ヒトの胎児微生物叢に対する介入レジメンの影響を推定するインビトロバッチ培養モデル

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Immunology and Infection

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Summary

このプロトコルは、ヒトのフェカル微生物叢のインビトロバッチ培養発酵システムを説明し、イヌリン(よく知られているプレバイオティクスと最も広く研究された微生物モジュレーターの1つ)を使用して、特定の効果を推定する上でこのシステムの使用を実証する。fecal微生物叢組成および代謝活動に対する介入。

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Ahmadi, S., Wang, S., Nagpal, R., Mainali, R., Soleimanian-Zad, S., Kitzman, D., Yadav, H. An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota. J. Vis. Exp. (149), e59524, doi:10.3791/59524 (2019).

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Abstract

いくつかのヒト疾患における腸内微生物叢の新たな役割は、新しいツール、技術、技術のブレークスルーを必要とします。このような改善は、人間の健康上の利点のためのマイクロバイオームモジュレータの利用を解読するために必要とされます。しかし、マイクロバイオーム変調を検証し、関連する健康上の利点を予測するための変調器の大規模なスクリーニングと最適化は、多数の動物および/またはヒト被験者が必要とするため、実質的に困難な場合があります。この目的のために、インビトロまたはex vivoモデルは、マイクロバイオームモジュレーターの予備スクリーニングを容易にすることができる。本明細物では、プロバイオティクス、プレバイオティクスおよび他の食品成分を含む腸内微生物叢の様々な介入の効果を調べることができるex vivo fecalマイクロビオタ培養システムを最適化し、実証する。栄養補助食品および薬物、ヒト腸内微生物叢の多様性および組成物に関する。最も広く研究されているプレバイオティクス化合物およびマイクロバイオームモジュレーターの1つであるイヌリンは、健康なフェカル微生物叢組成物およびその代謝活性(フェカルpHおよび有機酸のフェカルレベルなど)への影響を調べるために、ここで例として使用される。乳酸および短鎖脂肪酸(SCFA)を含む。このプロトコルは、フェカル微生物叢プロファイルに対するモジュレーターの異なる介入の影響を推定し、その健康への影響を予測することを目的とした研究に役立つ可能性がある。

Introduction

ヒト微生物叢は、細菌、古細菌、ウイルスおよび真核生物微生物1からなる複雑なコミュニティであり、人体の内部および外部に生息する。最近の証拠は、肥満、糖尿病を含む様々なヒト疾患における腸内微生物叢および腸内微生物叢(ヒト消化管に見られる微生物とその遺伝子の全コレクション)の基本的な役割を確立している。心血管疾患、および癌1、2、3.さらに、腸内に生息する微生物は、私たちの健康に大きな影響を与える代謝産物の広いスペクトルを生成し、また、いくつかの疾患の病態生理学だけでなく、様々な代謝機能4に貢献することができます4、5.この腸内微生物集団の組成および機能における異常な変化(摂動)は、一般に「腸ジスビオシス」と呼ばれる。ジスビオシスは、通常、宿主の不健康な状態に関連付けられているので、宿主の健全な制御状態に関連する正常な(恒常性)微生物群相と区別することができる。腸内微生物叢ジスビオシスの特定のパターンは、多くの場合、様々な異なる疾患1、2、3、6、7に見出される。

腸内微生物叢による未消化食品、特に発酵性炭水化物/繊維の発酵は、エネルギーを生み出すだけでなく、短鎖脂肪酸(SCFA)、乳酸塩、受刑者、二酸化炭素を含む発散代謝産物を産生し、メタン、水素、エタノール6.さらに、腸内微生物叢はまた、葉酸、ビオチン、トリメチルアミン-N-酸化物、セロトニン、トリプトファン、γ-アミノブチル酸、ドーパミン、ノルエピネフリン、アセチルコリン、ヒスタミン、などの他の生理活性物質の数を生成します。デオキシコール酸、および4-エチルフェニル硫酸塩。これは主に、いくつかの身体プロセス、代謝機能およびエピジェネティック変化1、8、9に寄与する宿主微生物ニッチ内の固有の代謝フラックスの利用によって起こる。 10.しかし、このような微生物製品に対する様々な介入の影響は、簡単で効率的かつ再現可能なプロトコルの欠如のために、未だ不明のままである。ヒト腸内微生物叢組成物は非常に複雑で多様な生態系であり、したがって、人間の健康と疾患病理学におけるその役割に関する多くの疑問は未だに未解決のままである。腸内微生物叢の組成および代謝機能に対する多くの一般的な腸内微生物叢(例えば、プロバイオティクス、プレバイオティクス、抗生物質、女性移植および感染症)の影響は、大部分が解明されていない。さらに、生体内でのこれらの効果の検査と検証は、特に腸内微生物叢によって産生される栄養素や代謝産物のほとんどが腸内で同時かつ迅速に吸収または処分されるため、困難である。したがって、生体内でこれらの代謝産物(例えば、SCFA)の産生、量および処理を測定することは、依然として実用的な課題である。実際、動物やヒト被験者などの生理学的モデルは、腸内微生物叢の役割と宿主の健康に対する変調を決定するために重要であるが、これらは、異なるタイプのマイクロバイオーム調節剤の大規模なスクリーニングには適していないかもしれない。倫理的、金銭的、または時間的制約。この目的のために、インビトロおよび/またはex vivoモデルでは、インビトロで腸内微生物叢を培養し、異なる微生物叢に介入することで、時間とお金を節約する機会を提供することができ、したがって、予備的または大規模なスクリーニングを可能にすることができます。様々な成分(プロバイオティクス、プレバイオティクス、および他の介入化合物など)は、女性の微生物叢の多様性、組成および代謝プロファイルに及ぼす影響を調べたり予測する。腸内微生物叢のこのようなインビトロおよびex vivo系を用いる研究は、宿主の健康と疾患に寄与する宿主-マイクロバイオーム相互作用のさらなる理解を促進し、また、マイクロバイオームを標的とする新しい治療法を見つけることにもつながる可能性がある。宿主の健康を改善し、様々な疾患を予防し、治療する1.

インビトロ腸内微生物叢培養システムは実際の腸の状態を本当に複製することはできませんが、いくつかの研究室はそのようなモデルの開発に努めており、そのうちのいくつかはある程度実用的に発見され、成功裏に使用されています。異なる目的。最近の腸のモデルの1つは、胃、小腸、結腸の異なる領域を含む人間の消化管全体を模倣するヒト腸微生物生態系のシミュレータである。しかし、このような技術的に複雑なモデルは、世界中の他の研究施設からアクセスできない場合があります。したがって、マイクロバイオームモジュレーターを研究する研究室にとって、比較的シンプルで手頃な価格で実用的な新しい代替モデルの開発と、腸内微生物叢および宿主の健康への影響に対する重要なニーズが依然として存在する。したがって、インビトロ(またはex vivo)フェカル微生物叢培養システムの使用は、そのような介入の効果を研究するのに有用であろう11,12.具体的には、腸内微生物叢の多様性と組成物の周期的変化の観点から、異なるプレバイオティクスが微生物叢発酵能力に及ぼす影響、およびFECAL pH、およびSCFAおよび乳酸塩を含む微生物代謝産物のレベルを研究することができる。13.本明細書において、微生物叢調節剤の一例としてイヌリン(最も広く研究されたプレバイオティック成分の1つ)を用いて、この単純な生体生微生物叢バッチ培養系のステップバイステッププロトコルは、その使用を実証するために記載されている。微生物叢への介入後の女性微生物叢および微生物代謝産物の変化。

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Protocol

注意:適切な材料安全データシートを参照し、適切なバイオセーフティレベル2(BSL-2)トレーニングの指示とガイドラインに従ってください。標準的なバイオセーフティルールに従ってすべての培養手順に従い、無菌条件を使用してBSL-2キャビネットを使用します。さらに、異なるモデルおよびヒト被験者からのfecalサンプルは、微生物媒介性疾患を広める潜在的なリスクを持つ可能性があります。傷害や感染症の発生時に直ちに医療援助を求めてください。さらに、ヒトおよび動物用便サンプルの使用は、制度的倫理委員会を通じて承認され、サンプルおよび被験者情報を使用するためのプロトコルに準拠する必要があります。

1. 文化メディアの準備

  1. 培養メディアの準備、9種類のストックソリューションを用意
    1. 溶液A(1,000mL):塩化ナトリウム(NaCl)の5.4g、リン酸カリウム二水素(KH2 PO4)の2.7g、塩化カルシウム二水和物の0.16g(CaCl2~2H2O)、0.12gの塩化マグネシウムヘキサハイドレート(MgCl)・6H2 O)、塩化マンガンの0.06g(MnCl2~4H2O)、塩化コバルタス塩化物ヘキサヒドレート(CoCl2~6H2O)、硫酸アンモニウム5.4g(NH4)2 SO4、脱イオン水中で、総体積を1,000mLにします。
    2. 溶液B(1,000mL):脱イオン水中にリン酸カリウム(K2HPO4)を2.7g溶解し、総体積を1000mLにします。
    3. 微量ミネラル溶液(1,000mL):エチレンジアミジン-テトラ酢酸二水和物(Na2 EDTA)の500mgを溶解し、200mgの硫酸ヘプタヒドレート(FeSO4~7H2O)、10mgの硫酸ヘプタヒドレート(ZnSO4)を溶解・7H2 O、3mgのマンガン(II)塩化物四質水和物(MnCl2×4H2O)、リン酸30mg(H3 PO4)、CoCl2の20mg×2×1、クムリン塩化物二水和物1mg(CuCl2)・2H2O)、2mgのニッケル(II)塩化物ヘキサヒドレート(NiCl2・6H2O)及び脱硫水和物中のモリブ化ナトリウム二水和物(Na2 MoO4~2H2O)の3mgを脱イオン水中で、総体積を1,000mLにする。
      注:この解決は光に敏感であるため、暗い/黒またはアルミニウム包装されたチューブ/ボトルに保管されることを確認します。
    4. 水溶性ビタミン溶液(1,000mL):塩酸チアミン100mgを溶解し、Dパントジン酸100mg、ナイアシン100mg、ピリドキシン100mg、P-アミノベンゾ酸5mg、ビタミン0.25mgを総量に還元1,000 mL
    5. 葉酸:ビオチン溶液(1,000mL):葉酸10mg、D-ビオチン2mg、重炭酸アンモニウム100mg(NH4 HCO3)を脱イオン水中に溶解し、総容積を1,000mLにします。
    6. リボフラビン溶液(1,000 mL):5 mM HEPES(1.19 g/L)溶液中にリボフラビン10mgを溶解し、総容積を1,000mLにします。
    7. ヘミン溶液(10mL):10mM水酸化ナトリウム(NaOH)(0.4g/L)溶液で5,000mgのヘミンを溶解し、総体積を10mLにします。
    8. 短鎖脂肪酸ミックス(10 mL):Nバレートの2.5 mL、イソバレートの2.5 mL、等溶性2.5mLを組み合わせます:DL-α-メチルブチル酸塩。
      注:このソリューションは、臭いや煙を避けるためにヒュームフードで使用することをお勧めします。
    9. レサズリン(1,000mL):脱イオン水中に1gのレサズリンを溶解し、総体積を1,000mLにします。
  2. インビトロ嫌気性発酵に使用される培地
    1. この培地を調剤するには、溶液Aの330 mL、溶液Bの330 mL、トレースミネラル溶液の10 mL、水溶性ビタミン溶液の20 mL、葉酸の5 mL:ビオチン溶液、リボフラビン溶液の5 mLを混合します。ヘミン溶液2.5mL、短鎖脂肪酸ミックス0.4mL、レサズリン1mL、酵母エキス0.5g、炭酸ナトリウム4g(Na2 CO3)、システインHCl-H2O0.5g、トリプチケース0.5g、ジリチケース0.5gを添加し、296.1mLの水を添加する。
    2. pH を確認し、7.0 前後であることを確認します(そうでない場合は、1 N HCl または 1 N NaOH で pH を調整します)。無菌ワークステーションの下のボトルフィルターを使用してメディアを真空フィルタリングすることによって殺菌します。
    3. または、すべての成分(ビタミンおよびヘミン溶液を除く)とオートクレーブを121°Cで20分間混ぜ、室温まで冷まします。同時に、0.22 μmの膜フィルターを使用してビタミンおよびヘミン溶液を殺菌し、分配する前にオートクレーブおよび冷却された媒体にこれらを加える。

2. 嫌気室および必要物質の調製

  1. 実験開始前に嫌気性室内の発酵実験に必要なすべての材料、溶液、およびツールを保管し、バッファー/溶液中のツールおよび可溶性酸素に関連する残留酸素が確実に取り外し、すべての材料は設定された嫌気性条件に順応される。
    注:嫌気性室内に必要な材料(実験開始の48時間前):(i)発酵培具;(ii)嫌気性溶液(セクション4.1に従って調製)、(iii)ボルテキサー、 (iv)計量バランス、(v)ムスリンチーズクロス、(vi)はさみ、(vii)漏斗、(viii)1.5、2.0、15、50mLチューブ、(ix)ピペッタ(2、20、200、1,000 μL)および互換性のあるピペットチップ、(x)ガンピペットおよびピペット(5および10mL)、(xi)紙組織、(xii)マーカー、(xiii)チューブは、異なるチューブ、(xiv)廃棄物箱、(xv)O2インジケータおよび(xvi)70%エタノールスプレーボトル(消毒剤)を表す。

3. チューブ・繊維の調製

  1. 重量300mgのイヌリンを50mLチューブに移し、続いて26mLの発酵培った発酵培った発酵培った添加を既に調製し、嫌気性チャンバーに保存する。各fecalサンプルタイプと実験チューブ(試験対象の化合物の数に応じて)に対して1本のブランクチューブを三分の1ずつ準備します。
  2. 発酵実験を開始する前にサンプルの水和を可能にするために、嫌気性室内にこれらのチューブを約24時間放置してください。接種時にチューブ温度が37°Cであることを確認し、したがって、嫌気性チャンバ内に囲まれたインキュベーター内のチューブを持参してください。

4. イヌマチンの調製

  1. 嫌気性希釈液(発酵実験前に少なくとも48時間):NaClの5g、ブドウ糖2g、システイン-HCl0.3gを脱イオン水中に溶解し、総体積を1,000mLにする。オートクレーブと使用前に少なくとも48時間嫌気性室内に保管してください。
  2. Fecalイヌキュラム製剤(発酵実験の日):50mL円錐管中の新鮮なfecalサンプルの5gの重量を量り、50 mL(1:10 w/v)の最終体積に嫌気性希釈液を加え、15分間または完全に均質化するまで渦を加える。無菌チーズクロス(オートクレーブ)の4層を通して均質化された混合物をフィルタリングし、メディアを含むチューブ内の接種のためにすぐにそれを使用します。
    注:被験者群の胎児サンプルは、実験目的が全体的な健康と病気の女性の微生物叢に対する特定の化合物/成分の効果を比較することであれば、プールすることができる。

5. 発酵とサンプリング

  1. セクション4.2に従ってチューブを準備し、希釈および濾過された気体の接種の4 mLでブランク/コントロールおよび実験管を接種する。嫌気性室内の37°Cで接種チューブをインキュベートします。チューブを1時間に1回振り、繊維と接種を再び中断するために穏やかに反転します。
  2. 2 mLアリコートサンプルをそれぞれの発酵管から2mLチューブに取り出して、発酵中に0、3、6、9、24時間ごとに、必要に応じて頻繁にサンプルを収集します。
  3. 実験室のpHメートルを使用してアリコートのpHを測定する(サンプルに直接pH電極を挿入することによって)。残りのサンプルを14,000 x gで10分間4°Cで遠心分離します。直ちに液体窒素中の上清とペレットを凍結し、スナップ凍結後、SCFA分析用の上清とペレットを-80°Cで保存します。

6. 短鎖脂肪酸(SCFA)と乳酸定量

注:マイクロバイオーム培養の上清中のSCFAおよび乳酸塩は、他の場所で13、14、15、16に詳細に説明された方法に従って正確に測定することができる。

  1. 簡単に言えば、氷上の制御および処理サンプルからセクション5で得られたスナップ凍結上清を解凍し、氷上のすべてのさらなる処理ステップを実行する。0.45 μmの膜フィルターを通して上清をろ過し、無細胞サンプルを使用して、HPX-87Hカラムを搭載した210 nmのDAD検出器を使用してHPLCシステムを使用してSCFAと乳酸塩の濃度を測定します。各サンプルに10 μLの注入量を使用し、H2 SO4(0.005 N)を使用して、35°Cで0.6 mL/minの流量でカラムを溶出します。

7. フェカルマイクロバイオーム分析

注:他の場所で詳細な方法とパイプラインに従ってマイクロバイオーム分析実行 7,13,14,17.

  1. 簡単に言えば、fecal DNA抽出キット13を用いて約200mgのfecalスラリーペレットからゲノムDNAを抽出する。
  2. 細菌16S rRNA遺伝子の超可変領域を増幅するバーコードプライマーを他の場所記載の方法に従って13に従って使用し、地球マイクロバイオームプロジェクトプロトコル18に記載されているプライマー配列を用いる。
  3. 得られたアンプリコンを磁気精製ビーズで浄化し、ピコグリーンまたは同等の方法で定量します。シーケンサー13上で同じモル濃度と配列で精製されたPCR産物をプールします。
  4. 非多重化、品質フィルタリングとクラスタリング、分類割り当てと希少性、および下流分析の結果のシーケンスを、微生物生態学(QIIME)ソフトウェアに関する定量的洞察を使用して処理します。カポラソら19.

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Representative Results

このプロトコルは、特定のプレバイオティクス(すなわち、微生物叢組成および代謝活性に対するイヌリンの効果を、胎児pHの変化および健康なヒト被験者の胎児における乳酸およびSCFAの濃度の観点から実証するために用いられる。イヌリンによる治療後の異なるタイムポイント)。fecal pHとは、乳酸およびSCFAのフェスカルレベル(図1)、および微生物叢組成物(図2および図3)を0(ベースライン)で測定し、イヌリンの有無にかかわらず9及び24時間のインキュベーションを行う。結果は、イヌリン処理の有無にかかわらず、インビトロ発酵中にfecal微生物叢組成およびその代謝活性がどのように調節されるかを示す。

Figure 1
図1:fecal pH(a)、乳酸(b)および短鎖脂肪酸の変化は、酢酸(c)、プロピオン酸(d)およびブチル酸塩(e)を0(ベースライン)で、9および24hの嫌気性発酵のイヌリンの有無にかかわらず。ここで示す値は、三量体サンプルの平均±SEMである。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ベースライン対.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:ヒトの便中における微生物叢の多様性および組成の変化は0(ベースライン)、9および24hの嫌気性発酵のイヌリンの有無にかかわらず。(a) 重み付けおよび (b) 原理座標解析 (PCoA) を用いて可視化されたβ-ダイバーシティの重み付けUnifracメジャー。(c-f)アルファ多様性viz.系統的多様性の指標(PD全樹(c);種の豊かさ(Chao1;d);観測された操作分類ユニットの数 (OTUs, e);と種の均一性(シャノン指数、f)。主要なフィラ(g)および属(h)の相対的な存在量。ここで示す値は、三量体サンプルの平均±SEMである。*P < 0.05, **P < 0.01, ベースライン対.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:線形判別分析(LDA)効果サイズ(LEfSe)の腸内微生物叢の分析は、(INU)または(CTL)イヌリンを使用した9時間および24時間インキュベーション後の変化である。16S配列のLEfSe分析に由来する分類クラドグラム(相対存在量≥ 0.5%)サンプルの異なるグループ間の差別的に豊富なタキサを表します。各ドットの明るさは、その効果サイズ(すなわち、分類の豊富さ)に比例します。ここに示すのは、LDA しきい値 >2.4 を渡す taxa のみです。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

ここで提示されるインビトロフェカルスラリー発酵モデルは、ヒトの大腿骨微生物叢の組成に対する異なる基質および微生物株(例えば、プレバイオティクスおよびプロバイオティクス)の影響を近似する単純な単一バッチモデルである。fecal pH および SCFA レベルの面で代謝活動.本明細に提示された結果は、イヌリンの接種がfecal pHを減少させ、非処理されたフェカル微生物叢培養と比較してイヌリン処理されたfecal検体におけるSCFAおよび乳酸のレベルを有意に増加させることを示している(図1)。さらに、腸内微生物叢シグネチャは、イヌリン処理サンプルと未処理サンプルの間でも異なっているように見える(図2および図3)。これらのデータは、このシステムが胎児のマイクロバイオームの多様性と組成だけでなく、その代謝活動に対するイヌリンの影響を反映する方法を例示する。また、特定の実験目的や仮説に応じて、このシステムを用いて様々な他の因子を測定することもできる。さらに、16S rRNA遺伝子シーケンシングに加えて、特定の単一または複数の属を標的とする微生物メタゲノムシーケンシング(全ゲノムシーケンサーを用いた)またはqPCRおよび培養方法などの他の分析(例えば、ビフィズス菌、乳酸菌、アケルマンシア、腸内細菌科、クロストリジウム症など)を実行することもできます。さらに、LC-MS、GC-MS、GC-FID、およびHPLCのようなSCFAの分析のための異なったクロマトグラフィー手順はまた実験的な条件および利用可能性に基づいて利用することができる。それにもかかわらず、これらの手順のためのサンプル調製物は、操作20に必要な器具および条件に応じて変化しうる。

新鮮なfecal標本の使用は、最良の再現可能な結果をもたらすが、;しかしながら、スナップ冷凍大腿骨試料(本明細書に提示される実験で使用される)はまた、ほとんどの細菌が体温に蘇生した後にそこから復活することができ、凍結21の後にこれ以上の分解が起こらないように有効に使用することができる。冷凍サンプルを使用すると、実験の予定日に特定のドナーから新鮮なfecalサンプルを得ることができない場合、または実験を複製する必要がある場合に同じドナーから新鮮なfecalサンプルを得ることができない場合に特に有利です。ただし、大腿骨サンプルは液体窒素を使用してスナップ冷凍し、さらに使用するまで-80°Cで直ちに保存する必要があります。さらに、凍結した大腿骨サンプルが空気(酸素)にさらされるのを避けるために、サンプルはできるだけ早く嫌気性室に移され、冷凍庫から取り出した直後に使用する必要があります(繰り返し解凍は避けるべきです)。サンプル解凍、接種準備および処理を含むすべての後続の実験は嫌気性室内で行われるべきである。

大腸における栄養発酵時の腸内有機環境およびpHは、特にpHの異常な減少が基質利用による酸性度の増加を示しているという観点から非常に重要である。したがって、より迅速なpH低減は、より迅速な基板利用22に対応することができる。このモデルではpHは制御されていませんが、直接比較を行うには、同一の非処理コントロールを含めることを強くお勧めします。腸内微生物叢による難消化性多糖類の発酵の結果として結腸内で産生されるSCFAは、宿主の健康維持に関連する多様なメカニズムにさらに影響を及ぼす可能性がある。これらの代謝産物は、グルコネオ新生および脂質生合成に寄与し、コロノサイトのエネルギー源として機能し、免疫調節、制御/改善された腸バリア機能、および神経変調23を含む健康上の利点を有することができる。 24,25,26.さらに、SCFAは、ホルモン、エンドカンナビノイド系、細胞増殖および死、骨の健康、ミネラル吸収、腸の運動性、腸pH、および腸内微生物叢に対する反転効果を含むいくつかの生物学的経路に影響を与えることも知られている。微生物代謝機能。したがって、腸/大腿骨SCFAのプロファイルおよび濃度に関する知識は、特定の微生物叢調節剤6の有効性を評価しながら重要な構成要素となりうる。もちろん、SCFAの他に、腸内微生物叢はまた、他の多くの重要な代謝産物(例えば、アンモニウム、ビタミン、ヒスタミン)を産生する。したがって、このようなインビトロ発酵実験中に収集された上清試料は、特定のマイクロバイオームモジュレーターの影響を受けることができる新しい腸内微生物叢由来代謝産物を発見するために、グローバルメタボロミクス分析のために評価することもできる。

ここで説明するシステムには、容易さ、簡易性、費用対効果、実験セットアップの一般的な採用性など、多くの利点があります。ただし、制限もほとんどありません。例えば、システムは、大腸の微生物叢にさらされる前に、上部消化器系(例えば、唾液、胃、小腸)におけるプレバイオティクス(または使用される他の介入)の相互作用に関係しない。しかし、このようなステップは、特定の実験要件に従って採用および組み込むことができます。また、酸性および/または酵素加水分解プロセスは、そのような食品の難消化性部分のみが低いによって発酵される大腸に達するため、食品全体または消化性食品を含む特定の基質を使用する場合、発酵前に行う必要があるかもしれません。腸内微生物叢。さらに、腸内微生物叢の組成は、発酵中に特定の培養条件に起因してシフトしてもよい。例えば、インキュベーションの9時間まで、微生物叢の変化は24時間で通常よりもはるかに近いことが観察された。しかし、インキュベーションの24時間後、pHおよびSCFAレベルは大幅に増加したが、腸内微生物叢組成物は、微生物多様性が減少する一方でプロテオバクテリア数が増加することを示した。しかし、下げられたfecal pHを伴う微生物代謝産物の蓄積が、特定の微生物叢シグネチャとどのように正確かつ密接に関連しているかは不明である。

要約すると、ex vivo微生物叢生態系をシミュレートする簡単なプロトコルが本明細書に記載されている。このシステムは、微生物叢の多様性、組成、代謝機能の変調に対する異なる介入をテストすることを可能にし、宿主の腸および全体的な健康の多様な特徴に影響を与えることができる。

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Disclosures

著者は何も開示していない。

Acknowledgments

著者らは、糖尿病、肥満と代謝のためのセンターと臨床翻訳科学センター、ウェイクフォレスト医学部、国防総省の資金援助(助成番号:W81XWH-18-1-0118)からの資金援助を感謝します。カーミットグレンフィリップスII心臓血管医学の椅子;国立衛生研究所は、クロードD.ペッパー古いアメリカ人センター(P30AG12232によって資金提供)に資金を提供しました。R01AG18915;R01DK114224および臨床翻訳科学センター(臨床研究ユニット、UL1TR001420によって資金提供)はまた、ありがたいことに認められている。また、この実験中に、ボランティアの方々と他のラボメンバーの技術支援に感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium Bicarbonate (NH4HCO3) Sigma-Aldrich 217255
Ammonium Sulfate (NH4)2SO4 TGI C2388 Toxic
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2•2H2O) Sigma-Aldrich C3306 Irritating
Cobaltous Chloride Hexahydrate (CoCl2•6H2O) Sigma-Aldrich 255599
Cupric Chloride Dihydrate (CuCl2•2H2O) Acros organics 2063450000 Toxic, Irritating
Cysteine-HCl Sigma-Aldrich C121800
D-biotin Sigma-Aldrich B4501
D-Pantothenic acid Alfa Aesar A16609
Disodium Ethylenediaminetetraacetate Dihydrate (Na2EDTA) Biorad 1610729
DL-α-methylbutyrate Sigma-Aldrich W271918
Ferrous Sulfate Heptahydrate (FeSO4•7H2O) Sigma-Aldrich F8263 Toxic
Folic acid Alfa Aesar J62937
Glucose Sigma-Aldrich G8270
Hemin Sigma-Aldrich H9039
Hepes Alfa Aesar A14777
Isobutyrate Alfa Aesar L04038
Isovalerate Alfa Aesar A18642
Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2•6H2O) Sigma-Aldrich M8266
Manganese Chloride Tetrahydrate (MnCl2•4H2O) Sigma-Aldrich 221279
Niacin (Nicotinic acid) Sigma-Aldrich N4126
Nickel(Ii) Chloride Hexahydrate (NiCl2•6H2O) Alfa Aesar A14366 Toxic
N-valerate Sigma-Aldrich 240370
P-aminobenzoic acid MP China 102569 Toxic, Irritating
Phosphoric Acid (H3PO4) Sigma-Aldrich P5811
Potassium Dihydrogen Phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P5504
Potassium Hydrogen Phosphate (K2HPO4) Sigma-Aldrich 1551128
Pyridoxine Alfa Aesar A12041
Resazurin Sigma-Aldrich R7017
Riboflavin Alfa Aesar A11764
Sodium carbonate (Na2CO3) Sigma-Aldrich 1613757
Sodium chloride (NaCl) Fisher BioReagents 7647-14-5
Sodium hydroxide (NaOH) Fisher Chemicals S320
Sodium Molybdate Dihydrate (Na2MoO4•2H2O) Acros organics 206375000
Thiamine Hydrochloride (Thiamin-HCl) Acros organics 148991000
Trypticase BD Biosciences 211921
Vitamin B12 Sigma-Aldrich V2876
Yeast extract Sigma-Aldrich 70161
Zinc Sulfate Heptahydrate (ZnSO4•7H2O) Sigma-Aldrich Z0251
0.22 µm membrane filter
AMPure magnetic purification beads Agencourt
Anaerobic chamber with incubatore Forma anaerobic system, Thermo Scientific, USA
Bottle filter Corning
Cheesecloth
Illumina MiSeq sequencer Miseq reagent kit v3
pH meter
Qiagen PowerFecal kit Qiagen
Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) software
Qubit-3 fluorimeter InVitrogen
Vortex Thermoscientific
Waters-2695 Alliance HPLC system Waters Corporation

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References

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