सम आवृत्ति जनरेशन कंपन स्पेक्ट्रोस्कोपी के माध्यम से पता चला पॉलिमर और बायोमैक्रो अणुओं के अंतरामुखीय आण्विक स्तर की संरचनाएं

Biochemistry

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Summary

व्यापक रूप से उपयोग किया जा रहा है, योग आवृत्ति पीढ़ी (एसएफजी) कंपन स्पेक्ट्रोस्कोपी बहुलक और जैव मैक्रो अणु इंटरफेस पर हो रहा श्रृंखला conformational आदेश और माध्यमिक संरचनात्मक परिवर्तन प्रकट करने में मदद कर सकते हैं।

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Li, X., Ma, L., Lu, X. Interfacial Molecular-level Structures of Polymers and Biomacromolecules Revealed via Sum Frequency Generation Vibrational Spectroscopy. J. Vis. Exp. (150), e59380, doi:10.3791/59380 (2019).

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Abstract

एक दूसरे आदेश nonlinear ऑप्टिकल स्पेक्ट्रोस्कोपी के रूप में, योग आवृत्ति पीढ़ी (एसएफजी) कंपन स्पेक्ट्रोस्कोपी व्यापक रूप से विभिन्न सतहों और इंटरफेस की जांच में इस्तेमाल किया गया है. यह गैर इनवेसिव ऑप्टिकल तकनीक मोनोलेयर या submonolayer संवेदनशीलता के साथ स्थानीय आणविक स्तर की जानकारी प्रदान कर सकते हैं. यहाँ हम इस बारे में प्रायोगिक पद्धति प्रदान कर रहे हैं कि स्थूल अणुओं और जैव-अणुओं दोनों के लिए दफन अंतराफलक का चुनिंदा रूप से पता कैसे लगाया जाए। इसे ध्यान में रखते हुए, रेशम फाइब्रोइन की अंतर-मुखीय माध्यमिक संरचनाओं और मॉडल लघु श्रृंखला ओलिगोन्यूक्लिओटाइड डुप्लेक्स के आसपास जल संरचनाओं पर चर्चा की जाती है। पूर्व एक श्रृंखला श्रृंखला ओवरलैप या स्थानिक कारावास प्रभाव से पता चलता है और बाद Ca2 + आयनों पानी की चिराल रीढ़ अधिरचना से उत्पन्न के खिलाफ एक सुरक्षा समारोह से पता चलता है.

Introduction

योग आवृत्ति पीढ़ी का विकास (एसएफजी) कंपन स्पेक्ट्रोस्कोपी शेन एट अल द्वारा किए गए काम के लिए वापस दिनांकित किया जा सकता है1,2. अंतरमुखीय चयनात्मकता और उप-मोनोलेयर संवेदनशीलता की विशिष्टता एसएफजी कंपन स्पेक्ट्रोस्कोपी को भौतिकी, रसायन विज्ञान, जीव विज्ञान,और सामग्री विज्ञान, आदि 3, 4 के क्षेत्रों में शोधकर्ताओं द्वारा सराहना की जाती है। ,5. वर्तमान में, सतहों और इंटरफेस से संबंधित वैज्ञानिक मुद्दों की एक विस्तृत श्रृंखला एसएफजी का उपयोग करके जांच की जा रही है, विशेष रूप से बहुलक और जैव मैक्रो अणुओं के संबंध में जटिल इंटरफेस के लिए, जैसे श्रृंखला संरचनाओं और संरचनात्मक छूट पर दफन बहुलक इंटरफेस, प्रोटीन माध्यमिक संरचनाओं , और interfacial जल संरचनाओं9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25,26.

बहुलक सतहों और इंटरफेस के लिए, पतली फिल्म के नमूने आम तौर पर स्पिन-कोटिंग द्वारा वांछित सतहों या इंटरफेस प्राप्त करने के लिए तैयार कर रहे हैं। यह समस्या तैयार की गई फिल्मों के दो इंटरफेसों के संकेत हस्तक्षेप के कारण उत्पन्न होती है, जिसके कारण एकत्र किए गए एसएफजी स्पेक्ट्रा27,28,29का विश्लेषण करने में असुविधा होती है . ज्यादातर मामलों में, कंपन संकेत केवल एक ही इंटरफ़ेस से, या तो फिल्म / वास्तव में, इस समस्या का समाधान काफी आसान है, अर्थात्, प्रयोगात्मक वांछनीय इंटरफ़ेस पर प्रकाश क्षेत्रों को अधिकतम करने और अन्य इंटरफ़ेस पर प्रकाश क्षेत्रों को कम करने के लिए. अतः फ्रेनल गुणांकों या स्थानीय क्षेत्र गुणांकों की गणना पतली फिल्म मॉडल के माध्यम से की जानी चाहिए और प्रायोगिक परिणामों3,9,10,11के संबंध में मान्य की जानी चाहिए, 12,13,14,15,30.

मन में उपरोक्त पृष्ठभूमि के साथ, कुछ बहुलक और जैविक इंटरफेस की जांच की जा सकती है ताकि आणविक स्तर से मौलिक विज्ञान को समझने के लिए. निम्नलिखित में, उदाहरण के रूप में तीन interfacial मुद्दों लेने: poly(2-hydroxyethyl methacrylate) सतह की जांच और सब्सट्रेट9के साथ दफन इंटरफेस , polystyrene पर रेशम फाइब्रॉइन (एस एफ) माध्यमिक संरचनाओं के गठन और मॉडल के आसपास के पानी संरचनाओं लघु श्रृंखला ओलिगोन्यूक्लिओटाइड डुप्लेक्स16,21, हम बताएंगे कि कैसे एसएफजी कंपन स्पेक्ट्रोस्कोपी अंतर्निहित विज्ञान के संबंध में interfacial आणविक स्तर संरचनाओं प्रकट करने में मदद करता है.

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Protocol

1. एसएफजी प्रयोगात्मक

  1. एक वाणिज्यिक picosecond SFG प्रणाली (सामग्री कीतालिका), जो $ 20 ps की एक पल्स चौड़ाई और 50 हर्ट्ज की एक आवृत्ति के साथ एक मौलिक 1064 एनएम बीम प्रदान करता है का प्रयोग करें, एक Nd:YAG लेजर पर आधारित है.
  2. मौलिक 1064 एनएम बीम को 532 एनएम बीम और दूसरे और तीसरे हार्मोनिक मॉड्यूल का उपयोग करके 355 एनएम बीम में कनवर्ट करें। प्रत्यक्ष रूप से एक इनपुट प्रकाश बीम के रूप में 532 एनएम बीम गाइड और ऑप्टिकल पैरामीट्रिक पीढ़ी (OPA) केमाध्यम से आवृत्ति रेंज को कवर अन्य इनपुट मध्य-infrared (आईआर) बीम उत्पन्न ( OPA)/ अंतर आवृत्ति पीढ़ी (DFG) प्रक्रिया.
  3. दो इनपुट बीमों के घटना कोण को क्रमशः 53 डिग्री (आईआर) और 64 डिग्री (दृश्य) (दृश्य), बनाम सामान्य सतह के रूप में सेट करें।
  4. बहुलक अंतर-मुखीय संरचनाओं (या तो फिल्म/सबस्ट्रेट इंटरफेस या फिल्म/अन्य मध्यम इंटरफ़ेस) का पता लगाने के लिए, एसएसपी (एस-ध्रुवित योग आवृत्ति बीम, एस-ध्रुवित दृश्य बीम और पी-ध्रुवित अवरक्त बीम) और पीपीपी के ध्रुवीकरण संयोजन का उपयोग करें।
  5. एसएसपी और पीपीपी के अलावा डीएनए के आसपास के अंतर-मुखीय प्रोटीन माध्यमिक संरचनाओं और पानी की संरचनाओं का पता लगाने के लिए, चिराल एसपीपी और पीएसपी ध्रुवीकरण संयोजन का उपयोग किया गया।
  6. यह सुनिश्चित करने के लिए कि नमूने क्षतिग्रस्त नहीं थे, अवरक्त और दृश्यमान नाड़ी ऊर्जा को नियंत्रित करने के लिए $ 70 और $ 30 mJ, क्रमशः. ऊर्जा स्तर आरेख के साथ एस एफ जी प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध चित्र 1में दिखाया गया था। चित्रा 2 हमारे साफ कमरे में एसएफजी प्रणाली से पता चलता है.

2. फ्रेनल गुणांक

  1. यहाँ चर्चा किए गए सभी प्रयोगों के लिए substrates के रूप में सही कोण प्रिज्म का प्रयोग करें. ठोस सब्सट्रेट पर एक बहुलक फिल्म के लिए दो इंटरफेस मौजूद हैं, अर्थात्, हवा में बहुलक सतह और बहुलक / दोनों SFG संकेत उत्पन्न कर सकते हैं के बाद से व्युत्क्रम समरूपता दोनों इंटरफेस पर टूट गया है. इसलिए, एकत्र एसएफजी स्पेक्ट्रम एक हस्तक्षेप है। तथापि, दोनों अंतराफलकों पर स्थानीय क्षेत्र गुणांक ों या फ्रेनल गुणांकों को एक समय में या एक साथ31,32में घटना कोण या फिल्म मोटाई को अलग करके समायोज्य किया जा सकता है। यह हमारे लिए केवल एक अंतरफलक से एसएफजी कंपन संकेत की जांच करने का अवसर प्रदान करता है। यहाँ, CAF2 प्रिज्म पर PHEMA फिल्म एक उदाहरण9के रूप में लिया गया था.
  2. जैसा कि चित्र 3में दिखाया गया है, नीचे PHEMA फिल्म से उत्पन्न एसएफजी संकेतों का पता लगाने के लिए सही कोण प्रिज्म ज्यामिति को रोजगार दें। परिलक्षित मोड में SFG उत्पादन तीव्रता के रूप में व्यक्त किया है
    Equation 1(1)
    जहां Equation 2 प्रभावी द्वितीय क्रम अरैखिक संवेदनशीलता प्रदिश को दर्शाता है.
    Equation 2तीन भाग होते हैं, नामत, प्रिज्म/बहुलक अंतराफलक, बहुलक/नीचे मध्यम अंतराफलक (नीचे माध्यम में गैस, द्रव या ठोस शामिल है।
    Equation 3(2)
    यहाँ नीचे मध्यम हवा, पानी या कुछ और हो सकता है. F स्थानीय फ़ील्ड सुधार के लिए उत्तरदायी संगत Fresnnel गुणांक का प्रतिनिधित्व करता है।
  3. इस मामले में फ्रेनल गुणांकों की गणना करने के लिए एक पतली-फिल्म मॉडल लागू करें। यहाँ केवल संक्षिप्त गणना प्रक्रियाओं प्रस्तुत कर रहे हैं.
    1. प्रिज्म/बहुलक अंतराफलक के लिए, उपयोग करें
      Equation 4(3)
      Equation 5(4)
      Equation 6(5)
      दिखाए गए प्रत्येक पैरामीटर का अर्थ नीचे प्रस्तुत किया गया है.
      1. -मैं बीम आवृत्ति को दर्शाता है।
      2. और त् समग्र संचरण गुणांकों को निरूपित करता है और इसे इस रूप में अभिव्यक्त किया जा सकता है
        Equation 7(6)
        Equation 8(7)
      3. च्12 तथा त े े12 प्रिज्म/बहुलक अंतराफलक पर प्रकाश किरण पुंज के रैखिक संचरण गुणांकों को निरूपित करता है।
      4. च23 तथा त े े23 बहुलक/मध्यम अंतराफलक पर प्रकाश किरण के रैखिक परावर्तन गुणांकों को निरूपित करती है।
      5. एक चिंतनशील बीम और उसके द्वितीयक चिंतनशील बीम के बीच प्रावस्था अंतर का प्रतिनिधित्व करता है जब यह बहुलक पतली फिल्म के पार फैलता है और फिर पीछे पर परावर्तित होता है, जिसे इस रूप में व्यक्त किया जा सकता है
        Equation 9(8)
      6. प्रकाश किरणपुंज की तरंगदैर्घ्य का प्रतिनिधित्व करता है तथा बहुलक फिल्म मोटाई है।
      7. र्1 तथा र्2 क्रमशः प्रिज्म/बहुलक अंतराफलक तथा बहुलक/मध्यम अंतराफलक पर घटना कोणों का प्रतिनिधित्व करते हैं।
      8. 1 और 2 क्रमशः प्रिज्म तथा बहुलक फिल्म के अपवर्तक सूचकांकों का प्रतिनिधित्व करते हैं।
      9. 12 प्रिज्म/बहुलक के लिए बहुलक अंतरमुखीय परतों के अपवर्तक सूचकांकों का प्रतिनिधित्व करता है।
    2. बहुलक/मध्यम इंटरफ़ेस के लिए, उपयोग करें
      Equation 10(9)
      Equation 11(10)
      Equation 12(11)
      1. - दो इंटरफेस पर प्रकाश विद्युत क्षेत्रों के चरण अंतर का प्रतिनिधित्व करता है.
      2. क्योंकि हमारे इनपुट बीम के लिए पल्स चौड़ाई $ 20 ps है, फैलाव प्रभाव के साथ जुड़े समय देरी से त्रुटि की उपेक्षा की जा सकती है.
      3. उत्पादन SFG के लिए इस तरह के चरण अंतर की अभिव्यक्ति, इनपुट दिखाई और इनपुट अवरक्त बीम अलग के रूप में लिखा जा सकता है
        Equation 13(12)
        Equation 14(13)
        Equation 15(14)
         
  4. उपरोक्त चर्चा से, प्रिज्म बहुलक फिल्म-मध्यम (1-2-3) प्रणाली के लिए, प्रिज्म/बहुलक और बहुलक/मध्यम इंटरफेस के लिए, एसएसपी और पीपीपी ध्रुवण संयोजन ों के लिए कुल फ्रेनेल गुणांकों को व्यक्त करें। . बेशक, दोनों इंटरफेस दिगंशीय आइसोट्रोपिक माना जाता है.
    1. प्रिज्म/बहुलक अंतराफलक के लिए, ssp और ppp ध्रुवण संयोजनदोनों के लिए कुल फ्रेनल गुणांकों की अभिव्यक्ति निम्नानुसार प्रस्तुत की जाती है।
      1. sspके लिए , समीकरण है
        Equation 16(15)
      2. और पीपीपीके लिए , समीकरण है
        Equation 5(16)
        Equation 5(17)
        Equation 5(18)
        Equation 5(19)
         
      3. 10 और 01 क्रमशः वायु/प्रिज्म तथा प्रिज्म तथा वायु अंतराफलकों पर रैखिक संचरण गुणांकों को निरूपित करता है।
    2. बहुलक/मध्यम अंतराफलक के लिए, ssp और ppp ध्रुवण संयोजन दोनों के लिए कुल Fresnnel गुणांकों की अभिव्यक्ति निम्नानुसार वर्णित हैं।
      1. sspके लिए , समीकरण है
        Equation 21(20)
      2. पीपीपीके लिए , समीकरण हैं
        Equation 5(21)
        Equation 5(22)
        Equation 5(23)
        Equation 5(24)
           
         
  5. सैंडविच किए गए मॉडल का उपयोग करके फ्रेनल गुणांकों की गणना करने के बाद, उन्हें फिल्म मोटाई के एक समारोह के रूप में प्लॉट करें, जैसा कि चित्र 4में दिखाया गया है।
    नोट: इस मामले में, वहाँ अन्य इंटरफ़ेस, जो लगभग 150 एनएम है से उपेक्षा योग्य योगदान के साथ CaF2 प्रिज्म/PHEMA इंटरफ़ेस से SFG संकेत एकत्रित करने के लिए एक मोटाई रेंज मौजूद है। इसी प्रकार, सीएएफ2 प्रिज्म/पीएचईएमए इंटरफेस से उपेक्षायोग्य योगदान के साथ PHEMA/नीचे मध्यम इंटरफ़ेस का पता लगाने के लिए एक उपयुक्त मोटाई चुना जा सकता है।

3. सीहिरल एसएफजी ध्रुवीकरण संयोजन

  1. सामान्य achiral इंटरफ़ेस के लिए, आमतौर पर, पहनावा औसत33,34के मामले में सीजेडवी समरूपता का उपयोग करें। व्युत्क्रम समरूपता के प्रचालन के साथ, शून्य द्वितीय-क्रम अरैखिक सुग्राह्यता प्रदिश घटकd हो सकते हैं, जो cxxz, cxzx, czxx, cyyz, cyzy,c zyzy , czyy और czzz () एक आइसोट्रोपिक इंटरफ़ेस माना जाता है, तो मौजूदा शब्दों को और कम किया जा सकता है, जिसका अर्थ है एक्स और y समान हैं). हालांकि, चिराल इंटरफ़ेस के लिए, स्थिति अलग होगी। चिराल इंटरफ़ेस में सीजेड सममिति होती है, केवल रोटेशन सममिति संक्रिया की अनुमति है। इस मामले में, सामान्य अचिरीय शब्दों के अलावा, अधिक द्वितीय-क्रम गैर-रेखीय susceptibilities शून्य नहीं होगा, जिसे चिरल शब्द कहा जा सकता है, अर्थात्, czyx, czxy और cyzx गैर इलेक्ट्रॉनिक के विचाराधीन अनुनाद. इसलिए, पी एसपी, पी पी एस और एस पीपी ध्रुवीकरण संयोजन का उपयोग करके, चिरल एसएफजी स्पेक्ट्रमको 33,34एकत्र किया जा सकता है।

4. नमूना तैयारी

  1. PHEMA फिल्म की तैयारी
    1. पिहमा पाउडर (सामग्री की तालिकादेखें) को निर्जल इथेनॉल में भंग करें ताकि समाधान को क्रमशः 2 wt% और 4 wt% के साथ तैयार किया जा सके।
    2. PHEMA फिल्मों के जमाव से पहले, टॉलूईन विलायक में सीएएफ2 सही कोण प्रिज्म लेना और फिर उन्हें इथेनॉल और अल्ट्राप्यूर पानी (18.2 एम$ सेमी) के साथ धो लें।
    3. बाद में, substrates बेनकाब (CaF2 सही कोण प्रिज्म) ऑक्सीजन प्लाज्मा के लिए प्लाज्मा द्वारा संभव कार्बनिक contaminants को दूर करने के लिए (सामग्री की तालिकादेखें).
      1. सबसे पहले प्लाज्मा क्लीनर पर बारी और उस में substrates डाल दिया.
      2. फिर क्लीनर को वैक्यूम पंप को वैक्यूम करने के लिए चालू करें। इसमें ऑक्सीजन इनपुट करें।
      3. अंत में सफाई के लिए 4 मिनट निर्धारित किया है. उसके बाद, अनुक्रमिक PHEMA फिल्म की तैयारी के लिए साफ substrates संरक्षित.
      4. फिर एक स्पिन-कोटर द्वारा CAF2 प्रिज्म पर PHEMA फिल्में तैयार करें (सामग्री की तालिकादेखें )। समाधान एकाग्रता और स्पिन गति से फिल्म मोटाई समायोजित करें।
        1. स्पिन-कोटर के चूसने वाली डिस्क पर CAF2 प्रिज्म को स्थिर करें।
        2. 1 मिनट के लिए 1,500 आरपीएम पर साफ substrates पर पहले तैयार PHEMA समाधान की एक बूंद ड्रॉप (फिल्म मोटाई 2 wt% 100 एनएम के लिए और 200 एनएम के लिए 4 wt%).
      5. रात भर 80 डिग्री सेल्सियस पर एक वैक्यूम ओवन में सभी तैयार PHEMA फिल्मों Anneal.
  2. रेशम फाइब्रोइन (एसएफ) की तैयारी
    नोट: Kaplan एट अल द्वारा सुझाए गए प्रोटोकॉल35 अपनाया गया था.
    1. उबलते सोडियम कार्बोनेट (Na2CO3, 0.02 M) जलीय विलयन (3 L) में बी मोरी के 7.5 ग्राम रेशम कोकून को 30 मिनट के लिए रखें। रेशेदार एसएफ को एक साफ कंटेनर में निकाल दें।
    2. सेरीसिन अणुओं को हटाने और रेशेदार नमूने में केवल एस एफ अणुओं को छोड़ने के लिए सरगर्मी के तहत तीन बार के लिए deionized पानी के साथ प्राप्त रेशेदार एस एफ धो लें।
    3. रेशेदार एस एफ नमूना एक वैक्यूम ओवन में 60 डिग्री सेल्सियस रात में सूखी.
    4. बाद में, एक लिथियम ब्रोमाइड (LiBr, 9.3 M) जलीय समाधान में degummed रेशेदार एस एफ नमूना भंग (1 छ एस एफ LiBr समाधान के $ 4 एमएल में हल किया गया था.) और यह 60 डिग्री सेल्सियस पर 2 ज के लिए सरगर्मी के तहत इनक्यूबेट।
    5. भंग LiBr को दूर करने के लिए 3 दिनों के लिए deionized पानी (3,500 दा डायलिसिस बैग) के खिलाफ एस एफ समाधान Dialyze. हर दिन तीन बार नए deionized पानी बदलें. अंत में बाद में SFG प्रयोगों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संसाधित एस एफ समाधान की दुकान.
  3. लघु श्रृंखला ओलिगोन्यूक्लिओटाइड डुप्लेक्स की तैयारी
    1. आदेश अपने 3 'अंत कोलेस्ट्रॉल-triethylene ग्लाइकोल द्वारा संशोधित के साथ एकल-संक्षिप्त ओलिगोन्यूक्लिओटाइड नमूना (Chol-TEG) (5'-GCTTCCGAAGGTCGA-3') एक वाणिज्यिक निगम से (सामग्री की तालिकादेखें) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पूरक एक. प्रत्येक एकल किनारा के लिए, 0.5 मिलीलीटर अल्ट्राप्योर पानी में नमूना पाउडर के 10 nmol भंग। फिर उन्हें एक साथ मिलाकर द्वैध ओलिगोन्यूक्लिओटाइड विलयन (10 एनमोल/
    2. लिपिड समाधान तैयार करने के लिए 1,2-डिपैलिमिटोइल-एसएन ग्लिसरो-3-फॉस्फोकोलीन (डीपीपीसी) और 2 मिलीग्राम ड्यूरेट डीपीपीसी (डी-डीपीपीसी) को मिलाएं और उन्हें 1 एमएल क्लोरोफॉर्म में भंग करें।
    3. एक Langmuir-Blodgett (एलबी) गर्त द्वारा DPPC और डी-डीपीपीसी मोनोलेयर की तैयारी
      1. एक प्रिज्म चेहरे के साथ एक घर का बना नमूना धारक के लिए सही कोण CAF2 प्रिज्म संलग्न लंब गर्त के जलीय वातावरण में डूबा हुआ.
      2. बाद में, पानी की सतह पर पहले तैयार मिश्रित लिपिड समाधान इंजेक्ट करें जबतक कि सतह का दबाव 34 एमएन $1 से नीचे एक निश्चित मूल्य तक पहुंच गया।
      3. सतह के दबाव के स्तर के बाद, दो Teflon बाधाओं का उपयोग करने के लिए 5 मिमी/
      4. प्रिज्म को लिपिड मोनोलेयर से 1 मिमी/मिनट की दर से पानी से बाहर निकाल दें।
    4. अन्य लिपिड मोनोलेयर की तैयारी
      1. द्वैध ओलिगोन्यूक्लिओटाइड और हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन (कोलेस्टेरॉल और लिपिड ऐल्किल श्रृंखला) के माध्यम से लिपिड अणुओं की विधानसभा को सुविधाजनक बनाने के लिए, 1:100 के मोलर अनुपात में लिपिड समाधान के साथ डुप्लेक्स ओलिगोन्यूक्लिओटाइड समाधान को मिलाएं लिपिड)।
      2. मिश्रित लिपिड और डुप्लेक्स ओलिगोन्यूक्लिओटाइड समाधान को एक घर का बना टेफ्लॉन कंटेनर में पानी की सतह पर तब तक इंजेक्ट करें जब तक कि 34 एमएन -एम जेड1 की सतह के दबाव तक पहुंच नहीं गया था।
    5. अंत में, पानी की सतह पर डाला डुप्लेक्स ओलिगोन्यूक्लिओटाइड के साथ लिपिड मोनोलेयर के साथ संपर्क में प्रिज्म के तल पर लिपिड मोनोलेयर डाल SFG माप के लिए अंतिम नमूना बनाने के लिए।
  4. लोरेंट्ज़ समीकरण
    1. एक विशिष्ट कंपन मोड के लिए कंपन जानकारी निकालने के लिए SFG स्पेक्ट्रम फिट करने के लिए Lorentz समीकरण का प्रयोग करें.
      Equation 26(25)
      जहां Equation 27 Qth कंपन मोड की तीव्रता Equation 28 का प्रतिनिधित्व करता Equation 29 है, गुंजयमान आवृत्ति का प्रतिनिधित्व करता Equation 30 है, आधा अधिकतम (HWHM) पर आधा चौड़ाई को दर्शाता है और घटना आईआर बीम की स्कैनिंग आवृत्ति का प्रतिनिधित्व करता है.

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Representative Results

प्रोटोकॉल अनुभाग के फ्रेनल गुणांक भाग में हमने यह दर्शाया है कि सैद्धांतिक रूप से एक ही समय में केवल एक ही अंतराफलक का चुनिंदा रूप से पता लगाना संभव है। यहाँ, प्रायोगिक रूप से हमने इस बात की पुष्टि की है कि यह पद्धति मूल रूप से सही है, जैसा कि चित्र 5 और चित्र 6में दर्शाया गया है।

चित्र 5 में जल दखल के बाद दफन अंतर-मुखीय पीएचईएमए संरचना को 150 दउ पीएचईएमए हाइड्रोजेल फिल्म और चित्रा 6 से पता चलता है कि जल में सतह ी संरचना 430 एनएम PHEMA हाइड्रोगेल फिल्म के साथ है। पैनल ए और बी दोनों आंकड़ों के लिए क्रमशः सीएच और सीओ पर्वतमाला के अनुरूप हैं। दफन इंटरफ़ेस में, सभी मनाया कंपन चोटियों तेज और स्पष्ट कर रहे हैं. कारण यह है कि CaF2 सब्सट्रेट चिकनी है और PHEMA अणुओं द्वारा प्रवेश नहीं किया जा सकता है, एक तेज CaF2/ हालांकि, सतह पर, क्योंकि पानी के अणुओं PHEMA के साथ बातचीत कर सकते हैं और थोक में फैलाना, PHEMA / पानी इंटरफ़ेस दफन एक के रूप में के रूप में तेज नहीं होगा. इसलिए, विभिन्न वर्णक्रमीय प्रोफाइल इन दो इंटरफ़ेस के लिए मनाया जाता है।

Figure 1
चित्र 1 . ऊर्जा संक्रमण आरेख (दाएं पैनल) के साथ एसएफजी प्रक्रिया (बाएं पैनल) का योजनाबद्ध शो। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 . प्रयोगशाला में एसएफजी प्रणाली। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 . Schematic एसएफजी प्रयोग के लिए प्रिज्म में प्रकाश संचरण पथ से पता चलता है. संख्या 0, 1, 2 और 3 क्रमशः वायु, प्रिज्म, PHEMA और नीचे माध्यम (नीचे माध्यम हवा, ठोस या तरल हो सकता है) का प्रतिनिधित्व करते हैं। ली, एक्स से पुन: उत्पादित; ली, बी; झांग, एक्स.; ली, सी.; गुओ, $.; झोउ, डी; लू, एक्स मैक्रो अणु 2016, 49, 3116 $3125 (ref 9)। कॉपीराइट 2016 अमेरिकी रासायनिक सोसायटी. यह आंकड़ा [9] से संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 . ssp और ppp ध्रुवीकरण संयोजनों के लिए पानी में प्रिज्म ज्यामिति के लिए फिल्म मोटाई के एक समारोह के रूप में परिकलित फ्रेनल गुणांक. पैनल A1 से C1 CH श्रेणी और पैनलA2 से C2 के अनुरूप सीओ श्रेणी के अनुरूप है। ली, एक्स से पुन: उत्पादित; ली, बी; झांग, एक्स.; ली, सी.; गुओ, $.; झोउ, डी; लू, एक्स मैक्रो अणु 2016, 49, 3116 $3125 (ref 9)। कॉपीराइट 2016 अमेरिकी रासायनिक सोसायटी. यह आंकड़ा [9] से संशोधित किया गया है।

Figure 5
चित्र 5 . पानी के संपर्क के बाद CaF2/PHEMA इंटरफ़ेस के एसएसपी और ppp स्पेक्ट्रम. एक: CH और OH रेंज; बी: सीओ रेंज. काले घटता Lorentz समीकरण का उपयोग करके फिट परिणाम हैं. स्पेक्ट्रम स्पष्टता के लिए ऑफसेट किया गया है. ली, एक्स से पुन: उत्पादित; ली, बी; झांग, एक्स.; ली, सी.; गुओ, $.; झोउ, डी; लू, एक्स मैक्रो अणु 2016, 49, 3116 $3125 (ref 9)। कॉपीराइट 2016 अमेरिकी रासायनिक सोसायटी. यह आंकड़ा [9] से संशोधित किया गया है।

Figure 6
चित्र 6 . CaF2 प्रिज्म पर PHEMA सतह के एसएसपी और पीपीपी स्पेक्ट्रम. एक: CH और OH रेंज; बी: सीओ रेंज. नमूना पानी के संपर्क में रखा गया था. काले घटता Lorentz समीकरण का उपयोग करके फिट परिणाम हैं. स्पेक्ट्रम स्पष्टता के लिए ऑफसेट किया गया है. ली, एक्स से पुन: उत्पादित; ली, बी; झांग, एक्स.; ली, सी.; गुओ, $.; झोउ, डी; लू, एक्स मैक्रो अणु 2016, 49, 3116 $3125 (ref 9)। कॉपीराइट 2016 अमेरिकी रासायनिक सोसायटी. यह आंकड़ा [9] से संशोधित किया गया है।

Figure 7
चित्र 7 . सामान्य चिराल (पी एस पी) एस एफ जी स्पेक्ट्रम एएमाइड I (पैनल ए) और एन-एच (पैनल बी) में पी एस/एस एफ समाधान (90 मिलीग्राम/एमएल) इंटरफेस के लिए मेथनॉल जोड़ने से पहले और बाद में। बिंदु प्रायोगिक आंकड़े हैं और ठोस रेखाएँ संचित वक्र हैं। स्पेक्ट्रा स्पष्टता के लिए ऑफसेट किया गया है. ली, एक्स से पुन: उत्पादित; डेंग, जी; मा, एल; लू, एक्स.; Langmuir 2018, 34, 9453"9459 (ref 16). कॉपीराइट 2018 अमेरिकी रासायनिक सोसायटी. यह आंकड़ा [16] से संशोधित किया गया है।

Figure 8
चित्र 8 . सामान्य चिराल (पी एस पी) एस एफ जी स्पेक्ट्रम एमिडी I (पैनल ए) और एन-एच (पैनल बी) में पी एस / एस एफ समाधान (1 मिलीग्राम/एमएल) इंटरफेसके लिए मेथेनॉल जोड़ने से पहले और बाद में । बिंदु प्रयोगात्मक डेटा हैं और ठोस रेखाएँ फिट किए गए वक्र (नीले) हैं। स्पेक्ट्रा स्पष्टता के लिए ऑफसेट किया गया है. ली, एक्स से पुन: उत्पादित; डेंग, जी; मा, एल; लू, एक्स.; Langmuir 2018, 34, 9453"9459 (ref 16). कॉपीराइट 2018 अमेरिकी रासायनिक सोसायटी. यह आंकड़ा [16] से संशोधित किया गया है।

Figure 9
चित्र 9 . अचिरल (एसएसपी, ए) और चिराल (एसपीपी, बी) एसएफजी स्पेक्ट्रम के लिए डुप्लेक्स ओलिगोन्यूक्लिओटाइड-एंकर्ड लिपिड बाइलेयर अलग-अलग सांद्रता के साथ Ca2+ समाधान के साथ संपर्क में (0.6 एमएम से 6 एम एम)। डेटा अंक लगभग Lorentz समीकरण का उपयोग करके फिट थे. Ca2 + एकाग्रता के एक समारोह के रूप में पानी कंपन संकेतों के लिए एकीकृत क्षेत्र का परिवर्तन प्रस्तुत किया गया था (एसएसपी, सी; एसपीपी, डी)। सभी स्पेक्ट्रम सामान्यीकृत किया गया है और स्पष्टता के लिए ऑफसेट. ली, एक्स से पुन: उत्पादित; मा, एल; लू, एक्स.; Langmuir 2018, 34, 14774-14779 (ref 21). कॉपीराइट 2018 अमेरिकी रासायनिक सोसायटी. यह आंकड़ा [21] से संशोधित किया गया है।

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Discussion

आण्विक स्तर से संरचनात्मक सूचना की जांच करने के लिए, एस एफ जी के अपने अंतर्निहित लाभ हैं (यानी, मोनोलेयर या उप-मोनोलेयर संवेदनशीलता और अंतरमुखीय चयनात्मकता), जिसे विभिन्न इंटरफेसों का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे कि ठोस/ठोस, ठोस/ तरल, ठोस/गैस, तरल/गैस, तरल/तरल इंटरफेस। हालांकि उपकरण रखरखाव और ऑप्टिकल संरेखण अभी भी समय लेने वाली हैं, भुगतान में महत्वपूर्ण है कि सतहों और इंटरफेस पर विस्तृत आणविक स्तर की जानकारी प्राप्त की जा सकती है.

जांच पाली (2-hydroxyethyl methacrylate) सतह और दफन अंतराफलक समाधानमें: जैसा कि हम ऊपर का प्रदर्शन किया, प्रकाश क्षेत्र गुणांक समायोजित किया जा सकता है. हम इस प्रयोगात्मक पुष्टि कर सकते हैं. सब्सट्रेट के साथ दफन इंटरफेस पर, क्योंकि CaF2 सब्सट्रेट सतह चिकनी है और PHEMA अणुओं द्वारा प्रवेश नहीं किया जा सकता है, इस इंटरफ़ेस एक तेज एक है. तथापि, जल के साथ सतह पर, जल के अणु PHEMA अणुओं के साथ अन्योन्यक्रिया कर सकते हैं और थोक में फैलाना. इसलिए इस इंटरफ़ेस blurry है, और दफन एक के रूप में के रूप में तेज नहीं है. इसलिए, विभिन्न SFG वर्णक्रमीय प्रोफाइल इन दो इंटरफेस के लिए मनाया जाएगा. हमारे प्रयोगात्मक SFG डेटा यह साबित किया, चुनिंदा सब्सट्रेट या समाधान में सतह के साथ दफन इंटरफेस की जांच करने की क्षमता का संकेत.

इंटरचेन इंटरेक्शन या सिल्क फाइब्रोइन माध्यमिक संरचनाओं के गठन पर प्रभाव:एक प्रमुख कारक महत्वपूर्ण ओवरलैपिंग एकाग्रता (सी *) है। एस एफ के लिए, सी * है $1.8 mg/ प्रायोगिक रूप से, $90 mg/mL (सी * से ऊपर) के एस एफ विलयन के लिए, कोई चिराल (पी एस पी) एस एफ जी कंपन संकेतों का पता एस एफ समाधान/पीएस इंटरफ़ेस में तब तक पाया गया जब तक कि एक प्रेरक एजेंट-मेथेनोल जोड़ा न गया, जैसा कि चित्र 7में दर्शाया गया है। लेकिन, के एस एफ समाधान के लिए $1 mg/mL (सी * से नीचे), चिरल (psp) एसएफजी कंपन संकेतों को सीधे मेथनॉल जोड़ने के बिना पता लगाया जा सकता है, जैसा कि चित्र 8में दिखाया गया है, जो इंगित करता है कि आदेश दिया माध्यमिक संरचनाओं पहले से ही एस एफ में गठन किया गया है समाधान/पीएस इंटरफ़ेस. चूंकि सी * श्रृंखला श्रृंखला ओवरलैप के लिए एक सीमा एकाग्रता है, श्रृंखला श्रृंखला बातचीत या स्थानिक कारावास इंटरफ़ेस पर एस एफ माध्यमिक संरचनाओं के गठन के लिए यहाँ एक विनियमन कारक के रूप में लिया जाना है.

लघु श्रृंखला Oligonucleotide डुप्लेक्सके आसपास पानी आणविक संरचनाएं: पानी के समाधान में एक छोटी श्रृंखला ओलिगोन्यूक्लिओटाइड डुप्लेक्स के लिए, चिरल पानी एसएफजी कंपन संकेतों छोटी नाली में चिराल रीढ़ की जलयोजन परत के अनुरूप . Achiral पानी एसएफजी कंपन संकेत ज्यादातर ओलिगोन्यूक्लिओटाइड डुप्लेक्स श्रृंखला और द्वि परत (पानी की परत की चिरालिक रीढ़ भी योगदान देता है)33के आसपास के पानी की परत से मेल खाते हैं। एक Ca 2 + एकाग्रता रेंज में 0.6 से 6 मम, जैसा कि चित्र 9में दिखाया गया है, हमने पाया, Ca2 + एकाग्रता के संदर्भ में chiral पानी कंपन संकेतों के लिए कोई स्पष्ट परिवर्तन नहीं था. हालांकि, जब Ca2 + एकाग्रता बदल गया था, तो अचील वाटर कंपन संकेतों को दृढ़ता से प्रभावित किया गया था। यह इंगित करता है कि पानी की परत की चिरल रीढ़ बारीकी से ओलिगोन्यूक्लिओटाइड डुप्लेक्स के लिए बाध्यकारी सामान्य जैविक स्थिति में, Ca2 + आयनों से ओलिगोन्यूक्लिओटाइड की रक्षा कर सकती है।

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Disclosures

हमारे पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन चीन के बुनियादी अनुसंधान के लिए राज्य कुंजी विकास कार्यक्रम (2017YFA0700500) और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (21574020) द्वारा समर्थित किया गया था. केंद्रीय विश्वविद्यालयों के लिए मौलिक अनुसंधान कोष, जियांग्सू उच्चतर शिक्षा संस्थानों के प्राथमिकता शैक्षणिक कार्यक्रम विकास (पीएपीडी) और प्रायोगिक जैव चिकित्सा इंजीनियरिंग के लिए राष्ट्रीय प्रदर्शन केंद्र द्वारा वित्त पोषित एक परियोजना शिक्षा (दक्षिण पूर्व विश्वविद्यालय) की भी काफी सराहना की गई।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)  Avanti Polar Lipids, Inc. 850355P-1g
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 100092680 ≥99.7%
CaF2 prism Chengdu YaSi Optoelectronics Co., Ltd.
Calcium chloride anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10005817 ≥96.0%
deuterated DPPC (d-DPPC) Avanti Polar Lipids, Inc. 860345P-100mg
Electromagnetic oven Zhejiang Supor Co., Ltd C21-SDHCB37
Langmuir-Blodgett (LB) trough KSV NIMA Co., Ltd. KN 2003
Lithium bromide anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 20056926
Milli-Q synthesis system Millipore Ultrapure water
Plasma cleaner Chengdu Mingheng Science&Technology Co., Ltd PDC-MG Oxygen plasma cleaning
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (PHEMA) Sigma-Aldrich Co., LLC. 192066 MSDS Mw = 300 000
Polystyrene Sigma-Aldrich Co., LLC. 330345 MSDS Mw = 48 kDa and Mn = 47 kDa
Silk cocoons From Bombyx mori
Single complementary strand of oligonucleotide Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. H03596 5'-CGAAGGCTTCCAGCT-3'
Single strand of oligonucleotide Nanjing Genscript Biotechnology Co., Ltd. H04936  3¢-end modified by cholesterol-triethylene glycol(Chol-TEG) (5¢-GCTTCCGAAGGTCGA-3¢)
Sodium carbonate anhydrous Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10019260 ≥99.8%
Spin-coater Institute of Microelectronics of the Chinese Academy of Sciences KW-4A For the prepartion of ploymer films 
Step profiler Veeco DEKTAK 150 For the measurement of film thickness
Sum frequency generation (SFG) vibrational spectroscopy system EKSPLA A commercial picosecond SFG system

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References

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