用于长期无细胞基因表达传导的多层微流体平台

Bioengineering
 

Summary

介绍了基于PDMS的多层微流体装置的制造过程,该装置允许长时间进行体外转录和翻译(IVTT)反应。此外,还全面概述了自动化和维护这些反应所需的硬件和软件,

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van der Linden, A. J., Yelleswarapu, M., Pieters, P. A., Swank, Z., Huck, W. T., Maerkl, S. J., de Greef, T. F. A Multilayer Microfluidic Platform for the Conduction of Prolonged Cell-Free Gene Expression. J. Vis. Exp. (152), e59655, doi:10.3791/59655 (2019).

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Abstract

随着研究人员致力于开发更大、更复杂的合成遗传调控回路,基于细胞的合成生物学的局限性正变得越来越明显。对体内合成遗传调控网络的分析非常耗时,而且缺乏环境控制,外源合成成分与宿主过程相互作用,导致不良行为。为了克服这些问题,新型电路的无细胞表征正变得越来越普遍。体外转录和翻译(IVTT)混合物允许调节实验环境,并可针对每个独特的系统进行优化。此处介绍的协议详细介绍了多层微流体器件的制造,该装置可用于长时间维持IVTT反应。与批次反应不同,在资源随时间而耗尽和(副产品)产品积累的情况下,微流体装置的使用允许补充资源并去除反应产物。通过这种方式,通过维持一个不平衡的环境来模拟细胞环境,在这种环境中,可以长期研究基因回路的动态行为。为了充分利用多层微流体器件,集成了硬件和软件,使IVTT反应自动化。通过将IVTT反应与此处介绍的微流体平台相结合,可以全面分析复杂的网络行为,从而加深我们对调节细胞过程机制的理解。

Introduction

细胞能够使用复杂的动态调节网络1,2来感知和响应其环境。合成生物学领域利用我们对包括这些网络的自然存在的成分的知识来设计生物系统,这些生物系统可以扩展细胞3,4的功能。相反,通过设计现有电路的简化合成类似物,或者通过具有自然发生行为的前瞻性工程生物系统,还可以进一步理解管理生命的自然网络。这种生物系统的解构工程以自下而上的方式进行,其中新的基因电路或信号通路以合理的方式设计,使用定义明确的部分5,6。将网络的合理设计与生物相关系统的设计相结合,可以对具有不同抽象层次的生物调控系统进行深入的表征和研究。

Elowitz和Leibler8和Gardner等人9的开创性工作首次证明了合成基因网络在细胞宿主中的成功引入。在接下来的十年里,尽管在细胞7、10、11中引入合成电路方面出现了一些限制,但许多研究人员仍然继续在这些初步成功的基础上再接再厉。 , 12.理想情况下,将合成电路引入蜂窝主机应采用模块化方式。不幸的是,蜂窝环境的复杂性使得这一点特别具有挑战性,许多部分和网络的功能高度依赖于上下文12,13,14。因此,网络经常遇到与本机主机组件的不需要的交互,这可能会影响合成电路的功能。同样,外源网络的组件可以抑制主机进程,在主机内争夺共享资源,并影响增长动力学 15、16、17 。因此,为了合理设计和预测合成网络在体环境中的行为,需要一个综合模型,所有主机和电路特定的动力学。

使用蜂窝主机对合成网络进行表征的一种可行的替代方法是应用体外转录和翻译 (IVTT) 技术。作为合成网络的试验台,反应在包含实现基因表达19、20、21所需的所有成分的溶液中进行。以这种方式,一个生物相关,虽然是人工的环境,其中合成网络可以测试22,23,24,25,26, 2728.使用IVTT解决方案的一个主要优点是在用户指定的条件下执行反应的能力,研究人员能够调整每个反应的准确组成2。此外,无细胞方法支持合成网络的高通量测试,因为它无需执行耗时的细胞克隆步骤。因此,连续设计-建造-测试周期的持续时间显著缩短29,30,31,32。利用无细胞克隆技术(如吉布森组件)快速设计新型网络,以及利用线性DNA模板构建网络,从而进一步加快设计周期,这与体内测试所需的质粒不同——可通过聚合酶链反应(PCR)33、34进行扩增。

批量反应是执行IVTT反应的最简单方法,需要一个单一反应容器,其中所有反应成分结合35。这种反应足以用于蛋白质表达和基本电路测试,但在试图研究网络的长期动态行为时证明是不够的。在批量反应过程中,试剂要么耗尽,要么降解,导致转录率和转化率持续下降。此外,随着反应的不断进步,副产品会干扰或完全抑制网络的正常运行。最终,使用批量反应器限制了可以观察到的动态行为,而消极的调节对于实施5,36尤其具有挑战性。

IVTT系统的多功能性使多种替代方法可以执行长时间的IVTT反应,从连续流到滴基方法,以及更简单的透析方法2,3037,383940.微流体器件的应用为用户提供了对反应的增强控制,同时提高了吞吐量,将成本降至最低 35、41、42,每种特定方法都有其自身优势。连续流的使用可以很容易地优化,提高表达产量,然而,无法有效地去除特定的反应产物,使动态行为的研究不平凡39。虽然采用基于液滴的微流体系统允许对新型网络进行高通量筛选,但难以向反应提供新鲜试剂,导致液滴类似于小体积批量反应43。透析基反应器允许引入新的试剂以及去除一些反应产物,然而,RNA分子和较大的蛋白质在反应器内积累,太大,无法扩散到膜孔。此外,需要大量的试剂来维持这些反应的时间为30,44。2013年,Maerkl等人展示了一种多层微流体装置,专门用于进行长时间的IVTT反应36,45。使用多层微流体装置可以直接控制流体流动,允许在设备46、47的特定区域重定向和隔离流体。这些隔离区域可以作为独立的纳米升级反应室,其中IVTT反应可以进行。在单个IVTT反应过程中,使用定期注入新试剂到反应器中补充IVTT成分和DNA模板。同时,将相同体积的旧反应溶液置换,去除反应产物。通过这种方式,保持一个不平衡的环境,使基底转录和翻译速率保持稳定状态,延长IVTT反应的寿命,并允许发生丰富的动态行为。通过应用这种方法,研究人员能够研究特定电路内发生的单个过程的动能速率,从而有助于新基因网络的前瞻性工程。例如,尼德霍尔特迈尔等人用这种方法来描述遗传环振荡器的各种元素,确定其动能速率36。在进一步的研究中,Yelleswarapu等人表明,在批处理条件下确定的西格玛因子28(±28)的动力学速率不足以描述基于±28的振荡器的行为,并且添加基于流量的数据改进了网络行为的模型预测22

本手稿的目的是为能够执行长期 IVTT 反应的多层微流体器件的制造提供完整的方案。此外,本手稿将描述执行长时间 IVTT 反应所需的所有硬件和软件。微流体装置的驱动 - 控制流体流动所必需的 - 是通过使用一系列气动阀实现的,这些气动阀通过管道长度直接连接到微流体装置。反过来,气动阀通过定制的虚拟控制接口进行控制。微流体装置内的流体流动是使用市售的压力调节系统提供的连续压力实现的。IVTT反应通常在29°C至37°C之间进行,显微镜培养箱用于调节反应过程中的温度。然而,当储存在4°C以上时,IVTT混合物的功能会逐渐退化。因此,本手稿将扩展用于在注入微流体装置之前用于冷却 IVTT 混合物的离片冷却系统。最后,本手稿全面概述了使用微流体流反应器成功执行长期 IVTT 反应所需的程序,以便其他研究人员能够相对地复制该技术缓解。

Protocol

1. 晶圆制备

注:我们的协议针对本研究中使用的 40 XT 正光刻胶和 SU8 3050 负光刻胶。可使用替代光刻胶,但特定的旋转速度、烘烤温度和烘烤时间会有所不同。尼德霍尔特迈尔等人36提供的微流体装置设计在材料表中链接。

  1. 将两块干净的硅片(直径 100 mm,<1-0-0> 定向,525 μm 厚度)放入设置为 250 °C 的预热烤箱中,让晶圆在一夜之间脱水(±16 小时)。
    注:也可以使用 HMDS 气相沉积对晶圆进行充注;但是,如果晶圆充分脱水,则没有必要这样做。
  2. 从烤箱中取出一个硅片,使其冷却至室温,然后再进行旋转涂层。将 40 XT 光刻胶的 3-4 mL 涂抹到晶圆中心。
  3. 要获得 25 μm 的特性高度,请应用以下旋转协议:在 500 rpm (110 rpm/s) 下旋转 20 s,将旋转速度提高到 3100 rpm(300 rpm/s),并在此保持 30 s,并将晶圆减速至 0 rpm,减速 200 rpm/s。超细纤维组织小心地去除在旋转涂层过程中可能发生的任何边缘珠。
  4. 使用两个分别设置为 70°C 和 120°C 的硬制热板进行软烘烤,方式如下:让晶圆在 70°C 下坐 30 s。然后将晶圆转移到120°C热板,让它在这里休息3.5分钟,然后再将晶圆返回到70°C热板30秒。
  5. 将流层光掩膜(乳化侧向下)置于光刻胶膜上,并使用紫外线灯曝光晶圆,直到达到 200 mJ/cm2的总曝光率。
  6. 暴露后使用两个热板(70°C 和 105 °C)以下列方式烘烤:让晶圆在 70°C 下坐 20 s,然后再将晶圆转移到 105°C 的热板,并将其留在这里 40 s。最后,将晶圆返回到 70°C 热板 20 s,以完成曝光后烘烤。
  7. 让晶圆在一堆超细纤维纸巾上冷却至室温。通过将晶圆转移到装有 726 MIF 光刻胶的培养皿,开始开发过程,从而开发晶圆。在台式摇床上执行时,开发速度加快,整个晶圆被淹没在开发人员中。
  8. 用脱矿水冲洗晶圆,并使用立体显微镜检查晶圆表面是否有任何光刻胶残留物。如果可以看到光刻胶残留物,则将晶圆返还给开发商。
  9. 将晶圆置于 110°C 的热板上 25 分钟,将正光片重新流动。此过程将导致圆形特征以及退火过程中可能出现的任何裂纹。按照步骤 1.17 中所述,继续对晶圆进行硅化。
  10. 从烤箱中取出第二个硅片,使其冷却至室温,然后再进行旋转涂层。将 5 mL 的 SU8 3050 光刻胶涂抹到晶圆中心。
  11. 要获得 30 μm 的特性高度,请应用以下旋转协议:在 500 rpm (110 rpm/s) 下旋转 20 s,将自旋速度提高到 4,000 rpm (330 rpm/s),并在此保持 42 s,并将晶圆减速至 0 rpm,减速 200 rpm/s。超细纤维组织小心地去除在旋转涂层过程中可能发生的任何边缘珠。
  12. 使用两个单独的热板(65 °C 和 95°C)以下列方式进行软烘烤:让晶圆在 65°C 下坐 30 s。然后将晶圆转移到95°C热板,让它在这里休息14分钟,然后将晶圆返回到65°C热板再30秒。
  13. 在曝光前测量紫外线灯的强度,并用它来确定达到260 mJ/cm2总曝光剂量所需的暴露持续时间。将光掩膜(乳化面向下)放在光刻胶胶片上,并将晶圆置于 UV 光源下方。使用紫外线灯照射晶圆,直到达到 260 mJ/cm2的总曝光率。
  14. 使用两个热板(65°C 和 95°C)进行后烘烤,方式如下:让晶圆在 65°C 下坐 60 秒,然后再将晶圆转移到 95°C 热板,并在此保留 4.5 分钟。将晶圆返回到 65°C 热板,再增加 30 秒完成曝光后烘烤。
  15. 让晶圆在一堆超细纤维纸巾上冷却至室温。开发晶圆,将其转移到装有mrDev-600光显开发者的培养皿中,开始开发过程。在台式摇床上执行时,开发速度加快,整个晶圆被淹没在开发人员中。
  16. 用异丙醇冲洗晶圆,并使用立体显微镜检查晶圆表面是否有任何光刻胶残留物。如果可以看到光刻胶残留物,则将晶圆返还给开发商。完全开发后,将晶圆放在 150°C 的热板上,将光刻胶硬烘烤 1 小时。
  17. 对两个晶圆进行硅化,以防止PDMS在软光刻过程中粘附。为了执行硅化,将硅烷的2-3个液滴(每片晶圆)移入一个小玻璃瓶中。将小瓶与晶圆一起放入干燥器中,并拉真空5-10分钟。密封干燥器,将晶圆置于真空状态12~16小时。
    注意:硅烷是有毒的,不应吸入。处理硅烷时,小心在烟罩中工作,并戴上手套。这包括在干燥器上拉真空时将真空泵置于烟气罩中。
  18. 从干燥器中释放真空,并取出硅化晶圆。用水冲洗,并使用 N2蒸汽干燥晶圆。此时,晶圆可以放入存储中,直到需要为止。

2. 微流体装置制造

注:用于制造基于PDMS的多层微流体器件的软光刻工艺可分为三个不同的步骤:1)流量和控制层的PDMS制备,2)两个PDMS层的对齐和粘接,3)完成设备。

  1. PDMS 准备
    1. 通过将底座和固化剂组合在塑料烧杯中,并使用搅拌棒搅拌两个部件,直到完全混合,制备两种 PDMS 前体溶液。控制层需要20克基剂和1克固化剂(20:1比例)。流层需要 40 g 的基础剂和 8 g 的固化剂(5:1 比率)。在干燥器中解气。
    2. 将流层晶圆放入培养皿中,将 5:1 比 PDMS 混合物倒在晶圆上。将 PDMS 脱气 30 分钟以去除气泡。
    3. 旋转涂覆控制层晶圆(使用负 SU8 3050 光敏电阻制备),使用 20:1 比率 PDMS。将 PDMS 的 5-10 mL 浇到晶圆中心,并运行以下旋转协议(保留 PDMS 上的左侧供以后使用):在 500 rpm 转速下旋转 15 s(100rpm/s),将旋转速度提高到 1450 rpm (300 rpm/s),45 s,然后将晶圆减速至 0 rpm(200 rpm/s)。
    4. 为确保 PDMS 薄膜厚度均匀,将 PDMS 涂层晶圆放在封闭培养皿中的水平表面上(以避免灰尘污染)。让晶圆坐30分钟。
    5. 从干燥器中取出流层,并将流量和控制层放在烤箱 (80°C) 中。固化两层 28-30 分钟,并在 PDMS 可塑性足以操作时去除,同时保持轻微粘稠。立即继续对齐过程。
  2. 对齐和粘合
    1. 使用手术刀,从流层晶圆上的 PDMS 中取出四个器件。从硅片中取出 PDMS 层后,立即用苏格兰胶带覆盖特征侧,以避免灰尘颗粒污染。
    2. 通过眼睛大致对齐控制层上的流层块,使器件的特征侧与控制层 PDMS 接触。随后,对每个流层块的位置进行微调,使流层的通道与控制层通道对齐,使用立体显微镜帮助实现调整的可视化。
    3. 施加压力以拆下两个 PDMS 层之间的气囊。倒入先前保存在对齐的流层块周围的剩余 20:1 比率 PDMS。在每个设备上放置 100 g 重量,以确保在粘合过程中有足够的接触。
    4. 将对齐的设备(包括重量)返回到 80°C 烤箱,使其粘合至少 1.5 小时,不超过 6 小时。
  3. 完成设备
    1. 从烤箱中取出晶圆,从控制层晶圆中提取每个单独的器件,用苏格兰胶带覆盖每个器件的特征侧。
    2. 迭代,对每个流量层入口、24 个控制层通道入口和每个器件的单个流层出口打一个孔。在功能侧朝上打孔设备时,使用摄像机确保在要素边界内打孔。
    3. 对于每个设备,使用异丙醇和丙酮清洁单个显微镜幻灯片,并在 N2流下干燥幻灯片。随后,将显微镜滑片置于设置为 150°C 的热板上 15 分钟。
    4. 使用氧气等离子消亮将 PDMS 设备粘结到玻璃玻片上,在 45 s 下施加 50 W 的消声功率。完成后,将设备功能侧下放在玻璃滑块上,施加压力以清除表面之间的滞留气体。
    5. 将粘合装置放在设定为 110°C 的热板上 1 小时。 重量可以放置在设备顶部,以提高设备的附着力。

3. 硬件设置

注:要实现对微流体芯片的控制,需要安装大量硬件并相互连接。需要三组不同的硬件:1) 控制通道的气动控制系统,2) 气动压力调节器控制设备内反应试剂的流量;3) 冷却系统,在控制通道之前冷却 IVTT 反应溶液注入微流体装置。图 1中提供了硬件设置的概述。应该指出的是,这里提供的协议试图尽可能一般,但在我们的研究中使用的某些特定设备被引用。所有硬件都可以由能够执行相同功能的替代方案替换。在这种情况下,此处的协议可用于概述设置系统所需的一般步骤以及每个组件的要求。替代硬件设置由布劳尔等人48和怀特和街道49提出。

  1. 气动控制系统(见图2)
    1. 使用制造商的协议,在现场总线控制器和用户工作站之间建立 TCP 连接。使用控制软件(作为补充文件提供)组成 MODBUS 命令,这些命令通过 TCP 连接发送到控制器,并激活电磁阀。
    2. 使用 8 个 4 通道数字输出模块扩展现场总线控制器,每个电磁阀一个。每个电磁阀都主持一个连接销。将正极导线连接到其中一个数字输出模块上的四个正极输出之一,同时将负极导线连接到数字输出模块的接地端口之一。
      注: 为了使系统正常工作,应系统地连接电磁阀,将第一个电磁阀连接到第一个输出端口,将第二个电磁阀连接到第二个输出端口,等等。在我们的系统中,两个阀门阵列分别与 8 个和 22 个电磁阀一起使用。输出端口 1-8 连接到 8 阀阵列,输出端口 9-30 连接到 22 阀阵列。
    3. 使用 1/4" 管将两个阀阵列连接到压缩空气源。使用压力调节器将 22 阀阵列的压力设置为 3 bar,将 8 阀阵列设置为 1 bar。
  2. 流量压力调节(见图3)
    注:为了将流体流过微流体装置的流层,使用市售的4端口压力调节器。每个端口的输出压力通过压力控制器提供的软件进行调节。使用随附的 USB 连接器将压力调节器连接到计算机。
    1. 将压力调节器连接到压缩空气源,确保提供的压力不超过调节器允许的最大压力。
    2. 将公卢尔连接到压力调节器的四个母 Luer 锁输出端口,将 3/32" barb 连接器连接到每个端口。将一段长度的软管(OD:3 mm,ID:1 mm,L:10 厘米)连接到棒。
    3. 将第二个公卢尔连接到 3/32" 棒接头连接到软管的打开端,并将其连接到储液罐连接器端口。
    4. 使用所提供的软件设置流量调节器每个出口所需的压力,对储存在储液罐中的试剂加压,使试剂流入微流体装置。第4.2节将讨论储层与微流体装置的连接。
  3. 芯片外冷却设置(参见图 4)
    1. 使用 PVC 管(OD:10 mm,ID:6 mm)使用压缩接头将水冷却系统连接到冷板水块。用冷却液填充水冷却系统的储液罐,轻轻倾斜装置以排出任何滞留的空气,持续向储液罐中添加冷却液以确保其充满。从系统中清除所有气体后,将储液罐中填充到最大体积的大约 90-95%。
    2. 线圈 PTFE 管(OD: 0.042",ID: 0.022")放在 Peltier 元件的冷面上,用胶带固定。确保 PTFE 油管的一端连接到流量层压力控制系统的储液罐(如第 4.3 节所述)。PTFE 管的另一端应突出不超过 1 厘米的 Peltier 表面。将 5 至 10 厘米长度的 PEEK 管(OD: 0.794 mm,ID: 0.127 mm)插入 PTFE 管的突出端。第 4.3 节进一步解释了管道的填充和与微流体装置的连接。
    3. 将 Peltier 元素的热面放在水块的冷板上,将足够的热化合物施加到两个面上。确保管、Peltier 元件和冷却块始终直接接触。
    4. 将 Peltier 元件连接到温度控制器(通过串行总线连接器),以便可以调节提供给 Peltier 的电压。将热敏电阻牢固地放置在 Peltier 表面上,将输出连接到温度控制器。打开水冷却器后,调整提供给 Peltier 的电压,直到温度稳定在 4°C。
      注: 使用此设置,Peltier 温度通过调整提供的电压手动控制,而热敏电阻仅用于监控温度。

4. 准备实验

注:在开始实验之前,必须准备微流体装置,并且必须将反应试剂插入正确的管中,以便注射到设备中。本节将讨论:1) 控制通道管与设备的连接,2) 未冷却的流入试剂与设备的连接,以及 3) 冷却的流入试剂与设备的连接。

  1. 连接控制通道管
    1. 对于微流体装置的每个控制通道,切割一段管的长度(OD:0.06",ID:0.02")。在一端,插入 23 G、1/2" Luer 存根的销,另一端插入不锈钢连接销(OD:0.65 mm,ID:0.35 mm,L: 8 mm)。
    2. 将 Luer 存根连接到公吕尔到 3/32" 棒尼龙连接器。将接头的棒插入一条聚氨酯管的长度(OD:4 mm,ID:2.5 mm)。将聚氨酯管直接插入其中一个电磁阀中。
    3. 将 23 G、1/2" Luer 存根连接到注射器上,并将其插入一根短(3-4 厘米)的管道(OD: 0.06",ID: 0.02")。将该管的开端放入超纯水的储液罐中,然后向注射器中注入超纯水。
    4. 编号微流体装置的每个控制通道,如图5所示。对于每个通道(不包括未加注水的控制通道 1 到 3),找到相应的管道(连接到电磁阀),并将金属销插入连接到注射器的管的导管的打开端。将水注入控制通道管,直到加满一半长度。
    5. 从注射器上断开油管,并将不锈钢接头销插入微流体装置的相应孔中。对所有控制通道重复上述步骤。
    6. 使用控制接口打开所有电磁阀。这将对控制通道管内的流体加压,迫使其进入微流体装置,并关闭设备内所有基于膜的阀门。图6给出了器件内开闭膜的例子。
  2. 将未冷却试剂连接到设备
    1. 对于每个未冷却的试剂,切一段长度的油管(OD:0.06",ID:0.02"),将储液罐出口连接到微流体设备入口。
    2. 取油管的一端,并将其插入储液罐中,确保油管到达储液罐底部。应拧紧储油罐管出口,以便实现气密密封。将不锈钢连接销(外径:0.65 mm,ID:0.35 mm,L: 8 mm)插入管材的开端。
    3. 将 23 G、1/2" Luer 存根连接到小型 (1 mL) 注射器的末端。将短长度的油管(OD: 0.06",ID: 0.02")添加到 Luer 存根中。将油管末端放入所需的试剂溶液中,用试剂填充注射器。
    4. 将不锈钢连接器销插入连接到注射器的聚氨酯管中,并用试剂填充管。当使用小反应体积时,试剂不会进入储液罐,油管本身将充当储液罐。断开注射器并将接头销插入微流体装置的流层入口孔之一。
    5. 使用压力调节器软件对每个储液罐施加压力,将试剂强制进入微流体装置。
  3. 将冷却流体连接到微流体装置
    1. 确保水冷却器和 Peltier 元件已打开,佩尔蒂埃的表面温度设置为 4°C。尽可能将冷却设置安装在微流体装置附近,将 Peltier 和设备入口之间的未冷却体积降至最低。
    2. 使用不锈钢连接器销(OD:0.65 mm,ID:0.35 mm,L: 8 mm)将 PTFE 管的开端连接到连接到其中一个储液罐的管(如第 4.2 节所述)。
    3. 将一个小注射器(1 mL)连接到一个Luer存根(23 G,1⁄2"),并连接在末端的管子短长度(OD:0.06",ID:0.02")。用待冷却试剂填充注射器(此处为IVTT反应溶液)。
    4. 通过连接管将 PEEK 管连接到注射器,对注射器施加恒定压力,迫使试剂通过 PEEK 管进入 PTFE 管。断开 PEEK 管与注射器的连接,并将其直接插入微流体装置的流通道入口之一。当通过压力调节器软件施加压力时,冷却的试剂将被迫进入微流体装置。

5. 实验

注:在进行实验之前,应完成协议第 3 节和第 4 节中详述的所有硬件和管道连接,并且所有试剂都应连接到设备。实验过程可分为四个不同的部分:1)微流体装置的装载,2)准备显微镜,3)装置的校准,以及4)执行实验。在整个研究中使用的自定义虚拟控制接口(参见图 7)通过材料列表作为补充资源提供)

  1. 加载微流体装置
    1. 将微流体装置与所有控制和流层管连接到显微镜阶段,并关闭孵化器上的任何开口。将培养箱的环境温度设置为 29°C。在开始实验之前,确保冷却系统已打开并设置为 4°C。
    2. 确保所有流量和控制通道都加压。将控制通道 1-3 的压力设置为 1 bar,在 3 bar 处设置控制通道 9-29 的加压控制通道。试剂要求使用压力调节器软件将压力施加到储液罐中,压力在20至100 mbar之间。
    3. 使用其中一种试剂从微流体装置中取出空气。关闭设备出口(加压控制通道 29),同时对控制通道 1-3 和 15-28 泄压。然后有选择地对多路复用器的控制通道进行减压,使选定的试剂流入设备。使用显微镜监测空气的去除情况。
      注:如果试剂未正确加载到设备中,或者未去除气泡,则压力可增大至 350 mbar。
    4. 确保所有试剂正确流动,无需引入空气 - 使用控制软件中的Flush功能。通过首先装载荧光和通过单个试剂监测其位移,可以简化对流体流动的监测。
  2. 准备显微镜
    1. 使用显微镜,在微流体装置内定位任何兴趣点(每个反应器内的单个点就足够了),并存储其坐标。这些点将在校准和实验过程中进行成像。
      注:在控制软件中包含的校准和实验过程中,显微镜被指示定期捕获先前存储的坐标下的图像。为此,控制软件与显微镜软件通信,通知它记录新的图像。此通信对于每个显微镜设置都是独一无二的,因此此功能已在提供的软件界面中进行了修改。提供虚拟可执行文件,最终用户可以对其进行修改,以便与自己的显微镜系统兼容。
  3. 校准微流体装置
    1. 通过执行校准协议,确定单个进气步(通过蠕动驱动控制通道 15-17(包括 6 个 MODBUS 命令)从每个反应器中置换的流体体积在软件包中提供。
    2. 在控制软件中设置以下数据字段:洗脱缓冲通道、荧光通道、稀释周期数(默认为 10 稀释)、流入步数(默认为 15 个步骤)、混合循环数(默认值为 4 个循环),混合周期之间的时间(默认值为 0 秒)。按"执行校准实验"启动校准。
      注:在校准过程中,所有反应器都装有荧光酸,并记录图像。随后,在将洗脱量计量到反应器中(基于设定的流入步数)时进行一系列稀释,从而取代荧光。彻底混合后,拍摄新的图像。此过程重复为设置的稀释周期数
    3. 完成校准后,按照控制软件提供的步骤,完成校准实验的分析。
      注:该分析将根据每个稀释周期记录的荧光降低率,为用户提供每个反应器的刷新率。此值指示由设置流入步数置换的反应堆体积的分数。反过来,此值将在实验期间使用,以确定需要多少流入步骤来取代特定的反应器体积。
  4. 执行实验
    1. 在虚拟控制接口中设置所需实验所需的值。关键是刷新分数 [%],它确定每个实验周期的反应堆体积置换,应设置在 15% 到 40% 之间。
      注: 特定实验协议将确定在启动实验之前应设置控制接口的哪些字段。需要一些小编码来适应控制接口,以便进行新颖的实验。
    2. 通过按控制界面中的"执行实验"按钮启动实验协议。
      注:未更改,所提供的软件启动一个简单的蛋白质表达。反应堆1和8用作控制,而反应堆2-7容纳相同的实验。在这里,75%的反应堆体积包括IVTT溶液,25%是超纯水或2.5 nM线性DNA溶液。稀释每15分钟发生一次,30%的反应堆体积被稀释后移位。图像记录在每个稀释周期的末尾。

6. 数据分析

注:已提供脚本用于分析图像(参见补充文件或材料表),使用"bfopen"分析包,这是审查'.nd2'文件所必需的(由我们的显微镜设置)。

  1. 运行分析脚本"校准脚本.m",一旦提示选择所需的".nd2"文件。将显示单个反应器图像,可确定正确的图像强度。使用滑块优化图像强度,使微流体通道的边缘清晰可见。
  2. 将显示反应堆的图像。在此图像中,选择应确定荧光强度的反应堆通道内的区域。
    注:每个反应器的荧光强度,对于每个记录的图像将确定与结果显示在一个简单的绘图,允许结果的可视化。

Representative Results

为了证明多层微流体平台对IVTT实验进行的有效性,所述设置用于表达deGFP蛋白。实验在市售的30种IVTT反应混合物中进行,包括所有必要的转录和翻译成分,辅以反应基质和DNA模板。实验在29°C的温度下进行;一种温度,对蛋白质的IVTT表达最最佳。

微流体装置拥有9个独特的入口,其中4个在实验中被利用。第一种含有商业上获得的IVTT反应混合物。IVTT反应混合物容纳成功表达蛋白质所需的所有组分,然而,在加载到微流体装置之前,将纯化的GamS添加到反应混合物中,最终浓度为1.3μM。在进行实验时,添加 GamS 蛋白有助于最大限度地减少线性 DNA 物种的降解。关键是,IVTT混合物被注射到聚四氟乙烯(PTFE)管中,盘绕到表面温度为4°C的Peltier元件上,在将溶液注入微流体装置之前冷却溶液;防止反应溶液在使用前降解。微孔聚醚酮(PEEK)管用于连接PTFE管,使佩尔蒂埃元件表面与微流体装置,减少IVTT反应混合物的体积不冷却。插入器件的第二个溶液包含在浓度为10 nM的浓度为10 nM的deGFP的线性DNA模板编码 - 溶解在超纯水中。第三种溶液,超纯水,在实验过程中具有多种用途。主要使用超纯水来确保所有反应器的置换体积相等,作为控制反应中DNA的替代品。此外,在设备校准期间,还使用超纯水稀释荧光,并在试剂之间切换时冲洗设备的死体积。插入器件的最终解决方案是执行初始设备校准所需的纯化 FITC-dextran 溶液 (25 μM)。DNA、水和荧光溶液被注射到管中(0.02"ID,0.06"OD),随后可以插入微流体装置的一个流入通道,根据协议第4.2节。因此,这些溶液被储存在29°C的整个实验。

微流体器件的控制通道的驱动是通过自定义控制软件实现的,其中每个控制通道都可以单独激活。长时间的 IVTT 反应的执行无法通过此手动过程实现,并且需要使用包含在控制软件中的自动协议。在为实验准备微流体装置时,可以使用类似的自动化协议来执行许多有用的过程:用新的试剂冲洗器件的死体积,在环形反应器内混合试剂,以及加载新的试剂进入反应器,同时取代电流溶液的同等体积。此外,还有两个复杂的过程:设备校准的传导,以及长期无细胞蛋白表达的执行。上述所有流程都可以轻松从主界面执行,同时还可以配置多个参数以改变特定过程设置,如流入通道、流入量和混合持续时间。

由于微流体设备制造过程中的压力波动和缺陷,单个喷射循环中置换的流体体积可能因设备而异。因此,在进行IVTT实验之前,确定每个注入周期的移位反应器体积(刷新分数)。此校准要求用荧光参考溶液填充所有八个反应器。在这种情况下,使用了纯化的FITC-dextran溶液(25μM)。随后,用超纯水稀释了10次。通过测量每个反应器的荧光每稀释循环的降低,确定了单个喷射周期中置换的流体量。在控制软件中,此值(刷新比率)被记录在IVTT实验期间使用。至关重要的是,为了考虑到整个装置的流速变化以及各个反应器体积的差异,确定并存储每个单独的反应器的刷新比率。使用构成控制软件一部分的"执行校准"程序自动执行反应器的填充和稀释顺序。校准实验的结果如图8所示。

最复杂的预编程过程执行一个长时间的IVTT实验,允许用户启动实验,然后允许它无人值守地运行,直到完成。在整个实验中,1号和5号反应堆被用作空白,在稀释过程中只向反应堆中添加水。反应器2和6用作负控制,只含有IVTT反应溶液和超纯水。其余反应器(3、4、7和8)含有IVTT反应溶液和2.5 nM的deGFP基因线性DNA编码。反应堆的初始化是通过在用超纯水置换25%的反应堆体积之前,用IVTT反应溶液完全填充所有反应堆(不包括1和5)来实现的。此后,开始定期向反应器中注入试剂。实验结果表明,每14.7分钟向反应器注入一次新的试剂,每个稀释周期中,30%的反应堆体积被置换。每次注射的组成是,75%的注射液包括新鲜的IVTT溶液,而其余25%由DNA或超纯水组成。每次注入新的试剂后,反应器被连续混合,然后用显微镜记录每个反应器的荧光图像。随后,该反应被允许连续运行68个周期,导致实验持续时间为16.5小时。图9给出了这个实验的结果。

在进行长时间的IVTT实验时,有两个主要原因导致反应失败;将空气引入微流体装置或降低IVTT反应溶液。微流体装置内空气的发生通常是流入溶液中存在小气泡的直接结果,这些气泡随后被注入微流体装置。进入设备后,空气的存在会抑制流体的正常流动,从而不再周期性地刷新反应,导致反应器环内形成批量反应。在某些情况下,通过试剂的反复冲洗,空气会慢慢从设备中去除,之后反应会按预期继续(如图9所示)。在其他情况下,空气仍然被困住,只能通过中止实验并随后对微流体装置的流层施加连续(高压)来清除,类似于协议第 5.1 节中描述的灌装过程。在我们的实验中,细胞流沙度储存在PEFE管中,冷却至4°C的Peltier元素上。这两种措施都有助于限制IVTT反应溶液随时间的降解,惰性PTFE管确保油管和反应溶液之间的有限相互作用,而低温则保留了功能(生物)分子执行 IVTT 所需的组件。如果反应溶液的降解发生 - 由于反应溶液和存储环境之间的冷却不足或不希望的相互作用 - 那么,这将在实验上表现为蛋白质的逐渐减少表达随着时间的推移。一旦降解,IVTT反应溶液就无法恢复,应准备新的实验。

Figure 1
图 1.执行连续 IVTT 反应所需的硬件设置。A) 硬件设置的原理图。B) 本手稿中使用的设置照片。实施用于连续 IVTT 反应的多层微流体装置需要广泛的硬件设置来调节流量压力、激活控制通道、热和冷反应以及试剂、存储流体和在设备期间成像实验。实验在30°C的温度下进行,这是通过将显微镜放在设定在此温度的培养箱内实现的。为了防止IVTT反应溶液的变质,它储存在PTFE管中,盘绕在Peltier元素的冷面上。Peltier 元件的温度设置为 4°C,使用水冷却器和水块来保持此温度。不需要冷却的试剂储存在显微镜培养箱外的液体储液罐中。恒定压力通过计算机控制的压力调节器施加到这些储液罐上。通过这种方式,流体通过储液罐的出口管被强制,该出口管直接连接到微流体装置的流入通道。微流体装置的每个控制通道都连接到气动阀。整个阀门阵列处于恒定压力之下。打开阀门,允许将气动阀连接到微流体装置的控制通道的油管内的流体加压,从而打开和关闭微流体装置内的 PDMS 膜。气动阀通过用户界面打开和关闭,该用户界面命令现场总线控制器(未显示)打开和关闭特定的气动阀。图改编自耶勒斯瓦拉普等人22。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图 2.气动阀设置和控制通道连接概述。显示一个 8 阀阵列,该阵列与安装在阀 1、2 和 3 上的三个控制通道连接。压缩空气可通过 1/4" 管材供应到阀阵列。对于控制通道的驱动,使用两个压力:1 bar 用于低压控制通道(1、2 和 3)和 3 bar 用于较高压力控制通道(9 到 30,此处未显示)。管子可以充满超纯水,并使用不锈钢连接器销插入控制通道入口之一。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图 3.商业流量压力调节器和储层系统的概述。市售压力调节器用于将流体注入多层微流体装置的流层。将压力控制器连接到计算机允许调节用于执行流体喷射的压力。试剂可储存在与压力调节器直接相连的储液罐中。向储液罐施加压力会通过出油管迫使液体流出储液罐。此出口管可使用不锈钢连接器销直接连接到微流体装置的流体入口之一。如果试剂体积无法到达储液罐,则出口管充当试剂的储液罐。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图 4.用于冷却反应试剂的冷却系统概述。(左)隔离冷却设置和(右)冷却设置放置在显微镜内并连接到微流体装置。在注射到微流体装置之前,Peltier 元素用于冷却 IVTT 反应溶液。试剂储存在PTFE管中,盘绕在Peltier元件的冷面上。一段 PEEK 管用于将冷却的流体转移到微流体设备,具有较小的内部直径 (0.005"),可最大限度地减少试剂体积不再冷却。除了盘绕的PTFE管外,还放置了热敏电阻,允许在Peltier元件表面进行实时温度监测。施加到 Peltier 的电压被设置为 Peltier 的表面温度保持在 0 °C 和 4 °C 之间。为了去除 Peltier 元素产生的多余热量,Peltier 的热面被放置在水冷却块上,并添加无硅散热器润滑脂,确保两个面之间的最佳传热。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图 5.微流体装置设计概述。用于连续IVTT反应的微流体流反应器由8个反应环组成,每个环的体积为10.7 nL。九个入口允许九种独特的反应溶液流入设备。24 个控制通道调节设备内的流体流动。控制通道 9 到 14 形成多路复用器。这些控制通道应始终加压,以抑制流体流入设备。两个控制通道的减压同时允许单个试剂流入。控制通道 15、16 和 17 用于以受控方式将试剂 Perpera 泵入设备。控制通道18至25,每个控制装置内8个反应器之一的进气。控制通道26可以关闭冲洗通道,从而迫使流体进入反应器。控制通道27有助于对反应器进行均匀填充。控制通道 28 和 29 分别调节环形反应器插座和唯一的装置插座。最后,控制通道1、2和3用于在环形反应器内蠕动泵送液体,从而混合试剂。这种微流体装置和图的设计均采用奈德霍尔特迈尔等人29。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 6
图 6.微流体装置内的膜基阀。 A) 微流体装置内的流道。在后台可以看到两个控制通道。这些通道没有加压,因此阀门是打开的(流体可以流动)。B) 与流层通道相交的两个控制通道已加压,关闭阀门(即流体流动受阻)。控制通道加压后,分离流层通道和控制层通道的薄 PDMS 膜向上偏转(控制层位于流层下方),从而关闭流层通道。流层通道的舍入对于确保偏转膜完全关闭流道至关重要。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 7
图 7.用于控制微流体设备的用户界面。在整个研究中,一个自定义控制接口用于控制微流体器件内的流体流动。该接口允许用户单独激活每个控制通道(编号为 1-3 和 9-29),或执行复杂的协议,从而冲洗和加载试剂、校准微流体设备以及执行实验。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 8
图8。校准实验的结果。在校准实验期间,反应器充满荧光(25 μM FITC-Dextran),之后记录荧光强度。随后,一系列稀释,其中一组进流步骤(15)用于将超纯水注入反应堆。每次稀释后,将试剂混合,并测量荧光。稀释的荧光强度降低,表明为设定的流入步数而置换的反应器环的体积;一个称为刷新比的值.A)所有八个反应器的平均强度和标准偏差以红色显示,单个强度痕迹以灰色显示。B) 每个稀释步骤的平均刷新比率和标准偏差以红色显示。每个反应器的单独刷新比率显示为灰色。可以看出,8个反应堆中有7个表现出非常相似的行为,然而一个反应堆在第七次稀释周期后显示刷新率的波动。这突出表明,每个反应器都需要独特的刷新比率,而不是使用平均刷新率将试剂注入反应器。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 9
图 9.表达deGFP蛋白的IVTT实验结果。长时间的IVTT反应开始,使30%的反应堆体积每14.6分钟被移位。反应在终止前可以运行超过16小时。微流体装置的两个反应器被用作空白,在整个实验过程中,只有超纯水通过反应堆(反应器1和5)。所有其他反应器包括75%的IVTT反应溶液和25%的超纯水(反应器2和6)或2.5 nM线性DNA模板编码表达deGFP(反应器3,4,7和8)。在添加DNA的所有四个反应器中,都有明显的deGFP表达。四个反应器中有三个提供类似的荧光强度,一个反应器显示较低的荧光信号。这可能是由于流量差异导致进入反应堆的DNA较少,或者由于反应堆尺寸的变化。14小时后,含有DNA的反应堆信号突然增加。这是由气泡进入微流体装置的流动层引起的,大概来自其中一个流入溶液。微流体装置中的空气捕获会显著限制流体通过通道的流动,因此,在空气通过之前,不得向反应器中添加或去除新的试剂。恢复流动后,实验将恢复到以前的荧光强度。请点击此处查看此图的较大版本。

补充文件。 请点击此处下载这些文件。

Discussion

介绍了一种基于PDMS的多层微流体装置,并证明了其长期维持IVTT反应的能力。尽管该技术非常适合此特定示例,但可以想象,该技术可用于许多其他应用。对流体流动的额外控制 - 与持续补充反应试剂,同时去除(按)产品的能力 - 是连续合成反应、调查各种动态行为和同时单一反应的多种变异的传导。

尽管基于 PDMS 的设备的制造过程相对简单,但使用它需要大量的硬件设置。包括阀门阵列、压力调节器、压力泵、孵化器和冷却单元,从制造到使用的过渡不是基本阶段,需要大量的初始投资。此外,能否持续设置和成功使用这些器件进行实验,需要大量的时间投入;本手稿旨在解决的一点。但是,一旦就位,整个设置可以修改为一系列的目的。此外,硬件设置包括许多模块化元件,每个模块都可以扩展,以便采用更复杂的微流体器件设计。此外,模块化设计允许通过功能类似的替代方案替换硬件组件,这样用户不仅限于此处描述的特定设置48,49

单个设备之间以及外部条件(如压力波动)中的可变性可能导致使用这些设备执行实验时不准确。为了解决这个问题,应在每次实验之前对系统进行校准,为每个反应器提供唯一的刷新率。虽然校准解决了设备到设备以及实验到实验的变化,但它是一个耗时的过程,并非完美无缺。当暴露于相同的压力时,粘度不同的流体不会以相同的速率流动,因此使用多个试剂进行校准可能不会产生相同的刷新率。通过使用三个控制通道将试剂蠕动泵入微流体装置,而不是仅通过改变提供的压力来调节流量,可以减轻这种效应。在粘度差异非常大的情况下,作为最后手段,可以通过执行多个校准实验,为每个试剂实现独特的刷新率。

使用蠕动泵将试剂注入微流体装置,会削弱使用粘度不同的溶液的影响,但它也造成了次要问题。使用离散步骤将流体泵入微流体装置,意味着注入到单个反应器的分辨率受执行单个泵循环时注入的体积的限制。在我们的研究中,这个值(在校准期间确定)大约等于1%,表明单个泵循环会取代大约1%的反应堆体积(约0.1 nL)。因此,取代30%的反应堆体积需要执行30个泵循环,23个泵周期的IVTT反应溶液被添加,只有7个泵周期的DNA或超纯水被添加。虽然我们的研究已经足够了,但当尝试添加大量独特的试剂、使用较低的刷新分数或向反应器中添加更小的单个试剂体积时,其他实验协议可能会遇到问题。在这种情况下,微流体装置设计可以调整,以提供更大的体积反应器。尼德霍尔特迈尔等人36日报道了这一例子。

至关重要的是,本手稿中概述的装置允许反应持续很长时间,从而产生稳态转录和翻译率。通过定期将新试剂注入反应器,并去除反应(按产品),反应是持续的,可以监测复杂的动态行为。通过这种方式,创建了一个平台,在一定程度上模仿了蜂窝环境。此外,该平台通过调整注射之间的周期和喷射的具体组成,能够探索系统动力学。因此,这些多层微流体器件是显示复杂动态行为的新型合成网络的特征和优化的有力工具。

Disclosures

提交人宣称,他们没有相互竞争的经济利益。

Acknowledgments

这项工作得到了欧洲研究理事会、ERC(BioCircuit项目)的支持,这是荷兰科学研究组织提供的NWO-VIDI赠款(NWO,723.016.003),来自教育、文化和科学部的资助(Gravity计划, 024.001.035 和 024.003.013), 人类前沿科学计划资助 RGP0032/2015, 欧盟 Horizon 2020 研究和创新计划下的欧洲研究理事会 资助 723106, 以及瑞士国家科学基金会赠款200021_182019.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Acetone VWR 20063.365
AZ 40 XT Merck KGaA (Darmstadt, Germany) - Positive Photoresist
AZ 726 MIF Developer Merck KGaA (Darmstadt, Germany) - Developer Positive Photoresist
Isopropanol Merck KGaA (Darmstadt, Germany) 109634
Microscope slides VWR ECN 631-1550
mr Dev 600 Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany) - Developer Negative Photoresist
Silicon Free Heat Sink Grease Circuit Works CW7270 Thermal Compound
Silicon wafers Silicon Materials - <1-0-0> orientation, 100 mm diameter, 525 µm thickness
SU-8 3050 Microchem Corp. (Newton, MA) - Negative Photoresist
Sylgard 184 Elastomer Kit (PDMS) The Dow Chemical Company 01317318
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Sigma-Aldrich 448931-10G
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
4 channel digital input/output module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-504 8x
Camera lens The Imaging Source -
Compression fitting Koolance, Inc. FIT-V06X10 Fitting for tubing with 6mm ID and 10mm OD. 4x
Controller end module WAGO Kontakttechnik GmbH 750-600
Device connecting tubing Saint-Gobain Performance Plastics AAD04103 0.02" ID, 0.06" OD, Tygon Tubing (ND-100-80)
Device connector pins Unimed SA (Lausanne, Switserland) 200.010-A AISI 304 tubing, 0.35mm ID, 0.65mm OD, 8mm L
Ethernet Controller WAGO Kontakttechnik GmbH 750-881
Female bus connector Encitech DTCK15-DBS-K 15 pole female bus connector
Fluid reservoirs Fluigent Fluiwell-4C
Fluigent pressure system Fluigent MFCS-EZ 0 - 345 mbar
Hg short arc lamp Advanced Radiation Corporation - 350W
Hot plate Torrey Pines Scientific HP61
Inverted microscope Nikon Instruments Eclipse Ti-E
LabVIEW Software de Greef Lab, Eindhoven University of Technology https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Liquid coolant Koolance, Inc. LIQ-705CL-B
Luer stubs Instech Laboratories, Inc. LS23
Male Luer to barb connectors Cole Parmer 45505-32 3/32" ID
Matlab Software de Greef Lab, Eindhoven University of Technology https://github.com/tfadgreef/Microfluidic-Device-Control-Software
Microcamera The Imaging Source DMK 42AUC03
Microscope camera Hamamatsu Photonics OrcaFlash4.0 V2 (C11440-22CU)
Orbital shaker Cole Parmer EW-513000-05
Oven Thermo Scientific Heraeus T6P 50045757
Oxygen plasma asher Quorum Technologies K1050X
PDMS puncher SYNEO Accu-Pucnh MP10
PEEK tubing Trajan 1301005001-5F 0.005" ID, 1/32" OD, Red
Peltier element European Thermodynamics APH-127-10-25-S
Peltier temperature controller Warner Instruments CL-100
Photomask CAD/Art Services, Inc. -
Photomask Design Maerkl Lab, EPFL https://zenodo.org/record/886937#.XBzpA8-2nOQ
Pneumatic valve array FESTO - 1x 22 valve array and 1x 8 valve array, Normally closed valves.
Power adapter Koolance, Inc. ADT-EX004S 110/220V AC Power Adapter
PTFE tubing Cole Parmer 06417-21 #24 AWG Thin Wall PTFE
Punching pin SYNEO CR0320245N21R4 OD: 0.032" (0.8128 mm), ID: 0.024" (0.6090 mm)
PVC Tubing Koolance, Inc. HOS-06CL 6 mm ID, 10 mm OD
Single edge blades GEM Scientific -
Soft tubing Fluigent - Supplied with fluid reservoirs. (1 mm ID, 3mm OD)
Spin coater Laurell Technologies Corporation WS-650MZ-23NPPB
Stereo microscope Olympus Corporation SZ61
Thermistor cable Warner Instruments TA-29 Cable with bead thermistor
UV exposure system ABM, USA - Near UV Exposure System, 350W
Vacuum pump Vacuumbrand GmbH MD1C
Water cooled cold plate block Koolance, Inc. PLT-UN40F
Water cooler Koolance, Inc. EX2-755
Weighing scales Sartorius M-prove

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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