Avbildning Kalciumdynamik i subpopulationer av mus bukspottskörteln ö-celler

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för avbildning och kvantifiering av kalciumdynamik i heterogena cellpopulationer, till exempel pankreasceller. Fluorescerande reportrar levereras i det perifera lagret av celler inom Holmen, som sedan immobiliseras och avbildas, och per cell analys av dynamiken i fluorescensintensiteten utförs.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Hamilton, A., Vergari, E., Miranda, C., Tarasov, A. I. Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells. J. Vis. Exp. (153), e59491, doi:10.3791/59491 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bukspottskörteln holhormoner reglera blodglukos homeostas. Förändringar i blodsocker inducera svängningar av cytosoliskt kalcium i bukspottskörteln ö-celler som utlöser utsöndring av tre huvudsakliga hormoner: insulin (från β-celler), glukagon (α-celler) och somatostatin (δ-celler). β-celler, som utgör majoriteten av ö-celler och är elektriskt kopplade till varandra, svara på glukos stimulans som en enda enhet. Retbarhet av de mindre subpopulationerna, α-cellerna och δ-cellerna (som utgör cirka 20% (30%) och 4% (10%) av den totala gnagare1 (Human2) ö-cellnummer, respektive) är mindre förutsägbar och är därför av särskilt intresse.

Kalcium sensorer levereras i det perifera lagret av celler inom den isolerade Holmen. Ön eller en grupp av holkar immobiliseras sedan och avbildas med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Valet av Imaging-läge är mellan högre dataflöde (Wide-fält) och bättre rumslig upplösning (konfokal). Konventionellt, laserskanning konfokalmikroskopi används för avbildning vävnad, eftersom det ger den bästa separationen av signalen mellan angränsande celler. Ett Wide-Field system kan utnyttjas för, om kontaminating signalerar från den dominera befolkningen av β-celler minimeras.

När kalciumdynamiken som svar på specifika stimuli har registrerats uttrycks data i numerisk form som fluorescensintensitet kontra tid, normaliserad till initial fluorescens och baseline-korrigerad, för att avlägsna effekterna kopplade till blekning av fluorophore. Förändringar i Spike frekvens eller delområde under kurvan (pAUC) beräknas kontra tid, att kvantifiera de observerade effekterna. PAUC är känsligare och ganska robust medan tillsatta frekvens ger mer information om mekanismen för kalcium ökning.

Mindre cell subpopulationer kan identifieras med hjälp av funktionella svar på markör föreningar, såsom adrenalin och ghrelin, som inducerar förändringar i cytosoliskt kalcium i en viss population av ö-celler.

Introduction

Syftet med metoden är att avbilda realtids förändringar i cytosoliska kalciumkoncentration ([ca2 +]CYT) i mindre subpopulationer av bukspottskörteln ö-celler. Detta gör att avslöja mekanismerna för hormon sekretion i dessa celler, avslöjar Detaljer om Cross-Talk mellan olika celltyper och, potentiellt, införa en populational dimension i den större bilden av Holmen signalering.

Islets består av flera celltyper. Förutom de mer välkända insulin-utsöndringen β-celler, det finns minst två subpopulationer som också är kritiska i regleringen av blodsocker3. α-celler (som utgör cirka 17% av ö-celler) utsöndrar glukagon när blodsockret blir för lågt, vilket signalerar för frisättning av glukos i blodet från depåer i levern. Överdriven glukagon nivåer (hyperglucagonemi) och försämrad kontroll av glukagon-release åtfölja (och, tekniskt, kan bidra till) den prediabetic tillstånd av nedsatt insulinkänslighet4. δ-celler (cirka 2%) utsöndrar somatostatin som svar på glukos förhöjning. Detta allestädande peptid hormon är sannolikt närvarande vid höga koncentrationer i närheten av α-och β-celler i holkar, som har en stark Gi receptor-medierad dämpande effekt på både glukagon och insulinsekretion.

α-celler och δ-celler delar en stor del av glukos Avkännings maskineriet med sina nära släkt, β-celler. Alla tre celler typer är utrustade med ATP-känsliga K+ kanaler, utarbeta metaboliska sensorer5 som styr plasmamembranet potential dessa retbara celler. Samtidigt regleras utsöndringen av insulin, somatostatin och glukagon på olika sätt av glukos. Avbildning av ca2 + dynamik i de två mindre subpopulationerna av ö-celler kan därför ge en inblick i Cross-Talk mellan blodglukos och Holmen sekretoriska produktionen.

Tidiga försök att övervaka retbarheten av α-och δ-celler med hjälp av plåster-klämma elektrofysiologi följdes snart av avbildning av ca2 + i enstaka α-och δ-celler. Cellernas identitet i dessa experiment kontrollerades i efterhand med anti-glukagon-eller anti-somatostatin-antikroppar. Dessa ansträngningar hämmades ofta av konstaterandet att ö-celler beter sig mycket annorlunda inom Holmen och som enstaka celler. Även om β-celler kan tyckas vara de viktigaste välgörare av Holmen arrangemanget (på grund av sin överväldigande majoritet som ligger bakom deras starka elektriska kopplingen), den största avvikelsen var, överraskande, hittades i α-celler. Inom den intakt holme, dessa celler ständigt och ihållande aktiveras vid låga glukos, vilket är bara sant för cirka 7% av enstaka dispergerade α-celler6. Att rapportera aktiviteten hos α-och δ-celler i intakta öar tros därför utgöra en närmare tillnärmning av in vivo-förhållanden.

I allmänhet finns det två sätt att rapportera ca2 + dynamik specifikt från α-cell-eller δ-cellsunderpopulationerna: (i) att uttrycka en genetiskt kodad ca2 + -sensor via en vävnadsspecifik promotor eller (II) använda markör föreningar. Den mer eleganta tidigare metoden lägger den stora fördelen av sann 3D-avbildning och därmed studerar cell distribution inom Holmen. Det kan dock inte tillämpas för intakt Human Holmen material. En annan potentiell angelägenhet är Promotorns "läckage", särskilt när β-/α-cells transdifferentieringen eller α-cellsreaktionen på hög glukos är på plats. Den sistnämnda metoden kan användas med färsk isolerad vävnad, inklusive mänskliga prover eller odlade öar. Data samlas dock endast från det perifera lagret av ö-celler, som levererar färgämne/markör molekyl i djupare lager utan att förändra Holmen arkitektur är utmanande. En oväntad fördel med den senare metoden är kompatibiliteten med Bredbildsläge, vilket gör det möjligt att skala upp experimenten till samtidig avbildning av tiotals eller hundratals öar (dvs. tusentals till tiotusentals celler).

Kalcium är avbildat i vivo med hjälp av genetiskt kodade gcamp7 (eller pericam8) familj sensorer, som är varianter av cirkulärt permuterade grönt fluorescerande protein (GFP) smält till kalcium-bindande protein calmodulin och dess målsekvens, M13 fragment av myosin ljus kedja Kinas7,9. Gcamps har superb signal-till-brus nyckeltal i intervallet nanomolar ca2 + koncentrationer och en hög 2-Photon tvärsnitt, vilket gör dem till ett idealiskt val för in vivo arbete10,11. Den utmanande aspekten av att använda rekombinanta sensorer är deras leverans till cellerna. Heterologt uttryck kräver användning av en viral vektor och flera timmar ex vivo odling, som ofta väcker farhågor om potentiell avdifferentiering eller försämring av cellfunktioner. Även om musmodeller förkonstruerade för att uttrycka GCaMP ta itu med detta problem, de lägger till nya utmaningar genom att öka ledtiden avsevärt och begränsa arbetet till en icke-mänsklig modell. Mycket hög känslighet för förändringar av intracellulära pH är en annan negativ sida av proteinbaserade sensorer12, vilket dock är mindre av ett problem för avkänning oscillerande signaler, såsom ca2 +.

Fördelen med trap-färgämnen (såsom grön fluorescerande Fluo4) är att de kan lastas i färsk isolerad vävnad inom cirka en timme. Förutsägbart, trap-färgämnen har lägre signal-brus-förhållanden och (mycket) lägre foto stabilitet än deras rekombinanta motsvarigheter. Vi kan inte bekräfta13 rapporterna om toxicitet av de trap-färgämnen14, men färg överlastning är ett vanligt problem.

Röda, rekombinanta ca2 + -sensorer baserade på cirkulär permutation har utvecklats snabbt sedan 201115, och de senaste utvecklingarna utgör en stark konkurrens till gcamps16 för vävnads avbildning, givet högre penetrationsgrad av rött ljus. Kommersiellt tillgängliga röda trap färger kan användas på ett tillförlitligt sätt för Single-cell Imaging, men på vävnadsnivå, kan inte konkurrera väl med de gröna analoger.

Det finns till synes väldigt lite val av bildteknik för experiment i vävnad där out-of-Focus ljus blir ett kritiskt problem. Den konfokalmikroskopi systemet ger acceptabel Single-cell upplösning genom annullering av out-of-fokus ljus med alla mål på Na ovan 0,3 (för fallet med GCaMP6) eller 0,8 (trap färg). I en teknisk bemärkelse, en konventionell konfokala Mikroskop kan användas för samtidig avbildning av [ca2 +]CYT från hundratals (gcamp) eller tiotals öar (trappable Dye). Det enda realistiska alternativet till konfokalläge vid 3D-uttryck av sensorn i vävnad är kanske ljusbladsmikroskopi.

Saker är något annorlunda för fallet när sensorn uttrycks i det perifera lagret av celler inom Holmen vävnad. För ljusa rekombinanta sensorer som har ett levande intracellulärt uttrycksmönster, med hjälp av ett brett fält bildhanterings läge med ett låg-NA-mål kan ge tillräcklig kvalitet och belöna forskaren med en betydande ökning inom synfälts området och därmed Genomströmning. Ett brett fält system ger sämre rumslig upplösning, eftersom ljuset utanför fokus inte avbryts. Därför bild vävnad med hög-NA (låg skärpedjup) mål är mindre informativ, som Single-cell signalen är kraftigt förorenad av angränsande celler. Föroreningen är mycket mindre för låg-NA (hög skärpedjup) mål.

Det finns dock uppgifter för vilka ett högt dataflöde och/eller samplingsfrekvens blir en kritisk fördel. α-och δ-celler uppvisar betydande heterogenitet, vilket skapar en efterfrågan på höga urvalsstorlekar för att avslöja subpopulationernas bidrag. Wide-fält Imaging är snabb och känsligare, med en industriell skala stora synfält systemavbildning hundratals (GCaMP) eller tiotals (Fluo4) av öar vid samma signal-brus-förhållande som de konfokala experiment på tio eller en enda Holmen, respektive. Denna skillnad i genomströmningen gör wide-fältet systemet fördelaktigt för populational Imaging med en enda cell upplösning, vilket kan vara särskilt viktigt för små subpopulationer såsom δ-cell en. Likaså skulle försök att rekonstruera elektrisk aktivitet från ca2 + tillsatta17 gynnas av den högre samplingsfrekvens som tillhandahålls av ett brett fält Imaging-läge. Samtidigt, flera "nisch" problem som aktiviteten av bukspottskörteln α-celler vid stimulering av den dominerande β-cell subpopulation, kräver användning av ett konfokalsystem. En faktor som påverkar beslutet mot konfokalläge är närvaron av betydande kontaminerande signal från β-cell subpopulation.

Även om du använder hormonspecifik antikropps färgning för att verifiera cellernas identitet efter att bild försöken fortfarande är ett alternativ, kan mindre cell subpopulationer identifieras med hjälp av funktionella markör föreningar, såsom adrenalin och ghrelin som visades selektivt stimulera ca2 + dynamik i α-18 och δ-celler19,20respektive.

Analysen av tidsfördröjning Imaging data syftar till att ge information utöver triviala farmakologi, såsom populational heterogenitet, korrelation och interaktion mellan olika signaler. Konventionellt analyseras bild data som intensitet kontra tid och normaliseras till den initiala fluorescensen (F/F0). Baseline korrigering behövs ofta, på grund av blekning av fluorophore signalen eller förorening genom förändringar i autofluorescence eller pH (typiskt induceras av millimolar nivåer av glukos12). Ca2 + data kan analyseras på många olika sätt, men tre huvudsakliga trender är att mäta förändringar i Spike frekvens, platå fraktion, eller område under kurvan, beräknad kontra tid. Vi fann det sistnämnda tillvägagångssättet fördelaktigt, särskilt i tillämpningen av kraftigt undersamplade konfokaldata. Fördelen med den pAUC metriska är dess känslighet för både förändringar i signal frekvens och amplitud, medan Computing frekvensen kräver ett stort antal svängningar21, vilket är svårt att uppnå med konventionell avbildning. Den begränsande faktorn för pAUC-analys är dess höga känslighet för baseline-förändringar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla metoder som beskrivs här har utvecklats i enlighet med Förenade kungarikets djur (Scientific procedurer) Act (1986) och University of Oxford etiska riktlinjer.

1. isolera mus pankreasöar

  1. Förbered odlingsmediet och isolerings lösningen.
    1. Utgör odlingsmediet: RMPI1640 (se tabell över material), kompletterat med 10% av fetalt kalv serum, 100 enheter/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin. Fördela mediet i 2 60 mm plast petriskålar (som inte behandlas med lim), och hålla rätterna i inkubatorn (37 ° c, 5% CO2, absolut luftfuktighet).
    2. Utgör isolerings lösningen (50 mL/mus): Hanks medium med 5 mM glukos, 100 enheter/mL penicillin 100 μg/mL streptomycin. Förvaras på is (4 ° c).
    3. Utgör enzym lösningen (t. ex. Liberase): 0,2 mg/mL i isolerings lösningen, 2 mL per mus. Förvaras på is (4 ° c). Alternativt, pre-test aktiviteten av liberase, och optimera inkubations parametrarna för varje omgång av enzymet22.
  2. Injicera enzym lösningen i mus gallgången.
    1. Offra musen (12-veckors gammal kvinna, C57Bl/6J) via cervikal dislokation.
    2. Under en dissektion Mikroskop, klippa öppna huden och muskel lagren med fin sax och lokalisera gallgången.
    3. Ligate tarmen på båda sidor av korsningen med gallgången, med hjälp av en bomullstråd.
    4. Lyft gallgången försiktigt med böjda Fine urmakare ' s pincett och introducera den iskalla enzym lösningen i kanalen med en 2 ml spruta med en 30g nål. En inflation i bukspottkörteln bör observeras i detta skede.
    5. Samla den uppblåsta bukspottkörteln med en kombination av trubbiga-nosed tumtång och fina urmakare ' s pincett i en 15 ml Falcon Tube och hålla den på is (4 ° c). Tillsätt 1 mL av enzym lösningen i röret.
  3. Befria och samla in pankreasöarna från bukspottkörteln.
    1. Inkubera pancreata uppblåsta med enzym lösningen för 16 min i ett vattenbad, vid 37 ° c. Skonsam skakning kan användas men är inte kritisk, förutsatt att inflationen har varit bra.
    2. Stoppa matsmältningen genom tillsats av iskall isolerings lösning, upp till 10 mL. Skaka försiktigt Digest: det bör falla i små bitar.
    3. Tvätta smälta tre gånger i 10 mL av isolerings lösningen, låt stå 5 min vid 1 x g till sediment de befriade holmar, på is. Aspirera supernatanten försiktigt, med en 10 ml serologiska pipett.
    4. Tillsätt kallt RPMI till Digest (för att göra upp till 10 mL).
    5. Använd plast petriskålar (steg 1.1.1) för att plocka kobbar. Dekanera RMPI mediet utanför en av Petriskålarna, och försiktigt hälla några (4-5 mL) av Digest istället. Samla de befriade öarna som visas som runda, släta och hög densitet bitar, med en P10 pipett i den andra petriskål.
    6. Odla kobbar i inkubatorn (37 ° c, 5% CO2, absolut luftfuktighet). Experimentet kan pausas i det här skedet. Lämnar öarna för 1-2 timmar tros av vissa för att hjälpa till att återhämta sig från den mekaniska stressen under isoleringen.

2. Fyll på färgämnet eller uttryck sensorn

  1. Förbered den trap-färgämnet.
    1. Lös upp alikvot (normalt, 50 μg) av det trappbara färgämnet (t. ex. fluo-4) i DMSO till en lager koncentration på 2 mM. Tillsätt Pluronic syra till en slutlig koncentration av 1% (med hjälp av en 20% lager i DMSO), för att förbättra solubilization av färgämnet.
    2. Färgämnet i små PCR-rör (2 μL i vardera). Färgen kan förvaras fryst (-20 ° c) i flera veckor.
  2. Alternativt, Förbered den rekombinanta sensorn.
    1. Fördela sensorn (t. ex. adenovirala vektor kodning GCaMP6f) till 10 μL alikvoter och förvara vid-80 ° c.
    2. (Valfritt) pre-test titern av virus beståndet genom att infektera öar (enligt nedan) med hjälp av flera seriella spädningar, att avslöja den optimala koncentrationen för infektion.
      Anmärkning: rekombinanta sensorer kodade med olika vektorer (lentivirus, BacMam, AAV) kräver ett annat infektions protokoll. Se till att kontrollera detta med Vector leverantören och optimera arbetsförhållandet för dina behov. Den "arbetande" lager av adenovirus kan lagras vid-20 ° c och frysta/tinade flera gånger. Överdriven frysning-Tina cykling minskar den effektiva titern av viruset.
  3. Förbered avbildnings lösningen.
    1. Gör upp Imaging Solution, mM: 140 NaCl, 4,6 KCl, 2,6 CaCl2, 1,2 mgcl2, 1 NaH2Po4,5NaHCO3, 10 Hepes (pH 7,4, med NaOH).
    2. Gör upp ett lager av glukos (0,5 M) och mannitol (0,5 M) i avbildnings lösningen. Beståndet kan förvaras i kylskåpet (4 ° c) i flera veckor.
  4. Fyll på det trap-bara färgämnet.
    1. Gör arbetslösningen för färgämnet genom att lösa upp 2 μL av färgämnet i 600 μL av avbildnings lösningen som innehåller 6 mM glukos. Lösningen kan värmas upp eller vortexed att förbättra solubiliseringen.
    2. Ladda kobbar isolerade i steg 1 i arbetslösningen av färgämnet. Lastning kan göras med hjälp av en multispot tallrik eller en petriskål. I det senare fallet, placera en 100 μL droppe av arbetslösningen på botten av en icke-adhesiv petriskål (35-eller 60-mm) och Pipettera 10-30 öar i DROPP.
    3. Vid olika grupper av öar (t. ex. vildtyp/knock-out), ordna flera brunnar och flera droppar så lastning kan göras samtidigt.
    4. Inkubera kobbar i färgen arbetslösning vid rumstemperatur i mörkret för 70-90 minuter. Överinkubera inte.
    5. Kontrollera belastningen under fluorescensmikroskopet. kobbar bör få mild fluorescens, med vissa celler är ljusare än resten. Avrundning av celler och nukleär lokalisering av färgämnet är tecken på överbelastning.
    6. Överför kobbar till Dye-fri avbildningslösning som innehåller 6 mM glukos. Kobbar kan användas för avbildning omedelbart, men eventuellt färgen kan lämnas att de-Esterify för en annan 10-15 minuter. Kobbar kommer att behålla färgämnet i flera timmar och kan därför användas för avbildning i flera SKIFT.
  5. Alternativt, infektera kobbar med rekombinant vektor.
    1. Platta kobbar i droppar i RPMI odlingssubstrat (steg 1.1.1) (t. ex. 30 μL), för att minimera mängden vektor som behövs.
    2. Lägg till vektorn vid ett förhållande av cirka 105 smittsamma enheter/Holmen som helst bör resultera i en mångfald av infektioner > 2. Helst bör förhållandet optimeras till det minimala förhållandet som skulle ge uttryck i perifert skikt. Förtitrering (steg 2.2.3) kan hjälpa.
    3. Introducera 20-50 holmar i dropp och kultur för 8-48 timmar. (Helst, övernattning). Holkar bör utveckla en svagt grön fluorescens i de flesta av cellerna, utan förändringar i cellmorfologi.
      Notera: framgången av infektionen och uttryckt beror på tiden av exponering till virus lösningen. Helst bör viruset stanna i lösningen över natten men kan eventuellt tas bort efter så lite som 15 minuter. Men smittsamhet, och därför uttryck, kommer sannolikt att bli dramatiskt lägre.

3. Imaging ca2 + dynamik

  1. Immobilisera kobbar under (inverterat) Mikroskop.
    1. Montera bild kammaren för inverterad mikroskopi. Placera glas täckglaset (tjocklek 1 eller 1,5) inuti kammaren och se till att glas kammarens gränssnitt är vattentätt. Kontrollera att täckglas är inom räckhåll för mikroskopet mål (kritisk för fallet med en skrymmande hög-NA mål).
    2. Förbered immobiliseringstillbehören. Skära små rektanglar (20 mm x 20 mm) från fin mesh och grova mesh. Introducera två spacer "väggar" på fin mesh med en 45-50 μm tjock tejp. Använd dubbla skikt av distansen om storleken på de öar som skall-vara-avbildas väsentligt överskrider det konventionella 100 μm.
    3. Sänk ner maskorna och vikten i avbildnings lösningen med en 35 mm petriskål. Se till att plasten och metallen är våta.
    4. Under en dissektion Mikroskop, vrid fin mesh med spacer "väggar" upp och ner, distansen vänd uppåt. Plocka flera öar lastade med den trap-färgämne eller uttrycka den rekombinanta sensorn med en P20 pipett och försiktigt placera dem ovanpå den fina mesh, mellan de två distansarna. Se till att maskorna och brickorna inte innehåller stora mängder av avbildnings lösningen på dem.
    5. Plocka upp mesh med kobbar, med hjälp av urmakare ' s forceps, och placera den upp och ner inuti bild kammaren, så att distansarna är vända nedåt och sitta direkt på kammaren täckslip. Se till att kobbar är fångade mellan distanser och mesh, i mitten av täckslip.
    6. Placera det grova nätet och vikten ovanpå det fina nätet i kammaren. Introducera avbildnings lösningen i kammaren. Se till att kobbar är immobiliserade och redo att avbildas. Undvik överdriven skakning av kammaren (små störningar som transporterar kammaren till mikroskopet och sätta in i en uppvärmd etapp är acceptabla).
      Obs: ett liknande immobiliseringsarrangemang kan appliceras på ett upprätt system.
  2. Ställ in mikroskopet.
    1. Välj bildhanterings läge och mål, placera kammaren med kobbar från steg 3,1 på det temperaturstyrda stadiet av mikroskopet.
      1. Ställ in temperaturkontroll (helst, mellan 30 ° c och 36 ° c) och perifusion. För ett inverterat system, placera inflödet lägre än utflödet i kammaren och Ställ in utflödes flödet till större än inflödet (vilket normalt uppnås genom att använda en slang av en bredare innerdiameter på en Peristaltisk pump).
      2. Se till att utflödet har en minimal kontaktyta med lösningen, så att den tar bort lösningen i flera sekventiella små droppar, undvika långa intervaller av kontinuerlig lösning borttagning. Den senare är den viktigaste källan till artefakt i tidsförlopp avbildning av periodiska signaler som de visas som regelbundna periodiska intensitet svängningar av varje avbildad pixel och ofta tolkas som "långsamma vågor".
      3. Initiera perifusion med avbildnings lösningen som innehåller 3 mM glukos.
    2. Välj ljus bana och filter för avbildning av de gröna fluorofoforer; excitation mellan 470 och 500 och utsläpp mellan 505 och 550 skulle fungera för var och en av dem.
    3. Kör Live Imaging för att ställa in avbildnings parametrarna. Justera vyn för att fånga de öar av intresse.
    4. Optimera bildens signal-brus-förhållande. För detta ändamål, justera excitation ljusintensitet, exponeringstiden och Binning. Se till att inställningarna tillåter en distinkt visualisering av varje cell inom Holmen vid minimal möjlig ljusintensitet och exponering.
    5. Utför bild anskaffning. Beroende på uppgift kan bilder tas vid 0,1 till 5 Hz. Detta ligger långt under Nyquistkriteriet för de snabba na+-drivna svängningarna i α-och δ-celler (≫ 300 Hz), vilket innebär att data är undersamplade som standard. Men att öka förvärvsfrekvensen för att matcha denna efterfrågan är inte möjligt i flercelliga/multi-Islet Imaging med ett stort synfält. GCaMP kan avbildas snabbare, medan Fluo4 kommer oundvikligt blekmedel under snabba förvärvs förhållanden.
      Obs: med tanke på att [ca2 +]CYT svängningar i ö-celler drivs av elektrisk aktivitet, med låga förvärvsfrekvensen kan låta kontraproduktivt. I verkligheten kan dock förvärvsfrekvensen vid omkring eller över 1 Hz räcka för att lösa β-cells tillspikning13, medan tröskeln för detektion av natrium kanals drivna svängningar i α-och δ-celler ligger långt över 300 Hz. Huruvida α-eller δ-cellen [ca2 +]CYT -oscillationer förvärvas vid 1 Hz eller 0,1 Hz, kommer de att vara allvarligt undersamplade och reflektera ca2 + hantering av cellen snarare än elektrisk aktivitet.
      1. Kontrollera kvaliteten på de förvärvade data: vid 3 mM glukos bör α-cellsaktivitet vara tydligt synlig/detekterbar. Se till att detta är fallet och gå vidare till full skala Time-lapse Imaging.
  3. Fotografering med tidsfördröjning
    1. Använda sig av en online-diagram över signaldynamik, som genomförs i förvärvet programvara om detta är tillgängligt. Om online-diagram inte är ett alternativ, tillämpa en look-up-tabell som visar signalintensiteten i det mest omfattande sättet (till exempel "Rainbow").
    2. Applicera stimuli på ett reversibelt sätt: spela in återhämtningen av signalen till basal nivå. Ignorera artefakterna i början och slutet av inspelningen; den senare kan se ut som oåterkallelig "ökning"/"minskning" av sonden fluorescens på grund av förändringar i pH-eller celldöd.
    3. Differentiera α-celler genom oscillerande ca2 + dynamik, vid låg glukos. Introducera adrenalin eller glutamat i badet lösning, reversibelt för 2-5 min. Ett snabbt hopp i [ca2 +]CYT följt av en avmattning eller annullering av Oscillationerna kommer att följa.
      Anmärkning: adrenalin är en erkänd markör förening för α-celler, som har en selektiv positiv effekt på denna subpopulation av ö-celler, medierad av frisläppandet av ca2 + från intracellulära depåer18. Glutamat har lagts fram som en annan α-cellsspecifik agonist23.
    4. Lägg till/ta bort ghrelin, som nyligen har rapporterats att aktivera δ-cell selektivt19,20. Observera en snabb reversibel ökning av [ca2 +]CYT i en liten subpopulation av ö-celler.
    5. Tillsätt/ta bort 20 mM glukos. Ett samordnat oscillerande svar i β-cells subpopulationen. Notera svaret av celler som tidigare har aktiverats av adrenalin eller glutamat och ghrelin.
    6. Spara bildsekvensen. Överväg att använda "AutoSave" under inspelningen.

4. analysera data

  1. Analysera tids fördröjnings bilden.
    1. Importera tids fördröjnings bilden till en bildanalysprogram vara, till exempel en öppen källkod ImageJ/FIJI.
    2. Om betydande/snabb rörelse har inträffat under inspelningen, kassera data som oreparerbar. Använd StackReg eller TurboReg plugins24 för att korrigera mindre drivor.
    3. Skapa en mask bild för cell identifiering och mappning av intresseområde (ROI). Det bästa sättet att uppnå detta är att göra en stapel bild med hjälp av en av de funktioner som "medel intensitet" eller "maximal intensitet". Den funktion som ska användas är den som kommer att ge den bästa igenkänningen av enskilda celler.
    4. Tröskel mask bilden, ta bort alla data utanför ö-regionen. Funktionen fungerar i automatiskt läge för 32-bitarsbilder.
    5. Identifiera Maxima i tröskel avbildningen. Maxima kan representeras av punkter, regioner eller till och med sektorer om bilden är tät.
    6. Använd funktionen "Find Maxima" utan storleksbegränsningar och klistra in det identifierade Maxima i redigeraren för intresse region (ROI).
    7. Släta/interpolera var och en av ROIs kartlagda; möjligen kommer ROIs kräver expansion. En enkel skriften kanna bli skrev för (4.1.6-4.1.8) och springa flera tiden till skaffa bäst cell upptäckten resultaten. Flera ROIs kan överlappa, men detta är sällsynt.
    8. Analysera placeringen av ROIs och klistra in respektive X-och Y-data i den elektroniska bords programvaran (t. ex. Microsoft Excel).
    9. Analysera den gråa intensiteten kontra tid för alla ROIs och klistra in data i den elektroniska tabellen programvara.
  2. Analysera numeriska data.
    1. Importera data till dataanalysprogram varan. Beroende på valet av programvara och varaktighet/sampling/storlek av experimentet, kan detta vara en enkel kopiera och klistra in åtgärden eller en fristående procedur. Säkerställa arrangemang och lagring av numeriska data.
    2. Importera tidsstämplar eller tids noteringar, om sådana finns.
    3. Normalisera data för rå fluorescensintensitet ("F") till det initiala värdet av fluorescens ("F0"). Detta behöver inte vara fluorescensen i den allra första punkten, men kan vara genomsnittet av flera första punkter. Normalisering bör minska variationen av data och i ett idealfall (ingen drivande baslinjen) resultera i en analyserbart datauppsättning ("f/f0").
    4. Om cell-till-cell-variationen för F/F0 -datasetet fortfarande är betydande (lång inspelning, blekning), utför du baslinje korrigeringen. För detta ändamål ska en "kontroll region" definieras, det vill säga det tidsintervall under vilket kontroll lösningen (för mus i bukspottskörteln, 3 mM glukos utan agonister/antagonister) tillämpades.
      1. Om kontrollområdet har en tydlig icke-oscillerande signal förutsätts att F/F0 återvände till det initiala värdet (F/f0= 1) efter varje applicering av kontroll lösningen. Korrigera tids fördröjnings data för varje cell genom att dela upp data i segment, avgränsade med punkter när kontroll lösningen lades till och tillämpa linjär korrigering på varje segment. Använd inte polynom eller annan ickelinjär korrigering eftersom detta resulterar i artefakter.
      2. Om kontrollområdet har tydliga svängningar eller ytterligare faktorer (såsom FAD autofluorescence) är närvarande, Använd en Spike upptäckt algoritm17. En trivial och snabb Run-around för det är en Maxima-känslig Wavelet Transform (figur 3a).
    5. Kvantifiera uppgifterna. Även om ca2 + är en mycket dynamisk signal, presenterar ca2 + data i termer av absoluta F/f0 -värden är allmänt godtagbara i biomedicinsk litteratur. Om resultaten från flera experiment måste jämföras, Välj ett mått.
      1. Mätfrekvensen av ca2 + spikar (figur 4A, D), och dess svar på tillsats av (ANT) agonister. För detta ändamål, dela inspelningen i lika tidsintervall och beräkna Timecourse för partiell frekvens (spiking frekvens i varje intervall) genom att räkna toppar inom intervallet och normalisera till intervallet varaktighet.
      2. Alternativt kan du ställa in tröskelvärdet och beräkna platå fraktionen (PF) för vart och ett av de intervall som definieras ovan (figur 4B, F). Fraktionen anger den procentuella tiden inom det intervall som cellen tillbringade i tillståndet "upphetsad".
      3. Alternativt kan du beräkna delområdet under kurvan (pAUC) för vart och ett av de intervall som anges ovan (figur 4C, G). Detta mått är känsligt för förändringar i både frekvens och amplitud av tillspikning.
        Anmärkning: en varning för att mäta frekvens är dess bristande känslighet för Spike varaktighet och dålig stabilitet. Eftersom uppgifterna är kraftigt undersamplas kontra den elektriska tillsatta, antalet spikar per intervall är ganska liten och därmed en enda extra spik kan dramatiskt påverka resultatet. Den "flaskhals" av pAUC är dess känslighet för förändringar i baslinjen. Även om mindre benägna att artefakter och mer känsliga för förändringar i [ca2 +]CYT än frekvens, är PAUC ändå inte särskilt informativ om arten av ca2 + dynamik. Platå fraktion är en utvidgning av det öppna sannolikhets konceptet till hela cell systemet. Det är mindre robust än pAUC dock, på grund av dess beroende av tröskelvärdet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Holkar belastning ganska bra med de trap färgämnen (figur 1A), om inte lipidsammansättningen av membranet har påverkats (t. ex. genom kronisk exponering för fettsyror). Den humana adenovirus typ 5 (Ad5)-vektorn riktar sig också till alla ö-celler (figur 1B). Problem kan uppstå när mer än en rekombinant sensor uttrycks i samma cell. Dessutom är holmar vanligtvis mycket väl immobiliserade med hjälp av den teknik som beskrivs ovan, vilket ger exceptionell stabilitet och tillgång till lösningen.

Ca2 + tillspikning i α-celler kan lätt detekteras vid låga glukosnivåer (figur 2). Det finns en hög cell-för-cell korrelation mellan aktiviteten vid låga glukos och svaret på adrenalin och glutamat. Ghrelin aktiverar vissa adrenalinmottagliga celler (α-celler?) vid lågt glukos, men det har ingen effekt på ca2 + dynamik i de flesta av de celler som aktiveras av låga glukos (β-celler).

När de analyseras i termer av partiell frekvens (figur 4A, C), adrenalin-eller ghrelin-stimulerade celler visar en betydande ökning under alla eller inget villkor. Det är, en cell med låg basal aktivitet som blir aktiverad av adrenalin eller ghrelin uppvisar en dramatisk ökning av detta mått. De övergripande förändringarna mellan basal tillspikning och adrenalin effekten är dock mycket subtila (figur 4A, C). Däremot är partiell AUC känslig för de förändringar som införts av adrenalin i alla celler, även när basal aktivitet är hög (figur 4B, D).

Figure 1
Figur 1: lastning av det trapperbara färgämnet och uttrycket för den rekombinanta sensorn i kobbar. Typiska mus öar laddade med den trap-färg fluo-4 (A) eller uttrycker den rekombinanta sensorn GCaMP6 i perifert skikt av celler (B) eller i det djupare skiktet (C). Polar Tracer sulforodamin B (SRB, visas som vit) har använts för att beskriva enskilda celler inom varje Holmen25. D) representativ kinetik för ca2 + som svar på glukos som registrerats från enskilda celler inom Holmen med hjälp av Fluo4. Notera heterogenitet inom mindre cellpopulationer. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: typisk ca2 + respons av ö-celler till olika stimuli. Typiska α-cell (a) och δ-cell (B) ca2 + dynamik, som svar på adrenalin, Glutamat, ghrelin, glukos. (C)-(d) värmekartor över ö-cellsrespons som visar adrenalinpositiva (c) och ghrelin-positiva (d) subpopulationer. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: korrigering Vidbaslinjen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: analys av tids fördröjnings data. Analys av ca2 + dynamik i α-celler. Partiell frekvens (a), platå fraktion (B) och areal under kurvan (C) i en α-cell [ca2 +]jag spårar. Populational [ca2 +]i data från en mus pankreasö uttryckt som rå (f/f0) (D), partiell frekvens (E), platå fraktion (f) och område under kurvan (G). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det finns tre stadier i protokollet som är avgörande för den totala framgången. En lyckad injektion av enzymet Liberase i gallgången bestämmer inte bara den kvantitativa framgången för isolerings förfarandet utan också påverkar kvaliteten på de isolerade holarna. Ouppblåst pancreata kan resultera i brist på några viktiga metaboliska svar i de isolerade öarna. För det andra, lastning av färgämnet/uttrycket av sensorn definierar signal-brus-förhållandet i tidsfördröjning inspelningen. Signalerna är frånvarande eller försvagade i överbelastade öar. Slutligen är en lyckad och tät positionering av vävnaden inne i bild kammaren ett avgörande ögonblick för meningsfulla och analyserbara experiment. Dåligt positionerat eller rörliga vävnad resulterar i slöseri med experimentell tid och/eller oklara data.

Metoden kan ändras för att redogöra för flera signaler (med hjälp av konfokalsystemet) och flera grupper av kobbar (t. ex. av olika genotyp). Avbildning av flera signaler förutsätter leverans av en andra sensor i varje cell i Holmen, spektralt förenligt med ca2 + reporter (t. ex. en pH-sensor SNARF5f26,27). För detta ändamål kan holer vara co-Loaded/Co-infekterade med ca2 + och pH-sensorer, som sedan sekventiellt avbildas inom varje tidsram.

Avbildning av signalen i grupper av öar med encellig upplösning kräver att man använder ett brett synfält mål. Målet är sannolikt att ha lägre förstoring och numerisk bländare (NA), vilket minskar den rumsliga upplösningen. På grund av det ökade djupet i fokus för låg-NA-målet kan avbildning utföras på ett Wide-Field-system. Nackdelarna med detta arrangemang är cell-cell korskontaminering av ljussignalen och reducerad förmåga att avbilda 3D-signalen (t. ex. möss som uttrycker ca2 + sensorn under insulin initiativtagarna). Samtidigt kan signalen som uttrycks från ytan ö-celler vara perfekt lösas med hög temporala upplösning från grupper inklusive tiotals till hundratals öar18.

Även om det kan låta obehagligt men utför bildanalys och numerisk dataanalys i separata mjukvarupaket är en bra idé. Vid den aktuella tiden, ImageJ/FIJI dominerar vetenskaplig bildanalys. De mest populära miljöerna för vetenskaplig kodning är python och MATLAB, men det finns också kända ansträngningar för att analysera ca2 + data i R28. Bästa användbarhet tillhandahålls av mer nischade paket som IgorPro. Vårt val är att prototyp i MATLAB/python och sedan genomföra koden i IgorPro för "Pipeline" användning. Anpassa signal analyspaket för elektrofysiologi (t. ex., Clampfit, Neuroexplorer) för analytiska behov kan vara användbart för Single-cell Imaging men är svårt att skala upp. Många alternativ som tillhandahålls av sådana paket är inte tillämpliga för Holmen Imaging på grund av låg samplingsfrekvens.

Det är viktigt att komma ihåg att denna metod begränsas av ett antal faktorer. För det första är avbildning, som nämnts ovan, till stor del baserad på undersampling av data, vilket betyder att den inte indikerar och därför inte kan jämföras direkt med cellens elektriska aktivitet. För det andra kommer uppgifterna från öperiferin och återspeglar inte viktiga kopplings processer som generellt sett är tredimensionella. För det tredje påverkar nivån för lastning/uttryck uppfattningen av sensorintensiteten. Slutligen kan aktivering av mindre välunderbyggda cell subpopulationer (t. ex. PP-celler & ε-celler) av markör föreningarna inte uteslutas, men på grund av det låga antalet av dessa celler inom Holmen kommer eventuell kontaminering att vara minimal.

Metoden är en sann "mästare" när det gäller visuell effekt, eftersom oscillatoriska processer ger ett starkt intryck av en genuint levande vävnad. Appliceras på mindre subpopulationer cell, metoden sonder funktionen av var och en tillförlitligt, vilket möjliggör identifiering av undergrupper och återspeglar heterogenitet.

Kalciumdynamik har studerats i bukspottskörteln ö β-celler för över 40 år, främst driven av framsteg i förvärv/detektionsteknik. Tidiga studier används atomabsorptionsspektroskopi29, men det var inte förrän ankomsten av fluorescerande ca2 + sensorer30 att detaljerad kinetik kan lösas i enskilda ö-celler, med hjälp av fotometri31,32,33. Strax efter det förbättrades den rumsliga delen av ca2 + kinetik som ca2 + Imaging34,35,36 blev en rutin teknik, tack vare den då nyligen tillgängliga Charge-kopplade enheten (CCD) detektorer. Problemet med out-of-Focus ljus, som hämmade Imaging signalen från enskilda celler i vävnaden, löstes sedan i mitten av 1990-talet via laser scanning konfokalmikroskopi (LSCM)37 och total intern reflektion fluorescens mikroskopi (tirfm)38. Båda metoderna, kompletterat med ankomsten av en ny generation av fluorescerande ca2 + sensorer retbara med en 488 nm Laser, har framgångsrikt använts för att bild ca2 + dynamik i ö-cell subpopulationer39,40,41.

Det nya århundradet frambringade två nya trender som härrörde från neurovetenskapsrelaterade tekniska utvecklingar. För det första, rekombinanta fluorescerande sensorer baserade på cirkulär permutation av GFP varianter väsentligt ökat signal-brus-förhållande för ca2 + detektion, effektivt föra studierna till nivån för stora cellpopulationer, där dynamiken i [ca2 +]CYT i varje cell kan lösas. För det andra, användning av vävnads-specifika promotorer tillåten inriktning sensor uttryck för mindre subpopulationer.

Även om det allmänt tros återspegla utvecklingen inom neurovetenskap, har studier på Holmen ca2 + dynamik två viktiga skillnader. För det första, tekniskt, någon in vivo avbildning av Holmen signalering är mer komplicerad än avbildning i hjärnan på grund av den oförutsägbara anatomin i bukspottkörteln och islets plats42. För det andra, utmärkt elektrisk koppling mellan ön β-celler i huvudsak gör öar i elektriskt inert populationer visar en till synes perfekt allt-eller-inget svar på den höga glukos stimulans. Vi tror att studier av [ca2 +]i kinetik i mindre öar subpopulationer, såsom δ-celler, baserat på vävnads-specifik inriktning kommer sannolikt att bredda vår kunskap om deras farmakologi/fysiologi. På samma gång, mycket känsliga sonder gör det möjligt att utvidga den statistiska effekten av sådana mätningar, redovisning till Holmen-till-Holmen variation och möjliggör avbildning av öar från olika grupper inom ett parallellt experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

AH var en mottagare av en diabetes UK PhD Student, EV stöddes av OXION-Wellcome Trust utbildningsprogram, AIT höll en Oxford biomedicinska forskningsrådet postdoktor Fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40x/1.3 objective
Axiovert 200 microscope
emission
Excitation
Fetal bovine serum Sigma-Aldrich F7524-500ML
Fluo4 Thermo Fisher (Life Technologies) F14201
GCaMP6f, in (human type 5) adenoviral vector Vector Biolabs 1910
Hanks' solution Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies)
Liberase Sigma-Aldrich 5401020001
penicillin/streptomycin Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) 15140122
RPMI medium Thermo Fisher (GibCo, Life Technologies) 61870044
Zeiss LSM510-META confocal system Carl Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elayat, A. A., el-Naggar, M. M., Tahir, M. An immunocytochemical and morphometric study of the rat pancreatic islets. Journal of Anatomy. 186, Pt 3 629 (1995).
  2. Cabrera, O., et al. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, (7), 2334-2339 (2006).
  3. Brereton, M. F., Vergari, E., Zhang, Q., Clark, A. Alpha-, delta-and PP-cells: are they the architectural cornerstones of islet structure and co-ordination. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 63, (8), 575-591 (2015).
  4. Færch, K., et al. Insulin resistance is accompanied by increased fasting glucagon and delayed glucagon suppression in individuals with normal and impaired glucose regulation. Diabetes. 65, (11), 3473-3481 (2016).
  5. Dabrowski, M., Tarasov, A., Ashcroft, F. M. Mapping the architecture of the ATP-binding site of the KATP channel subunit Kir6 2. The Journal of Physiology. 557, (2), 347-354 (2004).
  6. Liu, Y. J., Vieira, E., Gylfe, E. A store-operated mechanism determines the activity of the electrically excitable glucagon-secreting pancreatic alpha-cell. Cell Calcium. 35, (4), 357-365 (2004).
  7. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca 2+ probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19, (2), 137 (2001).
  8. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, (6), 3197-3202 (2001).
  9. Broussard, G. J., Liang, R., Tian, L. Monitoring activity in neural circuits with genetically encoded indicators. Frontiers in Molecular Neuroscience. 7, 97 (2014).
  10. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32, (40), 13819-13840 (2012).
  11. Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42, (2), 111-129 (2017).
  12. Tarasov, A. I., Rutter, G. A. Methods in enzymology. 542, Elsevier. 289-311 (2014).
  13. Tarasov, A. I., et al. Frequency-dependent mitochondrial Ca(2+) accumulation regulates ATP synthesis in pancreatic β cells. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 465, (4), 543-554 (2013).
  14. Smith, N. A., et al. Fluorescent Ca2+ indicators directly inhibit the Na, K-ATPase and disrupt cellular functions. Science Signal. 11, (515), 2039 (2018).
  15. Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333, (6051), 1888-1891 (2011).
  16. Dana, H., et al. Sensitive red protein calcium indicators for imaging neural activity. Elife. 5, 12727 (2016).
  17. Theis, L., et al. Benchmarking Spike Rate Inference in Population Calcium Imaging. Neuron. 90, (3), 471-482 (2016).
  18. Hamilton, A., et al. Adrenaline Stimulates Glucagon Secretion by Tpc2-Dependent Ca(2+) Mobilization From Acidic Stores in Pancreatic alpha-Cells. Diabetes. 67, (6), 1128-1139 (2018).
  19. Adriaenssens, A. E., et al. Transcriptomic profiling of pancreatic alpha, beta and delta cell populations identifies delta cells as a principal target for ghrelin in mouse islets. Diabetologia. 59, (10), 2156-2165 (2016).
  20. DiGruccio, M. R., et al. Comprehensive alpha, beta and delta cell transcriptomes reveal that ghrelin selectively activates delta cells and promotes somatostatin release from pancreatic islets. Molecular Metabolism. 5, (7), 449-458 (2016).
  21. Mourao, M., Satin, L., Schnell, S. Optimal experimental design to estimate statistically significant periods of oscillations in time course data. PloS One. 9, (4), 93826 (2014).
  22. Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. Journal of Visualized Experiments. (50), (2011).
  23. Cabrera, O., et al. Glutamate is a positive autocrine signal for glucagon release. Cell Metabolism. 7, (6), 545-554 (2008).
  24. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7, (1), 27-41 (1998).
  25. Tarasov, A. I., et al. Monitoring real-time hormone release kinetics via high-content 3-D imaging of compensatory endocytosis. Lab on a Chip. 18, (18), 2838-2848 (2018).
  26. Knudsen, J. G., et al. Dysregulation of Glucagon Secretion by Hyperglycemia-Induced Sodium-Dependent Reduction of ATP Production. Cell Metabolism. (2018).
  27. Adam, J., et al. Fumarate hydratase deletion in pancreatic β cells leads to progressive diabetes. Cell Reports. 20, (13), 3135-3148 (2017).
  28. Wills, Q. F., et al. Statistical approaches and software for clustering islet cell functional heterogeneity. Islets. 8, (2), 48-56 (2016).
  29. Berggren, P. O., Ostenson, C. G., Petersson, B., Hellman, B. Evidence for divergent glucose effects on calcium metabolism in pancreatic beta- and alpha 2-cells. Endocrinology. 105, (6), 1463-1468 (1979).
  30. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of Biological Chemistry. 260, (6), 3440-3450 (1985).
  31. Longo, E. A., et al. Oscillations in cytosolic free Ca2+, oxygen consumption, and insulin secretion in glucose-stimulated rat pancreatic islets. The Journal of Biological Chemistry. 266, (14), 9314-9319 (1991).
  32. Johansson, H., Gylfe, E., Hellman, B. Cyclic AMP raises cytoplasmic calcium in pancreatic alpha 2-cells by mobilizing calcium incorporated in response to glucose. Cell Calcium. 10, (4), 205-211 (1989).
  33. Grapengiesser, E., Gylfe, E., Hellman, B. Three types of cytoplasmic Ca2+ oscillations in stimulated pancreatic β-cells. Archives of Biochemistry and Biophysics. 268, (1), 404-407 (1989).
  34. Okamoto, Y., et al. Role of cytosolic Ca2+ in impaired sensitivity to glucose of rat pancreatic islets exposed to high glucose in vitro. Diabetes. 41, (12), 1555-1561 (1992).
  35. Gilon, P., Henquin, J. C. Influence of membrane potential changes on cytoplasmic Ca2+ concentration in an electrically excitable cell, the insulin-secreting pancreatic B-cell. The Journal of Biological Chemistry. 267, (29), 20713-20720 (1992).
  36. Valdeolmillos, M., Nadal, A., Soria, B., Garcia-Sancho, J. Fluorescence digital image analysis of glucose-induced [Ca2+]i oscillations in mouse pancreatic islets of Langerhans. Diabetes. 42, (8), 1210-1214 (1993).
  37. Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. Calcium sparks: elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle. Science. 262, (5134), 740-744 (1993).
  38. Stout, A. L., Axelrod, D. Evanescent field excitation of fluorescence by epi-illumination microscopy. Applied Optics. 28, (24), 5237-5242 (1989).
  39. Stozer, A., Dolensek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PloS One. 8, (1), 54638 (2013).
  40. Tian, G., Sandler, S., Gylfe, E., Tengholm, A. Glucose- and hormone-induced cAMP oscillations in alpha- and beta-cells within intact pancreatic islets. Diabetes. 60, (5), 1535-1543 (2011).
  41. Benninger, R. K., Zhang, M., Head, W. S., Satin, L. S., Piston, D. W. Gap junction coupling and calcium waves in the pancreatic islet. Biophysical Journal. 95, (11), 5048-5061 (2008).
  42. van Gurp, L., et al. Sequential intravital imaging reveals in vivo dynamics of pancreatic tissue transplanted under the kidney capsule in mice. Diabetologia. 59, (11), 2387-2392 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics