Bioengineering
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
En Mikrofluidic-platform med flere lag til overledning af forlænget celle frit genekspression
Chapters
Summary October 6th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Fremstillingsprocessen af en PDMS-baseret, flerlags, mikrofluidisk enhed, der tillader in vitro transkription og oversættelse (ivtt) reaktioner, der skal udføres over længere perioder er beskrevet. Desuden gives der en omfattende oversigt over den hardware og software, der kræves for at automatisere og vedligeholde disse reaktioner for længerevarende varigheder.
Transcript
Prototyping syntetiske gennetværk er stærkt forbedret ved brug af celle-fri genekspressionssystemer. Vores protokol beskriver fremstillingsprocessen for mikrofluidisk flowreaktor med flerelag og viser, at en sådan anordning kan bruges til langvarig cellefri ekspression af GFP. Cellefrie proteinudtryk i kombination med mikrofluidiske flowreaktorer udgør den hurtige prototypingplatform til design af syntetiske biologiske anordninger.
Hele dette setup er meget alsidigt og kan tilpasses til ledning af alle biokemiske eller kemiske reaktioner, der kræver høje niveauer af kontrol. Det er afgørende og vanskeligt at sikre stabiliteten af den cellefrie reaktionsløsning. Sørg for at fokusere på at give tilstrækkelig køling og udnytte de slanger, der er angivet i denne protokol.
Fremstilling og forberedelse af forsøgsplatformen kræver tilslutning af mange individuelle komponenter, en proces, der kan være vanskelig at følge uden visuelle hjælpemidler. Til at begynde med skal du følge med i den medfølgende tekstprotokol for at fremstille den mikrofluidiske anordning og for at opsætte den pneumatiske regulering af kontrol og flowtryk, som vil blive anvendt til at kontrollere de ventiler, der er afgørende for denne anordning. For at opsætte off-chip køling, begynde med at spole en længde ptfe slanger på den kolde side af en Peltier element og sikre spolen med tape.
Sørg for, at den ene ende af PTFE-slangen er forbundet med reservoirer i flowlagstrykkontrolsystemet, og at den anden ende ikke rager mere end en centimeter ud af Peltiers overflade. Næste indsætte en fem til 10 centimeter længde PEEK slanger i den fremspringende ende af PTFE slange. Påfør en tilstrækkelig mængde termisk forbindelse på peltierelementets varme side, og placer det på vandblokkens kolde plade.
Sørg for, at slangen, Peltier-elementet og køleblokken altid er i direkte kontakt med hinanden. Tilslut derefter Peltier-elementet til temperaturregulatoren ved hjælp af et serielt busstik, så den spænding, der leveres til Peltier, kan reguleres. Derefter sikkert placere en thermistor på Peltier overfladen og tilslut dens output til temperaturregulatoren.
Efter at have tændt vandkøleren, tilpasse spændingen leveres til Peltier, indtil temperaturen er stabil ved fire grader Celsius. For hver kontrolkanal af den mikrofluidiske enhed skære en længde af standard slange, der er en meter lang. I den ene ende, indsætte stiften af en 23 gauge, en halv tomme Luer stub og i den anden ende indsætte en rustfrit stål tilslutningsstift.
Tilslut Luer stub til en mandlig Luer 3/32 tommer pigtråd nylon stik og indsæt modhager af stikket i en længde af polyurethan slanger. Sæt derefter denne polyurethanslange direkte ind i en af magnetventilerne. Næste vedhæfte en 23 gauge halv tomme Luer stub til en sprøjte og indsætte dette i en tre til fire centimeter lang stykke standard slange.
Placer den åbne ende af denne slange i et reservoir af ultra rent vand og fyld sprøjten med ultra rent vand. Nummerer hver kontrolkanal for den mikrofluidiske enhed som vist her. For kanal fire til 29 skal du finde den tilsvarende slange og sætte metalstiften i den åbne ende af slangen, der er fastgjort til sprøjten.
Injicer derefter vand i kontrolkanalens slanger, indtil halvdelen af længden er fyldt. Derefter skal du tage slangen ud af sprøjten og sætte stikket i rustfrit stål ind i det tilsvarende hul i den mikrofluidiske enhed. Gentag dette trin for alle kontrolkanalerne.
Nu skal du bruge kontrolgrænsefladen til at åbne alle magnetventilerne. Dette vil presse væsken i kontrolkanalen slange tvinger det ind i mikrofluidic enhed og lukke alle de membran-baserede ventiler i enheden. For hver af de ikke-afkølede reagenser skæres en meter længde af standard slange til at forbinde reservoiret stikkontakt til den mikrofluidiske enhed indløb.
Tag den ene ende af slangen og sæt den i beholderen for at sikre, at slangen når bunden af beholderen. Beholderens slangeudgang skal strammes, så der opnås en lufttæt forsegling. Sæt derefter en rustfri forbindelsesstift ind i den åbne ende af slangen.
Dernæst vedhæfte en 23 gauge halv tomme Luer stub til slutningen af en en milliliter sprøjte. Tilføj en kort længde af standard slange til Luer stub. Slangen sættes i den ønskede reagensopløsning, og fyld sprøjten med reagenset.
Sæt derefter stikket i rustfrit stål i polyurethanslangen, der er forbundet med sprøjten, og fyld slangen med reagenset. Når der skal bruges små reaktionsmængder, kommer reagenset ikke ind i beholderen, og selve slangen fungerer som reservoir. Når sprøjten er færdig, skal du tage stikket ud og sætte stikstiften i et af mikrofluidiske enheders indløbshuller i strømlaget.
Tryk derefter på hver af beholderne ved hjælp af trykregulatorsoftwaren for at tvinge reagenserne ind i mikrofluidisk anordning. Sørg for, at vandkøleren og Peltier-elementerne er blevet tændt med peltierens overfladetemperatur indstillet til fire grader Celsius. Monter køleopsætningen så tæt på mikrofluidisk enhed som muligt for at minimere den ukoolerede lydstyrke mellem Peltier og enhedens indløb.
Derefter tilsluttes den ene milliliter sprøjte til en 23 gauge halv tomme Luer stub med en kort længde af standard slanger fastgjort til enden. Tegn i det, der skal afkøles reagens, for at fylde sprøjten. Derefter tilsluttes PEEK-slangen til sprøjten via binderøret, og tryk konstant på sprøjten, der tvinger reagenset gennem KIG-slangen og ind i PTFE-slangen.
Til sidst frakobles PEEK-slangen fra sprøjten, og sæt den direkte ind i mikrofluide enhedens indløb i strømkanalen. Når trykket er påtryk, vil det afkølede reagens blive tvunget ind i mikrofluidic enheden. Sørg for, at mikrofluidisk anordning er sikret på mikroskopstadiet med alle kontrol- og flowlagsslange fastgjort, og luk eventuelle åbninger på inkubatoren.
Næste sæt den omgivende temperatur af inkubatoren til 29 grader Celsius. Derefter sikre, at kølesystemet er blevet tændt og er indstillet til fire grader Celsius før påbegyndelse af eksperimentet. Kontroller, at det tryk, der påføres flowkanaltrykregulatoren, er indstillet til 800 millibar, og ved hjælp af softwaren skal du indstille udgangstrykket for hver enkelt flowkanal til mellem 20 og 100 millibar.
Kontroller, at tryk på kontrolkanalen magnetventiler er en bar for kanaler en gennem otte og tre bar for kanal ni til 29. Luk derefter enhedens udløb ved at trykke på kanal 29 og samtidig trykke kontrolkanalerne en til tre og 15 til 28. Derefter skal du trykke på styrekanalerne for multixeren selektivt, så et enkelt valgt reagens kan strømme ind i enheden.
Brug mikroskopet til at overvåge fjernelsen af luft og sørg derefter for, at alle reagenser flyder korrekt uden at indføre luftbobler. Ved hjælp af den medfølgende softwarepakke skal du konfigurere de datafelter, der er relateret til kalibreringsprocessen, som beskrevet i den medfølgende tekstprotokol. Derefter bestemmes den væskevolumen, der forskydes fra hver reaktor under et enkelt indløbstrin, ved at udføre kalibreringsprotokollen.
Følg sammen med de trin, der præsenteres af kontrolsoftwaren for at fuldføre analysen af kalibreringseksperimentet og for at bestemme opdateringsforholdet for hver ringreaktor i mikrofluidic-enheden. Endelig skal du indstille de nødvendige værdier for det ønskede eksperiment inden for den virtuelle kontrolgrænseflade. Start forsøgsprotokollen ved at trykke på eksperimentknappen i kontrolgrænsefladen.
Under et kalibreringsforsøg fyldes reaktorerne med en fluorophore, hvis intensitet registreres efter hver fortynding. Faldet i fluorescensintensiteten pr. fortynding afslører mængden af reaktorringen, der er forskudt for det indstillede antal indstrømstrin. Denne diskenhed kaldes opdateringsforholdet.
Det gennemsnitlige opdateringsforhold og standardafvigelsen vises for hvert fortyndingstrin i rødt. Syv af de otte reaktorer viser meget lignende adfærd, men en reaktor viser udsving efter den syvende fortyndingscyklus. Dette understreger behovet for unikke opdateringsforhold for hver af reaktorerne.
Den langvarige in vitro-udskrift og oversættelsesreaktion vist her havde 30% af reaktoren volumen fordrevet hver 14,6 minutter. To reaktorer af mikrofluidic anordningen, hvor de anvendes som emner. Alle de andre reaktorer bestod af 75% in vitro transskription og oversættelse reaktion løsning og 25% af enten ultra rent vand eller 2,5 nanomolar lineære DNA skabeloner kodning for udtrykket af deGFP protein.
I alle fire reaktorer, hvor DNA blev tilføjet, var der klart deGFP udtryk. En reaktor viser et lavere fluorescenssignal. Dette kan skyldes forskelle i flow, hvilket resulterer i mindre DNA ind i reaktoren eller på grund af variationer i reaktorens dimensioner.
Efter 14 timer ses der en pludselig stigning i signalet fra de reaktorer, der indeholder DNA. Dette skyldes en luftboble, der trænger ind i mikrofluidic-enhedens flowlag. Ved genoptagelse af flowet vender eksperimentet tilbage til sin tidligere fluorescensintensitet.
Cellefrie reaktionsopløsninger forringes over tid, medmindre de er tilstrækkeligt afkølet, hvilket gør den køleproces, der er beskrevet i denne protokol, af afgørende betydning. På grund af platformens alsidighed kan en række biokemiske og kemiske reaktioner udføres på en præcis og kontrolleret måde. Anvendelsen af mikrofluidiske flowreaktorer har fremskyndet successive design bygge test cykler til prototyping dobbelt genetiske kredsløb.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
