB: voor elke Rev-NoLS mutatie zal 3x 100 mm HLfB of HeLa cultuur platen voldoende proteïne lysaat opleveren voor Western Blot analyse en massaspectrometrie. Voeg extra platen toe voor een WT Rev positieve controle en negatieve controle. Het subcultuurcelvolume moet worden geoptimaliseerd met het gebruik van verschillende celtypen.

2. expressie van Rev-NoLS-3'flag mutaties tijdens HIV-1 replicatie

  1. Laat de celcultuur van de HLfB groeien tot een celdichtheid van 2 x 106 cellen/ml. Bereid 4 mL calciumfosfaat-DNA suspensie voor elke 100 mm plaat als volgt.
    1. Label 2 15 mL buizen als 1 en 2. Voeg 2 mL 2x HBS (0,05 M HEPES, 0,28 M NaCl en 1,5 mM na2HPO4 [pH 7,12]) toe aan buis 1. Voeg TE 79/10 (1 mM tris-HCl en 0,1 mM EDTA [pH 7,9]) toe aan buis 2. Het volume van TE 79/10 is 1,760 mL-het volume van het DNA.
    2. Voeg 20 μg plasmide toe met de Rev-NoLs-3'flag-mutatie van belang voor buis 2 en meng de inhoud door resuspensie. Voeg 240 μL 2 M CaCl2 toe aan buis 2 en meng opnieuw door resuspensie.
    3. Breng het mengsel van buis 2 naar buis 1 dropwise, zachtjes mengen. Laat de suspensie op kamertemperatuur 30 minuten zitten. Vortex de neerslag.
  2. Voeg 1 ml van de suspensie druppelsgewijs toe aan elk van de 3-celculturen, 100 mm platen terwijl u de media zachtjes zwenkende. Breng de platen terug naar de incubator en laat het transfectie mengsel 6 uur staan. Vervang het transfectie mengsel door 10 mL verse kweekmedia en incumener de cellen voor 42 h.

3. verzameling van virale eiwit lysaat

  1. Gooi de celmedia 48 h posttransfectie. Plaats elke 100 mm plaat op een bed van ijs. Label 15 mL buizen voor elk Rev-NoLS mutatie monster en plaats de buizen op ijs.
  2. Spoel de cellen voorzichtig af met 10 mL voorgekoelde 1x PBS zonder de cellaag te verstoren. Gooi de 1x PBS weg. Voeg 3 mL lysisbuffer (50 mM tris-HCl [pH 8,0], 137 mM NaCl en 1% X-100 wasmiddel [Zie de tabel van de materialen]), behandeld met cocktail van proteaseremmer, toe aan elk van de 100 mm platen.
  3. Gebruik een celscraper om de cellaag te verstoren. Kantel de plaat en plak de cellen zachtjes in een zwembad. Verzamel het cellenlysaat met een micro Pipet van 1.000 μL en meng de cellysaten van elk van de 3 100 mm platen in de prelabeled 15 mL Tube.
  4. Inbroed de cel lysaat op ijs voor 15 min, grondig elke 5 min. Centrifugeer het cellysaat bij 15.000 x g gedurende 5 min.
  5. Verzamel het eiwit supernatant zonder de pellet van de celresten te verstoren en breng het over naar een andere steriele 15 mL Tube. Verkrijg de virale eiwit lysaat-concentratie met behulp van de Bradford-methode (zie rubriek 4).
  6. Bewaar een aliquot van het ingangs monster (20 μg) voor de westerse immunoblotanalyse. Voeg 2x sample buffer (20% glycerol, 0,02% broomfenolblauw, 125 mm tris-cl [pH 6,8], 5% SDS en 10% 2-mercaptoethanol) toe aan het uiteindelijke volume. Kook het gedurende 10 minuten op 95 °C en bewaar het invoer monster bij-20 °C.

4. Bradford-test

Opmerking: bereid 10x bovien serumalbumine (BSA) van 100x BSA voorraad voor het genereren van eiwit standaard curven.

  1. Aliquot water in micro centrifugebuizen voor de volgende blanco en normen: blank = 800 μL; Standaard 1 = 2 mg/mL, 798 μL; Standaard 2 = 4 mg/mL, 796 μL; Standaard 3 = 6 mg/mL, 794 μL; Standaard 4 = 8 mg/mL, 792 μL; Standaard 5 = 10 mg/mL, 790 μL. aliquot 10x BSA in de volgende aangewezen normen: standaard 1 = 2 μL; Standaard 2 = 4 μL; Standaard 3 = 6 μL; Standaard 4 = 8 μL; Standaard 5 = 10 μL.
  2. Bereid een mengsel van eiwit monsters door het mengen van 795 μL water met 5 μL eiwit monsters. Voeg 200 μL eiwit assay kleurstof reagens (Zie de tabel met materialen) toe aan elk blanco, standaard en eiwit monster. Vortex de monsters kort voor een gelijkmatig mengsel en incuberen bij kamertemperatuur (18-20 °C) gedurende 5 minuten.
  3. Breng de blanco, normen en eiwit monsters over naar cuvettes. Meet de eiwit concentraties bij een OD van 595 nm.

5. coimmunoprecipitatie van Rev-NoLS-3'vlag

  1. Spoel 25 μL m2 affiniteits gelparels (Zie de tabel met materialen) met 500 μL lysisbuffer, behandeld met cocktail van proteaseremmers. Spoel meer affiniteits gelparels uit voor elk mutatie monster en-besturingselementen.
    Opmerking: bereid voldoende m2 Affinity gel kralen voor twee gels (50 μL)-één voor westerse immunoblot analyse en de andere voor eiwit kleuring en massaspectrometrie.
  2. Spin bij 820 x g gedurende 2 minuten bij 4 °c. Verwijder het supernatant. Spoel 2x meer.
  3. Voeg virale proteïne lysaat (1 mg/mL in 5 mL totaal volume) toe aan de prerinsed m2-affiniteits kralen. Pas het totale volume aan met de lysisbuffer.
  4. Inincuberen de reactie voor 3 uur, draaiend bij 4 °C. Centrifugeer de m2-affiniteits kralen/virale eiwit lysaat bij 820 x g gedurende 1 minuut.
  5. Verzamel het supernatant en bewaar een hoeveelheid post-IP monster (20 μg) voor westerse immunoblot analyse. Meet de eiwitconcentratie van het post-IP lysaat. Verzamel 20 μg voor westerse immunoblotting.
  6. Voeg 2x sample buffer toe aan het uiteindelijke volume. Kook het gedurende 10 minuten op 95 °C en bewaar het na-IP-monster bij-20 °C.
  7. Spoel de m2 kralen af met 750 μL lysisbuffer en was de parels op een Rotator bij 4 °C gedurende 5 min. Centrifugeer de m2 kralen op 820 x g en gooi het supernatant weg.
  8. Herhaal stap 5,7 voor nog twee wasjes op een Rotator bij 4 °C gedurende 5 minuten. Na de derde wasbeurt, Verwijder eventuele sporen van lysisbuffer van het m2 kralen/co-IP complex met behulp van een lange gel-loading tip.
    Opmerking: knijp het uiteinde van de gel-loading tip met platte pincet voordat u eventuele sporen van de lysisbuffer verwijdert. Dit voorkomt de verstoring en opname van de m2 kralen.
  9. Respendeer de m2 kralen in 55 μL van 2x laad buffer. Kook het monster gedurende 10 minuten bij 95 °C.
  10. Breng 25 μL eluaat op twee afzonderlijke SDS-PAGE gels (één gel voor westers immunoblotting en de andere voor Coomassie-kleuring).

6. bereiding van SDS-PAGE gels

  1. Gegoten 2 15% SDS-acrylamide oplossing van gels door de volgende reagentia te mengen in een buis van 50 mL (in een eindvolume van 40 mL, voldoende voor vier gels): 4,16 mL ultrapuur water, 15 mL 40% acrylamide: bisacrylamide (29:1), 10 mL 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) , 400 μL 10% SDS, 400 μL van 10% ammonium persulfaat en 40 μL TEMED.
  2. Meng de oplossend gel door de 50 mL buis meerdere malen te inverteren. Pipetteer het oplossend gelmengsel in een voorgespeende westers gelapparaat (vier gels-drie voor westerse immunoblotting en één voor Coomassie/zilver kleuring).
  3. Pipetteer voorzichtig genoeg water om de bovenste laag van het gelmengsel te bedekken. Laat de oplossend gel polymeriseren.
  4. Giet de waterlaag van de oplossend gel met behulp van een delicate taak wisser (Zie de tabel met materialen) om overtollig water te absorberen.
  5. Giet twee 5% SDS-acrylamide stapel gels door de volgende reagentia te mengen in een buis van 50 mL (in een eindvolume van 20 mL, voldoende voor vier gels): 11,88 mL ultrapuur water, 2,5 mL 40% acrylamide: bisacrylamide (29:1), 5,2 mL 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) , 200 μL 10% SDS, 200 μL van 10% ammonium persulfaat en 20 μL TEMED.
  6. Meng de stapel gel door meerdere malen de tube van 50 mL te inverteren. Pipetteer het stapelingsgel mengsel boven de oplossend gel naar de bovenkant van het apparaat.
  7. Plaats een gel cassette kam met het juiste aantal rijstroken in de stapel gel. Absorbeer elke overloop van het gelmengsel met behulp van een delicate taak wisser (Zie de tabel met materialen). Laat de stapel gel volledig polymeriseren.
  8. Overstroming van het Westers gelapparaat met 1x Western Running buffer (5x concentratie: 250 mM tris-cl [pH 8,3], 1,92 M glycine, 0,5% SDS en 10 mM EDTA).
  9. Trek de gel cassette kam voorzichtig uit de stapel gel. Laat de 1x Western Running buffer de laad putten vullen. Spoel elk goed met 1x Western Running buffer met behulp van een injectiespuit voordat u de samples laadt.
  10. Laad de westerse immunoblot monsters in elke corresponderende gel (input samples, coimmunoprecipitated samples en post-IP samples). Laad de Western gel Protein markers.
  11. Laad de coimmunoprecipitated samples voor de Coomassie/Silver kleuring in een andere gel. Laad de Western gel Protein markers.
  12. Sluit het hardloop-gel-apparaat aan op een voedingsbron en voer de gels uit op 100 V totdat de laad kleur de oplossend gel bereikt. Verhoog de spanning tot 140 V tot de laad kleurstof de bodem van de oplossend gel bereikt.

7. overdracht van Western Blot

  1. Demonteer het westerse gelapparaat. Snijd en gooi de stapel gel weg en laat de oplossend gel intact.
  2. Breng de oplossend gels voorzichtig over naar een schoon bakje gevuld met westerse overdrachts buffer (25 mM Tris, 194 mM Glycine, 0,005% SDS, 20% methanol) en laat ze gedurende 15 minuten weken.
  3. Monteer de gel Transfer apparatuur als volgt.
    1. Knip drie PVDF-overdrachts membranen en zes stukjes filtreerpapier (Zie de tabel met materialen) naar de grootte van de oplossend gel.
    2. Dompel het PVDF-membraan in methanol gedurende 5 min. Hydrateer het in water gedurende 5 min. plaats het PVDF-membraan in de westelijke overdrachts buffer totdat het klaar is voor gebruik.
    3. Plaats de gelhouder cassette in een glazen bakplaat die deels is gevuld met de Western Transfer buffer, met de zwarte kant aan de onderkant.
    4. Plaats een schuimkussen met een Western Transfer buffer tegen de zwarte kant van de gelhouder cassette.
    5. Bevochtig een stukje filtreerpapier in de Western Transfer buffer en plaats het bovenop het schuimkussen. Plaats de oplossend gel bovenop het filtreerpapier.
      Opmerking: plaats de oplossend gel in de juiste beladings richting die naar het PVDF-membraan wordt overgebracht.
    6. Plaats één PVDF-overdrachts membraan bovenop de oplossend gel. Bevochtig een stukje filtreerpapier met Western Transfer buffer en plaats het bovenop het PVDF-overdrachts membraan.
    7. Plaats een andere schuimkussen gedrenkt met westerse overdrachts buffer bovenop het filterpapier. Vouw voorzichtig de witte kant van de gel houder cassette bovenop het geweekte schuimkussen. Vergrendel de cassette strak.
    8. Plaats de gelhouder cassette in de elektrode assemblage van de overdrachts apparatuur. Herhaal stap 7.3.4-7.3.8 voor elke resterende oplossend gel.
    9. Vul de transfer apparaat tank met Western Transfer buffer. Plaats een roerstaaf in de apparaat tank.
    10. Plaats de apparaat tank bovenop een roer plaat. Stel de roer instelling in op 5-6 en zorg ervoor dat de roer stang niet vastzit of op de cassettes van de gelhouder raakt.
    11. Sluit de gel Transfer apparaat aan op een voedingsbron en breng de gel aan op 100 V gedurende 1 uur bij 4 °C.

8. immunoblotting

  1. Verwijder de cassette van de gel houder en plaats de zwarte kant tegen een schone glazen bakplaat. Open de cassette en gooi het schuimkussen en filtreerpapier voorzichtig weg. Markeer een hoek van het PVDF-membraan om de juiste laad richting te bepalen. Houd het membraan nat.
    Opmerking: het PVDF-membraan kan worden gedroogd en in een schone, verzegelde container worden opgeslagen. Hydrateer het membraan door de stappen 7.3.2 te herhalen.
  2. Plaats het membraan in 100 mL blokkerende oplossing (5% melk, 1x TBS en 0,1% Tween 20). Blokkeer het membraan door zachtjes te schommelen bij kamertemperatuur (18-20 °C) gedurende 1 uur.
  3. Snijd over het membraan boven de 25 kDa eiwit marker. Plaats het bovenste gedeelte van het membraan, met eiwit banden groter dan 25 kDa, in blokkerende oplossing met B23 muis monoklonaal IgG1 (1:500 verdunning). Blokkeer 's nachts, schommelen bij 4 °C.
  4. Plaats het onderste gedeelte van het membraan, met eiwit banden kleiner dan 25 kDa, in blokkerende oplossing met m2 muis monoklonaal IgG1 (1:1000 verdunning, zie de tabel met materialen). Blokkeer 's nachts, schommelen bij 4 °C.
  5. Was het membraan 3x voor 10 min in 25 mL Western Wash Solution (1x TBS, 0,1% Tween 20) op een schommel platform.
  6. Inincuberen van de membranen in geit-anti-muis IgG1-HRP (1:5000 verdunning) verdund in blokkerende oplossing voor 1 uur bij kamertemperatuur. Was het membraan 3x voor 10 min in 25 mL Western Wash oplossing op een schommel platform.
  7. Bereid chemiluminescentie Western blotting substraat. Gebruik een P1000 micropipet om het substraat aan het membraan toe te voegen.
  8. Ontwikkelen van elk membraan in chemiluminescentie Western blotting substraat voor 5 min. Verwijder het membraan van het substraat. Absorbeer overtollig substraat met behulp van een delicate taak wisser (Zie de tabel met materialen).
  9. Plaats het membraan in een schone blad beschermer die aan de binnenzijde van een cassette is geplakt. Neem de cassette in een donkere kamer en plaats één vel folie in de cassette. Vergrendel de cassette op zijn plaats en inbroed gedurende 5 – 15 minuten. Verwijder de film uit de cassette en ontwikkel deze.

9. Coomassie-kleuring

  1. Demonteer het westerse gelapparaat. Snijd en gooi de stapel gel weg en laat de oplossend gel intact. Breng de oplossend gel voorzichtig over naar een schoon bakje gevuld met 25 mL ultrazuiver water.
  2. Inbroed de gel op een schommel platform voor 15 min. gebruik zacht schommelen om te voorkomen dat de oplossend gel breekt. Gooi het ultrapuur water weg en herhaal de wasstap 2x meer.
    Opmerking: Als SDS Bubbles na de wasstappen blijven, kan de gel 's nachts in ultrapuur water worden gewassen. Het resterende VIB kan een hoge achtergrondkleuring van de gel veroorzaken.
  3. Meng het Coomassie vlek reagens door de fles te inverteren (Zie de tabel met materialen). Plaats 100 mL Coomassie Stain reagens om de oplossend gel te bedekken en inbroed de gel op een schommel platform voor 1 uur. Gooi het Coomassie Stain-reagens weg en was de gel in gedeïoniseerd water op een schommel platform gedurende 15 minuten.
  4. Gooi het gedeïoniseerde water weg. Herhaal de wasstap 2x meer. Blijf de gel wassen totdat de gewenste resolutie van de eiwit band wordt waargenomen.

10. zilver kleuring

  1. Demonteer het westerse gelapparaat. Snijd en gooi de stapel gel weg en laat de oplossend gel intact. Breng de oplossend gel voorzichtig over naar een schoon bakje gevuld met 25 mL ultrazuiver water.
  2. Inbroed de gel op een schommel platform voor 15 min. gebruik zacht schommelen om te voorkomen dat de oplossend gel breekt. Gooi het ultrapuur water weg en herhaal de wasstap 2x meer.
    Opmerking: Als SDS Bubbles na de wasstappen blijven, kan de gel 's nachts in ultrapuur water worden gewassen. Het resterende VIB kan een hoge achtergrondkleuring van de gel veroorzaken.
  3. Bevestig de gel in 30% ethanol: 10% azijnzuur oplossing (6:3:1 water: ethanol: azijnzuur) 's nachts bij kamertemperatuur. Was de gel in een 10% ethanol oplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Vervang de ethanol oplossing en was nog 5 min.
  4. Bereid de werkoplossing voor sensibilisator uit de Pierce Silver Stain Kit door het mengen van een deel zilver vlek sensibilisator met 500 onderdelen ultrapuur water (50 μL van sensibilisator met 25 mL ultrapuur water). Incuberen de oplossend gel in de werkoplossing van de sensibilisator gedurende 1 minuut. was de gel in ultrapuur water gedurende 1 minuut, vervang het water en was de gel opnieuw gedurende 1 minuut.
  5. Bereid vlek werkoplossing door het mengen van één-delige Silver Stain Enhancer met 50 delen zilver vlek (500 μL Enhancer met 25 mL zilver vlek). Inbroed de gel in vlekkenwerk oplossing gedurende 30 minuten.
  6. Bereid de werkoplossing van de ontwikkelaar voor door 1 deel Silver Stain Enhancer te mengen met 50 Parts Silver Stain Developer (500 μL Enhancer met 25 mL ontwikkelaar). Bereid 5% azijnzuur oplossing als stop oplossing. Was de gel met ultrapuur water gedurende 1 minuut, vervang het water en was de gel 1 minuut extra.
  7. Vervang het water met Developer Working Solution en inincuberen totdat de gewenste proteïne band intensiteit is verdwenen (5 min). Vervang de Developer Working Solution met stop Solution en inincuberen gedurende 10 min.

11. in-gel reductie, alkylatie en vertering van Coomassie-gekleurde gelbanden

  1. Snijd de gelbanden van de gel met een schoon scheermesje. Snijd elke Gelband in ongeveer 5 mm blokjes en plaats ze in een schone micro centrifugebuis van 0,5 mL.
  2. Destain de gelstukken door ze te bedekken met 100 mM ammoniumbicarbonaat in 1:1 acetonitril: water bij kamertemperatuur gedurende 15 min. Gooi het supernatant weg. Herhaal deze stap.
  3. Droog de gelstukken gedurende 5 minuten in een vacuüm centrifuge. Verminder de eiwitten door de gedroogde gelstukken met 10 mm dithiotreïtol in 100 mm Ammoniumbicarbonaat te bedekken en deze gedurende 1 uur bij 56 °c te bebroed.
  4. Pipetteer elke supernatant af. Alkylaat de eiwitten door de gelstukken met 100 mM iodoacetamide in water te bedekken en deze gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker te bebroed.
  5. Pipetteer het supernatant en verklein de gelstukken door ze met acetonitril te bedekken en ze gedurende 15 minuten zachtjes op kamertemperatuur te schudden. Pipetteer het supernatant en reswell de gelstukken door ze te bedekken met 100 mM Ammoniumbicarbonaat en schud ze zachtjes bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
  6. Herhaal stap 11,5. Droog de gelstukken gedurende 5 minuten in een vacuüm centrifuge.
  7. Bedek de gelstukken met 50 ng/μL sequentie graad gemodificeerde trypsine (Zie de tabel met materialen) in 100 mm Ammoniumbicarbonaat. Laat de gel 5 minuten zwellen; Pipetteer vervolgens de resterende oplossing. Bedek de gelstukken met 100 mM Ammoniumbicarbonaat en laat ze volledig reseren, waarbij extra 100 mM Ammoniumbicarbonaat wordt toegevoegd zodat de gelstukken volledig bedekt zijn.
  8. Incuberen de gelstukken 's nachts bij 37 °C. Stop de reactie door 1/10 van het volume van 10% mierenzuur in water toe te voegen. Verzamel de supernatant van elke buis.
  9. Pak de gelstukken door ze te bedekken met 1% mierenzuur in 60% acetonitril en inbroed ze gedurende 15 minuten met zacht schudden.
  10. Verminder het volume van de gecombineerde supernatanten tot minder dan 20 μL in een vacuüm centrifuge, terwijl u er voor zorgt dat de supernatanten niet volledig worden gedroogd. Voeg 1% mierenzuur toe om het totale volume terug te brengen tot 20 μL.

12. vloeistofchromatografie/massaspectrometrie

Opmerking: de monsters werden geanalyseerd met behulp van een massaspectrometer die is uitgerust met ultra HPLC, een nano spray-bron en een kolom (Zie de tabel met materialen). Oplosmiddelen A en B zijn respectievelijk 0,1% mierenzuur in water en acetonitril.

  1. Laad de verteerde eiwitten in hoge terugwinning polypropyleen autosampler flesjes. Laad de injectieflacons in de monster beheerder van een UPLC-systeem.
  2. Injecteer 6 μL van elk monster. Laad elk monster in de kolom overvulling van de nanotile voor 1,5 min bij 8 μL/min, met 99% oplosmiddel A/1% oplosmiddel B.
  3. Elute de peptiden in de massaspectrometer met een lineaire gradiënt van 3% tot 35% oplosmiddel B over 30 min, gevolgd door een gradiënt van 35% tot 50% oplosmiddel B over 4 min en 50% tot 90% oplosmiddel B over 1 min. Handhaaf 90% acetonitril gedurende 3 min; Verminder vervolgens de% B terug naar 3% over 5 min.
  4. Verwerven van positieve Ion profiel Mass spec gegevens in resolutie (20.000 resolutie) modus. Gegevens verzamelen van 100 tot 2.000 da met een snelheid van één scan elke 0,6 s. gegevens in MSE -modus verzamelen door afwisselende scans zonder botsingsenergie en scans met verhoogde aanrij energie.
  5. Voor de verhoogde botsing energie, helling de botsing energie in de Overvulcel van 15 V tot 40 V. verwerven van een lock Mass scan elke 30 s, met behulp van de + 2 Ion van [glu1]-fibrinopeptide B als de Lock Mass. Een gegevensbestand verkrijgen met behulp van een lege injectie van oplosmiddel A, met dezelfde verwervingsmethode tussen elk paar monsters om de overdracht te regelen.

13. gegevensanalyse voor massaspectrometrie

  1. Kopieer de Mass spectrometrie resultaten bestanden naar de computer met een kwantitatief en kwalitatief proteomica onderzoeksplatform (bijvoorbeeld proteinlynx Global Server). Gegevensanalyse is zeer CPU-intensief en moet worden uitgevoerd op een afzonderlijke, High-Performance Data Analysis computer.
  2. Maak een nieuw project voor de gegevens. Maak een nieuwe microtiterplaat die de autosampler plaat vertegenwoordigt. Wijs de monsters op dezelfde positie in de microtiterplaat als hun positie in de autosampler.
  3. Wijs elke voorbeeld verwerkingsparameters toe. Parameters voor gebruik zijn automatische chromatografische piekbreedte en MSTOF resolutie; lage-energie drempel, 100 telt; verhoogde-energie drempel, 5 tellingen; drempelwaarde voor intensiteit, 500 telt.
  4. Wijs elke voorbeeld workflowparameter toe. Parameters voor gebruik zijn database, samengevoegd Human SwissProt en HIV, met omgekeerde sequenties; automatische peptide en fragment tolerantie; min fragment Ion-matches per peptide, 3; min fragment Ion-matches per eiwit, 7; min peptide matches per proteïne, 1; primair samenvatting reagens, trypsine; gemiste decolleté, 1; vaste modificatie reagentia, carbamidomethyl C; variabele modificatie reagentia, oxidatie M; False Discovery rate, 100.
  5. Selecteer de voorbeelden en kies meest recente onbewerkte gegevens verwerken. Wanneer de zoekopdracht is voltooid, selecteert u de voorbeelden en kiest u gegevens exporteren naar Scaffold (versie 3). Open Scaffold, maak een nieuw bestand, en Importeer elk bestand geëxporteerd uit het proteomica platform als een nieuwe biosample met precursor Ion kwantatie.
  6. Wanneer alle bestanden zijn geïmporteerd, gaat u naar het scherm gegevens laden en analyseren . Selecteer dezelfde database die wordt gebruikt voor het zoeken en importeren van gegevens met behulp van LFDR scoring en standaard experiment-brede eiwit groepering. Stel weergaveopties in op de waarschijnlijkheid van eiwit identificatie, de eiwit drempel tot 20%, het minimum aantal peptiden tot 1 en de peptide drempel tot 0% tijdens de analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rev-NoLS single-en multiple-Point arginine mutaties, overeenkomend met een verscheidenheid van subcellulaire lokalisatie patronen, werden onderzocht in hun vermogen om te communiceren met cellulaire host factoren in vergelijking met WT Rev. WT Rev-3'vlag en pcDNA-Flag vector werden uitgedrukt in de HLfB-cultuur. Eiwitcomplexen werden verwerkt uit het totale cellysaat en gekleurd met Zilvervlek reagens. Rev-NoLS-3'flag is detecteerbaar (ongeveer 18 kDa) in drie verschillende lysisbuffer condities met verschillende concentraties van NaCl (137 mM, 200 mM en 300 mM) in Figuur 1. B23 was detecteerbaar (37 kDa) in lysisbuffer met een lagere zoutconcentratie (137 mM, rijstroken 2 – 4), nauwelijks detecteerbaar in lysisbuffer met 200 mM NaCl, en niet detecteerbaar in lysisbuffer met een hoge zoutconcentratie (300 mM NaCl). In Figuur 2, WT Rev-3'Flag, Rev-Nols M1-3 ' vlag, en pcDNA-Flag vector werden uitgedrukt in de hlfb-cultuur. Eiwitcomplexen werden verwerkt uit totaal celllysaten bereid uit twee lysisbuffer condities (137 mM en 200 mM NaCl). M2 muis monoklonaal IgG1 werd gebruikt bij de detectie van Rev-3'flag expressie van celllysates. B23 detectie was optimaal in lysisbuffer met 137 mM NaCl met WT Rev-3'flag (input en α-Flag-Rev IP) maar verloren affiniteit met Rev-NoLS M1-3 ' vlag. B23 affiniteit met WT Rev-3'flag daalde met een hogere zoutconcentratie in lysisbuffer met 200 mM NaCl. pcDNA negatieve controle gaf geen niet-specifieke immunodetectie in input en α-Flag-Rev IP van alle lysisbuffer condities.

Elutie-condities werden geoptimaliseerd voor rev-NoLS-3'flag IP in Figuur 3. WT Rev-3'flag en pcDNA-Flag vector werden uitgedrukt in de hlfb-cultuur. Eiwitcomplexen werden verwerkt uit de totale cellysaten en geeleerde met behulp van drie verschillende omstandigheden om lichte en zware ketting achtergrond uit te roeien (25 en 50 kDa)-2x sample-laad buffer bij 37 °C gedurende 15 minuten, 2x sample-laad buffer bij 95 °C gedurende 3 minuten en 3x vlag peptid e bij 4 °C gedurende 30 min. Rev NoLS-3'flag (~ 18 kDa) was het meest detecteerbaar na elutie door het koken in 2x sample laad buffer. B23 (~ 37 kDa) was detecteerbaar onder twee omstandigheden-37 °C incubatie in 2x monster laad buffer voor 15 min en 95 °C incubatie in 2x sample laad buffer gedurende 3 min.

M2 (nucleair/nucleolar in lokalisatie, niet functioneel bij HIV-1HXB2 productie), M6 (nucleolar in patroon, FUNCTIONEEL in HIV-1HXB2 productie), en M9 (verspreid in het cytoplasma/Nucleus, niet-functioneel in virale productie) werden uitgedrukt in de HLfB-cultuur. Eiwitcomplexen werden verwerkt uit het totale cellysaat, door een incubatie van 95 °C in 2x monster laad buffer gedurende 3 minuten, en opgelost in Zilvervlek reagens (Figuur 4). WT Rev was detecteerbaar na IP-vlag reactie. Rev-NoLS m2, M6 en M9 waren ook detecteerbaar bij 18 kDa. Bands overeenkomend met B23 eiwit werden waargenomen bij de 37 kDa marker. Eiwitcomplexen werden verder waargenomen in elke baan overeenkomend met IP-reacties van WT Rev, m2, M6, M9, en pcDNA negatieve achtergrondcontrole. Eiwit lysaten werden geanalyseerd door immunodetectie voor α-Flag-rev en B23. Overvloedige WT rev en gematigde niveaus van M6 werden uitgedrukt (α-vlag input) en detecteerbaar na vlag IP (α-Flag-Rev IP, Figuur 5). M2 en M9 waren niet sterk uitgedrukt uit 20 μg eiwit lysaat input maar detecteerbaar bij lage intensiteit na vlag IP van 5 mg eiwit lysaat. pcDNA negatieve controle gaf geen niet-specifieke immunodetectie in input en α-Flag-Rev IP. B23 affiniteit met WT Rev werd waargenomen na IP-vlag reactie (B23 co-IP). B23 affiniteit werd licht waargenomen met m2 (twee éénpuntsmutaties R48, 50G) en M6 (Single-Point mutatie R50G). B23 affiniteit was verloren in de aanwezigheid van drie single-point mutaties van M9 (R46, 48, 50G) binnen Rev-NoLS.

Totaal lysaten van immunoprecipitated WT rev en Rev-NoLS-3'flag mutaties (4, 5, 6 en 8) werden verwerkt, gekleurd met Coomassie-reagens en gevisualiseerd in vergelijking met seriële verdunningen van BSA (rechter paneel). Rev-NoLS-3'flag is detecteerbaar (12,5-25 μg) in aanwezigheid en afwezigheid van mutaties bij 18 kDa (Figuur 6). Eiwitcomplexen verwerkt van IP-reacties van WT Rev-3'flag, nucleollaire-lokaliserende Rev-NoLS-3'flag mutaties (M4, M5 en M6), en negatieve controle pcDNA-vlag werden gevisualiseerd in SDS-page gels gekleurd met Coomassie-reagens (Figuur 7). WT Rev (WT1 en WT2) was detecteerbaar na IP-vlag reactie op 18 kDa. Rev-NoLS mutaties waren licht detecteerbaar na expressie in de HLfB en IP Flag reactie. pcDNA negatieve controle gaf geen niet-specifieke achtergrond aan 18 kDa.

Immunoprecipitated lysaten bereid uit WT Rev-3'flag, m2, M6, M9, en negatieve controle pcDNA-vlag (weergegeven in Figuur 4) werden geanalyseerd door tandem massaspectrometrie. Eiwit-identificatie waarschijnlijkheid (in procenten) wordt weergegeven voor vergelijking van eiwit interacties die optreden bij elke nucleollaire-localiserende Rev-NoLS-mutatie versus WT Rev (tabel 1). Cellulaire eiwitten, waarvan sommige nucleollaire in lokalisatie patroon (ribosomale isoforms, eukaryotische vertaling initiatie factor 48, snoRNA C/D Box 58B, en nucleophosmin B23), werden geïdentificeerd als directe/indirecte bindende partners van WT Rev. deze nucleolar factoren verloren binding affiniteit aan m2 (twee éénpunts-mutaties R48, 50G), M6 (Single-Point mutatie R50G) en M9 (drie eenpunts mutatie R46, 48, 50G), vergelijkbaar metcDNA -negatieve controle. Elke rijstrook van de Coomassie-gebeitste gel in Figuur 6 werd verwerkt voor tandem massaspectrometrie (tabel 2). Peptide affiniteit met Rev-NoLS mutaties werd geanalyseerd en weergegeven met behulp van eiwit identificatie waarschijnlijkheid (in procenten). Een verscheidenheid van cellulaire eiwitten, waarvan sommige nucleolar in lokalisatie patroon (nucleolin C23, nucleophosmin B23, en nucleosome assemblage eiwit), werden geïdentificeerd als directe/indirecte eiwit bindende factoren van WT Rev. deze nucleollaire factoren waren niet geïdentificeerd om te binden met M4, M5 en M6. Transport factoren ARHGEF1 (Rho guanine nucleotide Exchange factor 1) en TBC1D24 (TCB1 domein familie, lid 24) verloren in affiniteit in aanwezigheid van Rev-NoLS mutaties. Splicing factoren hnRNPC (heterogene ribonuclear proteïne C) en PNN (pinin, desmosome-geassocieerde eiwitten) werden bovendien waargenomen om te binden aan WT Rev, die interactie met Rev single-point nucleolaire mutaties verloor.

Figure 1
Figuur 1 : Optimalisatie van celllysiscondities voor rev-3'flag co-IP tijdens de HIV-1-productie. WT Rev-NoLS-3'vlag en negatieve controle pcDNA-Flag IP-condities werden geoptimaliseerd in drie verschillende NaCl-concentraties (137 mm, 200 mM en 300 mm) in lysisbuffer. Zoals waargenomen door zilver kleuring, 137 mm NaCl was de optimale zoutconcentratie voor rev immunoprecipitatie en B23 binding. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2 : Optimalisatie van lysiscondities voor rev-3'flag co-IP en B23 immunodetectie tijdens de HIV-1-productie. WT Rev-NoLS-3'flag, M1-3 ' vlag en negatieve controle pcDNA-Flag IP-condities werden geoptimaliseerd in twee verschillende NaCl-concentraties (137 mm en 200 mm) in lysisbuffer. Zoals waargenomen door middel van immunodetectie, 137 mm NaCl was de optimale zoutconcentratie voor rev immunoprecipitatie en B23 binding. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3 : Optimalisatie van Rev-3'flag co-IP elutie tijdens de HIV-1-productie, gevisualiseerd door zilver kleuring. Eiwitcomplexen werden verwerkt uit de totale cellysaten bereid tijdens WT Rev-3'flag en pcDNA-Flag IP. Drie verschillende elutie-condities werden getest-2x sample-laad buffer bij 37 °C gedurende 15 minuten, 2x sample-laad buffer bij 95 °C gedurende 3 minuten en 3x-vlag peptide bij 4 °C gedurende 30 minuten. De optimale elutie condities van WT Rev traden op na de incubatieperiode van 15 minuten in 2x sample-laad buffer bij 37 °C en na de incubatieperiode van 3 minuten in 2x sample-laad buffer bij 95 °C. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4 : Immunoprecipatie van Rev-3'flag-mutaties 2, 6 en 9 tijdens de HIV-1-productie. Eiwitcomplexen die direct/indirect gebonden zijn met WT Rev, m2 (R48, 50G), M6 (R50G), M9 (R46, 48, 50G) en negatieve controle pcDNA-flag in de aanwezigheid van HIV-1-replicatie worden weergegeven in een zilverkleurige SDS-page gel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5 : Rev-3'flag co-IP van mutaties 2, 6 en 9 voor B23 immunodetectie tijdens de HIV-1 productie. De eiwithoudende lysaten en IP-reacties bereid uit WT Rev, m2, M6, M9 en negatieve controle pcDNA-flag in Figuur 4 werden verder geanalyseerd door immunodetectie voor α-Flag-rev en B23. WT rev en Mutant expressie, evenals interactie met B23 nucleocytoplasmorische eiwit, worden waargenomen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6 : Kwantificering van Rev-NoLS mutaties 4, 5, 6 en 8 na de vlag IP-reactie . IP-reacties van de HLfB die WT rev en nucleolar-localisatie M4 (R46G), M5 (R48G), M6 (R50G), M8 (ΔRQ) en negatieve controle pcDNA-Flag uitdrukt, werden gemeten voor eiwitconcentratie met behulp van seriële verdunningen van BSA. Voor elk monster werd een eiwitconcentratie van 12,5-25 μg waargenomen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 7
Figuur 7 : Immunoprecipatie van nucleollaire-localiserende Rev-NoLS mutaties 4, 5 en 6 tijdens de HIV-1-productie. Coomassie-gekleurd SDS-PAGE gel met immunoprecipitated proteïne complexen van WT Rev (1 en 2), M4, M5 en M6 worden getoond. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Geïdentificeerde eiwitten Molecuulgewicht WT Rev M2 M6 M9
signaal herkenning deeltje 14kDa (Homologous Alu RNA binding Protein) 15 kDa 95% 0 0 0
ribosomaal eiwit S3A 30 kDa 95% 0 0 0
eukaryotische vertaling initiatie factor 4B 69 kDa 95% 0 0 0
ribosomaal eiwit L31 14 kDa 91% 0 0 0
ribosomaal eiwit L12 18 kDa 93% 0 0 0
ribosomaal eiwit L22 15 kDa 91% 0 0 0
kleine nucleollaire RNA, C/D vak 58B 15 kDa 87% 0 0 0
zink vinger, CCHC domein met 11 185 kDa 87% 0 0 0
actine binding LIM proteïne 1 79 kDa 79% 0 0 0
ribosomaal eiwit S13 17 kDa 78% 0 0 0
nucleolaire fosfoproteïne B23, numatrin) 33 kDa 73% 0 0 0

Tabel 1: identificatie van cellulaire host factoren die met WT Rev tijdens de productie van HIV-1 communiceren. Eiwit eluaten bereid uit WT Rev, m2, M6, en M9 werden direct geanalyseerd door tandem massaspectrometrie. Eiwit interacties die direct/indirect gebonden zijn aan WT Rev versus m2, M6 en M9 worden samengevat door de proteïne-identificatie waarschijnlijkheid (in procenten).

Geïdentificeerde eiwitten Molecuulgewicht M4 M5 M6 Wt pCDNA
poly (A) bindend eiwit, cytoplasmatische 1 61 kDa 98% 0 100% 100% 0
hitteschok 70kDa eiwit 1B 70 kDa 100% 100% 100% 100% 0
ribosomaal eiwit L7 29 kDa 91% 0 100% 100% 0
Histon cluster 1, H1e 22 kDa 0 0 100% 100% 0
ribosomaal proteïne L4 48 kDa 95% 0 100% 100% 0
ribosomaal eiwit L13 24 kDa 99% 0 100% 100% 0
complement component 1, q subonderdeel bindend proteïne 31 kDa 100% 100% 100% 100% 0
Y doos binding proteïne 1 36 kDa 0 0 100% 100% 0
nucleosome assemblage eiwit 1-achtige 1 45 kDa 0 0 0 100% 0
ribosomaal eiwit N8 28 kDa 89% 36% 100% 100% 0
ribosomaal eiwit L18 22 kDa 27 0 100% 100% 0
hitteschok 70kDa proteïne 8 71 kDa 5 99% 100% 100% 0
ribosomaal eiwit L19 23 kDa 10 0 81% 100% 0
ribosomaal eiwit L27 16 kDa 92% 0 100% 100% 0
ribosomaal eiwit L7a 30 kDa 0 0 100% 100% 0
ribosomaal eiwit L24 18 kDa 0 0 100% 99% 0
tubulin, bèta klasse I 50 kDa 92% 69% 100% 100% 0
ribosomaal eiwit L6 33 kDa 0 0 100% 100% 0
hitteschok 70kDa proteïne 9 (mortalin) 74 kDa 33% 99% 100% 100% 0
ribosomaal proteïne S2 31 kDa 87% 0 100% 100% 0
caseïne kinase 2, Alfa 1 polypeptide 45 kDa 0 0 50% 100% 0
ribosomaal eiwit l14 23 kDa 0 0 81% 100% 0
ribosomaal eiwit, groot, P0 34 kDa 0 0 100% 100% 0
Histon cluster 1, H1b 23 kDa 0 0 73% 100% 0
hitteschok 70kDa proteïne 5 (glucose-gereguleerd proteïne) 72 kDa 99% 0 100% 100% 0
ribosomaal eiwit S4, X-gebonden 30 kDa 0 0 100% 100% 0
ribosomaal eiwit S20 13 kDa 98% 94% 99% 99% 0
ribosomaal eiwit L28 16 kDa 0 0 100% 99% 0
ribosomaal proteïne S14 16 kDa 0 0 100% 100% 0
ribosomaal eiwit S3A 30 kDa 0 0 100% 100% 0
ribosomaal eiwit L21 19 kDa 0 0 100% 100% 0
zink vinger CCCH-type, antivirale 1 101 kDa 0 0 97% 100% 0
Histon cluster 1, H1c 21 kDa 0 0 0 98% 0
ribosomaal eiwit L36 12 kDa 0 0 100% 100% 0
ribosomaal eiwit S18 18 kDa 90% 0 100% 100% 0
modulator van apoptosis 1 40 kDa 42% 88% 34% 0 0
ribosomaal eiwit L17 21 kDa 0 0 100% 100% 0
ribosomaal eiwit S26 13 kDa 91% 0 99% 98% 0
ribosomaal eiwit B32 18 kDa 0 0 48% 100% 0
ribosomaal eiwit L35 15 kDa 0 0 97% 100% 0
ribosomaal eiwit L29 18 kDa 0 0 57% 94% 0
ribosomale proteïne S9 23 kDa 0 0 100% 100% 0
heterogene nucleaire RiboNucleoProteïne H1 (H) 51 kDa 98% 0 100% 100% 0
ribosomaal eiwit S8 22 kDa 0 0 78% 100% 0
ribosomaal eiwit L10 25 kDa 0 0 100% 100% 0
ribosomaal eiwit L23a 18 kDa 0 0 68% 100% 0
ribosomale proteïne S6 29 kDa 0 0 100% 100% 0
ribosomaal eiwit L31 14 kDa 0 0 95% 100% 0
ribosomaal eiwit S13 17 kDa 0 0 100% 99% 0
ribosomaal eiwit L10a 25 kDa 45% 0 81% 100% 0
poly (A) bindend eiwit, cytoplasmatische 4 (indusgebonden vorm) 70 kDa 0 0 100% 100% 0
transmembraan emp24 eiwit transport domein met 1 25 kDa 0 0 0 100% 0
EBNA1 binding proteïne 2 35 kDa 0 0 69% 100% 0
gekonveerde Helix-lus-Helix alomtegenwoordige kinase 85 kDa 74% 92% 65% 83% 0
ribosomaal eiwit L12 18 kDa 0 0 57% 100% 0
ribosomaal eiwit S24 15 kDa 0 0 100% 100% 0
koude schok domein proteïne A 40 kDa 0 0 0 100% 0
ribosomaal eiwit L27a 17 kDa 0 0 89% 99% 0
heterogene nucleaire RiboNucleoProteïne F 46 kDa 0 0 99% 99% 0
ribosomaal eiwit L11 20 kDa 0 0 99% 100% 0
ribosomaal eiwit L26-achtige 1 17 kDa 0 0 100% 100% 0
caseïne kinase 2, alpha Prime polypeptide 41 kDa 0 0 0 100% 0
Tubuline, Alfa 1a 50 kDa 33% 0 100% 0 0
ribosomaal eiwit L3 46 kDa 0 0 86% 94% 0
mitochondriaal ribosomaal eiwit L15 33 kDa 0 0 100% 99% 0
nucleolin 77 kDa 0 0 25 100% 0
mitochondriaal ribosomaal eiwit S21 11 kDa 0 0 93% 94% 0
KRR1, kleine subeenheid (Ssu) processome component, homo (gist) 44 kDa 89% 0 76% 99% 0
mitochondriaal ribosomaal proteïne S7 28 kDa 0 0 0 100% 0
chloride kanaal, nucleotide-gevoelig, 1A 22 kDa 0 0 97% 86% 0
cycline B3 158 kDa 0 0 67% 49% 0
Guanine nucleotide bindende proteïne-achtige 3 (nucleolar) 61 kDa 0 0 99% 98% 0
mitochondriaal ribosomaal eiwit S23 22 kDa 0 0 100% 50% 0
mitochondriaal ribosomaal proteïne S22 41 kDa 0 0 0 99% 0
nucleolaire fosfoproteïne B23, numatrin) 33 kDa 0 0 52% 97% 0
ribosomaal proteïne S19 16 kDa 0 0 0 99% 0
Glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase 36 kDa 0 0 100% 0 0
Histon cluster 1, H2bg 14 kDa 0 0 53% 72% 0
ribosomaal eiwit S23 16 kDa 0 0 68% 0 0
Rho guanine nucleotide uitwisselings factor (GEF) 1 104 kDa 0 0 0 94% 0
dood geassocieerde eiwitten 3 46 kDa 0 0 87% 87% 0
mitochondriale ribosomale proteïne S6 14 kDa 0 0 52% 84% 0
ribosomaal eiwit L39 6 kDa 0 0 0 87% 0
mitochondriaal ribosomaal eiwit S28 21 kDa 0 0 85% 99% 0
Histon cluster 1, H4h 11 kDa 0 0 0 93% 0
mitochondriaal ribosomaal eiwit L43 23 kDa 0 0 0 97% 0
ribosomaal proteïne S15 17 kDa 0 0 0 85% 0
ribosomaal eiwit S12 15 kDa 0 0 68% 39% 0
ribosomaal eiwit L35a 13 kDa 0 0 0 96% 0
mitochondriaal ribosomaal eiwit L38 45 kDa 0 0 42% 98% 0
mitochondriaal ribosomaal proteïne S14 15 kDa 0 0 45% 76% 0
fosfodiësterase 5A, cGMP-specifiek 95 kDa 14 0 0 72% 0
ribosomaal eiwit L15 24 kDa 0 0 0 56% 0
heterogene nucleaire RiboNucleoProteïne C (C1/C2) 22 kDa 0 0 0 100% 0
mitochondriaal ribosomaal proteïne s16 11 kDa 0 0 0 92% 0
ribosomaal eiwit S15a 15 kDa 0 0 0 91% 0
neurexin 2 185 kDa 0 50% 0 0 0
Autisme susceptibiliteit kandidaat 2 139 kDa 0 0 46% 0 0
mitochondriaal ribosomaal eiwit L17 20 kDa 0 0 0 92% 0
splicing factor 3a, subeenheid 1, 120kDa 89 kDa 0 0 56% 89% 0
La RiboNucleoProteïne domein familie, lid 1 116 kDa 0 0 65% 66% 0
leprecan-zoals 2 62 kDa 0 0 0 68% 0
ribosomaal eiwit L18a 21 kDa 0 0 0 86% 0
ribosomaal eiwit L23 15 kDa 0 0 60% 47% 0
transmembraan emp24 eiwit transport domein met 9 27 kDa 0 0 0 78% 0
signaal herkenning deeltje 72kDa 75 kDa 0 0 0 100% 0
Lectine, galactoside-binding, oplosbaar, 3 26 kDa 0 71% 28 0 0
mitochondriaal ribosomaal eiwit L1 37 kDa 0 0 0 69% 0
H1 Histon familie, lid X 22 kDa 0 0 0 96% 0
caseïne kinase 2, Beta polypeptide 25 kDa 0 0 0 89% 0
opgeloste stof Carrier familie 4, natriumbicarbonaat cotransporter, lid 7 118 kDa 82% 0 0 0 0
WD Herhaal domein 13 54 kDa 0 81% 0 0 0
transcriptie rek factor A (SII), 3 17 kDa 0 0 0 38% 0
ribosomaal proteïne s16 16 kDa 0 0 75% 0 0
SP140 nucleair lichaam eiwit 92 kDa 0 0 0 64% 0
otoferlin 227 kDa 62% 0 0 0 0
Golgi transport 1B 15 kDa 0 0 0 33% 0
mitochondriaal ribosomaal eiwit s34 26 kDa 0 0 0 33% 0
ribosomaal eiwit l30 13 kDa 0 0 0 49% 0
actine binding LIM proteïne 1 96 kDa 0 0 0 43% 0
Guanine nucleotide bindende proteïne-achtige 2 (nucleolar) 84 kDa 40% 0 0 0 0
hoge dichtheid lipoproteïne bindend eiwit 141 kDa 0 0 34% 0 0
adenosine deaminase, RNA-specifieke, B2 81 kDa 0 0 28 0 0
cystatin E/M 17 kDa 0 27 0 0 0
zink vinger proteïne 786 80 kDa 0 0 23 0 0
pleckstrin homologie-achtig domein, familie B, lid 1 145 kDa 0 0 0 95% 0
eiwit fosfatase methylesterase 1 44 kDa 0 0 94% 0 0
Janus kinase en microtubulus interactie met proteïne 2 95 kDa 0 0 0 94% 0
signaal herkenning deeltje 68kDa 67 kDa 0 0 0 93% 0
TBC1 domein familie, lid 24 63 kDa 0 0 0 89% 0
mitochondriaal ribosomaal eiwit L27 16 kDa 0 0 0 89% 0
mitochondriaal ribosomaal proteïne L2 24 kDa 0 0 0 88% 0
mitochondriaal ribosomaal proteïne S2 33 kDa 0 0 0 87% 0
Pentatricopeptide herhalings domein 3 79 kDa 0 0 0 84% 0
ribosomaal eiwit, groot, P2 12 kDa 0 0 0 76% 0
IMP (Inosine 5 '-monofosfaat) dehydrogenase 2 56 kDa 0 0 76% 0 0
tubulin, Beta 4B klasse IVb 50 kDa 0 0 76% 0 0
mitochondriaal ribosomaal proteïne L23 19 kDa 0 0 0 74% 0
mitochondriaal ribosomaal proteïne S31 45 kDa 0 0 0 74% 0
galactose-3-O-sulfotransferase 1 49 kDa 74% 0 0 0 0
suppressor van de variegatie 4-20 homo 1 (Drosophila) 99 kDa 0 72% 0 0 0
mitochondriaal ribosomaal eiwit S25 20 kDa 0 0 0 70% 0
ribosomale L1 domein met 1 55 kDa 0 0 0 70% 0
familie met sequentie gelijkenis 110, lid D 29 kDa 69% 0 0 0 0
ribosomaal eiwit L36a-achtige 12 kDa 0 0 0 66% 0
cerebellin 4 precursor 22 kDa 0 0 0 64% 0
N-acetylglucosamine-1-fosfaat transferase, Alfa-en bèta-subeenheden 144 kDa 64% 0 0 0 0
RAD51 homo B (v. cerevisiae) 38 kDa 0 0 0 64% 0
transcriptie rek regulator 1 124 kDa 63% 0 0 0 0
Homeobox a1 15 kDa 0 0 0 62% 0
Fosfolipide overdracht eiwit 49 kDa 0 0 0 62% 0
Rho GTPase activeren proteïne 33 137 kDa 0 0 54% 0 0
mitochondriaal ribosomaal eiwit S18B 29 kDa 0 0 0 52% 0
endoplasmisch reticulum aminopeptidase 2 106 kDa 51% 0 0 0 0
tripartiete motief met 28 89 kDa 0 50% 0 0 0
onrijpe coloncarcinoom transcriptie 1 24 kDa 0 0 0 50% 0
BIJ Rich interactief Domain 1A (Zwi-achtig) 242 kDa 0 0 49% 0 0
mitochondriaal ribosomaal proteïne S17 15 kDa 0 0 0 48% 0
pinin, desmosome geassocieerde eiwitten 82 kDa 0 0 0 48% 0
eiwit fosfatase, Mg2 +/Mn2 + afhankelijke, 1G 59 kDa 0 0 0 45% 0
G patch domein en ankyrin herhalingen 1 39 kDa 45% 0 0 0 0
mitochondriaal ribosomaal eiwit L3 39 kDa 0 0 0 44% 0
ontluikende ongeremd door benzimidazolen 3 homo (gist) 37 kDa 0 44% 0 0 0
WD en tetratricopeptide herhaalt 1 76 kDa 0 0 0 44% 0
eiwit bisulfide isomerase familie A, lid 2 58 kDa 0 0 0 42% 0
kazrin, periplakin interageren eiwitten 86 kDa 0 41% 0 0 0
spiraalsnoer-Coil-spiraal-spiraal-spiraal domein met 2 16 kDa 0 0 40% 0 0
hitteschok proteïne 90kDa alpha (cytosolic), klasse A lid 1 85 kDa 0 0 40% 0 0
Retinitis pigmentosa GTPase regulator 83 kDa 0 0 40% 0 0
CTD (Carboxy-terminale domein, RNA polymerase II, polypeptide A)
fosfatase, subeenheid 1
104 kDa 0 39% 0 0 0
mitochondriaal ribosomaal eiwit L37 48 kDa 0 0 0 39% 0
C2CD2-like 76 kDa 0 38% 0 0 0
DnaJ (Hsp40) homolog, subfamilie C, lid 6 106 kDa 0 0 38% 0 0
mitochondriaal ribosomaal eiwit L51 15 kDa 0 0 0 38% 0
bystin-achtige 50 kDa 0 0 0 38% 0
huntingtine-geassocieerde eiwitten 1 76 kDa 0 0 0 37% 0
zink vinger proteïne 263 77 kDa 0 36% 0 0 0
celdelings cyclus en apoptosis regulator 1 133 kDa 0 0 34% 0 0
eiwit tyrosine fosfatase, niet-receptor type 13
(APO-1/CD95 (FAS)-geassocieerde fosfatase)
256 kDa 0 0 34% 0 0
KRAB-een domein met 2 56 kDa 0 0 0 31 0
activerings signaal cointegrator 1 complex subeenheid 2 28 kDa 0 0 0 31 0
centrosomal proteïne 76kDa 74 kDa 0 30 0 0 0
Polymerase (RNA) III (DNA-gestuurde) polypeptide C (62kD) 61 kDa 0 0 0 30 0
5-hydroxytryptamine (serotonine) receptor 6 47 kDa 0 0 0 29 0
T Cell receptor alpha toetreden 56 2 kDa 0 26 0 0 0
bioriëntatie van chromosomen in celdeling 1-achtige 330 kDa 0 0 0 25 0
RAS Association en DIL domeinen 114 kDa 0 0 25 0 0
WD herhalen domein 66 130 kDa 0 0 0 24 0
Chromosoom 6 open Lees frame 25 13 kDa 0 0 22 0 0
transmembraan proteïne 177 34 kDa 0 0 0 21 0
neurale precursor cel uitgedrukt, ontwikkelmentaal down-gereguleerde 4-achtige 101 kDa 0 20 0 0 0

Tabel 2: identificatie van cellulaire hostfactoren die zijn gecomplexed met nucleollaire lokalisatie van Rev-mutaties 4, 5 en 6 tijdens de HIV-1-productie. De Coomassie-gekleurd SDS-PAGE gel in Figuur 6 werd verwerkt voor tandem massaspectrometrie. Eiwit interactie resultaten van WT Rev versus nucleolaire mutaties M4, M5 en M6 worden samengevat door de waarschijnlijkheid van eiwit identificatie (in procenten).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Massaspectrometrische analyses met vergelijking van Rev-NoLS-mutaties en WT Rev in de aanwezigheid van HIV-1 werden beoordeeld om te begrijpen welke nucleollaire factoren betrokken waren bij de virale replicatiecyclus. Dit zou nucleollaire componenten identificeren die nodig zijn voor virale infectiviteit. Nucleollaire B23 heeft een hoge affiniteit met Rev-NoLS en functies in de nucleollaire lokalisatie van Rev3 en nucleocytoplasmorische transport van Rev-gebonden HIV mRNAs22. De affiniteit van B23 met Rev-NoLS mutaties, die enkele of meerdere arginine substituties bevatte, werd beoordeeld via immunoprecipitatie van Rev-3'flag tijdens virale productie (Figuur 2; WT en mutaties m2, M6 en M9). B23 affiniteit met éénpunts Rev-NoLS mutaties M4, M5 en M6 werden eerder onderzocht in aanwezigheid van HIV-1 replicatie. In de vorige studie werden IP-eluaten van M4, M5 en M6 onderworpen aan westerse immunoblotting met een specifiek antilichaam voor α-vlag voor rev en B23 Affinity1. Op de achtergrond van Rev single-point mutaties werd B23 binding affiniteit significant verlaagd. B23 onderhouden affiniteit met WT Rev tijdens HIV-replicatie. Single-Point mutaties geïnduceerd binnen Rev-NoLS werden verwacht te verminderen binding affiniteit met andere cellulaire host factoren vergemakkelijken van HIV mRNA binding en transport. Rev-nols single-en multiple-Point mutaties in dit model afgeschaft nucleophosmin B23 affiniteit met Rev, wat duidt op een verstoring in nucleocytoplasmorische pendelen en HIV mRNA transport. Het is waarschijnlijk dat nucleollaire factoren (nucleolin C23 en nucleosome assemblage eiwit 1), transport factoren (ARHGEF1 en TCB1D24), en splicing factoren (hnRNPC en PNN) zijn betrokken bij de HIV-1 infectieuze cyclus door interactie met Rev eiwitcomplexen. Tabel 1 en tabel 2 onthullen verschillende andere cellulaire factoren, zowel nucleolar en nonnucleolar in patroon, die mogelijk betrokken zijn bij de HIV-1-replicatiecyclus door middel van Rev. de nucleollaire factor-SnoRNA C/D Box 58, betrokken bij SnoRNA verwerking, snoRNA transport naar de Nucleolus, en 2 '-O-methylatie van ribosomaal RNA-werd geïdentificeerd, maar de functie van dit eiwit in de HIV-1 replicatiecyclus blijft onbekend. De specifieke rollen van deze cellulaire factoren in de HIV-1 infectieuze cyclus worden momenteel onderzocht.

De hier gepresenteerde resultaten tonen het gebruik van deze aanpak voor de identificatie van virale/host-nucleollaire factoren die de HIV-1-infectieuze cyclus behouden. Virale/host nucleollaire factoren die deelnemen aan andere ziekte modellen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van deze aanpak. Het is verder waarschijnlijk dat een nucleollaire factor multifunctionele rollen in verschillende ziekte modellen kan inhouden. Bijvoorbeeld, B23 is betrokken bij het transport van nucleollaire virale eiwitten, virale assemblage, encapsidatie, replicatie, en latency in andere virale infectieuze modellen. B23 wordt gekenmerkt in interacties met NoLS van cellulaire factoren voor nucleocytoplasmische transport-P120 groeifactor (aminozuren 40-57)23 en C23 pre-rRNA processor (aminozuren 540 – 628)24. B23 is ook gedocumenteerd om te communiceren met de menselijke T-cel lymfotroopvirus virus (HTLV-1) eiwit Rex (aminozuren 1-22)25, HIV-1 TAT (aminozuren 49 – 57)2, en HIV-1 rev (aminozuren 37-47)26. Het Japanse encefalitis virus (JEV) genoom codeert een nucleollaire-lokaliserend kern eiwit, waardoor aminozuren Gly42 en Pro43 communiceren met de N-terminale regio van B23 tijdens JEV-infectie, resulterend in het transport van virale kern proteïne/B23 in de Nucleus27. Het enkelvoudig-gestrande RNA genoom van het hepatitis B-virus (HBV) bestaat deels uit dubbel-streng DNA, dat een nucleollaire kern eiwit codeert. Het HBV kern eiwit koppelt met nucleolin en B23 in de Nucleolus28; B23 werd gedemonstreerd in de HBV-assemblage door interactie met het kern proteïne N-terminale domein. Specifiek, B23 aminozuren 259-294 binden aan de N-terminale domein van de HBV kern eiwitten om virale encapsidatie29. De negatieve-Sense, enkelvoudig-streng RNA hepatitis D-virus (HDV) drukt HDVAg-antigeen in twee isoforms uit; de kleine isovorm helpt bij RNA-replicatie, en de grote isovorm vergemakkelijkt virale assemblage. RNA-replicatie vindt plaats binnen de Nucleolus en vereist B23-interactie met hdvag30,31. HDV-infectie veroorzaakt een opregulatie van B23, die meestal samenwerkt met de kleine hdvag isovorm en minder met de grote hdvag isovorm. Interacties vinden plaats via het kleine HDVAg NLS-domein, waardoor B23 kern accumulatie bindt en bereikt. Bij het verwijderen van de site voor het binden van HDV aan B23, werd RNA-replicatie verstoord. HDVAg bleek te colocaliseren met B23 en nucleolin in de Nucleolus. Nucleolin werd ontdekt te bezitten transcriptionele eigenschappen als een onderdrukker32, onthullen van de Nucleolus als een compartiment voor regulering van HDV replicatie. B23 is ook betrokken bij de latentie van het Kaposi sarcoom-geassocieerde herpesvirus (KSHV) genoom. Kshv latente proteïne-v-cyclin-met gastheer CDK6 kinase, fosforyliseert B23 op Thr199, vergemakkelijken van B23 interactie met latency-geassocieerde nucleaire antigeen33. De latency-geassocieerde nucleaire antigeen fungeert om virale lytische replicatie te voorkomen. Uitputting van B23 leidt tot KSHV reactivatie, waardoor B23 wordt onthuld als een regulator van KSHV latency. B23 functie in de HIV-1 replicatiecyclus wordt gekenmerkt in de nucleocytoplasmic transport activiteit van tat en Rev, en het is onbekend of B23 latentie tijdens HIV-infectie kan induceren. B23's betrokkenheid bij de replicatie, encapsidatie, en assemblage van HIV-1 is momenteel onbekend.

Aanpassing van deze methode aan andere ziekte modellen zou veel inspanning en tijd vergen voor de generatie van eiwit-deficiënte infectieuze wervels uitgedrukt in de juiste cellijnen. Het voordeel van deze Rev-deficiënte HIV-1HXB2 backbone is de mogelijkheid om Rev-nols mutaties te onderzoeken in aanwezigheid van de volledige virale backbone, virale infectieuze factoren en hostfactoren die betrokken zijn bij de HIV-1 replicatiecyclus. Andere studies hebben de Rev nucleolar-functie onderzocht bij afwezigheid van het volledige HIV-1-infectieuze systeem. Een grondige karakterisering van infectieuze en ziekte trajecten moet representatieve omgevingen omvatten die het natuurlijke verloop van de ziekteprogressie ondersteunen. Er werden twee verschillende soorten analyses uitgevoerd en vergeleken in de mogelijkheid om nucleollaire factoren te identificeren. Tabel 1 vermeldt factoren die gebonden bleven aan WT Rev als gevolg van directe massaspectrometrie analyse van eiwit eluaat. Deze analyse leverde een aantal bekende factoren van HIV-1 rev op. deze directe methode werd vergeleken met een ander proces waarbij de extractie van eiwit gescheiden was binnen SDS-PAGE gels en massaspectrometrie analyse van dergelijke eiwitten. Deze tweede methode leverde een verscheidenheid aan bekende en potentiële factoren op die gebonden zijn aan het Rev-proteïne complex, maar miste de volgende eiwitten die eerder in tabel 1waren geïdentificeerd: signaal herkenning deeltje 14 kDa, eukaryotische vertaling initiatie factor 4B, ribosomaal proteïne L22, kleine nucleollaire RNA C/D Box 58B en zink vinger CCHC domein met 11. Uiteindelijk betrof de voor massaspectrometrie in dit protocol gekozen superieure methode de extractie van peptiden uit SDS-PAGE gels. De eerste directe methode omvatte 2x sample buffer in het eluaat zonder broomfenolblauw; de resterende componenten van de 2x-monster buffer kunnen de volledige trypsine-behandeling verstoren en kunnen niet volledig verwerkte peptiden opleveren voor massaspectrometrie analyse. De tweede indirecte methode was in staat om door trypsine behandelde peptiden te zuiveren van potentiële verontreinigingen van SDS-PAGE.

De hier beschreven methoden voor de bereiding van massaspectrometrie kunnen worden gebruikt voor de identificatie van therapeutische interventies om HIV-1-infectie uit te roeien via targeting Rev. alle deletie-en éénpuntrev-NoLS-mutaties kunnen worden onderzocht dominant-negatieve activiteit en gebruikt bij de arrestatie van de Rev-functie. Dominante negatieve kenmerken van belang voor rev functionele arrestatie zijn de volgende: Rev/RRE binding affiniteit; verplaatsing van nucleollaire WT Rev door multimerization met Rev Mutants; verlies van affiniteit met belangrijke cellulaire factoren die betrokken zijn bij HIV-1 mRNA transport en splicing. Rev multimerization met de coexpressie van Rev-NoLS mutaties met WT Rev kan worden onderzocht. Dominante negatieve mutaties in dit model worden verwacht te multimeriseren met WT rev en verschuiving nucleollaire patronen naar de kern en cytoplasma, leidt tot een Rev functionele arrestatie. Massaspectrometrie kan worden gebruikt om het verlies van belangrijke cellulaire factoren die betrokken zijn bij HIV-1 mRNA splicing en transport te identificeren. De identificatie van ontbrekende interacties met WT Rev als gevolg van coexpressie met dominante-negatieve Rev-NoLS-mutaties zou de betrokkenheid van nucleollaire-specifieke trajecten in HIV-1-pathogenese onthullen. Als alternatief kunnen virale HIV-1NL4-3- deeltjes die op de achtergrond van Rev-nols-mutaties worden gegenereerd, worden onderzocht voor alle verpakte cellulaire factoren. Cellulaire en virale factoren verpakt binnen virale deeltjes kunnen verder worden geïdentificeerd door middel van massaspectrometrie. Dit zou de aanwezigheid van nucleollaire factoren binnen virale deeltjes en de rol van geïdentificeerde nucleollaire factoren in virale infectie onthullen. De beschreven methoden zijn van toepassing op andere virale en ziekte modellen voor de identificatie en karakterisering van onderbestudeerde trajecten. Dit zou de ontwikkeling van therapeutische interventies mogelijk maken tegen ziekten waardoor er beperkte behandelingen beschikbaar zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs erkennen Dr. Barbara K. Felber en Dr. George N. PAVLAKIS voor de HLfB-aanhankelijke cultuur van de National Institutes of Health (NIH) AIDS onderzoek en referentie-reagens programma, afdeling AIDS, Nationaal Instituut voor allergie en infectieuze Ziekten (NIAID), NIH. De auteurs erkennen ook financiële bronnen verstrekt door de NIH, Grants AI042552 en AI029329.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Fisher Chemical A38S-212
Acetonitrile Fisher Chemical A955-500
Acrylamide:Bisacrylamide BioRad 1610158
Ammonium bicarbonate Fisher Chemical A643-500
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich 7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gel Sigma-Aldrich A2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG Sigma-Aldrich F3165
BioMax MS film Carestream 8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL Bio-Rad 5000006
B23 mouse monoclonal IgG Santa Cruz Biotechnologies sc-47725
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126
Carnation non-fat powdered milk Nestle N/A
Cell scraper ThermoFisher Scientific 179693PK
C18IonKey nanoTile column Waters 186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishes Fisher Scientific 08-772-22
Dithiothreitol Thermo Scientific J1539714
1 x DPBS Corning 21-030-CVRS
ECL Estern blotting substrate Pierce 32106
Ethanol, 200 proof Fisher Chemical A409-4
FBS Gibco 16000044
Formic Acid Fisher Chemical A117-50
GelCode blue stain reagent ThermoFisher 24590
Glycerol Fisher Chemical 56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz Biotechnologies sc-2005
Iodoacetamide ACROS Organics 122270050
KimWipe delicate task wiper Kimberly Clark Professional 34120
L-glutamine Gibco 25030081
Methanol Fisher Chemical 67-56-1
NanoAcuity UPLC Waters N/A
Pierce Silver Stain Kit Thermo Scientific 24600df
15-mL Polypropylene conical tube Falcon 352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa Thermo Scientific 26616
Protease inhibitor cocktail Roche 4693132001
Purified BSA New England Biolabs B9001
PVDF  Western blotting membrane Roche 3010040001
Sodium Pyruvate Gibco 11360070
10 x TBS Fisher Bioreagents BP2471500
TEMED BioRad 1610880edu
Triton X-100 detergent solution BioRad 1610407
Trizaic source Waters N/A
trypsin-EDTA Corning 25-051-CIS
Tween 20 BioRad 1706531
Synapt G2 mass spectrometer Waters N/A
Whatman filter paper Tisch Scientific 10427813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arizala, J. A. C., et al. Nucleolar Localization of HIV-1 Rev Is Required, Yet Insufficient for Production of Infectious Viral Particles. AIDS Research and Human Retroviruses. (2018).
  2. Li, Y. P. Protein B23 is an important human factor for the nucleolar localization of the human immunodeficiency virus protein Tat. Journal of Virology. 71, 4098-4102 (1997).
  3. Szebeni, A., et al. Nucleolar protein B23 stimulates nuclear import of the HIV-1 Rev protein and NLS-conjugated albumin. Biochemistry. 36, 3941-3949 (1997).
  4. Truant, R., Cullen, B. R. The arginine-rich domains present in human immunodeficiency virus type 1 Tat and Rev function as direct importin beta-dependent nuclear localization signals. Molecular and Cellular Biology. 19, 1210-1217 (1999).
  5. Eirin-Lopez, J. M., Frehlick, L. J., Ausio, J. Long-term evolution and functional diversification in the members of the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Genetics. 173, 1835-1850 (2006).
  6. Frehlick, L. J., Eirin-Lopez, J. M., Ausio, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. BioEssays. 29, 49-59 (2007).
  7. Okuwaki, M., Matsumoto, K., Tsujimoto, M., Nagata, K. Function of nucleophosmin/B23, a nucleolar acidic protein, as a histone chaperone. FEBS Letters. 506, 272-276 (2001).
  8. Szebeni, A., Olson, M. O. Nucleolar protein B23 has molecular chaperone activities. Protein Science. 8, 905-912 (1999).
  9. Hingorani, K., Szebeni, A., Olson, M. O. Mapping the functional domains of nucleolar protein B23. Journal of Biological Chemistry. 275, 24451-24457 (2000).
  10. Borer, R. A., Lehner, C. F., Eppenberger, H. M., Nigg, E. A. Major nucleolar proteins shuttle between nucleus and cytoplasm. Cell. 56, 379-390 (1989).
  11. Yun, J. P., et al. Nucleophosmin/B23 is a proliferate shuttle protein associated with nuclear matrix. Journal of Cellular Biochemistry. 90, 1140-1148 (2003).
  12. Savkur, R. S., Olson, M. O. Preferential cleavage in pre-ribosomal RNA byprotein B23 endoribonuclease. Nucleic Acids Research. 26, 4508-4515 (1998).
  13. Herrera, J. E., Savkur, R., Olson, M. O. The ribonuclease activity of nucleolar protein B23. Nucleic Acids Research. 23, 3974-3979 (1995).
  14. Grisendi, S., et al. Role of nucleophosmin in embryonic development and tumorigenesis. Nature. 437, 147-153 (2005).
  15. Itahana, K., et al. Tumor suppressor ARF degrades B23, a nucleolar protein involved in ribosome biogenesis and cell proliferation. Molecular Cell. 12, 1151-1164 (2003).
  16. Ye, K. Nucleophosmin/B23, a multifunctional protein that can regulate apoptosis. Cancer Biology & Therapy. 4, 918-923 (2005).
  17. Kuo, M. L., den Besten, W., Bertwistle, D., Roussel, M. F., Sherr, C. J. N-terminal polyubiquitination and degradation of the Arf tumor suppressor. Genes & Development. 18, 1862-1874 (2004).
  18. Kuo, M. L., den Besten, W., Thomas, M. C., Sherr, C. J. Arf-induced turnover of the nucleolar nucleophosmin-associated SUMO-2/3 protease Senp3. Cell Cycle. 7, 3378-3387 (2008).
  19. Horn, H. F., Vousden, K. H. Cancer: guarding the guardian. Nature. 427, 110-111 (2004).
  20. Grisendi, S., Mecucci, C., Falini, B., Pandolfi, P. P. Nucleophosmin and cancer. Nature Reviews Cancer. 6, 493-505 (2006).
  21. Dingwall, C., et al. Nucleoplasmin cDNA sequence reveals polyglutamic acid tracts and a cluster of sequences homologous to putative nuclear localization signals. The EMBO Journal. 6, 69-74 (1987).
  22. Fankhauser, C., Izaurralde, E., Adachi, Y., Wingfield, P., Laemmli, U. K. Specific complex of human immunodeficiency virus type 1 rev and nucleolar B23 proteins: dissociation by the Rev response element. Molecular and Cellular Biology. 11, 2567-2575 (1991).
  23. Valdez, B. C., et al. Identification of the nuclear and nucleolar localization signals of the protein p120. Interaction with translocation protein B23. Journal of Biological Chemistry. 269, 23776-23783 (1994).
  24. Li, Y. P., Busch, R. K., Valdez, B. C., Busch, H. C23 interacts with B23, a putative nucleolar-localization-signal-binding protein. European Journal of Biochemistry/FEBS. 237, 153-158 (1996).
  25. Adachi, Y., Copeland, T. D., Hatanaka, M., Oroszlan, S. Nucleolar targeting signal of Rex protein of human T-cell leukemia virus type I specifically binds to nucleolar shuttle protein B-23. Journal of Biological Chemistry. 268, 13930-13934 (1993).
  26. Szebeni, A., Herrera, J. E., Olson, M. O. Interaction of nucleolar protein B23 with peptides related to nuclear localization signals. Biochemistry. 34, 8037-8042 (1995).
  27. Tsuda, Y., et al. Nucleolar protein B23 interacts with Japanese encephalitis virus core protein and participates in viral replication. Microbiology and Immunology. 50, 225-234 (2006).
  28. Ning, B., Shih, C. Nucleolar localization of human hepatitis B virus capsid protein. Journal of Virology. 78, 13653-13668 (2004).
  29. Lee, S. J., Shim, H. Y., Hsieh, A., Min, J. Y., Jung, G. Hepatitis B virus core interacts with the host cell nucleolar protein, nucleophosmin 1. Journal of Microbiology. 47, 746-752 (2009).
  30. Huang, W. H., Yung, B. Y., Syu, W. J., Lee, Y. H. The nucleolar phosphoprotein B23 interacts with hepatitis delta antigens and modulates the hepatitis delta virus RNA replication. Journal of Biological Chemistry. 276, 25166-25175 (2001).
  31. Li, Y. J., Macnaughton, T., Gao, L., Lai, M. M. RNA-templated replication of hepatitis delta virus: genomic and antigenomic RNAs associate with different nuclear bodies. Journal of Virology. 80, 6478-6486 (2006).
  32. Yang, T. H., et al. Purification and characterization of nucleolin and its identification as a transcription repressor. Molecular and Cellular Biology. 14, 6068-6074 (1994).
  33. Sarek, G., et al. Nucleophosmin phosphorylation by v-cyclin-CDK6 controls KSHV latency. PLoS Pathogens. 6, 1000818 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics