Eine Freeze-Tauungsmethode zur Vorbereitung von Chitosan-Poly(Vinylalkohol) Hydrogelen ohne Vernetzungsmittel und Diflunisal Release Studies

Bioengineering

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Summary

Die Gefrier-Auftaumethode wird verwendet, um Chitosan-Poly(Vinylalkohol) Hydrogele ohne Vernetzungsmittel herzustellen. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Gefrierbedingungen (Temperatur, Anzahl der Zyklen) und das Polymerverhältnis zu berücksichtigen, die die Eigenschaften und Anwendungen der erhaltenen Hydrogele beeinflussen können.

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Figueroa-Pizano, M. D., Vélaz, I., Martínez-Barbosa, M. E. A Freeze-Thawing Method to Prepare Chitosan-Poly(vinyl alcohol) Hydrogels Without Crosslinking Agents and Diflunisal Release Studies. J. Vis. Exp. (155), e59636, doi:10.3791/59636 (2020).

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Abstract

Chitosan-Poly(Vinylalkohol)-Hydrogele können nach dem Gefrier-Auftauverfahren ohne Verwendung toxischer Vernetzungsmittel hergestellt werden. Die Anwendung dieser Systeme ist begrenzt durch ihre Eigenschaften (z. B. Porosität, Flexibilität, Quellkapazität, Lade- und Freisetzungskapazität von Arzneimitteln), die von den Gefrierbedingungen sowie der Art und dem Verhältnis von Polymeren abhängen. Dieses Protokoll beschreibt, wie Hydrogele aus Chitosan und Poly (Vinylalkohol) bei 50/50 w/w % polymerer Zusammensetzung zubereitet werden und die Gefriertemperatur (-4 °C, -20 °C, -80 °C) und Gefrierzyklen (4, 5, 6 Gefrierzyklen) variieren. ES wurden FT-IR-Spektren, SEM-Mikrographen und Porosimetriedaten von Hydrogelen gewonnen. Auch die Quellkapazität und die Belastung von Medikamenten und die Freisetzung von Diflunisal wurden bewertet. Die Ergebnisse von SEM-Mikrographen und Porosimetrie zeigen, dass die Porengröße abnimmt, während die Porosität bei niedrigeren Temperaturen zunimmt. Der Quellprozentsatz war bei der geringen Gefriertemperatur höher. Die Freisetzung von Diflunisal aus den Hydrogelen wurde untersucht. Alle Netzwerke halten die Wirkstofffreisetzung für 30 h aufrecht und es wurde beobachtet, dass ein einfacher Diffusionsmechanismus die diflunisale Freisetzung nach Korsmeyer-Peppas- und Higuchi-Modellen reguliert.

Introduction

In letzter Zeit haben Hydrogele großes Interesse im biomedizinischen Bereich geweckt, weil sie dreidimensionale Netzwerke mit hohem Wassergehalt sind und weich und flexibel sind, so dass sie natürliches Gewebe leicht imitieren können1. Auch lösen sie sich nicht in wässrigem Medium bei physiologischer Temperatur und pH-Wert auf, sondern stellen eine große Schwellung2dar. Hydrogele können als Gewebebaugerüste, Hygieneprodukte, Kontaktlinsen und Wundverbände fungieren; da sie Wirkstoffe und Medikamente fangen und freisetzen können, werden sie als Arzneimittelabgabesysteme verwendet3. Je nach Anwendung können Hydrogele aus natürlichen oder synthetischen Polymeren oder einer Kombination aus beidem hergestellt werden, um die besten Eigenschaften zu erhalten4.

Die Eigenschaften von Hydrogelen sind eine Folge vieler physikalischer und chemischer Faktoren. Auf der physikalischen Ebene hängen ihre Struktur und Morphologie von ihrer Porosität, Porengröße und Porenverteilungab 5. Auf chemischer und molekularer Ebene sind der Polymertyp, der hydrophile Gruppengehalt in der Polymerkette, der Vernetzungspunkttyp und die Vernetzungsdichte die Faktoren, die die Quellkapazität und die mechanischen Eigenschaften bestimmen6,7.

Je nach Art des Vernetzungsmittels, das zur Bildung des Netzes verwendet wird, werden die Hydrogele als chemische Hydrogele oder physikalische Hydrogele klassifiziert. Chemische Hydrogele werden durch kovalente Wechselwirkungen zwischen ihren Ketten verbunden, die durch UV- und Gammabestrahlung oder mit einem Vernetzungsmittel gebildet werden7,8. Chemische Hydrogele sind in der Regel stark und widerstandsfähig, aber im Allgemeinen ist das Vernetzungsmittel toxisch für die Zellen und seine Entfernung ist schwierig, so dass seine Anwendung begrenzt ist. Andererseits bilden sich physikalische Hydrogele durch die Verbindung der Polymerketten durch nicht-kovalente Wechselwirkungen, wodurch die Verwendung von Vernetzungsmitteln4,9vermieden wird. Die wichtigsten nicht-kovalenten Wechselwirkungen im Netzwerk sind hydrophobe Wechselwirkungen, elektrostatische Kräfte, Komplementär- und Wasserstoffgrenzen7.

Poly(Vinylalkohol) (PVA, Abbildung 1a) ist ein synthetisches und wasserlösliches Polymer mit hervorragender mechanischer Leistungsfähigkeit und Biokompatibilität, das von vernetzungsmittelfreien Hydrogelen über das Gefrier-Auftauverfahren10,11. Dieses Polymer hat die Fähigkeit, konzentrierte Zonen von Wasserstoffbindungen zwischen -OH-Gruppen ihrer Ketten (kristalline Zonen) zu bilden, wenn sie12einfrieren. Diese kristallinen Zonen fungieren als Vernetzungspunkte im Netzwerk und werden durch zwei Ereignisse gefördert: das Nähern der Polymerketten, wenn sich das Kristallwasser ausdehnt, und die PVA-Konformationsänderungen von isotaktischer zu syndiotaktischer PVA während des Einfrierens13. Durch die Gefriertrocknung werden die Wasserkristalle sublimiert, so dass Hohlräume, die die Poren im Hydrogel14sind. Um Hydrogele mit besseren Eigenschaften zu erhalten, kann PVA einfach mit anderen Polymeren kombiniert werden.

In diesem Sinne stellt Chitosan eine Option dar, da es das einzige Biopolymer aus natürlichen Quellen mit positiven Ladungen ist. Es wird durch die Deacetylierung von Chitin erhalten und es besteht aus zufälligen Kombinationen von -1,4 verknüpften D-Glucosamin (deacetylated Unit) und N-Acetyl-D-Glucosamin (acetylierte Einheit)15,16 (Abbildung 1b). Chitosan ist durch menschliche Enzyme biologisch abbaubar und biokompatibel. Auch durch seine kationische Natur, kann es mit der negativen Ladung der Zelloberfläche interagieren, und diese Eigenschaft wurde mit seiner antimikrobiellen Aktivität17verbunden. Dieses Polymer ist einfach zu verarbeiten; ihre mechanischen Eigenschaften reichen jedoch nicht aus und einige Materialien wurden zu Komplexen mit besseren Eigenschaften hinzugefügt.

Unter Berücksichtigung der spezifischen Eigenschaften von Chitosan und PVA wurde die erfolgreiche Herstellung von Hydrogelen durch das Gefrierauftauverfahren2,18 erreicht, um den Einsatz toxischer Vernetzungsmittel zu vermeiden. In Chitosan-PVA-Hydrogelen werden auch die kristallinen Zonen von PVA gebildet, und Chitosanketten werden durchdrungen und bilden einfache Wasserstoffbindungen mit -NH2 Gruppen und -OH-Gruppen in PVA. Das endgültige Chitosan-PVA-Hydrogel ist mechanisch stabil, mit hohen Schwellungsraten und geringer Toxizität, und mit antibakterieller Wirkung18. Abhängig von den in der Zubereitung verwendeten Gefrierbedingungen (Temperatur, Zeit und Anzahl der Zyklen) können sich die endgültigen Eigenschaften jedoch ändern. Einige Studien berichten, dass die Erhöhung der Anzahl der Gefrierzyklen verringert den Schwellungsgrad und erhöht die Zugfestigkeit19,20. Zur Stärkung des Netzwerks wurden nach der gefriertauten Zubereitung21,22,23zusätzlich weitere Wirkstoffe wie Gamma- und UV-Strahlung sowie chemische Vernetzer eingesetzt. Hydrogele mit einem höheren Chitosan-Anteil haben ein poröseres Netzwerk und eine hohe Quellkapazität, aber weniger Festigkeit und thermische Stabilität. In diesem Zusammenhang ist es wichtig, die Vorbereitungsbedingungen zu berücksichtigen, um geeignete Hydrogele für ihre Zielanwendung zu erhalten.

Der Zweck dieser Arbeit ist es, im Detail zu zeigen, wie sich die Gefrierbedingungen (Temperatur des Gefrierens und Anzahl der Zyklen) auf die endgültigen Eigenschaften von CS-PVA-Hydrogelen auswirken. FT-IR-Spektren, morphologische und porosity Eigenschaften und Schwellungsfähigkeit wurden bewertet, sowie Drogen be- und Freisetzungskapazität. In den Freisetzungsstudien wurde diflunisal (Abbildung 1c) aufgrund seiner Größe, die für die Hydrogelstruktur geeignet ist, als Modellmedikament verwendet.

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Protocol

1. Herstellung von Chitosan-PVA-Hydrogelen

  1. Bereiten Sie 2% (w/w) Chitosan und 10% (w/w) PVA-Lösungen vor. 0,2 g Chitosan in 10 ml 0,1 M CH3COOH-Lösung (zuvor gefiltert) bei Raumtemperatur auflösen und über Nacht kontinuierlich mechanisches Rühren aufrecht erhalten. 1 g PVA in 10 ml destilliertem Wasser auflösen und bei 80 °C 1 h rühren.
  2. Mischen Sie beide Lösungen 1:1 mit einem magnetischen Rührer, bis sie bei Raumtemperatur homogen sind, und gießen Sie die Mischungen auf Petri-Gerichte. Lassen Sie die Proben für 2 h bei atmosphärischem Druck zu entgasen.
  3. Die Hydrogele bei -4 °C, -20 °C oder -80 °C für 20 h und 4 Zyklen einfrieren (Proben CP4-4, CP4-20 bzw. CP4-80). Einfrieren eines anderen Hydrogels bei -80 °C für 20 h mit 5 oder 6 Gefrierzyklen (Proben CP5-80 und CP6-80). Nach dem dritten Gefrierzyklus die Hydrogele mit entionisiertem Wasser waschen. Am Ende die Hydrogele bei -46 °C für 48 h gefriertrocknen und zur weiteren Charakterisierung lagern (Methode angepasst ab2).

2. FT-IR-Charakterisierung

  1. Legen Sie ein kleines Stück (1 mm x 2 mm) Hydrogel in das FT-IR-Spektrometer im ATR-Modus. Nehmen Sie die FT-IR Spektren von 4000 bis 600 cm-1 (2 cm-1 Auflösung und durchschnitt 32 Scans).

3. Schwellungs-Assays

  1. Scheiben (13 mm Durchmesser und 10 mm Höhe) aus dem Hydrogel ausschneiden und wiegen. Inkubieren Sie die Scheiben in 50 ml entionisiertem Wasser mit Schütteln bei 25 °C. Wiederholen Sie dies dreimal.
  2. Alle 30 min entfernen Sie die Probe aus dem Medium, blotter, um den Überschuss an Wasser zu beseitigen, und wiegen. Berechnen Sie den Quellgrad mit der Gleichung 1 Equation 1 und berechnen Sie den Gleichgewichtszustand der Schwellung, bei 24 h mit der Gleichung 2.
    Equation 2)
    Wo Equation 3 ist das Gewicht des Equation 4 trockenen Hydrogels und ist das Gewicht des nassen Hydrogels.
    Equation 5

4. Elektronische Mikroskopie

  1. Bedecken Sie ein kleines Stück Hydrogel mit einer dünnen Goldschicht (30 s und 10 mA) in einem Sputterlacker.
  2. Legen Sie die Probe in ein Rasterelektronenmikroskop (SEM). Analysieren Sie die Proben unter Vakuum bei 20 kV und nehmen Sie die Bilder mit einer 500x und 1500x Vergrößerung auf.

5. Porosimmetrie

  1. Legen Sie Scheiben mit einem Durchmesser von etwa 0,26 g in das Penetrometer (ein solides Penetrometer mit einem Massenvolumen von 0,3660 ml und 5,7831 ml Stammvolumen). Analysieren Sie die Porosität und Porengröße durch Mercury Intrusion Porosimetrie (MIP).
  2. Führen Sie das Experiment im Hysteresemodus (Intrusion-Extrusion) durch. Messen Sie das gesamte Eindringvolumen (ml/g), die Gesamtporenfläche (m2/g), den Porendurchmesser (m), die Porosität (%), die Durchlässigkeit (mDarcy) und die Tortuosität. Wiederholen Sie dies zweimal.

6. Laden und Loslassen von Drogen

  1. Vor dem Beladen 4 L mit 15 mg/L Diflunisallösung vorbereiten und über Nacht umrühren. Bestätigen Sie die Konzentration der Lösung durch UV-Vis-Spektroskopie (Anfangskonzentration). In der Tat, anschwellen 400 mg gefriergetrocknete Proben von Hydrogel in 6 ml destilliertem Wasser für 24 h.
  2. Zum Beladen einen Kolben mit 50 ml Diflunisallösung füllen und bei 25 °C unter ständigem Rühren pflegen. Tauchen Sie jedes angeschwollene Hydrogel in den Kolben.
    1. Nehmen Sie Aliquots der verbleibenden Diflunisallösung (2 ml) zu verschiedenen Zeiten, um den Plateaubereich der Kurve zu bestimmen, z. B. 3, 6, 24, 27, 30 und 48 h. Nach 24 h ersetzen Sie die Lösung durch eine frische.
  3. Messen Sie die Absorption bei 252 nm jedes Aliquot und bestimmen Sie die Konzentration der diflunisalen Diflunisalin, die in der Lösung vorhanden ist, mit Hilfe einer Kalibrierkurve des Diflunisals. Berechnen Sie die im Hydrogel zurückgehaltene Diflunisalmenge bei 24 und 48 h als Differenz der Anfangs- und Endkonzentrationen unter Berücksichtigung des Gesamtvolumens (56 ml).
    1. Bestimmen Sie die Verkapselungseffizienz (EE) mit der Gleichung 3.
      Equation 6
    2. Die geladenen Hydrogele bei -80 °C einfrieren und bei -50 °C lyophilisieren.
  4. Zur Wirkstofffreisetzung 300 mg gefriergetrocknete diflunisale hydrogele in 50 ml Phosphatpuffer (pH 7,4) bei 25 °C untertauchen. Halten Sie ständiges Rühren. Entnehmen Sie Aliquots von 2 ml zu verschiedenen Zeiten und ersetzen Sie durch frisches Medium, um ein konstantes Volumen zu halten.
    1. Bestimmen Sie die diflunisale spektrophotometrisch bei 252 nm freigesetzt, nach einer Kalibrierkurve.
  5. Ableiten Sie den vorherrschenden Wirkstofffreisetzungsmechanismus in den Hydrogelen, der die Wirkstofffreisetzungsdaten entsprechend den ersten 60% an das Korsmeyer-Peppas-Modell (Gleichung 4) anpasst, um die kinetischen (k) und die Diffusionskonstanten (n) zu erhalten. Die n Werte geben den Mechanismus der Arzneimittelfreisetzung24,25an. Dann sind n Werte nahe 0,5 mit der fickischen Diffusion verbunden, inzwischen Werte von 0,5-1,0 für den anomalen Transport, bei denen Diffusions- und Entspannungsketten beteiligt sind, und schließlich beziehen sich die Werte von 1,0 auf den Transport von Fall II.
    Equation 7
    1. Um die Ergebnisse zu bestätigen, verwenden Sie die mathematischen Modelle Higuchi, First Order und Zero Order (Gleichungen 5 bis 7) und wählen Sie die bessere Passform aus.
    2. Equation 8
      Equation 9
      Equation 10
      wobei t die Freisetzungszeit, Mt die Menge des zu einem bestimmten Zeitpunkt gelieferten Arzneimittels und Mdie Gesamtmenge des am Ende des Prozesses gelieferten Arzneimittels darstellt.

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Representative Results

Hydrogele-Präparation
Chitosan-PVA-Hydrogele wurden bei -4 °C, -20 °C und -80 °C mit 4 Gefrierzyklen und bei -80 °C mit 5 und 6 Gefrierzyklen nach der zuvor gemeldeten Gefrier-Auftaumethode2gewonnen. Alle Hydrogele waren homogen, halbtransparent, flexibel und manipulationsbeständig.

FT-IR-Charakterisierung
Die FT-IR-Spektren sind in Abbildung 2dargestellt. Sieben Eigenschaftensignale von Chitosan- und PVA-Polymeren wurden nachgewiesen: bei 3286 cm-1 der Dehnungsschwingungsmodus der PVA-Hydroxylgruppe (-OH) und bei 2918 cm-1 der Dehnschwingungsmodus der -CH-Gruppe26,27. Die Signale der Amidgruppen, die für die Chitosanstruktur repräsentativ sind, wurden bei 1652 cm-1 zum Dehnungsschwingungsmodus von C=O (Amid I), bei 1560 cm-1 zum Flection-Vibrationsmodus von N-H (Amid II) und 1325 cm-1 bis zur Schwingung des Amids III28,29,30gefunden. Andere Signale, bei 1418 cm-1 zum Flection-Vibrationsmodus von C-H und bei 1086 cm-1 zum Dehnungsschwingungsmodus von C-O-Gruppen, beide von PVA, wurden27,31,32.

Elektronische Mikroskopie
Alle CS-PVA-Hydrogele zeigten eine stark poröse Oberfläche(Abbildung 3, von links nach rechts) und je nach Präparationsbedingungen wurden markante Veränderungen beobachtet. Hydrogele, die bei -4 °C (CP4-4) hergestellt werden, zeigten größere Poren als die bei -80 °C (CP4-80) hergestellten Hydrogele. Darüber hinaus scheint letzteres über ein poröseres Netzwerk zu verfügen. Dieser Effekt kann auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass bei niedrigerer Temperatur die Bildung des Wasserkristalls schneller war und viele kleine Kristalle entstanden und während des Gefriertrocknungsprozesses sublimiert wurden, so dass Leere Poren14,33. In der Zwischenzeit scheint die Wirkung der Anzahl der Gefrierzyklen definiertere und kreisförmige Poren in Hydrogelen CP6-80 zu fördern (Abbildung 3, von oben nach unten).

Porosimetrie
Die Proben CP4-4, CP4-80 und CP6-80 wiesen deutlichere Veränderungen auf; Um die Informationen über die Morphologie zu ergänzen, wurden sie durch MIP analysiert (Tabelle 1). Der Vergleich zwischen den Hydrogelen CP4-4 und CP4-80 (Abbildung 3a) zeigte, dass Hydrogele bei einer niedrigeren Gefriertemperatur ein poröseres Netzwerk entwickelten, das ein großes Gesamteindringvolumen und eine höhere Gesamtporenfläche aufwies. Hydrogele CP6-80 zeigten jedoch eine geringere Durchlässigkeit als CP4-80 (Abbildung 3b), wahrscheinlich aufgrund ihrer hohen Tortuosität, was sich auch in einem geringeren Gesamteindringvolumen widerspiegelte. Abbildung 3 zeigt die verschiedenen Porengrößen dieser Hydrogele. Es wurden zwei Porengrößen unterschieden, eine zwischen 0,3-5,0 m und eine andere zwischen 5,0-30 m. Bei den Hydrogelen CP4-80 und CP6-80 hatte das poröse Netzwerk eine größere Anzahl kleiner Poren als große, verglichen mit CP4-4 Hydrogel. Diese Ergebnisse ähnelten denen, die von SEM-Mikrographen beobachtet wurden, und legten nahe, dass bei niedrigerer Temperatur größere Wechselwirkungen zwischen den PVA-Ketten bevorzugt wurden und mehr kristalline Zonen gebildet wurden. Auf diese Weise wurde die Bildung von kristallinen Zonen durch PVA-Ketten bei niedriger Temperatur angeregt.

Schwellungen assays
Das Quellverhalten von CS-PVA-Hydrogelen ist in Abbildung 4zu sehen. Sie absorbierten schnell große Mengen Wasser; in den ersten 5 Stunden behielten sie das 10-fache ihres Gewichts bei, und nach 20 Stunden behalten sie bis zu 15-fach ihr Gewicht (Gleichgewichtspunkt). In Bezug auf Hydrogele, die bei der gleichen Anzahl von Gefrierzyklen hergestellt wurden, zeigte das Hydrogel CP4-80 jedoch in den ersten 5 Stunden aufgrund der Für die Herstellung verwendeten Temperatur (-80 °C) eine geringere Quellkapazität. Bei Hydrogelen, die in unterschiedlicher Anzahl von Gefrierzyklen (CP4-80, CP5-80 und CP6-80) hergestellt werden, wurden zu keinem Zeitpunkt Unterschiede festgestellt. Vermutlich wurde die bei -80 °C beobachtete verminderte Quellkapazität in Hydrogelen durch die geringe Porengröße des Hydrogelnetzes verursacht.

Laden und Freigeben von Drogen
Um die Kapazität von CS-PVA-Hydrogelen als Arzneimittelabgabesysteme zu bewerten, wurde das entzündungshemmende Medikament Diflunisal in das Netzwerk geladen und anschließend freigegeben. Die Verkapselungseffizienz (EE) in all diesen Systemen betrug etwa 70 %; das HYDROgel CP4-80 lag jedoch mit 73 %(Tabelle 2) etwas leichter bei EE. In der Zwischenzeit wurde die Freisetzungskinetik von Diflunisal aus den CS-PVA-Hydrogelen in allen Fällen für ca. 30 h aufrechterhalten. Das CP4-80 Hydrogel gab die höchste Menge an Diflunisal ab (Abbildung 5). Dies kann auf die Tatsache zurückzuführen sein, dass dieses Hydrogel eine porösere Struktur im Vergleich zu den anderen beiden Hydrogelarten zeigte. Diese Funktion ermöglichte es, das kleine Molekül des Medikaments leicht in das Hydrogel-Netzwerk zu gelangen und dann freigesetzt zu werden. Zwischen CP4-80 und CP6-80 Hydrogelen wurden während der Freisetzungszeiten keine Unterschiede beobachtet (Abbildung 6). Bei keinem der CS-PVA-Hydrogele wurde ein Bursteffekt beobachtet, der für pharmazeutische Anwendungen vielversprechend ist. Mathematische Modelle wurden verwendet, um den Hauptfreisetzungsmechanismus in CS-PVA-Hydrogelen zu bestimmen. Die Ergebnisse wurden an verschiedene mathematische Modelle angepasst (Tabelle 3) und nach den n Werten wurde festgestellt, dass die Fick-Diffusion den Wirkstofffreisetzungsprozess dominiert.

Figure 1
Abbildung 1: Chemische Struktur von PVA (a), Chitosan (b) und diflunisal (c). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: FT-IR-Spektren aus reinem Chitosan und PVA und Chitosan-PVA-Hydrogelen, die unter verschiedenen Gefrierbedingungen hergestellt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: SEM-Mikrographien von Chitosan-PVA-Hydrogelen bei 1500-facher Vergrößerung. Porengrößenverteilungen von Chitosan-PVA-Hydrogelen: a) Hydrogele, die mit 4 Gefrierzyklen und bei -4 °C und -80 °C hergestellt werden. b) Hydrogele bei -80 °C und 4 und 6 Zyklen hergestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Quellkinetik von Chitosan-PVA-Hydrogelen: a) Hydrogele mit 4 Gefrierzyklen und b) Hydrogelen, die bei -80 °C hergestellt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Diflunisale Freisetzungsprofile in mg (Equation 11 a) und Mt/ (b) für Hydrogele CP4-4 und CP4-80. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Diflunisale Freisetzungsprofile in mg (Equation 11 a) und Mt/ (b) für Hydrogele CP4-80 und CP6-80. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Hydrogel Gesamtes Eindringvolumen (mL/g) Gesamtporenfläche (m2/g) Porosität (%) Durchlässigkeit (Mdarcy) Tortuosität
CP4-4 5.16 10.19 67.13 132.43 10.46
CP4-80 7.36 15.14 85.95 151.16 5.83
CP6-80 6.69 12.86 84.82 129.28 12.2

Tabelle 1: Porosimetrieparameter der porösen Struktur von Chitosan-PVA-Hydrogelen.

Beispiel Diflunisal geladen Diflunisal veröffentlicht
mg/g Hydrogel Verkapselungseffizienz (%) % freigegebener Respekt vor geladenen
CP4-4 3,05 x 0,09 71 79 € 3,33
CP4-80 3,22 € 0,47 73 86 x 0,4
CP6-80 3,19 x 0,05 68 80 x 3,9

Tabelle 2: Verkapselung und Freisetzung von Effizienzen für Chitosan-PVA-Hydrogele.

Beispiel Korsmeyer-Peppas Higuchi Erste Ordnung Zero Order
kKP x 102 N R2 kH x 102 R2 k1 x 102 R2 k0 x 102 R2
(min-n) (min-0,5) (min-1) (min-1)
CP4-4 4,3 bis 0,39 0,44 € 0,02 0.99 3,1 x 0,1 0.98 0,29 € 0,03 0.803 0,18 € 0,02 0.54
CP4-80 3,6 x 0,33 0,50 x 0,02 0.99 3,7 x 0,1 0.99 0,42 € 0,03 0.894 0,27 € 0,02 0.7
CP6-80 2,3 x 0,24 0,54 € 0,02 0.99 2,9 x 0,1 0.99 0,27 € 0,02 0.925 0,17 € 0,01 0.77
k= kinetische Konstante; n= Diffusionskonstante.

Tabelle 3: Kinetische Parameter der diflunisalen Freisetzung aus Chitosan-PVA-Hydrogelen.

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Discussion

Die Gefrier-Auftaumethode ist ein geeignetes Verfahren zur Herstellung biokompatibler Hydrogele, die sich auf biomedizinische, pharmazeutische oder kosmetische Anwendungen konzentrieren34,35,36. Der wichtigste Vorteil dieser Methode, im Vergleich zu anderen bekannten Methoden zur Herstellung von Hydrogelen, ist, dass die Verwendung von Vernetzungsmitteln vermieden wird, was eine Entzündungsreaktion oder nebenwirkungende Wirkungen im menschlichen Körper verursachen könnte34. Dies ist eine vielseitige Methode, weil es die Möglichkeit bietet, Hydrogele aus PVA oder deren Mischungen mit verschiedenen Polymeren11,37 so zuzubereiten, dass neue Eigenschaften aus den anderen Polymeren im neuen Material gewonnen werden können (z.B. Hauptkapazität zur Aufnahme von Wasser, antimikrobielle oder antioxidative Eigenschaften2,18,35). Es ist jedoch wichtig zu berücksichtigen, dass die Einbeziehung anderer Polymere die Festigkeit der Hydrogele19,37verringern könnte.

Die wichtigsten Parameter, die bei der Gefrier-Auftaumethode zu berücksichtigen sind, sind die Temperatur des Gefrierens, die Zeit und die Anzahl der Gefrierzyklen sowie das Polymerverhältnis (bei Polymermischungen)2,19,20. Mit dieser Methode kann eine Breite von Schwellungen, morphologischen und mechanischen Eigenschaften erhalten werden, wenn die Gefrierbedingungen kontrolliert werden. Diese Parameter wirken sich direkt auf die dreidimensionale Netzwerkkonfiguration in Chitosan-PVA-Hydrogelen aus, da die Gefrierbedingungen die Anordnungen in PVA-Ketten fördern, die durch physikalische Wechselwirkungen, sogenannte kristalline Zonen12,38,verbunden sind. Diese kristallinen Zonen sind konzentrierte Regionen von Wasserstoffbindungen, die als Vernetzungspunkte in den Hydrogelen fungieren, die das dreidimensionale Netzwerk erhalten und bilden und es ist eine Retraktorkraft, wenn Hydrogele im Quellzustand2,39,40sind.

In dieser Studie haben wir die Wirkung eines neuen Bereichs von Gefriertemperaturen (-4 °C, -20 °C und -80 °C) in Kombination mit einer unterschiedlichen Anzahl von Gefrierzyklen (4, 5 und 6), aber zur gleichen Zeit des Gefrierens (20 h) bewertet, um 1:1 Chitosan-PVA-Hydrogele vorzubereiten. Die geringste Quellkapazität wurde bei der niedrigsten Temperatur (-80 °C) beobachtet. Tatsächlich erhielten Hydrogele bei dieser niedrigsten Temperatur die kleineren Poren und die poröseren Netze. Diese Unterschiede bei Chitosan-PVA-Hydrogelen sind für verschiedene Anwendungen wie Arzneimittelabgabesysteme oder Gerüste nützlich. Im Allgemeinen bieten Chitosan-PVA-Hydrogele aufgrund von Chitosan-Hydrophilengruppen (-NH2)41,42, hohe Schwellungsraten und sind weich, flexibel, leicht zu handhaben und widerstehen der Manipulation aufgrund von PVA-Eigenschaften. In diesem Sinne ist die Gefrier-Auftaumethode einfach, billig und schnell, um Chitosan-PVA-Hydrogele mit unterschiedlichen Eigenschaften herzustellen, wodurch eine toxische Vernetzung vermieden wird.

Obwohl das Einfrieren eine einfache und freundliche Methode ist, hat es einige Nachteile. Eine vollständige Homogenisierung von Chitosan, in diesem Fall, und der Polymermischungen ist sehr wichtig. Hydrogele können empfindlichere Zonen und eine unregelmäßige poröse Struktur aufweisen. Auch ist es notwendig, eine korrekte Auflösung von PVA in Wasser durch Erhitzen bei 70-80 °C42,43 für 1 h unter magnetischem Rühren zu machen. Die Kühlung dieser PVA-Lösung muss mit ständigem Rühren langsam erfolgen, um die Bildung einer festen PVA-Schicht zu verhindern.

Eine Einschränkung dieser Methode für Zellkultur-Assays ist die Bildung von weißlichen oder halbtransparenten Hydrogelen. In diesem Fall könnte die Anwendung von Glycerin oder DMSO (toxische Verbindung bei Raumtemperatur) verwendet werden, um das Aussehen von Hydrogel23,44zu verbessern. Der Gefriertrocknungsschritt der Gefrier-Auftaumethode zur Herstellung von CS-PVA-Hydrogelen ist ein entscheidender Schritt, da die Hydrogele eine Verengung in der mittleren Zone darstellen könnten, was die Arbeit und die Charakterisierung erschwert. Um dies zu vermeiden, muss die Probe vor der Lyophilisierung vollständig gefroren gehalten werden. In Bezug auf die Drogen-Lade- und Freisetzungsstudien ist es sehr wichtig, sicherzustellen, dass es keine Interferenzen mit den Signalen der Hydrogel-Komponenten und des zu quantifizierenden Arzneimittels gibt.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Autoren sind C. Luzuriaga für die Unterstützung bei den Porosimetriemessungen dankbar. Die Autoren danken auch dem spanischen Ministerio de Economéa y Competitividad für die finanzielle Unterstützung (Projekt MAT2014-59116-C2-2-R) und PIUNA (Ref. 2018-15). Die Autoren möchten auch Dr. Amir Maldonado von Departamento de Fésica-UNISON für Unterstützung und hilfreiche Kommentare und Dr. SE Burruel-Ibarra von DIPM-UNISON für SEM-Bilder und Rubio Pharma y Asociados S. A. de C. V. für finanzielle Unterstützung danken. ME Martinez-Barbosa dankt den CONACyT (México)-Projekten Nr. 104931 und Nr. 256753 neben der finanziellen Unterstützung durch die Rote Temétea de Nanociencias y Nanotecnologa del programa de Redes Teméteticas del CONACyT. Und, auch Projekt USO316001081. MD Figueroa-Pizano möchte CONACyT für die finanzielle Unterstützung (Stipendium 373321) würdigen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials:
Chitosan medium molecular weight Sigma-Aldrich 448877 Mw determined by capillary viscometry (637,000 Da) and deacetylation degree of 70%
Diflunisal (2'-4'-difluoro-4-hydroxy-3-biphenyl-carboxylicacid) Merck
Glacial acetic acid Sigma-Aldrich 1005706
Poly(vinyl alcohol) Sigma-Aldrich 341584 Mw 89,000-98,000, 99+% hydrolyzed
Equipment:
Cressington Sputter Coater 108 auto TED PELLA INC
Cryodos Lyophilizator Telstar
Falcon tubes Thermo Fisher Company
FT-IR spectroscopy Nicolet iS50 in ATR mode
Lyophilizator LABCONCO
Micromeritics Autopore IV 9500 Micromeritics
Scanning electron microscope Pemtron SS-300LV
UV-visible spectrophotometer Agilent 8453

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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