DNA-sekvens genkendelse af DNA Primase ved hjælp af Primase profilering med høj gennemløb

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Protein binding microarray (PBM) eksperimenter kombineret med biokemiske assays forbinder bindende og katalytiske egenskaber af DNA primase, et enzym, der syntetiserer RNA primere på Template DNA. Denne metode, der er udpeget som et højt gennemløb primase profilering (HTPP), kan bruges til at afsløre DNA-bindende mønstre af en række enzymer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ilic, S., Cohen, S., Afek, A., Gordan, R., Lukatsky, D. B., Akabayov, B. DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling. J. Vis. Exp. (152), e59737, doi:10.3791/59737 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

DNA primase syntetiserer korte RNA primere, der initierer DNA-syntese af Okazaki fragmenter på den tilbagestående streng ved DNA-Polymerase under DNA-replikering. Bindingen af prokaryote dnag-lignende primases til DNA sker ved en specifik trinucleotid genkendelsessekvens. Det er et afgørende skridt i dannelsen af Okazaki fragmenter. Konventionelle biokemiske værktøjer, der anvendes til at bestemme DNA-genkendelse sekvens af DNA primase giver kun begrænset information. Ved hjælp af en mikroarray baseret bindings test med høj gennemløb og på hinanden følgende biokemiske analyser er det blevet påvist, at 1) den specifikke bindende kontekst (flankensekvens af anerkendelses stedet) påvirker DNA-primases bindende styrke til dens skabelon DNA, og 2) stærkere binding af primase til DNA giver længere RNA primere, hvilket indikerer højere processivitet af enzymet. Denne metode kombinerer PBM og primase Activity assay og er udpeget som høj gennemløb primase profilering (HTPP), og det giver mulighed for karakterisering af specifikke sekvens genkendelse af DNA primase i hidtil uset tid og skalerbarhed.

Introduction

HTPP gør brug af DNA binding microarray teknologi kombineret med biokemisk analyse (figur 1) til statistisk at identificere specifikke funktioner i DNA-skabeloner, der påvirker den enzymatiske aktivitet af DNA primase. Derfor giver HTPP en teknologisk platform, der letter et videnspring i marken. De klassiske værktøjer, der anvendes til at bestemme primase anerkendelse sites ikke har evnen til at give massive mængde data, mens HTPP gør.

PBM er en teknik, der rutinemæssigt anvendes til at bestemme de bindende præferencer for transkriptionsfaktorer til DNA1,2; Det er dog ikke egnet til påvisning af svag/forbigående binding af proteiner til DNA. I modsætning til Universal PBM, der giver oplysninger om gennemsnitlig proteinbinding specificitet til alle mulige sekvenser bestående af otte base par, er HTPP baseret på biblioteket af enkelt-strandede DNA-skabeloner, der omfatter unikke sekvens elementer. Sådanne DNA sekvens elementer involverer titusinder kort (få snesevis af BP) genomiske sekvenser, samt computationelt designede DNA-sekvenser beriget i visse DNA gentagne sekvens elementer til stede i genomet, som besidder forskellige gennemsnitlige GC indhold . En sådan tilgang med høj gennemløb gør det muligt på en systematisk, kvantitativ og hypotese drevet måde at fastslå de sekvens relaterede egenskaber, der er vigtige for primase binding og dens enzymatiske aktivitet3. Navnlig er den vigtige forbindelse mellem primase-DNA-bindende præferencer (moduleret af DNA-sekvenser, der flanserer specifikke Tri-nucleotid-bindingssteder) og primase processivitet blevet identificeret for dette enzymatiske system4.

Den nye teknologi blev anvendt til at revidere vores forståelse af primase anerkendelse sites selv for T7 DNA primase, der er blevet grundigt undersøgt5. Specifikt, re-undersøgelse af klassiske begreber, såsom DNA-anerkendelse sites af T7 DNA primase (som blev fastsat næsten fire årtier siden 6) ved hjælp af protein-DNA binding microarray (PBM) har ført til hidtil uset indsigt i funktioner relateret til den ledsage sekvens af disse anerkendelse sites3. Det blev forventet, at sekvenser ledsage Tri-nucleotid anerkendelse site af T7 DNA primase (5 '-GTC-3 ') vil være tilfældig. I stedet, vi fandt, at TG-rige flankerende sekvenser øge chancerne for T7 DNA primase at syntetisere længere RNA primere indikerer en stigning i processivitet.

Andre metoder, der kan anvendes til at studere DNA-bindende egenskaber af proteiner in vitro omfatter den elektroforetiske mobilitets Skift assay (EMSA)7, DNase I fodaftryk8, overflade-Plasmon resonans (spr)9, og sydvestlige blotting 10. disse er dog, lav-gennemløb metoder kun gælder for at undersøge et lille antal DNA-sekvenser. Desuden er præcisionen og følsomheden af nogle af disse teknikker (f. eks. EMSA) lav. På den anden side, in vitro udvælgelse11 er en teknik, der, på samme måde som PBM, kan bruges til identifikation af talrige bindende sekvenser. Men, lav affinitet sekvenser er normalt udelukket i de fleste anvendelser af in vitro udvælgelse; Derfor er denne fremgangsmåde ikke egnet til at opnå sammenlignelige bindings data for alle tilgængelige sekvenser. Den universelle PBM1,2 bruges primært til at karakterisere de bindende karakteristika af transkriptionsfaktorer fra prokaryoter og eukaryoter samt specifikke faktorer (f. eks. tilstedeværelsen af visse ligands, cofaktorer osv.), der kan påvirke denne interaktion12.

HTPP udvider PBM-applikationen til DNA-forarbejdnings enzymer ved at kombinere hidtil uset statistisk effekt med høj gennemløb med høj præcision for at give oplysninger om bindings sekvens konteksten. Sådanne data er endnu ikke opnået for primases og relaterede enzymer (der har svag/forbigående binding til DNA) på grund af førnævnte tekniske begrænsninger af andre tilgængelige teknikker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. design af mikroarray

Bemærk: DNA-sonder repræsenterer brugerdefinerede 36-nukleotidsekvenser, der består af anerkendelses stedet for T7 DNA primase (GTC), som ligger mellem to variable flankenregioner, efterfulgt af en konstant 24-nukleotidsekvens, der er bundet til et glas dias3. Vi brugte et 4 x 180.000 microarray format, som aktiverede spotting af hver DNA sekvens i seks replikater, tilfældigt fordelt på diaset.

  1. Design af DNA-bibliotek for primases med kendte genkendelses sekvenser
    1. Sørg for, at hver sekvens består af 60 nucleotider. Hold de første 24 nukleotider konstante (skal fastgøres til glaspladen). Variable regioner skal have følgende generelle form: (N)16GTC (n)17; hvor N repræsenterer enhver ønsket nukleotid.
    2. Designe flanken region for at løse et specifikt videnskabeligt spørgsmål (et eksempel på design er præsenteret i den følgende tekst). De flankende regioner kan udformes, så de indeholder specifikke egenskaber såsom gentagelses elementerne eller den specifikke symmetri.
      Bemærk: vi har oprettet otte kategorier af forskellige ledsage sekvenser bestående af to eller tre specifikke nukleotider: T og G (gruppe 1); T og C (gruppe 2) C og A (gruppe 3) A og G (gruppe 4) G, C og T (gruppe 5) C, T og A (gruppe 6) G, A og T (gruppe 7) G, A og C (gruppe 8). 2.000 forskellige sekvenser er designet til hver gruppe. Hver gruppe havde undergrupper af sekvenser med forskellige typer og forskellige antal sekvens gentagelser.
    3. Medtag et sæt negative kontrol sekvenser (mangler det specifikke bindingssted)4. Tilstedeværelsen af sådanne sekvenser gør det muligt at validere forekomsten af specifik binding i forsøget.
  2. Design af DNA-bibliotek for primases med ukendte genkendelses sekvenser
    1. Hvis genkendelses sekvensen er ukendt, Opret DNA-biblioteket ved at vælge sekvenser (med eller uden specifikke funktioner nævnt tidligere) fra genomet af den ønskede organisme (bakterier, svampe osv.).
  3. Design af microarray slide
    1. Køb brugerdefinerede slides (fx 4x180K, AMADID #78366) fra en kommerciel leverandør (for flere detaljer se tabel over materialer). Bestil hver sekvens i seks replikater, hvor hver replikat skal knyttes til et tilfældigt valgt sted på diaset.

2. primase DNA binding eksperiment

Bemærk: dagen før (eller mindst 2 timer før) PBM, klargør blokerings opløsningen [2% w/v skummetmælk i fosfatbuffer saltvand (PBS)] og rør den på en magnetisk omrører. Før brug filtreres opløsningen med et 0,45 μM filter. For at detektere den primase binding til DNA-strengene, skal der udføres flere trin i følgende rækkefølge.

  1. Blokering procedure
    1. Pre-våd microarray slide i en Coplin krukke med 0,01% v/v Triton X-100 i PBS (5 min ved 125 rpm på en lab rotator).
    2. Vask kort pakningen (også kaldet dæksedlen) med vand og ethanol og tør med trykluft.
    3. Saml bunden del af stål hybridiserings kammer (PBM kammer) med pakning glide opad (kommerciel etiket opad). For flere detaljer om samlingen, henvises til tabellen over materialer.
    4. Opløsning af pipet (2% w/v skummetmælk i PBS) i hvert kammer.
    5. Fjern microarray-diaset fra Coplin-krukken, og tør den ikke-DNA-side (DNA'ET skal være på samme side som firma etiketten) og kanterne ved hjælp af en fin serviet. Placer langsomt mikrosystemet på pakningen, og undgå bobler (firma etiketten vender nedad). Straks samle og stramme stål hybridiseringkammer apparat. Inkuber i 1 time ved stuetemperatur (RT).
    6. Fyld en farvnings skål ("PBS" skålen) med 800 mL frisk PBS. Fyld en anden farvnings skål ("vaske" skålen) med 800 mL frisklavet 0,5% v/v Tween-20 i PBS.
    7. Skru PBM-kammeret af og fjern mikromatrixens slide-Cover slip "sandwich", idet du skal passe på ikke at bryde forseglingen. Skil den ad under vandet i vaske skålen ved at placere pincet mellem sliden og dæksedlen.
    8. Ryst microarray slide under vandet og hurtigt overføre til en Coplin jar.
    9. Vask en gang med 0,1% v/v Tween-20 i PBS (5 min ved 125 rpm på en lab rotator).
    10. Vask en gang med 0,01% v/v Triton X-100 i PBS (2 min ved 125 rpm på en lab rotator).
    11. Overfør hurtigt sliden til en Coplin-krukke med PBS.
  2. Protein binding
    1. Saml PBM-kammeret som tidligere beskrevet (trin 2.1.2-2.1.3).
    2. Blanding af pipette proteinbinding indeholdende 5 μM T7 DNA primase, 30 mm Tris-HCL pH 7,5, 6,5 mm mgcl2, 30 mm K-glutamat, 6 mm ditiotreitol (DTT), 65 μM ribonucleosid trifosfat (rntp), 2% w/v skummetmælk, 100 ng/μl bovint serumalbumin (BSA), 50 ng/μl laks testikler DNA, og 0,02% v/v Triton X-100 (TX-100) ind i hvert kammer af pakningen glide (uden at røre gummi sider og uden at indføre bobler).
    3. Skyl microarray-diaset kortvarigt ved at dyppe det i PBS-skålen, som fjerner overskydende rengøringsmiddel fra overfladen af diasene. Tør ikke-DNA-overfladerne på diaset med en fin serviet.
    4. Sænk langsomt microarray-diaset (vender nedad) på pakningen, og sørg for at undgå lækage fra det ene kammer til det andet. Straks samle og stramme PBM kammer apparat uden at indføre bobler. Hvis der dannes bobler, kan de fjernes ved forsigtigt at tappe stål kammeret mod en hård overflade.
    5. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur (RT).
  3. Fluorescerende antistof fastgørelse
    1. Skru PBM-kammeret af og fjern mikromatrixens slide-Cover slip "sandwich", idet du skal passe på ikke at bryde forseglingen. Afmonter under vandet i vaske skålen ved hjælp af pincet. Ryst diaset under vandet, og Overfør hurtigt til en Coplin-krukke med PBS.
    2. Saml PBM-kammeret med pakningen som tidligere beskrevet (trin 2.1.2-2.1.3).
    3. Tilføj Alexa 488-konjugeret anti-His-antistoffer (10 ng/μL i bindings buffer) til pakningen.
    4. Skyl lysbilledet kortvarigt ved at dyppe det i PBS skålen som før, og fjern derefter sliden fra PBS langsomt, tør den ikke-DNA-overflade af og Placer den med nedad på pakningen.
    5. Inkuber 30 min ved RT i mørket (Fluorescens sonde er lysfølsom) for at reducere foto blegning.
    6. Demontere PBM kammer og dækglas som før, fjerne dækglas under vandet i vaske skålen.
    7. Skyl lysbillederne kortvarigt ved at dyppe dem i PBS skålen. Tør gliderne med trykluft. Opbevar den i mørket i en slide boks, indtil den er klar til at scanne.
  4. Scanning af microarray-diaset
    1. Scan chippen ved hjælp af microarray scanner (Se tabel over materialer) med excitation af 495 nm og emission af 519 nm og indsamle median fluorescens intensitet.

3. analyse af mikroarray data

Bemærk: al databehandling blev udført ved hjælp af brugerdefinerede skriftlige scripts i MATLAB.

  1. Udfør den indledende PBM-databehandling ved hjælp af Wilcoxon Rank sum test p-værdi som beskrevet tidligere4.
  2. Brug medianværdien af bindings intensiteten for hver DNA-sekvens til yderligere analyse.
  3. Derefter sammenlignes Statistisk signifikans af de observerede forskelle i primase-DNA-bindings intensiteter, der er opnået for forskellige grupper af DNA-sonder, som forklaret ovenfor i design afsnit3i DNA-biblioteket, ved hjælp af envejs-ANOVA p-værdier.

4. template-instrueret RNA-syntese katalyseret af T7 DNA primase

  1. Fremstilling af Denaturerings polyacrylamid-gel
    1. Til tilberedning af 100 mL gel-blanding Kombiner 62,5 mL 40% acrylamid-bisacrylamid (19:1), 42 g urinstof, 1,1 g Tris base (2-amino-2-(hydroxymethyl)-1, 3-propanediol), 0,55 g borsyre og 0,4 mL 0,5 M ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA) opløsning.
    2. Blandingen opdeles i 14 mL aliquoter (det nødvendige beløb til en gel på 16,5 cm x 26 cm x 0,03 cm) og holdes beskyttet mod lys ved 4 °C i op til 1 måned.
    3. For at tilberede en Denaturerings polyacrylamidgel tilsættes 4 μL TEMED og 40 μL 10% w/v ammonium persulfat til 14 mL af den tidligere fremstillede blanding, og det overlades til polymeriserer i mindst 2 timer ved RT. Gelen kan opbevares i en dag ved 4 °C.
  2. Forberedelse af prøver
    Bemærk: Opbevar reagenserne, reaktionsblandingen og prøverne på isen.
    1. Til klargøring af den reaktionsblanding, der kræves til 10 reaktioner, kombineres 11 μL 5x aktivitets buffer (200 mM Tris-HCl, pH = 7,5; 50 mM dithiothreitol, 250 mM kaliumglutamat, 50 mM MgCl2), 5,5 μl af 2,5 mm blanding af nukleotidtri-fosfat (ntp'er) og 5,5 μl radioaktivt mærket ribonucleotid [f. eks. ATP, (α-32P) 3000 CI/mmol].
      Bemærk: alle beløb er blevet forhøjet med 10% på grund af mulige pipetteringsfejl. Radioaktivt mærkede ribonucleotider skal fortyndes i henhold til styrken af det radioaktive signal (den oprindelige fortynding er sædvanligvis 1:10 eller mere).
    2. 2 μL af reaktionsblandingen overføres til ti PCR-rør.
    3. Tilsæt 1 μL 100 μM DNA-skabelon til det tilsvarende PCR-rør, og drej ned.
    4. Tilsæt 2 μL 16 μM T7 DNA primase, spin ned, bland forsigtigt, og spin ned igen.
    5. Reaktionen ved RT i 20 min.
    6. Reaktionen stoppes ved at tilsætte 5 μl dæmper (95% formamid, 20 mm EDTA, 0,05% w/v xylen cyanol og bromphenolblåt blå), blandes og spinne ned.
  3. Udskillelse af RNA-produkter ved elektroforese gennem denaturering af polyacrylamid-gel og efterfølgende signaldetektering
    1. Før du kører gelen i 1 time (10 mA, 600 V) i 1x TBE-buffer (90 mM Tris-Borat, 2 mM EDTA).
    2. Opload op til 2 μL af hver prøve, og Udfør elektroforese (20 mA, 1100 V) i 1x TBE-buffer (90 mM Tris-Borat, 2 mM EDTA).
    3. Tør gelen i 2 timer ved 80 °C under et vakuum.
    4. Eksponere fosfor billedpladen til radioaktiv gel i et par timer til natten, afhængigt af styrken af radioaktivt signal.
    5. Optag signalet (foto stimuleret luminescens) ved hjælp af phosphorimager (Se tabel over materialer).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dette teknologiske frem forskud til kortlægning af primase bindingssteder gør det muligt at opnå DNA-bindingsegenskaber, der er svære, hvis ikke umulige, at observere ved hjælp af klassiske værktøjer. Endnu vigtigere er det, at HTPP gør det muligt at genbesøge den traditionelle forståelse af primase bindingssteder. Specifikt, HTPP afslører bindende særtræk i tillæg til kendte 5 '-GTC-3 ' anerkendelse sekvenser, hvilket fører til ændringer i funktionelle aktiviteter af T7 DNA primase. Nemlig, to grupper af sekvenser blev identificeret: stærk-bindende DNA-sekvenser, der indeholdt T/G i flankerne og svage bindende sekvenser, der indeholdt A/G i flankerne (alle thymines i den stærke bindende skabeloner blev erstattet af adeniner). Ingen primase binding til DNA-skabeloner, der manglede 5 '-GTC-3 ' inden for deres sekvens blev opdaget.

De primase DNA anerkendelse sites, der indeholdt specifikke funktioner, såsom T/G-rige flanker, øget primase-DNA binding op til 10-fold, og overraskende også øget længden af nydannede RNA (op til tredobbelt) (figur 2 i tidligere publikation 3). vigtigere, htpp tillod os at observere og kvantificere variabiliteten i primer længde i forhold til SEKVENSEN af DNA-skabelonen.

Figure 1
Figur 1: skematisk gengivelse af primase profilering med høj gennemløb (HTPP). A) sliden blev inkuberet med primase i aktivitets buffer (40 mm Tris-HCl, pH 7,5; 10 mm mgcl2, 50 mm K-glutamat, 10 mm DTT, 100 μM rntps). Næste, Alexa 488-konjugeret anti-hans fluorescerende antistof blev introduceret for at mærke proteinet. Efter det milde vaske trin blev diaset scannet ved hjælp af microarray scanner. Bindingsaffinitet blev bestemt i henhold til det mediane fluorescens signal, og DNA-sekvenser blev inddelt i grupper i overensstemmelse hermed. B) der blev udført biokemiske analyser for at KORRELERE de DNA-bindende resultater opnået fra mikromatrixforsøget med de funktionelle egenskaber af T7 DNA primase. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: sammenligning af T7 DNA primase katalytisk aktivitet på to grupper af DNA-skabeloner (stærk binding med T/g i flankerne og svag binding med A/g i flankerne) opnået fra PBM. (A) RNA-primer dannelse katalyseret af T7 DNA primase. Reaktionerne indeholdt oligonukleotider med den primase genkendelsessekvens (nummererede baner), 32P-α-ATP, ATP, CTP, UTP og GTP i standard reaktionsblandingen. En gruppe DNA-oligonukleotider (mørkeblå) indeholdt T/G i flankerne, hvorimod alle thyminer blev erstattet med adeniner i den anden gruppe (lyseblå). Efter inkubation blev de radioaktive RNA-produkter adskilt af elektroforese gennem en 25% polyacrylamid gel indeholdende 7M urinstof og visualiseret af Autoradiografi. B) relativ længde (antal ribonucleotider, der udgør hver RNA-primer er ukendt) og mængden af RNA-primere syntetiseres af T7 DNA primase på to grupper af DNA-skabeloner (panel A). De parceller viser, at længere RNA primere er syntetiseret (øget processivitet) på DNA-skabeloner, der primase binder med højere affinitet (der indeholder T/G i flankerne) i forhold til de skabeloner, der er bundet med lavere affinitet (der indeholder A/g i flankerne). C) kvantificering af mængden af SYNTETISEREDE RNA-primere på to grupper af DNA-skabeloner. Resultaterne viser en sammenhæng mellem DNA bindende affinitet og mængden af syntetiseret RNA af T7 DNA primase. AU (vilkårlig enhed) er det mål for intensiteten af radioaktivt signal, som direkte korrelerer med mængderne af syntetiserede RNA Primers. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den PBM metode har været meget anvendt til at undersøge bindende egenskaber af transkriptionsfaktorer og kan også anvendes til DNA-behandling enzymer, såsom DNA primase, der binder sig til DNA med lav affinitet. Der kræves dog visse ændringer af forsøgsprocedurerne. Mikroarray eksperimentet involverer flere trin: design af DNA-biblioteket, forberedelse af chippen, binding af protein målet, fluorescerende mærkning og scanning. Milde vaske trin er kritiske, da de lange skylninger med opløsninger, der indeholder rengøringsmidler, forårsager dissociation af proteinet fra DNA-skabelonen på grund af den svage/forbigående bindings form. Andre kritiske trin omfatter bindende betingelser (f. eks. buffer sammensætning, cofactors) og inkubationstider, der skal optimeres for hvert specifikt enzym.

De opnåede resultater fra mikrosystemet skal valideres i biokemiske analyser. Biokemiske analyser giver også indsigt i interessante funktioner i DNA-forarbejdnings enzymer såsom sammenhængen mellem DNA bindende affinitet og enzymatisk aktivitet/processivitet. HTPP gjorde os i stand til at observere effekten af DNA-binding på T7 DNA primase funktionelle egenskaber. For eksempel er det blevet observeret, at hvis primase udviser højere bindingsaffinitet til DNA-skabelonen, katalyserer den dannelsen af længere RNA-primere (øget processivitet).

Samlet set er den metode, der præsenteres i denne artikel er hurtig, pålidelig, og giver mulighed for at samtidig teste bindende egenskaber på titusinder af forskellige DNA-sekvenser i et enkelt eksperiment på en hypotese-drevet måde. Tilsætning af andre proteiner eller metal cofaktorer til reaktionsblandingen giver mulighed for at undersøge deres virkning på DNA-bindingsegenskaber af primases i en hurtig, høj gennemløb måde. På den anden side er anvendelsen af denne metode begrænset af relativt høje priser på mikroarray-slides og de sikkerhedsforanstaltninger, der kræves ved håndtering af radioaktivt materiale til primase aktivitets analyser.

Det er vigtigt at bemærke, at forskellige primases kræver modifikationer af både mikroarray bindende betingelser og buffer betingelser for aktivitet assays. For eksempel, primase af Mycobacterium tuberkulose kræver substitution af magnesium med divalent mangan i reaktions bufferen. Uhensigtsmæssige metal kofaktorer eller uhensigtsmæssige reaktions buffere kan føre til dårlig primase aktivitet eller nedsat DNA bindende affinitet.

Som tidligere nævnt binder primases til DNA-skabeloner med svag affinitet; Derfor er blide vaske trin påkrævet under microarray binding eksperiment. Ellers vil de blive vasket ud fra microarray slide, hvilket fører til tab af det fluorescerende signal ved tilsætning af fluor cently mærket antistof.

For at opsummere, de DNA bindende egenskaber af mange prokaryote primases (herunder trinucleotid DNA anerkendelse sekvens) er stadig dårligt forstået, for det meste på grund af de tekniske begrænsninger af nuværende tilgængelige metoder. HTPP repræsenterer en hurtig og effektiv platform for opdagelsen af DNA-anerkendelses stederne eller undersøgelser af andre skabelon relaterede faktorer (dvs. samlet nukleotidsammensætning, GC-indhold, tilstedeværelsen af gentagne DNA-sekvens elementer og deres symmetri) der påvirker binde affiniteten og aktiviteten af ssDNA-bindings enzymer. Desuden kan fremtidige anvendelser rettes mod virkningerne af forskellige proteiner eller cofaktorer på DNA bindende affinitet, anerkendelses mønstre eller funktionel aktivitet af primases og andre DNA-forarbejdnings enzymer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af Israels VIDENSKABS fond (Grant nr. 1023/18).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
40% acrylamide-bisacrylamide (19:1) solution Merck 1006401000
95% formamide Sigma-Aldrich F9037-100ML
Alexa 488-conjugated anti-his antibody Qiagen 35310
Ammonuium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678-100G
ATP, [α-32P] – 3000 Ci/mmol Perkin Elmer NEG003H250UC
Boric acid, granular Glentham Life Sciences GE4425
Bovine Serum Albumin (BSA) Roche 10735094001
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Coplin jar
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich D0632-25G
DNA microarray Agilent 4x180K (AMADID #78366)
https://www.agilent.com
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Acros Organics AC118430010
Fujifilm FLA-5100 phosphorimager FUJIFILM Life Science
Glass slide staining rack Thermo Scientific 12869995 If several slides are used
Lab rotator Thermo Scientific 88880025
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 63064-500G
Microarray Hybridization Chamber Agilent G2534A https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf
Microarray scanner (GenePix 4400A) Molecular Devices
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Potassium glutamate Alfa Aesar A172232
Ribonucleotide Solution Mix (rNTPs) New England BioLabs N0466S
Salmon testes DNA Sigma-Aldrich D1626-1G
Skim milk powder Sigma-Aldrich 70166-500G
Staining dish Thermo Scientific 12657696
Tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 1610800
Tris base (2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) Sigma-Aldrich 93362-500G
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ML
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416-50ML
Urea Sigma-Aldrich U6504-1KG
Xylene cyanol Alfa Aesar B21530

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berger, M. F., Bulyk, M. L. Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins. Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).
  2. Berger, M. F., Bulyk, M. L. Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors. Nature Protocols. 4, (3), 393-411 (2009).
  3. Afek, A., et al. DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase. iScience. 2, 141-147 (2018).
  4. Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111, (48), 17140-17145 (2014).
  5. Frick, D. N., Richardson, C. C. Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site. Journal of Biological Chemistry. 274, (50), 35889-35898 (1999).
  6. Tabor, S., Richardson, C. C. Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7. Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78, (1), 205-209 (1981).
  7. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Research. 9, (23), 6505-6525 (1981).
  8. Galas, D. J., Schmitz, A. DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Research. 5, (9), 3157-3170 (1978).
  9. Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics). Nucleic Acids Research. 19, (10), 2788 (1991).
  10. Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. The detection of DNA-binding proteins by protein blotting. Nucleic Acids Research. 8, (1), 1-20 (1980).
  11. Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein. Molecular Cell Biology. 9, (7), 2944-2949 (1989).
  12. Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition. Gene. 304, 1-12 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics